WO2007148720A1 - ネフローゼ症候群の疾患関連たんぱく質およびその使用 - Google Patents

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Isao Kaneko
Yoshihide Miyake
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Japan Health Sciences Foundation
National Institute Of Biomedical Innovation
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Definitions

  • the present invention relates to a disease-related protein of nephrotic syndrome, its use in a method for determining a disease state of a nephrotic syndrome group, a kit for determining a disease state of nephrotic syndrome, a method for screening a therapeutic agent for nephrotic syndrome, and the like.
  • Nephrotic syndrome is known to exhibit a large amount of proteinuria and hypoproteinemia. Nephrotic syndrome includes those with minimal changes, those that develop focal glomerulosclerosis, membranous nephropathy, and membranoproliferative glomerulonephritis. Among them, minimal change nephritic syndrome (MCNS) accounts for the majority of nephropathy in childhood and about 15% of adult nephropathy, and death in severe cases in children.
  • MCNS minimal change nephritic syndrome
  • nephrotic syndromes such as MCNS
  • the glomerulus shows almost no histological changes. , No complement deposition was observed.
  • it develops acutely and has features such as remission but relapse after administration of corticosteroid hormones (steroids) and immunosuppressants.
  • steroids corticosteroid hormones
  • the hypothesis is that T cell dysfunction (Non-Patent Document 1) and glomerular permeability-enhancing factors such as hemopexin (Non-Patent Document 2) Slit membrane-related protein decrease, etc. Reference 3) has been proposed, but has not yet been fully elucidated.
  • an effective method for determining the disease state of this disease it is not sufficient as a method for reflecting the force-specific and rapid disease state, which is known to measure the total protein amount and albumin / globulin ratio in serum. .
  • nephrotic syndrome In nephrotic syndrome, it is known that a relatively small amount of serum protein leaks into urine, resulting in a decrease in total protein mass and albumin / globulin ratio in serum. Therefore, for determining the pathological condition of nephrotic syndrome, it has been conventionally performed to measure serum total protein mass and albumin / globulin ratio.
  • treatments such as steroid administration and resting diet therapy have improved the filtration function of the kidney glomeruli, and the urinary function is improved. Even if protein leakage stops, serum total protein mass and albumin / glopurin ratio will not recover significantly, immediately.
  • Non-Patent Literature l Boulton- Jones J.M. et al. Clinical Nephrol, 20, 72-76 (1983)
  • Non-Patent Document 2 Winston, W. et al. Kidney International, 68, 603-610 (2005)
  • Non-Patent Document 3 Koop K, et al: J. Am. Soc. N mark hrol, 14, 2063-2071 (2003)
  • the present invention finds a serum protein that is effective in determining the pathological condition of nephrotic syndrome, reflects the therapeutic effect quickly, and can be used for prognosis, and uses it for a method for monitoring treatment and prognosis of nephrotic syndromes. It was an object to provide a method, a kit therefor, and a screening method for a therapeutic drug for nephrotic syndrome.
  • Zin c alpha-2 -glycoprotein 1 (hereinafter sometimes referred to as “ZAG”) (GI number: 4502337), a type of common circulating blood protein, is a condition of nephrotic syndrome. It was found that the marker is an effective marker for determination, a serum protein that quickly reflects the therapeutic effect and can be used for prognosis, and the present invention has been completed.
  • ZAG is known as a serum circulating glycoprotein, and it is also known that serum levels rise after bladder cancer (Bing, C et al: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 , 2500-2505 (2004), Irmak, S et al: Proteomics. 5, 4296-4304 (2005)).
  • the present invention revealed for the first time that the level of ZAG is closely related to the pathology of nephrotic syndrome.
  • the present invention provides the following.
  • a method for determining the pathology of nephrotic syndrome which is a subject with nephrotic syndrome
  • a method comprising determining the amount of zinc alpha-2 -glycoprotein 1 (ZAG) in the obtained sample;
  • nephrotic syndrome is minimal change nephrotic syndrome.
  • a kit for determining the pathological condition of nephrotic syndrome comprising a means for measuring the amount of ZAG in a sample in the method according to item 1.
  • nephrotic syndrome is minimal change nephrotic syndrome.
  • the pathological condition of nephrotic syndrome for example, treatment monitoring, prognosis, etc. can be quickly and accurately performed.
  • FIG. 1 is a graph showing variability of serum ZA G levels before, during and after treatment, and their average for 5 patients.
  • Figure 2 shows serum levels of retinol binding protein 4 (upper left panel), transthyretin (upper right panel), antithrombin III (lower left panel) and prostaglandin D2 synthase (lower right panel). It is a graph which shows the correlation with the quantity in serum of ZAG.
  • the present invention provides a method for determining the pathological condition of nephrotic syndrome.
  • the method includes examining the amount of ZAG in a sample obtained from a subject with nephrotic syndrome.
  • the “subjects with nephrotic syndrome” and “nephrotic syndrome patients” are those who have been determined to be active in nephrotic syndrome. Such a determination can be made by a known method, for example, by measuring the total protein mass and albumin / globulin ratio in serum or the presence of hematuria.
  • the ZAG fluctuation pattern is observed in all patients, the amount of ZAG in the sample of nephrotic syndrome patients is measured, and the ZAG fluctuation pattern in the sample as described above is used as a calibration curve. By doing so, it is possible to analyze the pathology of nephrotic syndrome in patients. For example, if the patient is receiving treatment It is possible to determine the presence / absence and extent of the patient's response, the status of the patient's treatment stage, etc., and to predict future disease states.
  • the amount of ZAG in a sample obtained from a subject under treatment is similarly obtained from the same subject before treatment and Z or after treatment, and / or from a normal individual as well. You may compare with the amount of ZAG in the examined sample.
  • under treatment refers to a period during which a patient is administered treatment such as steroid administration or diet therapy.
  • a sample is obtained from the patient at least once before treatment, during treatment, and each time after Z or treatment.
  • patient force samples are sampled at appropriate time intervals before, during and after treatment.
  • the nephrotic pathological condition analysis method of the present invention can be used for treatment monitoring and prognosis of nephrotic syndrome.
  • the nephrotic syndrome pathological analysis method of the present invention is effective in the pathological analysis of any type of nephrotic syndrome, but is particularly suitable for the pathological analysis of minimal change nephrotic syndrome (M CNS).
  • the subject to which the method of the present invention is applied is a mammal, preferably a primate, particularly preferably a human.
  • the type of sample from the subject is not particularly limited.
  • the sample may be a body fluid or a tissue sample. Since collection of the tissue sample may be burdensome to the subject, a body fluid sample is preferred. Examples of body fluid samples include whole blood, serum, urine, sweat, saliva, ascites, etc., and serum is preferred because it contains a large amount of ZAG.
  • a sample is collected from a normal individual in the same manner as the subject. Various sampling methods are known and used in the field, and can be selected and used as appropriate.
  • blood when obtaining a serum sample, blood can be collected from an arm vein and the serum can be obtained by a normal separation method such as centrifugation.
  • a normal separation method such as centrifugation.
  • obtaining samples using the same collection method and measuring ZAG using the same measurement method can improve the accuracy of the data. It is preferable from the point.
  • Proteins known to vary from normal values in nephrotic syndrome such as retinol-binding protein 4 (Fe XG and Hasson, ⁇ .: Eur. J. Biochem. 94, 307-313 (1979)), transthyretin (Fex. G. and Hasson, B .: Eur. J. Biochem. 94, 307-313 (1979)), antithrombin (Malysz ko J, et al: Blood Coagul Fibrinolysis 13, 615-621 (2002)), or prostaglandin D2 synthase (Donadio C, et al: J. Phar. Biome. Anal. 32, 1099-1104 (2003)) etc. are also measured, and these data and ZAG data are used together to make nephrotic pathological condition determination with higher accuracy in the method of the present invention. be able to.
  • retinol-binding protein 4 Fe XG and Hasson, ⁇ .: Eur. J. Bio
  • Methods for detecting and measuring ZAG are not particularly limited, and methods known in the art can be used. Examples include affinity chromatographic methods, two-dimensional electrophoresis methods, isotope labeling methods such as cICAT methods, and immunological methods using antibodies specific for ZAG. It is preferable to apply a method used for proteome analysis such as two-dimensional electrophoresis and isotope labeling.
  • the isotope labeling method is not only qualitative but also excellent in quantitativeness.
  • the cICAT method (Hansen, K.C. et al, Mol. Cell Proteomics, 2, 299-314 (2003)) is more preferable.
  • the cICAT method is used as an effective means of analyzing disease-related proteins by conducting a comprehensive expression difference analysis of proteins between patients and healthy individuals or before and after treatment, and is also used effectively in the present invention. It is done.
  • isotope labeling is combined with mass spectrometry (MS).
  • MS mass spectrometry
  • MS mass spectrometry
  • MS mass spectrometry
  • MS mass spectrometry
  • ZAG may be detected and measured using immunological techniques.
  • Antibodies against ZAG can be prepared by known methods and analyzed by known methods such as ELISA. The It is also possible to analyze a large amount of samples by performing high-throughput analysis using a known instrument 'apparatus such as a microchip, microtiter dish, or bead, and a known immobilization means.
  • a known instrument 'apparatus such as a microchip, microtiter dish, or bead
  • immobilization means There are various labels that can be used to label proteins in the sample as appropriate (for example, isotope labels, fluorescent labels, luminescent labels, colored labels, colloidal gold labels, labels with specific binding substances such as biotin, etc.) It is known in the field, and methods for adding these labels are also known.
  • the present invention provides a kit for determining the pathological condition of nephrotic syndrome.
  • the kit essentially includes means for measuring the amount of ZAG in the sample in the method of the present invention described above.
  • Various methods for measuring the amount of ZAG in a sample are known as described above, and can be appropriately selected and used.
  • the kit of the present invention contains a ZAG-specific monoclonal antibody, an ELISA microtiter plate, an appropriate color reagent, and the like.
  • One of the preferred specific examples of the kit of the present invention is one in which the measurement of ZAG is performed using an isotope labeling method, particularly the cICAT method.
  • the kit of the present invention is preferably used for analysis of the pathological condition of MCNS.
  • the present invention provides a screening method for a therapeutic agent for nephrotic syndrome.
  • the method comprises administering a candidate agent to an animal suffering from nephrotic syndrome, and examining the amount of ZAG in the sample of the animal force before and after administration of the candidate agent. Whether the therapeutic effect is good or bad can be judged from the degree of increase in the amount of ZAG in samples obtained from animals. The remission period can be confirmed by the decrease in the amount of ZAG in the sample.
  • Nephrotic therapeutics obtained by intensive methods are also encompassed by the present invention.
  • the patient serum fraction (lmg) from which albumin, IgG, ⁇ 1-antitrypsin, IgA, transferrin, and haptoglobin were removed using an Agilent antibody column (lmg) Labeled with cICAT-H chain reagent and cICAT-L chain reagent. After mixing each labeled fraction, trypsin treatment, purify the obtained peptide fragment by SCX column and avidin column, and cleave the piotine part by TFA treatment, to obtain cICAT labeled peptide (H chain, L chain) ) This labeled peptide is fractionated on an SCX column (4.6 x 100 mm) (25 fractions).
  • the cICAT peptide of each fraction is nano-LC / Q-Star XL (Applied Biosystems (AB), ES to Q / TOF). Perform mass spectrometric measurement, check raw data, identify peptide and protein using integrated database system (HiSpec), perform comparative quantitative analysis, and analyze patient serum (H chain label) and healthy human standard serum (L The comparative quantitative ratio (H / L) of each protein with (chain label) was calculated.
  • the percentage of cases where the H / L value is less than 0.5 or greater than 2.0 exceeding the threshold of the quantitative error range of the cICAT method is 8.4% before treatment, 11.4% and 11.4% after treatment, both of which were higher than those of 4 healthy Japanese people (3.5%).
  • protein urinalysis, serum total protein, and albumin Z globulin ratio are measured by conventional methods before (onset of), during (on steroid administration) and after (on steroid administration, remission) patients (Table 1).
  • the H / L ratios of antithrombin III and retinol binding protein 4 which are reported to increase with improved glomerular function of the kidney, were 0 ⁇ 85 ⁇ 0.17 and 0 ⁇ 73 ⁇ , respectively, before treatment. 0.17, and the treatment resulted in 1.08 ⁇ 0.18 and 1.05 ⁇ 0.16 ('during treatment directly). However, these protein changes are subtle compared to ZAG changes.
  • the present invention can be used in the field of nephrotic pathology research, the manufacture of kits for determining the pathological condition, and the field of drug discovery and screening of new therapeutic agents for nephrosis.

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Abstract

　ネフローゼ症候群の病態の判定方法であって、ネフローゼ症候群の被験者から試料を得ること、次いで試料中のzinc alpha－２－glycoprotein 1（ＺＡＧ）の量を調べることを含む方法。

Description

明 細 書
ネフローゼ症候群の疾患関連たんぱく質およびその使用
技術分野
[0001] 本発明は、本発明は、ネフローゼ症候群の疾患関連たんぱく質、ネフローゼ症候 群の病態の判定方法におけるその使用、ネフローゼ症候群の病態判定用キット、ネ フローゼ症候群の治療薬のスクリーニング方法等に関する。
背景技術
[0002] ネフローゼ症候群は多量の蛋白尿と低蛋白血症等を呈することが知られている。ネ フローゼ症候群には微小変化型のもの、巣状糸球体硬化症、膜性腎症、膜性増殖 性糸球体腎炎を発症するもの等が含まれる。なかでも微小変化型ネフローゼ症候群 (minimal change nephritic syndrome: MCNS)は、小児期の腎症の大部分および成 年期の腎症の約 15%を占め、小児において重篤な場合には死に至る。
[0003] MCNSなどのネフローゼ症候群においては、糸球体のろ過機能に異常が認めら れる力 他の腎症と異なり、糸球体には殆ど組織学的な変化が見られず、また、免疫 グロブリンや、補体の沈着も認められなレ、。多くの症例では、急性に発症し、副腎皮 質ステロイドホルモン (ステロイド）や免疫抑制剤の投与により寛解するが再発しやす レ、などの特徴点を有する。その発症原因仮説としては、 T細胞機能異常 (非特許文 献 1)やへモぺキシンなどの糸球体透過性亢進因子の異常等 (非特許文献 2)スリット 膜関連たんぱく質の低下等（非特許文献 3)が提唱されているが、未だ完全には解明 されていなレ、。また本疾患の病態判定に有効な方法として、血清中の総蛋白質量及 びアルブミン/グロブリン比を測定することが知られている力 特異的で迅速な病態 を反映する判定法としては充分ではない。
[0004] ネフローゼ症候群においては、尿中に比較的低分子の血清蛋白質が多量に漏出 するため、血清中の総たんぱく質量およびアルブミン/グロブリン比が低下することが 知られている。従って、ネフローゼ症候群の病態判定には、血清総たんぱく質量及 びアルブミン/グロブリン比を測定することが従来から行われている。しかし、ステロイ ド投与や安静食事療法等の治療により、腎臓糸球体のろ過機能が改善し、尿中への たんばく質の漏出が停止しても、血清総たんばく質量及びアルブミン/グロプリン比は 、すぐに著しくは回復しなレ、。それゆえ、これらの測定値によってはネフローゼ症候群 の治療効果等の病態があまり迅速には反映されず、定量性にも問題があった。そこ で、ネフローゼ症候群の治療効果等の病態をより迅速に反映し、定量性にも優れた 血清中のマーカーたんぱく質を特定することが切望されていた。
非特許文献 l : Boulton- Jones J.M. et al. Clinical Nephrol, 20, 72-76(1983)
非特許文献 2 : Winston, W. et al. Kidney International, 68， 603-610(2005)
非特許文献 3 : Koop K， et al: J. Am. Soc. N印 hrol， 14, 2063-2071(2003)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、ネフローゼ症候群の病態判定に有効であり、治療効果を迅速に反映し 、予後にも用いることにできる血清たんぱく質を見出し、それを用いたネフローゼ症候 群の治療モニタリング法や予後方法、そのためのキット、ならびにネフローゼ症候群 の治療薬のスクリーニング方法等を提供することを課題とした。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ね、健常人および微小変化型ネ フローゼ症候群患者の治療前と治療後の血清中のたんぱく質の比較定量解析を行 つにところ、血?胃循環糖蛋 貧 (common circulating blood protein)の一種である、 zin c alpha- 2 -glycoprotein 1 (以下、「ZAG」ということがある）（GI番号： 4502337)が、ネ フローゼ症候群の病態判定に有効なマーカーであり、治療効果を迅速に反映し、予 後にも用いることにできる血清たんぱく質であることを見出し、本発明を完成させた。
[0007] ZAGは血清循環糖たんぱく質として知られており、膀胱癌にぉレ、て血清レベルが 上昇することも知られている（Bing, C et al: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2500- 2505 (2004)、 Irmak, S et al: Proteomics. 5， 4296-4304 (2005))。しかしながら、 ZAG のレベルがネフローゼ症候群の病態と密接な関連性を有することは本発明により初 めて明らかとなった。
[0008] すなわち、本発明は、下記のものを提供する。
( 1 )ネフローゼ症候群の病態の判定方法であって、ネフローゼ症候群の被験者か ら得た試料中の zinc alpha- 2 -glycoprotein 1 (ZAG)の量を調べることを含む方法；
(2)治療中の被験者から得た試料中の ZAG量と、治療前および/または治療後の 同じ被験者、および/または正常個体から得た試料中の ZAG量とを比較すること をさらに含む（1)記載の方法。
(3) ZAG量の測定が同位体標識法を用いて行われる（1)または（2)の方法。
(4)同位体標識法が cICAT法である（3)記載の方法。
(5)病態の判定がネフローゼ症候群の治療モニタリングである（1)〜（4)のいずれ かに記載の方法。
(6)病態の判定がネフローゼ症候群の予後である（1)〜（4)のレ、ずれかに記載の 方法。
(7)ネフローゼ症候群が微小変化型ネフローゼ症候群である（1)〜（6)のいずれか に記載の方法。
(8) (1)〜（7)のいずれ力 1項記載に方法において試料中の ZAG量を測定するた めの手段を必須として含む、ネフローゼ症候群の病態の判定用キット。
(9) ZAG量の測定が同位体標識法を用いて行われる（8)記載のキット。
(10)同位体標識法が cICAT法である（9)記載のキット。
(11)病態の判定がネフローゼ症候群の治療モニタリングである（8)〜（： 10)のいず れかに記載のキット。
(12)病態の判定がネフローゼ症候群の予後である（8)〜（10)のいずれかに記載 のキット。
(13)ネフローゼ症候群が微小変化型ネフローゼ症候群である（8)〜（12)のいず れかに記載のキット。
(14)ネフローゼ症候群の治療薬のスクリーニング方法であって、
(a)ネフローゼ症候群に力、かっている動物に候補薬剤を投与すること、および
(b)該候補薬剤の投与前および投与後に該動物から採取した試料中の ZAG量 を調べること
を含む方法。
(15) (14)に記載の方法により得られるネフローゼ症候群治療薬。 発明の効果
[0009] 本発明によれば、対象から得た試料中の ZAGのレベルを測定することにより、ネフ ローゼ症候群の病態の判定、例えば治療モニタリング、予後などを迅速かつ正確に 行うことができ、さらにはネフローゼ症候群の治療薬のスクリーニングを行うこともでき る。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]図 1は、 5人の患者についての、治療前、治療中、治療後における血清中の ZA G量の変動、並びにそれらの平均を示すグラフである。
[図 2]図 2は、レチノール結合たんぱく質 4 (左上パネル）、トランスシレチン (右上パネ ノレ）、アンチスロンビン III (左下パネル）およびプロスタグランジン D2シンターゼ（右下 パネル）の血清中の量と ZAGの血清中の量との相関性を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明は、ネフローゼ症候群の病態の判定方法を提供する。該方法は、ネフロー ゼ症候群の被験者から得た試料を中の ZAGの量を調べることを含む。 「ネフローゼ 症候群の被験者」、「ネフローゼ症候群患者」とは、ネフローゼ症候群に力かっている と判定された者である。かかる判定は、既知の方法、例えば、血清中の総蛋白質量 及びアルブミン/グロブリン比を測定すること、あるいは血尿があることなどにより行う こと力 Sできる。
[0012] ネフローゼ症候群患者の治療前、治療中、治療後の試料中の ZAG量は、患者に よらず図 1に示すように同様のパターンで経時変化をすることがわかった。すなわち、 試料中の ZAGは、治療効果が発揮されるに伴って（患者尿中たんぱく質の消失とと もに)増加し、治療効果が良好であれば同じ患者の治療前の値または治療後の値あ るいは正常個体の標準値力 著しく（約 3倍に)増加する。そして緩解期に入ると治療 前の値あるいは正常個体の標準値と等しいレベルにまで減少する（表 2も参照のこと )。力、かる ZAGの変動パターンはいずれの患者においても見られるので、ネフローゼ 症候群患者の試料中の ZAG量を測定し、上記のような試料中の ZAGの変動パター ンを検量線のようにして利用することにより、患者におけるネフローゼ症候群の病態を 解析することができる。例えば、患者が治療を受けている場合であれば、治療に対す る患者の応答の有無、程度、あるいは患者がいずれの治療段階にあるのか等の状況 を判定することができ、今後の病態の予測も可能である。
[0013] 上で説明した本発明の方法において、治療中の被験者から得た試料中の ZAG量 と、治療前および Zまたは治療後の同じ被験者、および/または正常個体から同様 に得て同様に調べた試料中の ZAG量とを比較してもよい。本明細書において、治療 中とは、ステロイド投与や食事療法などの処置を患者に施している期間をいう。治療 前、治療中および Zまたは治療後の各々において少なくとも 1回患者から試料を得る 。好ましくは、治療前、治療中そして治療後の各々において数回、適当な時間間隔 を置いて患者力 試料をサンプリングする。そうすることによってネフローゼ症候群患 者の試料中の ZAG量の経時変化をより詳細に調べることができ、ネフローゼ症候群 の病態をさらに詳細に解析することができる。例えば、治療に対する患者の応答の有 無、程度、あるいは患者がいずれの治療段階にあるのか等の状況をさらに詳細に調 ベることができ、今後の病態の変化をさらに高い精度で予測することができる。
[0014] したがって、本発明のネフローゼ病態解析方法は、ネフローゼ症候群の治療モニタ リングならびに予後にも用いることができる。
[0015] 本発明のネフローゼ症候群の病態解析方法はいずれの種類のネフローゼ症候群 の病態解析においても効果的であるが、なかでも微小変化型ネフローゼ症候群 (M CNS)の病態解析に適している。
[0016] 本発明の方法を適用する対象は、哺乳動物、好ましくは霊長類、特に好ましくはヒト である。被験者からの試料の種類は特に限定されなレ、。試料は体液であってもよぐ 組織試料であってもよい。組織試料の採取は被験者に負担力 Sかかる場合があるので 、体液試料が好ましい。体液試料としては全血、血清、尿、汗、唾液、腹水などが例 示され、 ZAGが多く含まれることから血清が好ましい。対照として、正常個体から被験 者と同様の方法で試料を採取する。試料の採取方法は当該分野において様々なも のが知られ、用いられており、適宜選択して用いることができる。例えば、血清試料を 得る場合には、腕の静脈から採血し、遠心分離等の通常の分離方法により血清を得 ること力 Sできる。好ましくは、被験者および/または正常個体において、同じ採取方 法にて試料を得て、同じ測定方法にて ZAGを測定することが、テータの精度向上の 点から好ましい。
[0017] また、ネフローゼ症候群において正常値から変動することが知られているたんぱく 質、例えば、腎糸球体のろ過機能能改善と相関するレチノール結合たんぱく質 4 (Fe X. G. and Hasson, Β·: Eur. J. Biochem. 94, 307-313 (1979))、トランスシレチン（Fex. G. and Hasson, B. : Eur. J. Biochem. 94, 307-313 (1979))、アンチスロンビン（Malysz ko J， et al: Blood Coagul Fibrinolysis 13, 615-621(2002))等のたんぱく質、あるいは 糸球体のろ過機能の低下に相関するプロスタグランジン D2シンターゼ（Donadio C, et al: J. Phar. Biome. Anal. 32, 1099-1104 (2003))等のたんぱく質に関しても測定 を行って、これらのデータと ZAGのデータを併用することにより、本発明の方法にお いてさらに精度の高いネフローゼ病態判定を行うことができる。
[0018] 本発明における ZAGの検出および量の測定には当該分野で知られた種々の方法 を適用することができる。 ZAGの検出および測定方法としては、特に限定されるもの ではなぐ当該分野で知られた方法を使用することができる。例としてはァフィ二ティ 一クロマト法、二次元電気泳動法、 cICAT法などの同位体標識法、 ZAGに特異的 な抗体を用いる免疫学的方法等が挙げられる。二次元電気泳動法や同位体標識法 等のプロテオーム解析に用いられる方法を適用することが好ましい。
[0019] 同位体標識法は定性のみならず定量性にも優れた方法である。同位体標識法の なかでも cICAT法（Hansen, K.C. et al, Mol. Cell Proteomics, 2， 299-314(2003))が さらに好ましい。 cICAT法は、患者と健常人あるいは治療前と治療後のたんぱく質の 網羅的発現差解析を行うことにより、疾患関連たんぱく質を分析する有効な手段とし て用いられており、本発明にも有効に用いられる。同位体標識法には質量分析法（ MS)を組み合わせるのが一般的である。 MSの手段'方法は種々のものがあり、装置 も多数市販されているので、適宜選択して使用することができる。また、分離能力と定 性能力の向上を図るために、ガスクロマトグラフィー（GC)や液体クロマトグラフィー（ LC)と MSとを組み合わせた分析方法（GC/MS、 LCZMSあるいは LC/MSZ MSなど)も開発されており、そのための装置の多数市販されている。
[0020] 免疫学的手法を用いて ZAGを検出および測定してもよい。 ZAGに対する抗体を 公知の方法により調製して、 ELISA法などの公知の手法により分析を行うことができ る。マイクロチップやマイクロタイターディッシュ、あるいはビーズ等の当該分野で公知 の器具'装置、ならびに公知の固定化手段等を用いてハイスループット分析を行って 大量の検体を分析することもできる。試料中のたんぱく質を適宜標識してもよぐ種々 の標識 (例えば、同位体標識、蛍光標識、発光標識、呈色標識、金コロイド標識、ビ ォチンなどの特異的結合物質での標識等）が当該分野で知られており、それらの標 識を付加する方法も公知である。
[0021] さらに本発明は、ネフローゼ症候群の病態の判定用キットを提供する。該キットは、 上記の本発明の方法において試料中の ZAG量を測定するための手段を必須として 含む。試料中の ZAG量の測定方法は上述のごとく種々のものが公知であり、適宜選 択して用いることができる。例えば ZAGの測定力 ¾LISA法を用いて行われる場合に は、本発明のキットは、 ZAG特異的モノクローナル抗体、 ELISA用マイクロタイター プレート、適当な発色試薬等を含む。本発明のキットの好ましい具体例の 1つは、 ZA Gの測定が同位体標識法、特に cICAT法を用いて行われるものである。本発明のキ ットは MCNSの病態の解析に好ましく用いられる。
[0022] さらに本発明は、ネフローゼ症候群の治療薬のスクリーニング方法を提供する。該 方法は、ネフローゼ症候群に力かっている動物に候補薬剤を投与すること、そして該 候補薬剤の投与前および投与後に該動物力 採取した試料中の ZAG量を調べるこ とを含む。治療効果の良否は、動物から得た試料中の ZAG量の増加の程度から判 断すること力 Sできる。緩解期に入ったことは試料中の ZAG量の減少により確認するこ とができる。力かる方法により得られたネフローゼ治療薬もまた本発明に包含される。
[0023] 以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本 発明を限定するものではない。
実施例 1
[0024] 微小変化型ネフローゼ症候群患者 5名（A, B, C, D, E)の治療前 (発症中）、治療 中（ステロイド等投与中）或いは治療後 (ステロイド投与終了、緩解期）の患者血清（ 合計 15検体）と健常人標準血清 (健常人 10名の血清をプールしたもの）中の血清た んぱく質を、 cICAT法により、比較定量解析を行った。すなわち、金子 勲：疾患関 連たんぱく質解析研究 平成 17年度 総括 ·分担研究報告書 p. 104— 144に記 載の方法により、アジレント社製抗体カラムで、アルブミン、 IgG、 α 1—アンチトリプシ ン、 IgA、トランスフェリン、ハプトグロビンを除去した患者血清画分（lmg)及び健常 人標準血清画分（lmg)を、それぞれ cICAT— H鎖試薬および cICAT— L鎖試薬 で標識した。標識した各画分を混合後、トリプシン処理を行い、得られたペプチド断 片を SCXカラム、アビジンカラムで精製し、さらに TFA処理でピオチン部分切断する ことにより、 cICAT標識ペプチド (H鎖、 L鎖）を得た。本標識ペプチドを SCXカラム（ 4. 6x100mm)で分画（25分画）し、各画分の cICATペプチドは nano- LC/Q-Star XL (Applied Biosystems (AB), ESト Q/TOF)で質量分析測定を行レ、、生データをチ エック後、統合データベースシステム（HiSpec)を用いてペプチドおよびたんぱく質の 同定 ·比較定量解析を行い、患者血清 (H鎖標識)と健常人標準血清 (L鎖標識）との 各たんぱく質の比較定量比 (H/L)を計算した。
[0025] その結果、何れの場合も、 Refseqのデータベースを用いて、 cICATペプチドレベル でランク 1、スコア 20以上を示すたんぱく質を同定たんぱく質とすると、約 120種類の 血清たんぱく質の同定と比較定量比（H/L)が可能であった。治療前ネフローゼ患 者（5名）血清と健常人標準血清とで比較した場合、その発現比率 (H/L)値が 0. 6 0〜： 1. 67の範囲に入るケースが占める割合は、治療前で 81. 5%、治療中で 78. 8 %、治療後では 80. 6%であった。一方、 cICAT法の定量誤差範囲の閾値を超えて 、 H/L値が 0. 5よりも小、または 2. 0よりも大を示すケースの割合は、治療前で 8. 4 %,治療中で 11. 4%、治療後では 11. 4%であり、いずれも日本人健常人 4名の場 合（3. 5%)よりも多かった。この閾値を超えたものの中で、治療前、治療中、治療後 で変動がみられるものを患者毎に調べた。また、常法により、患者の治療前 (発症中） 、治療中（ステロイド投与中）および治療後 (ステロイド投与終了、緩解期）のたんぱく 尿検査値、血清総蛋白質量及びアルブミン Zグロブリン比を測定した（表 1)。
[0026] [表 1] 表 1 . 微小変化型ネフローゼ患者の治療前、 治療中および治療後 （緩解期） の尿蛋白、 血清総蛋白質量およびアルブミン /グロプリン比率
Figure imgf000010_0001
[0027] その結果、患者全例において、ステロイド投与治療により、尿中へのたんぱく質の 漏洩は完全に停止（+ + +から-に改善）したが、それととともに、血清循環糖たん ばく質の一種である ZAG (H/L比）は治療前では平均 1. 18 ± 0. 68であったのが 、治療により平均 3. 27 ± 0. 82と著しく増加した（図 1)。一方、他の血清循環糖たん ばく質のビトロネクチン、 ひ一IBグリコプロテイン、へモぺキシンの HZL比は治療に より、殆ど変化はしなかった (データ示さず)。また、腎臓の糸球体の機能改善に伴い 増加すると報告されているアンチスロンビン III、レチノール結合たんぱく質 4の H/L 比は、それぞれ、治療前では 0· 85 ± 0. 17および 0· 73 ± 0. 17であり、治療により 、 1. 08 ± 0. 18および 1. 05 ± 0. 16になった（'治療中のィ直）。し力し、これらのたん ばく質の変化は、 ZAGの変化と比べると微小なものといえる。
[0028] 表 1に示すように、治療による蛋白尿は陰性になり、血清総たんぱく質量およびァ ルブミン/グロブリン比は上昇するものの治療中の時点では緩解期のレベルまでに は回復していなかった。従って、治療による ZAGの増加は血清総たんぱく質量及び アルブミン/グロブリン比の正常値までの変化よりも先行した。また、治療後 (緩解期） には、本たんぱく質の H/L比は正常値に戻った。このこと力ら、本発明のネフローゼ 病態解析方法は、より迅速に病態の変化を捉えることができることがわかる。
[0029] 治療前と治療中の血清たんぱく質解析データに関して、本たんぱく質と他の血清た んばく質との相関性を調べたところ、本たんぱく質の H/L比と、腎糸球体のろ過機 能能改善と相関することが知られているレチノール結合たんぱく質 4、トランスシレチ ン、アンチスロンビン ΠΙの H/L比とは正の相関関係が認められ、逆に、糸球体のろ 過機能の低下に相関するプロスタグランジン D2シンターゼの H/L比とは負の相関 関係が認められた（図 2)。このことは、当該蛋白質がネフローゼ症候群の治療による 病態変化を迅速反映する蛋白質であることを示すものである。したがって、 ZAGの血 清中の濃度を測定することにより、ネフローゼ症候群の病態の判定、例えば、治療モ ニタリング、予後、治療効果の予測などを行うことができる。
産業上の利用可能性
本発明は、ネフローゼ病態の研究分野ならびにその病態判定のためのキットの製 造などの分野、さらにはネフローゼの新規治療薬の創薬やスクリーニングの分野にお いて利用可能である。

Claims

請求の範囲
[I] ネフローゼ症候群の病態の判定方法であって、ネフローゼ症候群の被験者から得 た試料中の zinc alpha- 2 -glycoprotein 1 (ZAG)の量を調べることを含む方法。
[2] 治療中の被験者から得た試料中の ZAG量と、治療前および Zまたは治療後の同 じ被験者、および/または正常個体から得た試料中の ZAG量とを比較すること をさらに含む請求項 1記載の方法。
[3] ZAG量の測定が同位体標識法を用いて行われる請求項 1または 2記載の方法。
[4] 同位体標識法が cICAT法である請求項 3記載の方法。
[5] 病態の判定がネフローゼ症候群の治療モニタリングである請求項 1〜4のいずれか
1項記載の方法。
[6] 病態の判定がネフローゼ症候群の予後である請求項 1〜4のいずれ力 1項記載の 方法。
[7] ネフローゼ症候群が微小変化型ネフローゼ症候群である請求項:!〜 6のいずれか 1 項記載の方法。
[8] 請求項 1〜7のいずれか 1項記載の方法において試料中の ZAG量を測定するため の手段を必須として含む、ネフローゼ症候群の病態の判定用キット。
[9] ZAG量の測定が同位体標識法を用いて行われる請求項 8記載のキット。
[10] 同位体標識法が cICAT法である請求項 9記載のキット。
[II] 病態の判定がネフローゼ症候群の治療モニタリングである請求項 8〜： 10のいずれ 力、 1項記載のキット。
[12] 病態の判定がネフローゼ症候群の予後である請求項 8〜： 10のいずれ力 4項記載の キット。
[13] ネフローゼ症候群が微小変化型ネフローゼ症候群である請求項 8〜： 12のいずれか
1項記載のキット。
[14] ネフローゼ症候群の治療薬のスクリーニング方法であって、
(a)ネフローゼ症候群に力かっている動物に候補薬剤を投与すること、および
(b)該候補薬剤の投与前および投与後に該動物力 採取した試料中の ZAG量 を調べること を含む方法。
請求項 14記載の方法により得られるネフローゼ症候群治療薬。
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