CN106645454B - 精浆中特发性男性不育诊断标志物丝氨酸与山梨醇及其检测方法和应用 - Google Patents
精浆中特发性男性不育诊断标志物丝氨酸与山梨醇及其检测方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分析化学及临床医学领域,公开了精浆中特发性男性不育诊断标志物丝氨酸与山梨醇及其检测方法和应用。该标志物为丝氨酸和/或山梨醇,采用UPLC‑Qexactive MS方法检测,该标志物可用于特发性男性不育的辅助诊断与监测,具有较高的灵敏度和特异度,具有临床推广价值。
Description
发明领域
本发明属于分析化学及临床医学领域,涉及精浆中特发性男性不育诊断标志物丝氨酸与山梨醇及其基于UPLC-Q exactive MS的检测方法和应用。
背景技术
1988年,WHO首次提出了生殖健康的概念,即人类及其个体在整个生命过程中与生殖相关的机体的结构、功能和行为过程中的生理、心理和社会的完满和谐的健康状态。目前,全球约有10-15%的育龄夫妇患有生育障碍。我国由于人口基数大,新婚夫妇中不孕不育的患者人数远超过百万,其中男性因素导致的不育高于50%。目前的研究认为遗传因素如Y染色体AZF基因区域序列改变、DAZ基因拷贝数改变、性激素受体基因序列改变等。环境因素如有害因素暴露、营养和生活习惯等均与男性不育有关。值得注意的是,男性不育有相当一部分表现为无法解释病因,这使得诊断特发性男性不育变得极为困难,也贻误了治疗时机。男性不育的WHO的诊断标准是夫妻婚后同居1年以上,未采取避孕措施,由于男方原因造成女方不孕者。然而,同居长达1年的观察时间,大大耽误了对男性不育进行早期治疗和干预的时间;很多夫妻并不能保证严格的同居1年,使得最后的男性不育判断变得非常困难;为了排除女方原因,女方还需要进行详细的检查,带来了沉重的经济和医疗负担。现有的男性不育相关检查依赖的是传统的精液常规检查,它只关注精子数量、活力、精液量、pH和液化时间等常规参数。因为受到禁欲时间等因素的影响,常规精液参数常规分析结果表现为较大的波动性。因而,临床诊断往往需要参考多次精液常规分析。更为重要的是,传统的精液参数检查不能全面地反应精液的全部状况。因此,男性不育经常表现为常规精液参数无明显异常,也使得传统的精液参数检查并不能有效诊断男性不育。因而,临床上亟需用于特发性男性不育的新的诊断方法。
代谢组学(metabonomics)是以组群指标分析为基础,以高通量检测和数据处理为手段,以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支,是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后系统生物学的新的另一重要研究领域,它是研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢产物变化的科学,所关注的是代谢循环中分子量小于1000的小分子代谢物的变化,反映的是机体在疾病状态或环境刺激下的应答变化。代谢组学在复杂疾病的诊断中表现出极高的应用潜力和价值,由于其分析的样本可以为血液尿液各种体液这些无创和低创的样本,可大大提高病人的依从性,且具有灵敏度高稳定的特点。男性不育的根本原因是精液的问题。精浆作为精液的液体成分可以很好地反映精液的质量改变,而且具有无创,容易采集的优点。然而,采用代谢组学分析精浆代谢小分子在特发性男性不育的诊断监测中的应用还未得到相应的关注。
目前代谢组学研究常用技术包括液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气象色谱-质谱联用(GC-MS)及核磁共振技术(NMR)。核磁共振技术特点是对待测组分无破坏,样本前处理简单,但灵敏度较低;气相色谱-质谱联用具有较好的灵敏度和重现性,但一般要采用衍生化方法对样本进行前处理,使得实验步骤变得复杂。而LC-MS具有样本处理简单,灵敏度高,临床实用性强的特点。UPLC-Q exactive MS是新一代高分辨质谱与超高效液相的组合,具有相比传统LC-MS更强的灵敏度、特异度和稳定性。故而采用UPLC-Q exactive MSS进行精浆代谢小分子的代谢组学分析,若能发现稳定的与特发性男性不育发病相关的特异精浆代谢小分子作为生物标志物,并研发相应的代谢小分子标志的UPLC-Q exactive MS检测方法,将为男性生殖健康做出巨大贡献。
发明内容
本发明的目的是提供精浆中与特发性男性不育相关的诊断标志物。
本发明另一个目的是提供上述诊断标志物的检测方法。
本发明再有一个目的是提供检测上述诊断标志物的试剂盒。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的:
精浆中与特发性男性不育相关的诊断标志物,该标志物为丝氨酸和/或山梨醇。
所述的诊断标志物在制备特发性男性不育诊断或监测试剂中的应用。
一种诊断或监测特发性男性不育的试剂盒,该试剂盒含有检测精浆中丝氨酸和/或山梨醇的试剂。
所述的试剂盒,该试剂盒含有采用UPLC-Q exactive MS方法检测精浆中丝氨酸和/或山梨醇的试剂。
所述的试剂盒,该试剂盒含有下列试剂:
丝氨酸和/或山梨醇标准品;
内标A:肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸中一种或多种物质的同位素内标(氘标,水溶液);
内标B:十五烷酸的同位素内标(氘标,甲醇溶液);
内标C:二十四烷酸的同位素内标(氘标,甲醇溶液)。
所述的试剂盒,该试剂盒还含有:
Hypersil GOLD C18色谱柱;
试剂A:沉淀蛋白用,含100%甲醇;
试剂B:流动相用,含0.1%的甲酸的水;
试剂C:流动相用,含0.1%的甲酸的乙腈;
试剂D:复溶用,超纯水。
一种检测上述的精浆中与特发性男性不育相关的诊断标志物的方法,该方法采用UPLC-Q exactive MS方法,检测精浆中丝氨酸和/或山梨醇含量。
该方法中:
一、液相条件:
液相色谱柱为Hypersil GOLD C18色谱柱,柱温为40℃;
流动相A为含0.1%甲酸的水,流动相B为含0.1%甲酸的乙腈,流速为400μL/min;
仪器梯度为:0-3min 1%B,3-10min 1%到99%B,10-13min 99%B,13-13.1min99%到1%B,13.1-17min 1%B;(B指流动相B,各梯度中流动相A的量与对应的流动相B的量共100%,下同)
进样方式:体积5μl;
二、质谱条件
采用加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析,正离子模式喷雾电压:3.5kV;负离子模式喷雾电压:2.5kV;两种模式下毛细管温度:250℃,加热器温度:425℃,鞘气气流:50AU,辅助气气流:13AU,反吹气气流:0AU;透镜电压:60V;采用全扫模式,扫描范围:70到1050m/z;分辨率:70000。
上述丝氨酸优选为L-丝氨酸。
本发明详细描述如下:
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的精浆样本,系统收集完整的人群基础信息和临床资料,并采用了基于UPLC-Q exactive MS的代谢组学方法进行分析。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分:
一、研究对象选择和分组依据
第一阶段 筛选阶段
随机纳入明确诊断的特发性男性不育148人和健康对照148人,共296人。
A组:健康对照组(148人):
1.年龄在19至39岁之间;
2.体质指数在17至31之间;
3.生殖能力健康的男性,而且6-8个月后有了健康的后代;
4.无全身重大疾病。
B组:特发性男性不育疾病组(148人):
1.年龄与对照组匹配;
2.体质指数与对照组匹配
3.尝试怀孕12个月没有成功,而配偶没有不孕疾病的男性;。
4.无明确男性不育病因;
5.吸烟饮酒史与对照组匹配;
6.民族与对照组匹配;
7.无全身重大疾病。
第二阶段 验证阶段
纳入明确诊断的特发性男性不育15人和健康对照15人,共30人。
A组:健康对照组(15人):
1.年龄在24到36岁之间;
2.体质指数在19至24之间;
3.生殖能力健康的男性,而且6-8个月后有了健康的后代;
4.无全身重大疾病。
B组:特发性男性不育疾病组(15人):
1.年龄与对照组匹配;
2.体质指数与对照组匹配;
3.尝试怀孕12个月没有成功,而配偶没有不孕疾病的男性;
4.无明确男性不育病因;
5.吸烟饮酒史与对照组匹配;
6.民族与对照组匹配;
7.无全身重大疾病。
二、UPLC-Q exactive MS代谢组学分析和特发性男性不育诊断用L-丝氨酸和山梨醇筛选和验证
1.样本前处理
1.1.取10μL精浆、加入10μL内标A,加入10μL内标B,加入10μL内标C,加入甲醇(试剂A)40μL,涡旋30s,沉淀蛋白。
1.2.离心机中4℃16000g离心15min,将上清液转移至1.5mL进口EP管,并将上清液在室温条件下于离心浓缩干燥仪中浓缩至干。
1.3.用10μL超纯水(试剂D)复溶,待分析。
2.仪器检测
2.1.分析仪器:UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色谱仪;Q-Exactive高分辨质谱仪。
2.2.液相条件:
2.2.1液相色谱柱为Hypersil GOLD C18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.9μm,Thermo Scientific,Germany),柱温为40℃。
2.2.2采用的流动相A为含0.1%甲酸的水(试剂B)和流动相B为含0.1%甲酸的乙腈(试剂C),流速为400μL/min。
2.2.3仪器梯度为:0-3min 1%B,3-10min 1%到99%B,10-13min 99%B,13-13.1min99%到1%B,13.1-17min 1%B。
2.2.4进样方式:体积5μl。
2.3.质谱条件
2.3.1加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析。
2.3.2采用加热电喷雾电离方式(HESI),正离子模式喷雾电压:3.5kV;负离子模式喷雾电压:2.5kV;两种模式下毛细管温度:250℃,加热器温度:425℃,鞘气气流:50AU,辅助气气流:13AU,反吹气气流:0AU;透镜电压:60V。采用全扫模式,扫描范围:70到1050m/z;分辨率:70000。
3.物质定性
代谢小分子定性采用与标准品L-丝氨酸和山梨醇比对色谱信息(保留时间)和质谱信息(精确分子量),并实时比对样本中同位素内标标准品系列的色谱信息以校正保留时间。
4.数据分析:
生物标志物筛选采用多元Logistic回归确认关键代谢物。
5.健康对照组、特发性男性不育组精浆样本中代谢小分子的差异和诊断意义。
经过校正年龄、体质指数、吸烟和饮酒史的信息,多元Logistic回归分析发现精浆L-丝氨酸和山梨醇的含量与特发性男性不育有关。采用随机人群应用上述代谢小分子组合诊断特发性男性不育,灵敏度为86.67%,特异度为93.33%,ROC曲线下面积为0.9778,具有较高的诊断价值。
三、诊断试剂盒制备方法
根据上述一系列实验结果,本发明人还制备了一种能用于特发性男性不育动态监测的诊断试剂盒,所述诊断试剂盒包含测定受试者精浆中稳定存在且可检测的L-丝氨酸和山梨醇的标准品以及辅助分析的内标标准品系列。诊断试剂盒还包括一套精浆代谢小分子提取及色谱分离用试剂及器材。
本发明的有益效果:
本发明人通过采用UPLC-Q exactive MS比较正常对照和特发性男性不育精浆中的代谢小分子,发现了精浆中存在可用于评估是否患有特发性男性不育,具有辅助诊断价值的L-丝氨酸和山梨醇组合,以及该L-丝氨酸和山梨醇检测的UPLC-Q exactive MS的应用,研制出可便于临床应用的特发性男性不育诊断、监测试剂盒。
本发明采用精浆代谢小分子作为特发性男性不育评价的标志物的优越性在于:
(1)精浆代谢小分子是一种新型生物标志物,其与疾病结局关联强,不仅稳定、无创、易于检测,且定量精确,将大大提高特发性男性不育诊断的敏感性和特异性,该类小分子生物标志物的成功开发将为特发性男性不育的防治开创全新局面,为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)本发明提供的L-丝氨酸和山梨醇可用作特发性男性不育的诊断标志物,为临床医生进一步深入检查提供依据,为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持,延缓和阻止疾病进展。
(3)本发明采用特发性男性不育和健康对照随机人群的精浆样本进行验证,证明了精浆中L-丝氨酸和山梨醇水平在诊断特发性男性不育中具有较高灵敏度和特异度,可作为标志物使用。
(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系,初期通过预实验筛选多种精浆代谢小分子,应用UPLC-Q exactive MS进行独立人群验证,保证了该精浆代谢生物标志物和诊断方法的可靠性。
(5)UPLC-Q exactive MS技术样本处理简单,仪器分析迅速准确,具有较高的临床诊断实用价值。
附图说明
图1.筛选阶段,经过校正年龄、体质指数、吸烟和饮酒史的信息,多元Logistic回归分析发现精浆L-丝氨酸和山梨醇的含量与特发性男性不育密切相关。a未调整混杂因素的单因素Logistic回归结果。b调整年龄、体质指数、吸烟和饮酒史后的多元Logistic回归结果。
图2.代谢小分子检测水平波动性(均数±标准差)。
图3.验证阶段,采用精浆L-丝氨酸含量信息制作的正常对照组和特发性男性不育组之间的ROC曲线。
图4.验证阶段,采用精浆山梨醇含量信息制作的正常对照组和特发性男性不育组之间的ROC曲线。
图5.验证阶段,采用精浆L-丝氨酸和山梨醇含量信息制作的正常对照组和特发性男性不育组之间的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1:研究对象选择和分组依据
本部分研究对象来自南京医科大学附属医院的首诊特发性男性不育病例及健康生育对照。研究内容和知情同意书均得到南京医科大学伦理委员会的批准,符合相关法规的要求。病例和对照在了解内容后签署了知情同意书。所有研究对象均进行了完整的体格检查,并完成了一份包括个人基础资料、生活习惯、职业和环境暴露、遗传危险因素、性功能与生殖功能、疾病史和体力活动的调查问卷。第一阶段纳入了符合要求的148例特发性男性不育病例和148例健康对照;第二阶段符合要求的15例特发性男性不育病例和15例健康对照作为特发性男性不育精浆代谢小分子生物标志物的筛选实验对象。具体的样品归类标准如下:
第一阶段筛选阶段
随机纳入明确诊断的特发性男性不育148人和健康对照148人,共296人。
A组:健康对照组(148人):
1.年龄在19至39岁之间;
2.体质指数在17至31之间;
3.生殖能力健康的男性,而且6-8个月后有了健康的后代;
4.无全身重大疾病。
B组:特发性男性不育疾病组(148人):
1.年龄与对照组匹配;
2.体质指数与对照组匹配
3.尝试怀孕12个月没有成功,而配偶没有不孕疾病的男性;。
4.无明确男性不育病因;
5.吸烟饮酒史与对照组匹配;
6.民族与对照组匹配;
7.无全身重大疾病。
第二阶段验证阶段
纳入明确诊断的特发性男性不育15人和健康对照15人,共30人。
A组:健康对照组(15人):
1.年龄在24到36岁之间;
2.体质指数在19至24之间;
3.生殖能力健康的男性,而且6-8个月后有了健康的后代;
4.无全身重大疾病。
B组:特发性男性不育疾病组(15人):
1.年龄与对照组匹配;
2.体质指数与对照组匹配;
3.尝试怀孕12个月没有成功,而配偶没有不孕疾病的男性;
4.无明确男性不育病因;
5.吸烟饮酒史与对照组匹配;
6.民族与对照组匹配;
7.无全身重大疾病。
实施例2:UPLC-MS代谢组学特发性男性不育L-丝氨酸和山梨醇筛选
1.样本前处理
1.1.取10μL精浆、加入10μL内标A,加入10μL内标B,加入10μL内标C,加入甲醇(试剂A)40μL,涡旋30s,沉淀蛋白。
1.2.离心机中4℃16000g离心15min,将上清液转移至1.5mL进口EP管,并将上清液在室温条件下于离心浓缩干燥仪中浓缩至干。
1.3.用10μL超纯水(试剂D)复溶,待分析。
2.仪器检测
2.1.分析仪器:UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色谱仪;Q-Exactive高分辨质谱仪。
2.2.液相条件:
2.2.1液相色谱柱为Hypersil GOLD C18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.9μm,Thermo Scientific,Germany),柱温为40℃。
2.2.2采用的流动相A为含0.1%甲酸的水(试剂B)和流动相B为含0.1%甲酸的乙腈(试剂C),流速为400μL/min。
2.2.3仪器梯度为:0-3min 1%B,3-10min 1%到99%B,10-13min 99%B,13-13.1min99%到1%B,13.1-17min 1%B。
2.2.4进样方式:体积5μl。
2.3.质谱条件
2.3.1加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析。
2.3.2采用加热电喷雾电离方式(HESI),正离子模式喷雾电压:3.5kV;负离子模式喷雾电压:2.5kV;两种模式下毛细管温度:250℃,加热器温度:425℃,鞘气气流:50AU,辅助气气流:13AU,反吹气气流:0AU;透镜电压:60V。采用全扫模式,扫描范围:70到1050m/z;分辨率:70000。
3.物质定性
代谢小分子定性采用与标准品L-丝氨酸和山梨醇比对色谱信息(保留时间)和质谱信息(精确分子量),并实时比对样本中同位素内标标准品系列的色谱信息以校正保留时间。
4.数据分析:
生物标志物筛选采用多元Logistic回归确认关键代谢物。
5.健康对照组、特发性男性不育组精浆样本中代谢小分子的差异和诊断意义。
经过校正年龄、体质指数、吸烟和饮酒史的信息,多元Logistic回归分析发现精浆L-丝氨酸和山梨醇的含量与特发性男性不育密切相关(图1)。
实施例3:精浆L-丝氨酸和山梨醇的稳定性分析
采用实施例2的方法对精浆L-丝氨酸和山梨醇水平的稳定性进行评价(间隔时间为2周)。结果显示,精浆中L-丝氨酸和山梨醇测定水平稳定(图2),具备作为诊断/监测标志物的特性。
实施例4:L-丝氨酸和山梨醇组合对特发性男性不育的诊断
根据上述UPLC-Q exactive MS代谢组学方法,本发明人通过对随机人群15病例和15对照的精浆样品检测L-丝氨酸和山梨醇,以此绘制ROC曲线并评估预测的灵敏性和特异性,进而评估检测精浆中这2个代谢小分子水平对特发性男性不育的评估能力。
L-丝氨酸的灵敏度为73.33%,特异度为86.67%,ROC曲线下面积为0.8711;山梨醇灵敏度为73.33%,特异度为80.00%,ROC曲线下面积为0.8400。
组合L-丝氨酸和山梨醇的灵敏度为86.67%,特异度为93.33%,ROC曲线下面积为0.9778。
故而组合L-丝氨酸和山梨醇具有较好地诊断特发性男性不育的能力。
实施例5:用于特发性男性不育精浆L-丝氨酸和山梨醇检测和诊断试剂盒的制作
首先通过UPLC-Q exactive MS的方法确定正常对照和特发性男性不育精浆中具有较高丰度的代谢小分子。然后,在其中通过基于UPLC-Q exactive MS的代谢组学技术筛选与特发性男性不育相关的代谢小分子,作为是否为特发性男性不育的诊断指标。最后将筛选出的对应精浆代谢小分子的数量控制在2个,这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批精浆代谢小分子检测用试剂和耗材,其中代谢小分子的定性和定量采用L-丝氨酸和山梨醇的标准品,辅助分析采用内标A:肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸八种物质的氘标同位素内标。内标B:十五烷酸的氘标同位素内标。内标C:二十四烷酸的氘标同位素内标。其它还有用于UPLC色谱分离的配套反向色谱柱(Hypersil GOLD C18色谱柱,100mm×2.1mm,粒径1.9μm)、用于沉淀精浆蛋白的试剂(100%甲醇),用于流动相的试剂(含0.1%的甲酸的水和含0.1%的甲酸的乙腈),用于提取代谢小分子的试剂(100%超纯水)。此试剂盒的价值在于只需要10μl精浆,即可检测L-丝氨酸和山梨醇的含量,再通过含量诊断特发性男性不育,并易于进行动态监测和观察治疗效果。
具体试剂盒组成如下:
L-丝氨酸标准品
山梨醇标准品
内标A(肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸八种物质的氘标同位素内标水溶液)
内标B(十五烷酸的氘标同位素内标甲醇溶液)
内标C(二十四烷酸的氘标同位素内标甲醇溶液)
进一步,还可以含有:
色谱柱(Thermo 100mm×2.1mm,粒径1.9μm,Hypersil GOLD C18色谱柱)
试剂A(100%甲醇)
试剂B(含0.1%的甲酸的水)
试剂C(含0.1%的甲酸的乙腈)
试剂D(100%超纯水)。
主要参考文献
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Claims (1)
1.精浆中与特发性男性不育相关的诊断标志物在制备特发性男性不育诊断或监测试剂中的应用,所述标志物为丝氨酸和山梨醇。
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