CN114414694B - 一种无精子症有关的分子标志物及其检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种无精子症有关的分子标志物及其检测方法和应用，属于分析化学及临床医学技术领域。本发明通过采用UPLC‑Qexactive MS比较正常对照和无精子症精液中的代谢小分子，发现了精液中存在可用于评估是否患有无精子症的具有诊断价值的1,3‑二羟基丙‑2‑基十五烷酸酯，以及检测该物质的UPLC‑Q exactive MS的应用，研制出可便于临床应用的无精子症诊断、监测试剂盒。代谢小分子是一种新型生物标志物，其与疾病结局关联强、稳定、无创、易于检测、定量精确。本发明提供的1,3‑二羟基丙‑2‑基十五烷酸酯可用作无精子症的诊断标志物，为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

Description

一种无精子症有关的分子标志物及其检测方法和应用
技术领域
本发明涉及一种无精子症有关的分子标志物及其检测方法和应用，属于分析化学及临床医学技术领域。
背景技术
1988年，世界卫生组织(WHO)首次提出了生殖健康的概念，即人类及其个体在整个生命过程中与生殖相关的机体的结构、功能和行为过程中的生理、心理和社会的完满和谐的健康状态。不孕不育是全球普遍存在的夫妻之间的问题，据估计有4-17%的夫妻会就诊以纠正他们的不孕不育，但通常认为，更多的不孕不育夫妇不会去诊疗。调查显示，男性因素为主要或唯一因素的占不孕不育原因的20-50%左右。无精子症的发生率占男性不育症的10%-20%。WHO对男性不育的标准是夫妻婚后同居1年以上，未采取避孕措施，由于男方原因造成女方不孕者。无精子症的临床诊断往往需要参考多次精液常规分析。更为重要的是,传统的精液参数检查不能全面地反映精液的全部状况。因此,男性不育经常表现为常规精液参数无明显异常,也使得传统的精液参数检查并不能有效诊断男性不育。因而,临床上亟需用于特发性男性不育的新的诊断方法。
代谢组学是一种新兴的技术,可以用于疾病诊断的生物标志的发现并且可以揭示疾病发生的机制。代谢组学揭示了发生在基因、转录和蛋白层面之下的分子事件,被认为是最近接近疾病表型的组学。目前,无精子症的精浆代谢组改变仍然未知,精浆调节了精液的化学成分,是一种无创伤的样本,特别适合用来发现无精子症诊断和机制研究的生物标志。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种与无精子症提供相关的分子标志物。
本发明另一个目的是为将分子标志物1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯用于无精子症诊断提供基于UPLC-Q exactive MS的应用。
本发明再有一个目的是为上述分子标志物1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯提供色谱质谱用检测和诊断试剂盒。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种无精子症有关的分子标志物，所述分子标志物为1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯。
本发明还提供一种如上所述的分子标志物在制备无精子症诊断或监测试剂中的应用。
本发明再提供一种如上所述的分子标志物制备的无精子症诊断或监测试剂盒，包括：
1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯标准品；
内标A：肌酐﹑缬氨酸、烟酸、胸腺密啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸八种物质的氛标同位素内标；
内标B：十五烷酸的氩标同位素内标；
内标C：二十四烷酸的氛标同位素内标、配套Hypersil GOLDC18色谱柱：100mm×2.1mm，粒径1.9μm ThermoScientific，Germany；
试剂A：含100%甲醇；
试剂B：含0.1%的甲酸的水；
试剂C：含0.1%的甲酸的乙腈；
试剂D：超纯水。
本发明又提供一种无精子症诊断或监测的UPLC-Q exactive MS的方法，所述方法检测精液中的如权利要求1中所述分子1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
与人类无精子症相关的1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯，采用UPLC-Q exactiveMS方法检测上述代谢小分子进行无精子症的早期诊断。
所述的检测和诊断试剂盒，该试剂盒含有1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯标准品。内标A：肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺密啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸八种物质的氩标同位素内标。内标B：十五烷酸的氛标同位素内标。内标C：二十四烷酸的氛标同位素内标。配套Hypersil GOLD C18色谱柱(100mm×2.1mm，粒径1.9μm ThermoScientific,Germany)、试剂A(沉淀蛋白用，含100%甲醇)、试剂B(流动相用，含0.1%的甲酸的水)、试剂C(流动相用，含0.1%的甲酸的乙腈)，试剂D(复溶用，超纯水)。
本发明详细描述如下：
以标准操作程序(SOP)采集符合标准的精液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于UPLC-Q exactive MS的代谢组学方法进行分析。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
一、研究对象选择和分组依据
纳入明确诊断的包括梗阻和非梗阻类型的无精子症80人和健康对照116人，共196人。
A组：健康对照组(80人)：
1.年龄在24至36岁之间；
2.体质指数在19至24之间；
3.生殖能力健康的男性，而且5-8个月后有了健康的后代；
4.无全身重大疾病。
B组：无精子症疾病组(116人)：
1.年龄与对照组匹配；
2.体质指数与对照组匹配；
3.尝试怀孕12个月没有成功，而配偶没有不孕疾病的男性；
4.明确患有无精子症；
5.吸烟饮酒史与对照组匹配；
6.民族与对照组匹配；
7.无全身重大疾病。
二、UPLC-Q exactive MS代谢组学分析和无精子症诊断用1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯筛选和验证
1.样本前处理
1.1.取100μL精液、加入10μL内标A，加入10μL内标B，加入10μL内标C，加入甲醇(试剂A)310μL，涡旋30s，沉淀蛋白。
1.2.离心机中4℃20000g离心15min，将上清液转移至1.5mL进口EP管，并将上清液在室温条件下于离心浓缩干燥仪中浓缩至干。
1.3.用20μL超纯水(试剂D)复溶，待分析。
2.仪器检测
2.1.分析仪器：UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色谱仪；Q-Exactive高分辨质谱仪。
2.2.液相条件：
2.2.1液相色谱柱为Hypersil GOLD C18色谱柱(100mm×2.1mm，粒径1.9μm，Thermo Scientific,Germany)，柱温为40℃。
2.2.2采用的流动相为(A)含0.1%甲酸的水(试剂B)和(B)含0.1%甲酸的乙腈(试剂C)，流速为400μL/min。
2.2.3仪器梯度为：0-3min 1%流动相(B)，3-10min 1%到99%流动相(B)，10-13min99%流动相(B)，13-13.1min 99%到1%流动相(B)，13.1-17min 1%流动相(B)。
2.2.4进样方式：体积10μL。
2.3.质谱条件
2.3.1加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析。
2.3.2采用加热电喷雾电离方式(HESI)，正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V。采用全扫模式，扫描范围：70到1050m/z；分辨率：70000。
3.物质定性
代谢小分子定性采用与标准品1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯比对色谱信息(保留时间)和质谱信息(精确分子量)，并实时比对样本中同位素内标标准品系列的色谱信息以校正保留时间。
4.数据分析：
生物标志物筛选采用异方差T检验确认关键代谢物。健康对照组和无精子症精液中1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯含量差异P值为2.35×10-27。
5.健康对照组、无精子症组精液样本中代谢小分子的差异和诊断意义。
分析发现精液1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯的含量与无精子症有关。采用随机人群应用上述代谢小分子诊断无精子症，1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯的灵敏度为97.5%，特异度为91.4%，ROC曲线下面积为0.957，具有较高的诊断价值。
三、诊断试剂盒制备方法
根据上述一系列实验结果，还制备了一种能用于无精子症动态监测的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者精液中稳定存在且可检测的1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯的标准品以及辅助分析的内标标准品系列。诊断试剂盒还包括一套精液代谢小分子提取及色谱分离用试剂及器材。
本发明的有益效果在于：通过采用UPLC-Q exactive MS比较正常对照和无精子症精液中的代谢小分子，发现了精液中存在可用于评估是否患有无精子症，具有诊断价值的1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯，以及该1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯检测的UPLC-Qexactive MS的应用，研制出可便于临床应用的无精子症诊断、监测试剂盒。
本发明采用代谢小分子1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯作为无精子症评价的标志物的优越性在于：
(1)代谢小分子是一种新型生物标志物，其与疾病结局关联强，不仅稳定、无创、易于检测，且定量精确，将大大提高无精子症诊断的敏感性和特异性，该类小分子生物标志物的成功开发将为无精子症的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)本发明提供的1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯可用作无精子症的诊断标志物，为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。
(3)本发明采用无精子症和健康对照随机人群的精液样本进行验证，证明了精液中1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯水平在诊断无精子症中具有较高灵敏度和特异度，可作为标志物使用。
(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种代谢小分子，应用UPLC-Q exactive MS进行独立人群验证，保证了该代谢生物标志物和诊断方法的可靠性。
(5)UPLC-Q exactive MS技术样本处理简单，仪器分析迅速准确，具有较高的临床诊断实用价值。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1采用1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯含量信息制作的正常对照组和无精症之间的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1 研究对象选择和分组依据
本部分研究对象来自南京医科大学附属医院和中山大学附属第六医院生殖医学中心的首诊无精子症病例及精液常规参数正常对照。研究内容和知情同意书均得到南京医科大学伦理委员会的批准，符合相关法规的要求。病例和对照在了解内容后签署了知情同意书.所有研究对象均进行了完整的体格检查，并完成了一份包括个人基础资料、生活习惯、职业和环境暴露、遗传危险因素、性功能与生殖功能﹑疾病史和体力活动的调查问卷。具体的样品归类标准如下：
纳入明确诊断的包括梗阻和非梗阻类型的无精子症62人和健康对照84人，共146人。
A组：健康对照组(84人)：
1.年龄在24至36岁之间；
2.体质指数在19至24之间；
3.生殖能力健康的男性，而且5-8个月后有了健康的后代；
4.无全身重大疾病。
B组：无精子症疾病组(62人)：
1.年龄与对照组匹配；
2.体质指数与对照组匹配；
3.尝试怀孕12个月没有成功，而配偶没有不孕疾病的男性；
4.明确患有无精子症；
5.吸烟饮酒史与对照组匹配；
6.民族与对照组匹配；
7.无全身重大疾病。
实施例2 UPLC-MS代谢组学无精子症1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯筛选
1.样本前处理
1.1.取10μL精液、加入10μL内标A，加入10μL内标B，加入10μL内标C，加入甲醇(试剂A)40μL，涡旋30s，沉淀蛋白。
1.2.离心机中4℃16000g离心15min，将上清液转移至1.5mL进口EP管，并将上清液在室温条件下于离心浓缩干燥仪中浓缩至干。
1.3.用10μL超纯水(试剂D)复溶，待分析。
2.仪器检测
2.1.分析仪器：UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色谱仪；Q-Exactive高分辨质谱仪。
2.2.液相条件：
2.2.1液相色谱柱为Hypersil GOLD C18色谱柱(100mm×2.1mm，粒径1.9μm，Thermo Scientific,Germany)，柱温为40℃。
2.2.2采用的流动相为(A)含0.1%甲酸的水(试剂B)和(B)含0.1%甲酸的乙腈(试剂C)，流速为400μL/min。
2.2.3仪器梯度为：0-3min 1%B，3-10min 1%到99%B，10-13min99%B，13-13.1min99%到1%B，13.1-17min 1%B。
2.2.4进样方式：体积5μL。
2.3.质谱条件
2.3.1加热电喷雾电离方式(HESI)进行分析。
2.3.2采用加热电喷雾电离方式(HESI)，正离子模式喷雾电压：3.5kV；负离子模式喷雾电压：2.5kV；两种模式下毛细管温度：250℃，加热器温度：425℃，鞘气气流：50AU，辅助气气流：13AU，反吹气气流：0AU；透镜电压：60V。采用全扫模式，扫描范围：70到1050m/z；分辨率：70000。
3.物质定性
代谢小分子定性采用与标准品1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯比对色谱信息(保留时间)和质谱信息(精确分子量)，并实时比对样本中同位素内标标准品系列的色谱信息以校正保留时间。
4.数据分析：
生物标志物筛选采用异方差T检验确认关键代谢物。健康对照组和无精子症精液中1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯含量差异P值为2.35×10-27。
实施例3 1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯对无精子症的诊断
根据上述UPLC-Q exactive MS代谢组学方法，本发明人通过对62病例和84对照的精液样品检测1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯﹐以此绘制ROC曲线并评估预测的灵敏性和特异性，进而评估检测精液中该代谢小分子水平对无精子症的评估能力。
请参见图1，1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯的灵敏度为96.3%，特异度为91.4%，ROC曲线下面积为0.965，故而1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯具有较好地诊断无精子症的能力。
实施例4 用于无精子症精液1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯检测和诊断试剂盒的制作
首先通过UPLC-Q exactive MS的方法确定正常对照和无精子症精液中具有较高丰度的代谢小分子。然后，在其中通过基于UPLC-Q exactive MS的代谢组学技术筛选与无精子症相关的代谢小分子，作为是否为无精子症的诊断指标。最后将筛选出的对应代谢小分子的数量控制在1个，这是在预实验的基础上做出的最优化的精简。此试剂盒包括一批代谢小分子检测用试剂和耗材，其中代谢小分子的定性和定量采用1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯的标准品，辅助分析采用内标A：肌酐、缬氨酸﹑烟酸、胸腺咤啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸八种物质的'标同位素内标。内标B：十五烷酸的氛标同位素内标。内标C：二十四烷酸的氛标同位素内标。其它还有用于UPLC色谱分离的配套反向色谱柱(Hypersil GOLD C18色谱柱，100mm×2.1mm，粒径1.9μm)、用于沉淀蛋白的试剂(100%甲醇)，用于流动相的试剂(含0.1%的甲酸的水和含0.1%的甲酸的乙腈)，用于提取代谢小分子的试剂(100%超纯水)。此试剂盒的价值在于只需要10μL精液，即可检测1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯的含量，再通过含量诊断无精子症，并易于进行动态监测和观察治疗效果。
具体试剂盒组成如下：
1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯标准品；
内标A(肌酐、缬氨酸、烟酸、胸腺咤啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰对氨基酚、马尿酸八种物质的氛标同位素内标水溶液)；
内标B(十五烷酸的氛标同位素内标甲醇溶液)；
内标C(二十四烷酸的氛标同位素内标甲醇溶液)；
进一步，还可以含有：
色谱柱(Thermo 100mm×2.1mm，粒径1.9μm，Hypersil GOLD C18色谱柱)；
试剂A(100%甲醇)；
试剂B(含0.1%的甲酸的水)；
试剂C(含0.1%的甲酸的乙腈)；
试剂D(100%超纯水)。
在另一实施例中，以标准操作程序(SOP)采集符合标准的精浆样本，进行上述试验后结论也成立，即以精浆为检测样本也可以进行检测。
综上，通过采用UPLC-Q exactive MS比较正常对照和无精子症精液中的代谢小分子，发现了精液中存在可用于评估是否患有无精子症，具有诊断价值的1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯，以及该1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯检测的UPLC-Q exactive MS的应用，研制出可便于临床应用的无精子症诊断、监测试剂盒。
本发明采用代谢小分子1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯作为无精子症评价的标志物的优越性在于：
(1)代谢小分子是一种新型生物标志物，其与疾病结局关联强，不仅稳定、无创、易于检测，且定量精确，将大大提高无精子症诊断的敏感性和特异性，该类小分子生物标志物的成功开发将为无精子症的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)本发明提供的1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯可用作无精子症的诊断标志物，为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。
(3)本发明采用无精子症和健康对照随机人群的精液样本进行验证，证明了精液中1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯水平在诊断无精子症中具有较高灵敏度和特异度，可作为标志物使用。
(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选多种代谢小分子，应用UPLC-Q exactive MS进行独立人群验证，保证了该代谢生物标志物和诊断方法的可靠性。
(5)UPLC-Q exactive MS技术样本处理简单，仪器分析迅速准确，具有较高的临床诊断实用价值。
以上所述实施例的各技术特征以及各检测项目可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种精液中的分子标志物在制备无精子症诊断或监测试剂盒中的应用，其特征在于，所述分子标志物为 1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯，
所述试剂盒包括：
1,3-二羟基丙-2-基十五烷酸酯标准品； Hypersil GOLD C18 色谱柱：
试剂A：含 100%甲醇；
试剂B：含 0.1%甲酸的水； 试剂C：含 0.1%甲酸的乙腈； 试剂D：超纯水；
所述试剂盒的使用方法为：
1. 样本前处理：
1.1. 取精液，加入甲醇，涡旋，沉淀蛋白；
1.2. 离心，将上清液在室温条件下于离心浓缩干燥仪中浓缩至干；
1.3. 用超纯水复溶，待分析；
2. 仪器检测：
2.1.分析仪器： UPLC Ultimate 3000system高效液相色谱仪， Q- Exactive 高分辨质谱仪；
2.2.液相条件：
2.2.1液相色谱柱为Hypersil GOLD C18 色谱柱；
2.2.2 采用的流动相A 为含 0.1%甲酸的水，流动相 B 为含 0.1%甲酸的乙腈， 流速为 400μL/min；
2.3.质谱条件：加热电喷雾电离方式进行分析。
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