AT5044U1 - Quantitativer einschritt immuntest in lyophilisierter form - Google Patents
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Abstract
Ein Immun-Test-Kit für die qualitative und quantitative Bestimmung einer Probe durch spezifische Bindungspartner wie z.B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren und Liganden besteht aus einer Träger- bzw. einer Mikrotiterplatte mit einer Mehrzahl von Vertiefungen, wobei der Träger bzw. die Mikrotiterplatte mit einem primären Bindungspartner vorbeschichtet ist und der Bindungspartner fixiert als Lyophilisat vorliegt. In einem Teil der Vertiefungen der Mikrotiterplatte liegt zusätzlich eine Referenzstandardreihe der zu bestimmenden Probe mit inkrementeller Verdünnung in lyophilisierter Form vor.
Description
AT 005 044 Ul
Die Erfindung bezieht sich auf einen Immun-Test-Kit für die qualitative und quantitative Bestimmung einer Probe durch spezifische Bindungspartner wie z.B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren und Liganden, mit einer Träger- bzw. einer Mikrotiterplatte mit einer Mehrzahl von Vertiefungen, wobei der Träger bzw. die Mikrotiterplatte mit einem primären Bindungspartner vorbeschichtet ist und der Bindungspartner fixiert als Lyophilisat vorliegt.
Immuntests, Enzym gekoppelte Immuntests, Fluoreszenz Label gekoppelte Immuntests, Lumineszenz Label gekoppelte Immuntests oder mit einem anderen Label markierte Immuntests werden in der Routinediagnostik und Forschungsdiagnostik zur Detektion und Quantifizierung von Proteinen, zum Beispiel Antigenen, Liganden, Rezeptoren, Antikörpern sowie von chemischen Verbindungen eingesetzt. Stand der Technik ist es, in solchen Test-Kits einen der Bindungspartner an einen festen Träger, zum Beispiel eine Polystyrolplatte, zu binden und die weiteren für die Versuchsdurchführung benötigten Reagentien als separate Komponenten des Testkits hinzuzufügen. Diese Reagentien sind üblicherweise das nachzuweisende Protein in quantifizierter Form als Konzentrat oder Lyophilisat (Referenzstandard), ein Standard- und Probenverdünnungsmedium, der zweite spezifische Bindungspartner in gekoppelter Form (Konjugat) als Konzentrat oder Arbeitelösung, falls benötigt ein sekundäres Detektionssystem sowie im Falle eines Enzymlabels das zum Nachweis benötigte Substrat-Reagenz. Zur Terminierung der enzymatischen Reaktion wird eine Stopplösung beigefügt, zum Herstellen der Arbeitslösungen für den zweiten spezifischen Bindungspartner sowie für das Sekundärreagenz steht ein Assaypuffer zur Verfügung, welcher meist als Konzentrat vorliegt. Da zwischen den Arbeitsschritten Waschschritte erforderlich sind, enthält ein herkömmlicher Immun-Test-Kit einen Waschpuffer, üblicherweise in konzentrierter Form.
Kommerzielle ELISA Kits bieten dem Anwender validierte Testsysteme. Die Produkte enthalten alle für die Testdurchführung erforderlichen Reagentien in optimierten Konzentrationen und Mengen sowie ein detailliertes Protokoll zur Durchführung 2 AT 005 044 Ul des Tests. Die einzelnen Reaktionsschritte werden üblicherweise konsekutive durchgeführt. Die gemeinsame Inkubation von Analyten (Standard, Probe) und sekundärem Antikörper mit der Festphase (Cocktail) ist für eine Vielzahl von Testsystemen möglich.
Ein typisches Beispiel für einen Immuntest ist der Sandwich ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) .
Typischer Weise enthalten solche ELISA Kits folgende Komponenten: • Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, vorbeschichtet mit dem primären Antikörper, geblockt, fixiert. • Referenzmaterial: Analyt (Standard) in definierter Konzentration zur Erstellung einer Standardreihe • Enzym- (Horse Radish Peroxidase) oder Biotin-gekoppelter Sekundärantikörper • Falls erforderlich Streptavidin-Enzym (Horse Radish Peroxidase) • Substratlösung (Tetramethylen-Benzidin) • Waschpuffer: Salzlösung zum Waschen der Platten vor der Probeninkubation und zwischen den Reaktionsschritten • Assay-Puffer: Salzlösung zur Verdünnung des Sekundärantikörpers und Streptavidin-Enzym Konzentrates (Herstellen der Arbeitslösungen) • Probenverdünnungsmedium: Spezifisches flüssiges Medium zur Verdünnung des Referenzmaterials sowie der unbekannten Proben • Stopp-Lösung zur Beendigung der enzymatischen Reaktion
Zur Testdurchführung sind durch den Anwender folgende Arbeitsschritte durchzuführen: • Herstellung der Arbeitslösungen • Erstellung der Standardreihe durch Verdünnung des Referenzmaterials • Waschen der Mikrotiterplatte • Vor legen des Probenverdünnungsmediums 3 AT 005 044 Ul • Aufträgen der einzelnen Referenzverdünnungen (Standardreihe) • Aufträgen der unbekannten Proben • Zugabe des Enzym- oder Biotin-gekoppelten Sekundärantikörpers • Waschen der Mikrotiterplatte • Optional Zugabe von Streptavidin-Enzym • Waschen der Mikrotiterplatte • Zugabe des Substrates • Zugabe der Stopplösung • Messung der optischen Dichte
Die Erfindung zielt nun darauf ab, die Handhabung derartiger Test-Kits zu vereinfachen und neben einer qualitativen Aussage auch quantitative Aussagen zu ermöglichen. Des weiteren zielt die Erfindung neben der Reduktion des Arbeitsaufwandes und der zur Testdurchfühung benötigten Zeit darauf ab, die Fehlerwahrscheinlichkeit für den Anwender durch Minimierung der durchzuführenden Arbeitsschritte zu reduzieren. Schließlich ist es Ziel der vorliegenden Erfindung, die Verpackungsvolumina sowie Verpackungskosten ebenso wie die Versandkosten durch deutliche Gewichtsverringerung und Volumsverringerung der Kits herabzusetzen und eine logistische Vereinfachung bereitzustellen, bei welcher standardisierte Basis-Kits mit verbesserter Lagerfähigkeit des Produktes zur Verfügung gestellt werden.
Zur Lösung dieser Aufgabe besteht der erfindungsgemäße Immun-Test-Kit im wesentlichen darin, daß in einem Teil der Vertiefungen der Mikrotiterplatte zusätzlich eine Referenzstandardreihe der zu bestimmenden Probe mit inkrementeller Verdünnung in lyophilisierter Form vorliegt. Dadurch, daß der Träger bzw. die Mikrotiterplatte zusätzlich bereits eine Referenzstandardreihe der zu bestimmenden Probe enthält, wird die Möglichkeit geschaffen, neben einer rein qualitativen Analyse auch eine quantitative Abschätzung und eine quantitative Bestimmung durch Interpolation zwischen definierten Testergebnissen im Bereich zwischen inkrementell benachbarten Standards vorzunehmen, wobei der aufwendige Schritt der Herstellung der 4 AT 005 044 Ul
Arbeitslösung des Referenzmateriales und der Herstellung der entsprechenden Verdünnungsreihe bei der Laborbestimmung entfällt. Mit einer derartigen Ausbildung des Immun-Test-Kits, bei welcher das Herstellen der Arbeitslösung des Referenzmaterials und das Aufträgen des Standardverdünnungsmediums in die für die Standardreihe vorgesehenen Vertiefungen der Mikrotiterplatte entfällt, läßt sich somit bereits eine wesentliche Rationalisierung und Vereinfachung des Verfahrens und insbesondere eine exakt reproduzierbare Standardreihe vorgeben, wodurch die Fehlerwahrscheinlichkeit bereits wesentlich verringert wird.
In besonders vorteilhafter Weise kann aber die Vorfertigung des Immun-Test-Kits noch wesentlich weiter vorangetrieben werden und die notwendigen Bestimmungsschritte für die Probe weiter reduziert werden. Zu diesem Zweck ist mit Vorteil die Ausbildung so getroffen, daß die Vertiefungen der Mikrotiterplatte zusätzlich ein Enzym- oder Biotin-gekoppeltes Konjugat eines Sekundärbindungspartners, insbesondere -antikörpers, und im Fall des Biotin-gekoppelten Konjugates ein Enzym in lyophilisierter Form enthalten. Auf diese Weise wird neben der Standardreihe zur Quantifizierung des nachzuweisenden Proteins in definierten Proteinkonzentrationen auch der zweite, spezifische mit einem der oben genannten Labels gekoppelte Bindungspartner (Konjugat in titrierter Konzentration sowie gegebenfalls das sekundäre Reagenz) zum Nachweis gemeinsam mit dem fest an Phasen gebundenen primären Bindungspartner bereits in lyophilisierter Form in der Festphase eingebracht, wobei die Bereitstellung dieser Komponenten in lyophilisierter Form, d. h. somit in bei tiefen Temperaturen von etwa -30°C dehydrierter Form, die Reaktionskinetik soweit einfriert, daß keine Vorabreaktion des Referenzmaterials zu befürchten ist. Da hochverdünnte Arbeitslösungen ebenso wie begrenzt stabile Lösungen nicht vorrätig gehalten werden, sondern vielmehr erst unmittelbar zu Testbeginn durch Zugabe von Lösungsmittel bzw. Rehydrierung auf dem Träger erzeugt werden, werden weitere mögliche Fehlerquellen ausgeschlossen.
In weiterer Verbesserung und zur weiteren Verringerung der erforderlichen Arbeitsschritte bei der Bestimmung ist die 5 AT 005 044 Ul
Ausbildung so getroffen, daß die Vertieflangen der Mikrotiterplatte ein Probenverdünnungsmedium in lyophilisierter Form enthalten. Das spezifische Probenverdünnungsmedium kann hiebei bei einer Temperatur von beispielsweise 2°C in der benötigten Menge in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte eingebracht werden, wobei das Sekundärantikörper-Enzymkonjugat bzw. das Gemisch aus Sekundärantikörper-Biotinkonjugat bei gleicher Temperatur in alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte eingebracht werden kann, worauf die so beschickte Mikrotiterplatte einem Gefriertrocknungsprozeß in einer beispielsweise auf -30°C vorgekühlten Gefriertrocknungsanlage der Lyophilisierung unterzogen wird.
Ein derartiger vorkonfektionierter Träger bzw. eine derartige vorkonfektionierte Mikrotiterplatte erfordert zur Vervollständigung des Test-Kits nur mehr eine geringe Anzahl zusätzlicher Komponenten, wobei mit Vorteil der Test-Kit zusätzlich zur vorbeschichteten Mikrotiterplatte lediglich Waschpuffer, Substratlösung und Stopplösung enthält. Für die Bestimmung der Probe ist es somit lediglich erforderlich, die Mikrotiterplatte durch Zugabe definierter Volumina an destilliertem Wasser zu den Vertiefungen der Standardreihe, gegebenenfalls den Blanks und den Probenvertiefungen, zu rehy-drieren, worauf die unbekannte Probe aufgegeben und inkubiert wird. Nach einem Waschen der Mikrotiterplatte und dem Aufträgen des Substrates in alle für den Test verwendeten Vertiefungen der Mikrotiterplatte wird nach vorbestimmter Zeit die Stopplösung zugegeben und es kann unmittelbar die Testauswertung vorgenommen werden.
Mit Vorteil ist die Ausbildung hiebei so getroffen, daß im Falle von Biotin-gekoppeltem Sekundärantikörper-Konjugat als Sekundärreagenz Streptavidin - Horse Radish Peroxidase (HRP) eingesetzt ist.
Insgesamt wird durch die erfindungsgemäße Ausbildung die Testdurchführung für den Anwender auf die Zugabe der unbekannten Probe sowie die enzymatische Reaktion reduziert, wobei alle weiteren Schritte zuvor vom Hersteller des ELISA Kits durchgeführt werden. Die Mikrotiterplatte wird somit beim Hersteller 6 AT 005 044 Ul mit dem spezifischen Primärantikörper beschichtet, geblockt und fixiert, worauf die Platte beispielsweise auf -20°C gekühlt wird und die oben beschriebenen zusätzlichen Schritte zum Einbringen der Standardreihe des Probenverdünnungsmittels sowie des Sekun-därantikörper-Enzymkonjugates bzw. des Gemisches aus Sekundärantikörper-Biotinkonjugates und Streptavidin-Enzymes in definierter Weise beim Hersteller vorgenommen werden. Die Testdurchführung reduziert sich somit auf die Zugabe der zu analysierenden Proben sowie die Testauswertung aufgrund der Substratfärbung.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand einer Gegenüberstellung zum Stand der Technik näher erläutert, wobei der Stand der Technik als Standard-Kit bezeichnet wird. 1. Komponenten der ELISA Kitas a) direkt Enzym gekoppeltes Konjugat
Standard Kit Einschritt Kit der vorliegenden Erfindung 1 Antikörperbeschichtete Mikroti terplatte 1 Antikörper beschichtete Mikrotiterplatte inklusive Standardreihe, Pr obenverdünnungsmedium, Koni ugatantikörper 2 Standardmaterial 3 Assav-Puffer 4 Koni ucratant ikörper 5 Probenverdünnungsmedium 6 Waschouffer 2 Waschpuffer 7 Substratlösung 3 Substratlösung 8 Stopplösung 4 Stopplösung 7 AT 005 044 Ul b) zweiter Antikörper an Biotin gekoppelt, Sekundärreagenz Streptavidin-Horse Radish Peroxidase (HRP) o.ä.
Standard Kit Einschritt Kit der vorliegenden Erfindung 1 Antikörper-bes chichtete Mikrotiterplatte 1 Antikörper beschichtete Mikro titerplatte inklusive Standardreihe, Probenverdünnungsmedium, biotinylierter Antikörper, Streptavidin-HRP o.ä. 2 Standardmaterial 3 Assay-Puffer 4 Biotinylierter Antikörper 5 Streptavidin-HRP o.ä. 6 Probenverdünnunasmediuin 7 Waschpuffer 2 Waschpuffer 8 Substratlösung 3 Substratlösung 9 Stopplösung 4 Stopplösung 2. Arbeit 8 schritte zur Testdurchführung s a) direkt Enzym gekoppeltes Konjugat
Standard Kit Einschritt Kit der vorliegenden Erfindung 1 Waschen der Antikörper beschichteten Mikrotiterplatte 2 Herstellen der Arbeitslösung des Referenzmaterials (Standard) 3 Aufträgen des Standardverdünnungsmediu ms in die für die Standardreihe vorges ehenen Vertiefungen der Mikrotiterplatte 4 Externe oder interne (in der Platte) Verdünnung der Arbeitslösung des Standards in definierte Konzentrationen (Standardreihe) 8 AT 005 044 Ul 4a Gegebenenfalls Einbringen der Standardverdünnungen in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte 5 Aufträgen des Probenverdünnungsmedium als Nullwert (blank) in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte 6 Einbringen des benötigten Volumens des Probenverdünnungsmediums in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte 1 Rehydrierung der Mikrotiterplatte (Zugabe definierter Volumina an destilliertem Wasser zu den Vertiefungen der Standardreihe, Blank und den Probenvertiefungen) 7 Aufträgen der unbekannten Proben 2 Aufträgen der unbekannten Proben 8 Herstellen der Arbeitslösung des HRP-Koniugates o.ä. 9 Aufträgen des HRP-Konj ugates (o.ä.) in alle für den Test verwendeten Vertiefungen der Mikrotiterplatte 10 Inkubation 3 Inkubation 11 Waschen der Mikrotiterplatte 4 Waschen der Mikrotiterplatte 12 Aufträgen des Substrates in alle für den Test verwendeten Vertiefungen der Mikrotiterplatte Aufträgen des Substrates in alle für den Test verwendeten Vertiefungen der Mikrotiterplatte 13 Zugabe der Stopplösung 5 Zugabe der Stopplösung 14 Tes tauswertung 6 Tes tauswertung b) zweiter Antikörper an Biotin gekoppelt, Sekundärreagenz Streptavidin-Horse Radish Peroxidase (HRP) o.ä.
Standard Kit Einechritt Kit der vorliegenden Erfindung 1 Waschen der Antikörper beschichteten Mikrotiterplatte 2 Herstellen der Arbeitslösung des Referenzmaterials (Standard) 9 AT 005 044 Ul 3 Aufträgen des S tandardver dünnungsmediu ms in die für die Standardreihe vorges ehenen Vertiefungen der Mikrotiterplatte 4 Externe oder interne (in der Platte) Verdünnung der Arbeitslösung des Standards in definierte Konzentrationen (Standardreihe) 4a Gegebenenfalls Einbringen der Standardverdünnungen in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte 5 Aufträgen des Probenverdünnungsmedium als Nullwert (blank) in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte 6 Einbringen des benötigten Volumens des Probenverdünnungsmediums in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte 1 Rehydrierung der Mikrotiterplatte (Zugabe definierter Volumina an destilliertem Wasser zu den Vertiefungen der Standardreihe, Blank und den Probenvertiefungen) 7 Aufträgen der unbekannten Proben 2 Aufträgen der unbekannten Proben 8 Herstellen der Arbeitslösung des biotinylierten Antikörpers 9 Aufträgen des Biotin-Konjugates in alle für den Test verwendeten Vertiefungen der Mikrotiterplatte 10 Inkubation 11 Waschen der Mikrotiterplatte 12 Herstellen der Streptavidin-HRP o.ä. Arbei t s 1 ösung 13 Aufträgen der Streptavidin-HRP o.ä. Lösung in alle für den Test verwendeten Vertiefungen der Mikrotiterplatte 10 AT 005 044 Ul 14 Inkubation 3 Inkubation 15 Waschen der Mikrotiterolatte 4 Waschen der Mikrotiterplatte 16 Aufträgen des Substrates in alle für den Test verwendeten Vertiefungen der Mikrotiterplatte Aufträgen des Substrates in alle für den Test verwendeten Vertiefungen der Mikrotiterplatte 17 Zugabe der Stopplösung 5 Zugabe der Stopplösung 18 Testauswertung 6 Testauswertung
Die Erfindung kann hiebei ihre Anwendung zur Detektion von Antigenen mit Hilfe eines Paares von Antikörper (Sandwich ELISA) finden. Ebenso ist der Nachweis von Antikörpern mit dem entsprechenden Antigen möglich. Die Detektion von Rezeptoren bzw. Liganden durch den jeweiligen Bindungspartner ist eine weitere Möglichkeit der Anwendung der vorliegenden Erfindung, sodaß eine große Anzahl von Testformaten zur Verfügung steht. Insbesondere kann der Test zum Nachweis von Proteinen, Steroiden, chemischen Verbindungen, Medikamenten, Nukleinsäuren, und ähnlichen Substanzen eingesetzt werden.
Die Detektion des Reaktionskomplexes kann mit Hilfe eines direkt gekoppelten Enzymes erfolgen (zum Beispiel Horse Radish Peroxidase, Alkalische Phosphatase u.ä.), über eine enzymatische Reaktion, welche durch einen Sekundärschritt erfolgt (Biotin-Streptavidin-HRP, enzym-gekoppelter Antikörper gegen den Detektionsantikörper u.ä.). Jedes weitere Label, welches für die Durchführung eines Immuntestes geeignet ist, wie Fluorochrome, Chemiluminenszenz Labels, radioaktive Labels, u.ä., kann ebenso benutzt werden.
Der Träger zur Immobilisierung des primären Bindungs-partners ist vorzugsweise eine Polystyrol 96 Well Mikrotiterplatte, wobei jedoch jeder andere Träger, der für die Durchführung eines Immuntestes geeignet ist, ebenso für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden kann.
Die zur Messung eingesetzten Proben können alle flüssigen Proben, die den Analyten enthalten, im speziellen Körperflüssigkeiten wie Seren, Plasmapräparationen, lokale Körperflüssigkeiten, Vollblut, u.ä. sowie Zellkulturüberstände, gepufferte Lösungen der Analyten u.ä., sein. 11 AT 005 044 Ul
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von spezifischen Anwendungsbeispielen näher erläutert.
Anwendungsbeispiel 1
Sandwich ELISA zum Nachweis von humanem XCAM-1 A) Herstellung der Platten in Verbindung mit Proben verdünnungsmedium, Standardreihe, HRP-Konjugat
Schritt 1:
Beschichtung:
Die 96 well Mikrotiterplatten werden nach dem Stand der Technik mit 2,5ug/ml anti-ICAM-1 in PBS Puffer beschichtet (ΙΟΟμΙ pro well, über Nacht Inkubation bei 4°C).
Schritt 2:
Blockierung:
Die Beschichtungslösung wird abgesaugt, die Platte wird einmal mit Waschpuffer gewaschen (PBS/Tween). Zur Absättigung der Polystyroloberfläche (Verhinderung unspezifischer Bindungen) wird die Platte mit 300μ1 pro well PBS/2% BSA blockiert (2h, RT). Schritt 3:
Fixierung:
Die Blockierungslösung wird abgesaugt, die Platte zweimal gewaschen, pro Well werden 150μ1 PBS/15% Sucrose hinzugefügt. Nach einer Stunde Inkubation bei RT wird die Fixierungslösung dekantiert. Die Platte wird ca. 20 Stunden bei 28°C im Umlufttrockenschrank getrocknet. Die Platte wird auf -20°C eingefroren.
Schritt 4:
Einbringung des Probenverdünnungsmediums:
Die beschichtete Platte wird im gefrorenen Zustand eingesetzt. Das Probenverdünnungsmedium wird auf 2°c gekühlt. Zur Erstellung der Standardreihe wird in den ersten beiden Reihen der Mikrotiterplatte in jede Vertiefung ΙΟΟμΙ Probenverdünnungsmedium vorgelegt. Für die Bestimmung des Blanks wird in die entsprechenden Vertiefungen ΙΟΟμΙ Probenverdünnungsmedium vorgelegt. 12 AT 005 044 Ul
Zur Bestimmung der unbekannten Proben wird in jede entsprechende Vertiefung 90μ1 Probenverdünnungsmedium vorgelegt.
Schritt 5:
Erstellung der Standardreihe:
Die Arbeitlösung (20ng/ml) des Referenzmaterials {rekombinantes humanes ICAM-1) (2°C) wird in Doppelbestimmung in die beiden obersten Vertiefungen auf der linken Seite der Mikrotiterplatte eingebracht (ΙΟΟμΙ/well) . Durch serielle 1:2 Verdünnung in der Platte wird eine Standardreihe hergestellt (lOng/ml; 5ng/ml; 2,5ng/ml; l,25ng/ml; 0,63ng/ml).
Schritt 6:
Einbringung des HRP-Konjugates:
Die Arbeitslösung des HRP-Konjugates (anti-ICAM-1-HRP) wird auf 2°C gekühlt und rasch in alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte eingebracht (50pl/well).
Schritt 7:
Lyophi1is ierung:
Die Mikrotiterplatte wird unmittelbar nach Beschickung mit allen Komponenten mit einer Folie abgedeckt und in die auf -30°C vorgekühlte Gefriertrocknungsanlage eingebracht. Die Lyophilisierung erfolgt ca. 20 Stunden bei -30°C. Die getrocknete Platte wird unmittelbar nach der Entnahme aus der Gefriertrocknungsanlage zusammen mit Trocknungsmittel in eine Aluminiumtasche eingeschweißt. B) Testdurchführung:
Die Platte wird aus der Alurainiumtasche genommen.
Die Standardreihe sowie die Blanks werden durch Zugabe von 150μ1 destilliertem Wasser pro Vertiefung rehydriert, die Probenvertiefungen durch Zugabe von 140μ1 H20. In die Probenvertiefungen werden je 10μ1 der unbekannten Probe aufgetragen. Die Platte wird mit einer Folie abgedeckt und 1 Stunde bei RT inkubiert. Die Platte wird 3mal gewaschen, in jede Vertiefung der Platte wird ΙΟΟμΙ Substratlösung zugegeben. Die Enzymreaktion wird nach 15 Minuten durch die Zugabe der Stopplösung (ΙΟΟμΙ) abgebrochen 13 AT 005 044 Ul und die Farbintensität in den einzelnen Vertiefungen photo-metrisch ausgewertet.
Anwendungsbeispiel 2
Sandwich ELISA zum Nachweis von humanem Interleukin 10 (IL-10)
A) Herstellung der Platten in Verbindung mit Probenverdünnungsmedium, Standardreihe, Biotin-Konjugat, Streptavidin-HRP
Schritt 1:
Beschichtung:
Die 96 well Mikrotiterplatten werden nach dem Stand der Technik mit 5μ5/πι1 anti-IL-10 in PBS Puffer beschichtet (ΙΟΟμΙ pro well, über Nacht Inkubation bei 4°C).
Schritt 2:
Blockierung:
Die Beschichtungslösung wird abgesaugt, die Platte wird einmal mit Waschpuffer gewaschen (PBS/Tween). Zur Absättigung der Polystyroloberfläche (Verhinderung unspezifischer Bindungen) wird die Platte mit 300μ1 pro well PBS/2% BSA blockiert (2h, RT) . Schritt 3:
Fixierung:
Die Blockierungslösung wird abgesaugt, die Platte zweimal gewaschen, pro Well werden 150μ1 PBS/15% Sucrose hinzugefügt. Nach einer Stunde Inkubation bei RT wird die Fixierungslösung dekantiert. Die Platte wird ca. 20 Stunden bei 28°C im Umlufttrockenschrank getrocknet. Die Platte wird auf -20°C eingefroren .
Schritt 4:
Einbringung des Probenverdünnungsmediums:
Die beschichtete Platte wird im gefrorenen Zustand eingesetzt. Das Probenverdünnungsmedium wird auf 2°C gekühlt. Zur Erstellung der Standardreihe wird in den ersten beiden Reihen der Mikrotiterplatte in jede Vertiefung ΙΟΟμΙ Probenverdünnungs-medium vorgelegt. Für die Bestimmung des Blanks wird in die 14 AT 005 044 Ul entsprechenden Vertiefungen ΙΟΟμΙ Probenverdünnungsmedium vorgelegt. Zur Bestimmung der unbekannten Proben wird in jede Vertiefung 50μ1 Probenverdünnungsmedium vorgelegt.
Schritt 5:
Erstellung der Standardreihe:
Die Arbeitlösung (400pg/ml) des Referenzmaterials (rekombinantes humanes IL-10) (2°C) wird in Doppelbestimmung in die beiden obersten Vertiefungen auf der linken Seite der Mikrotiterplatte eingebracht (ΙΟΟμΙ/well). Durch serielle 1:2 Verdünnung in der Platte wird eine Standardreihe hergestellt (200 - 3.1 pg/ml) . Schritt 6:
Einbringung des Biotin-Konjugates und Streptavidin-HRP:
Die Arbeitslösung des Gemisches aus Biotin-Konjugat (anti-lL-10-BT) und Streptavidin-HRP wird auf 2°C gekühlt und rasch in alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte eingebracht (50pl/well).
Schritt 7:
Lyophilisierung:
Die Mikrotiterplatte wird unmittelbar nach Beschickung mit allen Komponenten mit einer Folie abgedeckt und in die auf -30°C vorgekühlte Gefriertrocknungsanlage eingebracht. Die Lyophilisierung erfolgt ca. 20 Stunden bei -30°C. Die getrocknete Platte wird unmittelbar nach der Entnahme aus der Gefriertrocknungs-anlage zusammen mit Trocknungsmittel in eine Aluminiumtasche eingeschweißt. B) Tes tdurchführung:
Die Platte wird aus der Aluminiumtasche genommen.
Die Standardreihe sowie die Blanks werden durch Zugabe von 150μ1 destilliertem Wasser pro Vertiefung rehydriert, die Probenvertiefungen durch Zugabe von ΙΟΟμΙ H20. In die Probenvertiefungen werden je 50μ1 der unbekannten Probe auf getragen. Die Platte wird mit einer Folie abgedeckt und 3 Stunden bei RT inkubiert. Die Platte wird 3mal gewaschen, in jede Vertiefung der Platte wird ΙΟΟμΙ Substratlösung zugegeben. Die Enzymreaktion wird nach 15 Minuten durch die Zugabe der Stopplösung 15 AT 005 044 Ul (ΙΟΟμΙ) abgebrochen und die Farbintensität in den einzelnen Vertiefungen photometrisch ausgewertet.
Anwendungsbeispiel 3
Inverser Sandwich ELISA zum Nachweis von humanem Antikörpern gegen Interferon alpha (iFNa) A) Herstellung der Platten in Verbindung mit Probenverdünnungsmedium, Standardreihe, HRP-Konjugat
Schritt 1:
Beschichtung: Die 96 well Mikrotiterplatten werden nach dem Stand der Technik mit 10pg/ml Streptavidin in PBS Puffer beschichtet (ΙΟΟμΙ pro well, über Nacht Inkubation bei 4°C) . Schritt 2:
Spezifische Beschichtung/Blockierung: Die Streptavidin-Beschich-tungslösung wird abgesaugt, die Platte wird einmal mit Waschpuffer gewaschen (PBS/Tween) . Zur spezifischen Beschichtung der Platte sowie zur Absättigung der Polystyroloberfläche (Verhinderung unspezifischer Bindungen) wird die Platte mit 300μ1 pro well IFNa-Biotin Konjugat, lpg/ml in PBS/2% BSA beschichtet beziehungsweise blockiert (2h, 37°C).
Schritt 3:
Fixierung: Die Beschichtungs/Blockierungslösung wird abgesaugt, die Platte zweimal gewaschen, pro Well werden 150μ1 PBS/15% Sucrose hinzugefügt. Nach einer Stunde Inkubation bei RT wird die Fixierungslösung dekantiert. Die Platte wird ca. 20 Stunden bei 28°C im Umlufttrockenschrank getrocknet. Die Platte wird auf -20°C eingefroren.
Schritt 4:
Einbringung des Probenverdünnungsmediums:
Die beschichtete Platte wird im gefrorenen Zustand eingesetzt. Das Probenverdünnungsmedium wird auf 2°C gekühlt. Zur Erstellung der Standardreihe wird in den ersten beiden Reihen der Mikrotiterplatte in jede Vertiefung ΙΟΟμΙ Probenverdünnungs-medium. vorgelegt. Für die Bestimmung des Blanks wird in die entsprechenden Vertiefungen ΙΟΟμΙ Probenverdünnungsmedium vor- 16 AT 005 044 Ul gelegt. Zur Bestimmung der unbekannten Proben wird in jede Vertiefung 75μ1 Probenverdünnungsmedium vorgelegt.
Schritt 5:
Erstellung der Standardreihe:
Die Arbeitlösung (200ng/ml) des Referenzmaterials (anti human IFNa Antikörper) (2°C) wird in Doppelbestimmung in die beiden obersten Vertiefungen auf der linken Seite der Mikrotiterplatte eingebracht (ΙΟΟμΙ/well). Durch serielle 1:2 Verdünnung in der Platte wird eine Standardreihe hergestellt (100 - l,6ng/ml). Schritt 6:
Einbringung des HRP-Konjugates:
Die Arbeitslösung des HRP-gekoppelten IFNa Proteins wird auf 2°C gekühlt und rasch in alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte eingebracht (50ul/well).
Schritt 7;
Lyophi1is ierung;
Die Mikrotiterplatte wird unmittelbar nach Beschickung mit allen Komponenten mit einer Folie abgedeckt und in die auf -30°C vorgekühlte Gefriertrocknungsanlage eingebracht. Die Lyophilisierung erfolgt ca. 20 Stunden bei -30°C. Die getrocknete Platte wird unmittelbar nach der Entnahme aus der Gefriertrocknungs-anlage zusammen mit Trocknungsmittel in eine Aluminiumtasche eingeschweißt. B) Testdurchführung:
Die Platte wird aus der Aluminiumtasche genommen.
Die Standardreihe sowie die Blanks werden durch Zugabe von 150μ1 destilliertem Wasser pro Vertiefung rehydriert, die Probenvertiefungen durch Zugabe von 125μ1 H20.In die Probenvertiefungen werden je 25μ1 der unbekannten Probe aufgetragen. Die Platte wird mit einer Folie abgedeckt und 2 Stunden bei RT inkubiert.Die Platte wird 3mal gewaschen, in jede Vertiefung der Platte wird 100μ1 Substratlösung zugegeben. Die Enzymreaktion wird nach 15 Minuten durch die Zugabe der Stopplösung (100μ1) abgebrochen und die Farbintensität in den einzelnen Vertiefungen photometrisch ausgewertet. 17 AT 005 044 Ul
Anwendungsbeispiel 4
BioLISA zum Nachweis von humanem Tumor Necrosis Factor alpha (TNFa) (Rezeptor-Liganden Bindung)
A) Herstellung der Platten in Verbindung mit Probenverdünnungsmedium, Standardreihe, Biotin-Konjugat, S treptavidin-HRP
Schritt 1:
Beschichtung:
Die 96 well Mikrotiterplatten werden nach dem Stand der Technik mit lpg/ml rekombinantem TNF-Rezeptor in PBS Puffer beschichtet (ΙΟΟμΙ pro well, über Nacht Inkubation bei 4°C) .
Schritt 2:
Blockierung:
Die Beschichtungslösung wird abgesaugt, die Platte wird einmal mit Waschpuffer gewaschen (PBS/Tween). Zur Absättigung der Polystyroloberfläche (Verhinderung unspezifischer Bindungen) wird die Platte mit 300μ1 pro well PBS/2% BSA blockiert (2h, RT) . Schritt 3:
Fixierung:
Die Blockierungslösung wird abgesaugt, die Platte zweimal gewaschen, pro Well werden 150μ1 PBS/15% Sucrose hinzugefügt. Nach einer Stunde Inkubation bei RT wird die Fixierungslösung dekantiert. Die Platte wird ca. 20 Stunden bei 28°C im Umlufttrockenschrank getrocknet. Die Platte wird auf -20°C eingefroren.
Schritt 4:
Einbringung des Probenverdünnungsmediums:
Die beschichtete Platte wird im gefrorenen Zustand eingesetzt. Das Probenverdünnungsmedium wird auf 2°C gekühlt. Zur Erstellung der Standardreihe wird in den ersten beiden Reihen der Mikrotiterplatte in jede Vertiefung ΙΟΟμΙ Probenverdünnungs-medium vorgelegt. Für die Bestimmung des Blanks wird in die entsprechenden Vertiefungen ΙΟΟμΙ Probenverdünnungsmedium vorgelegt. Zur Bestimmung der unbekannten Proben wird in jede Vertiefung 50μ1 Probenverdünnungsmedium vorgelegt. 18 AT 005 044 Ul
Schritt 5:
Erstellung der Standardreihe:
Die Arbeitlösung (2000pg/ml) des Referenzmaterials (rekombi-nantes humanes TNFa) (2°C) wird in Doppelbestimmung in die beiden obersten Vertiefungen auf der linke Seite der Mikrotiterplatte eingebracht (ΙΟΟμΙ/well). Durch serielle 1:2 Verdünnung in der Platte wird eine Standardreihe hergestellt (1000 -16 pg/ml)
Schritt 6:
Einbringung des Biotin-Konjugates und Streptavidin-HRP:
Die Arbeitslösung des Gemisches aus Biotin-Konjugates (anti-TNFa-BT) und Streptavidin-HRP wird auf 2°C gekühlt und rasch in alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte eingebracht (50pl/well) . Schritt 7:
Lyophilisierung:
Die Mikrotiterplatte wird unmittelbar nach Beschickung mit allen Komponenten mit einer Folie abgedeckt und in die auf -30°C vorgekühlte Gefriertrocknungsanlage eingebracht. Die Lyophilisierung erfolgt ca. 20 Stunden bei -30°C. Die getrocknete Platte wird unmittelbar nach der Entnahme aus der Gefriertrocknungsanlage zusammen mit Trocknungsmittel in Aluminiumtaschen eingeschweißt . B) Testdurchführung:
Die Platte wird aus der Aluminiumtasche genommen.
Die Standardreihe sowie die Blanks werden durch Zugabe von 150μ1 destilliertem Wasser pro Vertiefung rehydriert, die Probenvertiefungen durch Zugabe von ΙΟΟμΙ H20. In die Probenvertiefungen werden je 50μ1 der unbekannten Probe aufgetragen. Die Platte wird mit einer Folie abgedeckt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platte wird 3mal gewaschen, in jede Vertiefung der Platte wird ΙΟΟμΙ Substratlösung zugegeben. Die Enzymreaktion wird nach 15 Minuten durch die Zugabe der Stopplösung (ΙΟΟμΙ) abgebrochen und die Farbintensität in den einzelnen Vertiefungen photometrisch ausgewertet. 19
Claims (5)
- AT 005 044 Ul Ansprüche : 1. Immun-Test-Kit für die qualitative und quantitative Bestimmung einer Probe durch spezifische Bindungspartner wie z.B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren und Liganden, mit einer Träger- bzw. einer Mikrotiterplatte mit einer Mehrzahl von Vertiefungen, wobei der Träger bzw. die Mikrotiterplatte mit einem primären Bindungspartner vorbeschichtet ist und der Bindungspartner fixiert als Lyophilisat vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Teil der Vertiefungen der Mikrotiterplatte zusätzlich eine Referenzstandardreihe der zu bestimmenden Probe mit inkrementeller Verdünnung in lyophilisierter Form vorliegt.
- 2. Immun-Test-Kit, dadurch gekennzeichnet, daß die Vertiefungen der Mikrotiterplatte zusätzlich ein Enzym- oder Biotin-gekoppeltes Konjugat eines Sekundärbindungspartners, insbesondere -antikörpers, und im Fall des Biotin-gekoppelten Konjugates ein Enzym in lyophilisierter Form enthalten.
- 3. Immun-Test-Kit, dadurch gekennzeichnet, daß die Vertiefungen der Mikrotiterplatte ein Probenverdünnungsmedium in lyophilisierter Form enthalten.
- 4. Immun-Test-Kit, dadurch gekennzeichnet, daß der Test-Kit zusätzlich zur vorbeschichteten Mikrotiterplatte lediglich Waschpuffer, Substratlösung und Stopplösung enthält.
- 5. Immun-Test-Kit, dadurch gekennzeichnet, daß im Falle von Biotin-gekoppeltem Sekundärantikörper-Konjugat als Sekundärreagenz Streptavidin - Horse Radish Peroxidase (HRP) eingesetzt ist. 20
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