KR102344385B1

KR102344385B1 - 간암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트

Info

Publication number: KR102344385B1
Application number: KR1020200049161A
Authority: KR
Inventors: 조주연; 장인진; 김다정
Original assignee: 서울대학교병원
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2021-12-29
Also published as: KR20210130970A

Abstract

본 발명은 간암 진단용 조성물 및 키트에 관한 것으로, 간암에 특이적인 대사체를 검출하고, 이들 농도를 측정하여 특정 수학식에 적용함으로써 간암 발병 지수를 계산하여, 간편하고 정확하게 간암 진단할 수 있다.

Description

간암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트{COMPOSITION FOR DIAGNOSIS OF A HEPATOCELLULAR CARCINOMA AND KIT COMPRISING THE SAME}

본 발명은 간암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

암은 보통 종양이라고 하며 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 덩어리를 의미한다. 암이 발생하면, 세포주기가 조절되지 않아 계속 세포분열을 하고, 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협한다.

이에, 암을 조기에 진단하기 위한 방법으로서 신규 바이오마커에 대한 연구가 진행되고 있다. 바이오마커는 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하며, 바이오마커를 활용하면 대상체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다. 바이오마커는 특정 질병의 내적 표현형이라고 불리며, 특정 질병의 원인을 찾거나 발병 위험도를 측정하는 데 이용할 수 있다.

특히, 세포 내의 대사물질과 대사회로를 총체적으로 분석하는 대사체학(metabolomics)은 질병의 바이오마커로 널리 사용되고 있으며 암 발병 시기에 특이적으로 존재하는 대사체를 암 특이적 마커로 사용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

그러나, 이러한 대사체 바이오마커가 간암 진단에 활용된 사례는 극히 드물어, 간편하고, 정확성이 높은 간암 진단을 위한 대사체 마커 개발이 요구되고 있다.

한국공개특허 제10-2018-0106889호

1. 메티오닌에 특이적으로 결합하거나 반응하는 물질 및 오르니틴에 특이적으로 결합하거나 반응하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물.

2. 위 1에 있어서, 프롤린, 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일카르니틴에 특이적으로 결합하거나 반응하는 물질을 더 포함하는, 조성물.

3. 메티오닌 및 오르니틴의 농도 정량수단을 포함하는 간암 진단용 키트.

4. 위 3에 있어서, 프롤린, 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일카르니틴의 농도 정량수단을 더 포함하는, 키트.

5. 진단대상으로부터 분리된 시료 내의 메티오닌 및 오르니틴의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 간암 진단을 위한 정보제공방법.

6. 위 5에 있어서, 상기 메티오닌 및 오르니틴의 농도가 정상 대조군 보다 높으면 정상 대조군 대비 간암 발병 확률이 높다고 판단하는, 방법.

7. 위 5에 있어서, 상기 측정된 농도를 하기 수학식 1에 대입하여 간암 발병 지수를 계산하는 단계를 더 포함하는, 방법:

[수학식 1]

Logit [P]= EXP(-3.495 + 0.038*[Methionine] + 0.015*[Ornithine]) / 1 + EXP(-3.495 + 0.038*[Methionine] + 0.015*[Ornithine])

(식 중, [Methionine] 및 [Ornithine]은 각각의 혈청 농도이다)

8. 위 7에 있어서, 상기 수학식 1의 값이 간경변 환자의 값보다 큰 경우 간암이 발병되었다고 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.

9. 위 7에 있어서, 상기 수학식 1의 값이 0.48 이상인 경우 간암이 발병되었다고 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.

10. 위 5에 있어서, 진단대상으로부터 분리된 시료 내의 프롤린, 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일카르니틴 농도를 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.

11. 위 10에 있어서, 상기 프롤린의 농도가 정상 대조군 보다 높거나, 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일 카르니틴 농도가 정상 대조군 보다 낮으면 정상 대조군 대비 간암 발병 확률이 높다고 판단하는, 방법.

12. 위 10에 있어서, 상기 측정된 농도를 하기 수학식 2에 대입하여 간암 발병 지수를 계산하는 단계를 더 포함하는, 방법:

[수학식 2]

Logit [P]= EXP(-1.716 + 0.035*[Methionine] + 0.002*[Proline] + 0.009*[Ornithine] + 24.584*[Pimelylcarnitine] - 14.088*[Octanoylcarnitine]) / 1 + EXP(-1.716 + 0.035*[Methionine] + 0.002*[Proline] + 0.009*[Ornithine] + 24.584*[Pimelylcarnitine] - 14.088*[Octanoylcarnitine])

(식 중, [Methionine], [Ornithine], [Proline], [Pimelylcarnitine] 및 [Octanoylcarnitine]은 각각의 혈청 농도이다)

13. 위 12에 있어서, 상기 수학식 2의 값이 간경변 환자의 값보다 큰 경우 간암이 발병되었다고 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.

14. 위 12에 있어서, 상기 수학식 2의 값이 0.49 이상인 경우 간암이 발병되었다고 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.

본 발명은 간암 진단용 조성물 및 키트에 관한 것으로, 간암에 특이적인 대사체를 검출하고, 이들 농도를 측정하여 특정 수학식에 적용함으로써 간암 발병 지수를 계산하여, 간편하고 정확하게 간암을 진단할 수 있다.

도 1은 GC-TOFMS 및 LC-MSMS 기반 데이터로부터 마커 선택 과정의 개략도이다.
도 2는 실험 디자인과 트레이닝 세트 및 테스트 세트에 대한 설명이다. 여기서, HCC는 hepatocellular carcinoma; LC는 liver cirrhosis; NC는 normal control, LC-MS는 liquid chromatography-mass spectrometry; GC-MS는 gas chromatography-mass spectrometry이다.
도 3은 트레이닝 세트에서 초기 간암(HCC)의 진단에 위한 잠재적인 대사체 바이오마커를 확인한 것이고, 3a는 score plot of unsupervised multivariate analysis(PCA)결과이고, 3b는 score plot of supervised multivariate analysis (PLS-DA)결과이다.
도 4는 각 대사체 바이오마커의 농도를 정상대조군, 간경변 환자, 간암 환자 별로 비교한 것이다. 여기서, NC, LC 및 HCC는 트레이닝 세트에 속하고, V-LC 및 V-HCC는 테스트 세트에 속한다.
도 5는 본 발명의 대사체 바이오마커가 로지스틱 회귀 모델(logistic regression model)을 사용하여 간경변과 간암을 구별하는 것을 평가한 ROC 커브를 나타낸다.
도 6은 간암에서 대사체 바이오마커의 경로 농축 분석(Pathway enrichment anaylysis) 결과이다.
도 7은 간암에서 대사체 바이오마커의 경로 농축 개요를 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 메티오닌에 특이적으로 결합하거나 반응하는 물질 및 오르니틴에 특이적으로 결합하거나 반응하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.

메티오닌 및 오르니틴은 진단대상으로부터 분리된 시료 내에 존재하는 대사체로, 진단대상은 현재 간암(Heptocellular Carcinoma, HCC)을 보유하고 있거나 간암을 보유한 경험이 있는 동물, 그 외 간암 진단을 위한 정보를 제공받고자 하는 동물 등으로서, 상기 동물은 인간을 포함한 포유류일 수 있다.

시료는 진단대상으로부터 분리된 것으로서, 그 예로는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨일 수 있고, 구체적으로는 진단대상으로부터 분리된 혈청일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 물질은 메티오닌 및 오르니틴 중 어느 하나에 특이적으로 결합하거나 반응하여 이들 대사체를 검출할 수 있다면 제한되지 않으나, 예를 들면, 상기 대사체에 특이적인 유도체화 시약, 항체, 화합물, 단백질, 펩타이드, 핵산 또는 고분자를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라 상기 대사체를 검출하는 물질은 유도체화 시약일 수 있다. 예를 들면, 페닐이소티오시아네이트(phenylisothiocyanate) 시약을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 간암 의심 환자를 대상으로 간암 발병 여부를 진단하는데 사용하기 위한 물질로서, 진단대상으로부터 분리된 시료에 처리하여 시료 내의 메티오닌 및 오르니틴의 농도를 측정하여 간암 발병 여부를 진단하는데 사용될 수 있다.

예를 들어, 간암 의심 환자의 시료 내의 메티오닌 및 오르니틴의 농도와 정상 대조군에서의 농도를 비교하여 간암 의심 환자의 메티오닌 및 오르니틴의 농도가 더 높은 경우, 정상 대조군 대비 간암 발병율이 더 높다고 판단할 수 있다. 또는, 두 의심 환자의 시료 내 메티오닌 및 오르니틴의 농도를 비교하여 상기 대사체의 농도가 더 높은 환자의 경우, 간암이 발병되었을 가능성이 더 높거나, 병기가 더 많이 진행되었다고 판단할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 간경변과 간암을 구별하는 데 사용될 수 있다.

예를 들어, 간암 의심 환자의 시료 내의 메티오닌 및 오르니틴의 농도와 간경변 환자에서의 농도를 비교하여 간암 의심 환자의 메티오닌 및 오르니틴의 농도가 더 높은 경우, 간암이 발병되었다고 판단할 수 있다. 또는, 두 간경변 환자의 시료 내 메티오닌 및 오르니틴의 농도를 비교하여 농도가 더 높은 환자의 경우, 간암이 발병되었을 가능성이 더 높다고 판단할 수 있다.

상기 조성물은 더욱 명확한 간암 진단 용도로 활용하기 위해 프롤린, 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일카르니틴에 특이적으로 결합하거나 반응하는 물질을 더 포함할 수 있다.

프롤린, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴은 진단대상으로부터 분리된 시료 내에 존재하는 대사체로, 진단대상 및 시료는 전술한 바와 같다.

상기 물질은 프롤린, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴 중 어느 하나에 특이적으로 결합하거나 반응하여 이들 대사체를 검출할 수 있다면 제한되지 않으나, 예를 들면, 상기 대사체에 특이적인 유도체화 시약, 항체, 화합물, 단백질, 펩타이드, 핵산 또는 고분자를 포함할 수 있다.

상기 조성물이 메티오닌, 오르니틴, 프롤린, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴을 검출하는 물질을 모두 포함하는 경우, 보다 높은 정확도로 간암의 발병 여부를 진단할 수 있다.

예를 들어, 간암 의심 환자의 시료 내의 메티오닌, 오르니틴, 프롤린, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도와 정상 대조군에서의 농도를 비교하여 간암 의심 환자의 메티오닌, 오르니틴 및 프롤린의 농도가 더 높고, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도가 더 낮은 경우, 정상 대조군 대비 간암 발병율이 더 높다고 판단할 수 있다. 또는, 두 의심 환자의 시료 내 메티오닌, 오르니틴, 프롤린, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도를 비교하여 메티오닌, 오르니틴 및 프롤린의 농도가 더 높고, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도가 더 낮은 환자의 경우, 간암이 발병되었을 가능성이 더 높거나, 병기가 더 많이 진행되었다고 판단할 수 있다.

또한, 상기 조성물이 메티오닌, 오르니틴, 프롤린, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴을 검출하는 물질을 모두 포함하는 경우, 보다 높은 정확도로 간경변과 간암을 구별할 수 있다.

예를 들어, 간암 의심 환자의 시료 내의 메티오닌, 오르니틴, 프롤린, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도와 간경변 환자에서의 농도를 비교하여 간암 의심 환자의 메티오닌, 오르니틴 및 프롤린의 농도가 더 높고, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도가 더 낮은 경우, 간암이 발병되었다고 판단할 수 있다. 또는, 두 간경변 환자의 시료 내의 메티오닌, 오르니틴, 프롤린, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도를 비교하여 메티오닌, 오르니틴 및 프롤린의 농도가 더 높고, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도가 더 낮은 환자의 경우, 간암이 발병되었을 가능성이 더 높다고 판단할 수 있다.

본 발명은 메티오닌 및 오르니틴의 농도 정량수단을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 메티오닌 및 오르니틴의 농도를 측정하여 간암을 진단 할 수 있다.

상기 키트는 프롤린, 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일카르니틴의 농도 정량 수단을 더 포함할 수 있다.

프롤린, 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일카르니틴의 농도를 더 측정하는 경우, 더욱 명확하게 간암을 진단할 수 있다.

상기 대사체의 농도 정량 수단은 고속액체크로마토그래피(HPLC), 액체 크로마토그래피-질량분석(LC-MS), 가스 크로마토그래피-질량분석(GC-MS), 모세관 전기영동-질량분석(CE-MS), 직접 분사(direct infusion) 질량분석(DIMS), 액체 크로마토그래피-이온트랩 질량분석, 적외선 분광분석(FT-IR), 핵자기공명분광분석(NMR), 라만 분광분석, 말디토프 질량분석(MALDI-TOF MS), Triple-토프 질량분석(Triple TOF MS), Quadrupole-토프 질량분석(Q-TOF MS) 또는 이들의 조합을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 통상적으로 사용되는 대사체 분석 방법을 사용할 수 있다.

상기 키트는 상기 대사체에 특이적으로 결합하거나 반응하는 물질 또는 농도 분석에 적합한 하나 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 상기 대사체 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

구체적인 일례로, 상기 키트는 ELISA 키트, 샌드위치 ELISA등 다양한 ELISA 방법을 구현하기 위하여, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 이러한 ELISA 키트는 상기 대사체들에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 상기 대사체에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이 외에도, 상기 키트는 웨스턴 블롯, 면역침전분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석, 또는 단백질 칩 등을 구현하기 위한 키트일 수 있으며, 각 분석 방법에 적합한 부가적인 구성을 추가로 포함할 수 있다. 이 분석 방법들을 통하여, 항원-항체 복합체 형성량을 비교함으로써 간암을 진단할 수 있다.

본 발명은 진단대상으로부터 분리된 시료 내의 메티오닌 및 오르니틴의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 간암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

진단대상, 시료 및 물질은 전술한 바와 같다.

상기 농도를 측정하는 단계는 메티오닌 및 오르니틴을 검출하고, 이를 정량 수단 또는 농도 분석에 적합한 하나 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 이용하여 측정하는 것일 수 있다.

정량 수단 및 농도 분석 조성물, 용액 또는 장치는 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 농도를 정상 대조군의 농도와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 메티오닌 및 오르니틴의 농도를 간암 의심 환자의 시료 및 정상 대조군의 시료로부터 각각 측정하고, 상기 측정한 결과들을 서로 비교한 후, 간암 의심 환자의 시료에서 농도가 더 높게 측정되는 경우, 간암의 발병율이 더 높다고 판단 할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 농도를 간경변 환자의 농도와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 간암 의심 환자의 시료 내의 메티오닌 및 오르니틴의 농도와 간경변 환자에서의 농도를 비교하여 간암 의심 환자의 메티오닌 및 오르니틴 농도가 높은 경우, 간암이 발병되었다고 판단할 수 있다.

본 발명은 상기 측정된 농도를 하기 수학식 1에 대입하여 간암 발병 지수를 계산하는 단계를 더 포함할 수 있다.

[수학식 1]

(식 중, [Methionine] 및 [Ornithine]은 각각의 혈청 농도이다)

상기 간암 발병 지수가 간경변 환자의 값보다 큰 경우 간암이 발병되었다고 판단할 수 있고, 또한, 간암 발병 지수가 일정 수준 이상인 경우에 간암이 발병되었다고 판단할 수도 있다. 예를 들면 수학식 1의 값이 0.48 이상이면 간암이 발병되었다고 판단할 수 있다.

본 발명의 방법이 진단대상으로부터 분리된 시료 내의 프롤린, 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일카르니틴의 농도를 측정하는 단계를 더 포함하는 경우에, 보다 높은 정확도로 간암 발병 여부를 판단할 수 있다.

진단대상, 시료, 물질은 전술한 바와 같다.

상기 농도를 측정하는 단계는 프롤린, 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일카르니틴을 검출하고, 이를 정량 수단 또는 농도 분석에 적합한 하나 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 이용하여 측정하는 것일 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 메티오닌, 오르니틴, 프롤린, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도를 정상 대조군의 농도와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 간암 의심 환자의 시료 내의 메티오닌, 오르니틴, 프롤린, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도와 정상 대조군에서의 농도를 비교하여 간암 의심 환자의 메티오닌, 오르니틴 및 프롤린의 농도가 더 높고, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도가 더 낮은 경우, 정상 대조군 대비 간암 발병율이 더 높다고 판단할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 메티오닌, 오르니틴, 프롤린, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도를 간경변 환자의 농도와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 간암 의심 환자의 시료 내의 메티오닌, 오르니틴, 프롤린, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도와 간경변 환자에서의 농도를 비교하여 간암 의심 환자의 메티오닌, 오르니틴 및 프롤린의 농도가 더 높고, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 농도가 더 낮은 경우, 간암이 발병되었다고 판단할 수 있다.

본 발명은 상기 측정된 농도를 하기 수학식 2에 대입하여 간암 발병 지수를 계산하는 단계를 더 포함할 수 있다.

[수학식 2]

상기 간암 발병 지수가 간경변 환자의 값보다 큰 경우 간암이 발병되었다고 판단할 수 있고, 또한, 간암 발병 지수가 일정 수준 이상인 경우에 간암이 발병되었다고 판단할 수도 있다. 예를 들면 수학식 2의 값이 0.49 이상이면 간암이 발병되었다고 판단할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

1. 실험 대상

실험 대상에는 서울대학교병원에서 2개의 전향적 코호트에 등록된 환자가 포함되었다. 트레이닝 세트는 Barcelona Clinic Liver Cancer staging system에 기초한 극초기 또는 초기 HCC 환자 53명, 간경변 환자 47명 및 건강한 대조군 50명으로 구성되었다. 테스트 세트는 82명의 극초기 또는 초기 HCC 환자와 간경변 환자 80명으로 구성되었다. HCC는 대부분 국제 가이드 라인의 비침습적 기준에 따라 진단되었다. 간경변은 조직학적 또는 임상적 소견을 바탕으로 진단되었다. 대조군에는 간질환의 임상 또는 영상 증거가 없는 환자가 포함되었다. 임상 및 생화학적 데이터는 레지스트리 데이터베이스 또는 의료기록에서 확인하였다. 밤새 공복 혈청 샘플을 모든 환자로부터 수득하고, -80℃에서 보관하였다.

2. Gas Chromatography Time-of-Flight Mass Spectrometry(GC-TOFMS)를 사용한 전반적인 대사체학(global metabolomics)

냉동된 혈청 샘플을 4 ℃에서 해동하고, 각 샘플의 50 μL를 3:3:2 비율의 아세토니트릴, 이소프로판올, 물 혼합물 1 mL 로 희석하고, 이어서, 상청액 400 μL를 증발시켜 상온에서 완전히 건조시킨 후, 400 μL 부피의 50 % 아세토니트릴과 함께 재구성되었다. 이어서, 4 ℃, 18,341 × g에서 5 분 동안 원심분리를 반복한 후, 상청액을 증발시켰다. 잔류물은 피리딘에 용해된 메톡시아민과 N-메틸-N-(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드 및 지방산 메틸 에스테르의 혼합물과 함께 재구성되었다. 이어서, 분취량 1 μL를 페가수스 HT 비행 시간 질량 분석기 (Leco Corporation, St. Joseph, MI, USA)와 결합된 애질런트 7890 A 기체 크로마토그래피에 분할없는(splitless) 모드로 주입되었다. 전체 대사체 프로파일을 사용하여 검출된 1292개의 대사체 중에서, 실제 화합물과 비교하여, 상이한 체류 시간을 갖는 미지의 화합물 및 대사 산물을 배제하고, 나머지 값을 통계적으로 검증하였다. 통계 분석을 사용하여 마커 선택 후, 대사체의 농도를 표 1에 나타낸 바와 같이 정량화하였다.

3. Tandem Mass Spectrometry를 포함한 Liquid Chromatography(LC-MS/MS)를 이용한 표적 대사체학

혈청 샘플에서 대차체를 동시적이고 고수율로 검출하고 정량하는 LC-MS / MS 시스템과 함께 AbsoluteIDQ® p180 키트 (BIOCRATES Life Science AG, Innsbruck, Austria)를 사용하여 총 188 개의 대사체를 정량하였다. 이 플랫폼은 직접 흐름 주입 (아실카르니틴(acylcarnitines)과 글리세로인지질(glycerophospholipids)) 및 액체 크로마토그래피 (아미노산 과 biogenic amines) 질량 분석법이 결합되었다. 프로토콜은 제조업체의 지침에 따라 진행되었다. 간단히 말하면, 10 μL의 혈청을 표준 및 동위 원소-표지된 내부 표준을 함유하는 96-웰 키트 플레이트로 옮겼다. 혈청 샘플을 질소 기체 하에서 증발시킨 후, 페닐이소티오시아네이트(phenylisothiocyanate) 시약으로 유도체화 하였다. 이어서, 대사체를 표준 및 직접 주입 분석 질량 분석(direct injection analysis mass spectrometry)을 위해 메탄올 내에서 5mM 암모늄 아세테이트를 사용하여 추출하였고, LC-MS / MS 분석 및 데이터 처리를 수행하였다.

4. 통계분석

다변량, 일변량 및 농축 경로 분석은 Metaboanalyst 4.0 툴을 사용하여 수행되었다. 검출된 모든 이온의 총합에 기초하여 정규화된 데이터를 입력하고, 그룹 간의 전체 대사체 프로파일의 차이를 조사하기 위해 PCA를 수행하였다. 여러 테스트 문제는 Benjamini 및 Hochberg 방법을 사용하여 FDR을 조정하여 수정되었다. 선택된 대사체의 농도는 대사 변화 패턴을 의미있게 식별하고 해석하기 위해 Metaboanalyst 4.0을 사용하여 농축 경로 분석에 적용되었다. LC와 HCC간에 유의하게 다른 대사체는 Kyoto Encyclopedia of Genes 및 Genomes (KEGG)의 미리 정의된 대사 산물 경로와 일치되었다.

GC-TOFMS로부터 새로 식별된 대사체 및 AbsoluteIDQ® p180 키트 (BIOCRATES Life Sciences AG, Innsbruck, Austria)의 화합물을 포함한 정량화된 결과는 그룹 간의 거리를 최대화하고, 프로젝션에서 중요한 변수(VIP)의 분류에 중요한 기여를 하는 변수를 식별하기 위해 partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA)에 적용되었다. 모델에 대한 과적합의 위험을 평가하기 위해 순열 테스트를 1000 회 반복하였다.

FDR로 조정된 p-값이 0.05 미만이고 VIP 점수가 1.0보다 큰 대사 체는 예측 모델을 구성하기 위해 후보가 되었다. 마커 선택에 대한 자세한 절차는 도 1에 나타내었다. 범주형 데이터를 비교하기 위해 χ²또는 Fisher's exact test를 사용하였다. 피어슨 상관 분석(Pearson correlation analysis)과 이원 로지스틱 회귀분석(binary logistic regression)은 SPSS 25.0 소프트웨어 (IBM Corp., New York, USA) 패키지를 사용하여 수행되었다.

실험결과

1. 기준(baseline) 특성

트레이닝 및 테스트 세트에서 환자의 기준선 특성은 표 2에 나타내었다. 두 세트에서 검증 세트의 환자가 C형 간염 바이러스 관련 또는 비 바이러스성 간 질환을 가질 가능성이 더 높다는 것을 제외하고, 환자들은 유사한 기준 특성을 보였다. 각 그룹과 관련된 연령, 성별 및 간 기능과 같은 임상적 매개변수에는 통계적으로 유의한 변화가 없었다. 예상한 바와 같이 혈청 AFP 수준은 간경변 및 대조군보다 HCC 그룹에서 유의하게 더 높았다. 모든 환자는 극초기 또는 초기 단계 HCC를 가졌다.

2. 간 질환에 따른 전체 및 표적 대사체 프로파일링

대사체 프로파일의 흐름도는 도 2에 나타내었다. 광범위한 대사체 후보를 얻기 위해 트레이닝 세트에서 두 개의 다른 이온 분리 기술, 즉 GC-MS 및 LS-MS가 사용되었다. LC-MS기술은 바이오마커를 검증하기 위해 트레이닝 세트 및 테스트 세트에서 사용되었다.

도 3을 참조하면, GC-MS 분석으로부터 얻어진 대사체 특징은 감독되지 않은 패턴 인식 분석에 적용되었다. 트레이닝 세트에서 간경변과 HCC를 구별하는 대사체 바이오마커는 건강한 대상체와 비교하였고, 이것은 더 특징적인 마커 후보 선택을 가능하게 하였다. 주성분 분석(PCA) 점수 도표의 처음 두 주요 성분은 트레이닝 세트에서 25.7%의 정확성을 보여주었다. 도 3a는 클러스터된 그룹을 보여준다. 트레이닝 세트의 통계적 분석을 통해, 표 3에 나타낸 바와 같이 27개의 대사체가 확인되었다. 이 연구는 통계적 공식과 함께 사용될 수 있는 바이오마커 패널을 제공하는 것을 목표로 하였으므로, 이들 대사체들은 정량화되었다; 따라서, 다변량 분석으로부터의 대사체 후보를 후속적으로 정량화하였다. 그 중 18개 대사체가 최종적으로 세 그룹에서 유의하게 다른 것으로 확인되었다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 광범위한 표준 오차를 나타내는 시트르산은 제외하였다.

표적 분석을 위해, LC-MS 분석에 기초하여 188 대사체를 정량화 하였다. 이 기술은 각각의 샘플에 대한 40개의 아실카르니틴, 42개 아미노산, biogenic amines, 및 단당류; 15 스핑고지질; 및 90개의 글리세로인지질의 정량화된 데이터를 제공한다.

GC-MS 및 LC-MS 기반 분석이 모두 많은 수의 화합물을 동시에 수집하도록 지정되었으므로 다변량 및 일변량 분석은 false discovery rate (FDR) 조정으로 수행되었다. 프로젝션에서 중요한 변수(VIP) 점수를 갖는 대사체들은 도 3b에 도시된 바와 같이 감독 패턴 인식 분석 (PLS-DA)을 사용하여 분석하였다. PLS-DA 모델은 트레이닝 세트에서 간경변과 HCC를 비교할 때 18.6 %의 정확도를 나타냈다. 로지스틱 회귀 분석을 위한 변수를 포함하기 위해 0.05 미만의 FDR 조정 값과 1.0보다 큰 VIP 점수가 사용되었다.

3. HCC에 대한 잠재적인 대사체 바이오마커

잠재적으로 유용한 바이오마커를 선별하기 위해, 테스트 세트와 비교하여 동일한 경향의 변화를 동시에 보유한 바이오마커에 대한 추가 평가가 수행되었다. 간경변과 HCC를 구별하기 위해, 이원 로지스틱 회귀분석 및 역 단계적 방법의 최적화된 알고리즘을 사용하여 이러한 보유된 대사체 바이오마커를 사용하는 최상의 모델을 구성하였다. 궁극적으로 도 4와 같이 5개의 대사체 즉, 메티오닌, 오르니틴, 프롤린, 파이메릴카르니틴, 및 옥타노일카르니틴이 도출되었다. 5개의 대사체는 트레이닝 세트의 분산 분석(ANOVA)동안 FDR-조정된 p-값의 통계적 유의성을 나타냈다. 그들은 또한 건강한 대조군과 구별되었다(*, p-values < 0.05; **, p-values < 0.001; ***, p-values < 0.0001이다).

메티오닌, 오르니틴, 및 프롤린의 혈청 수준은 질병 중증도에 따라 점진적으로 증가하는 반면, 파이메릴카르니틴 및 옥타노일카르니틴의 혈청 수준은 감소하였다. 특히, 이들 대사체의 농도는 테스트 및 트레이닝 세트에서 유사하였다. 모든 하위 그룹의 대사체 농도는 표 5에 나열하였다.

이 5개의 대사체 바이오마커 중 HCC 환자를 진단하는 2개의 마커 결합은 메티오닌과 오르니틴이었고, HCC의 조기 진단을 위한 모델은 다음과 같이 구성되었다.

[수학식 1]

상기 [수학식 1]에서, [P = HCC]는 이 패널에 의한 HCC의 예측된 확률이고, [대사체]는 대사체의 혈청 농도를 나타낸다. 대사체 바이오마커 패널은 트레이닝 세트에서 the receiver operating curve (AUC)이 아래 면적이 0.783 (95%CI (신뢰도 간격):0.689~0.877) vs. 0.75(95% CI: 0.65~0.85)로 AFP의 패널과 비교하여 우수한 성능을 나타냈다. 또한, 테스트 세트에서는 AFP를 상당히 능가하였다(AUC:0.914; 95% CI: 0.873~0.956 vs. AUC: 0.78; 95% CI: 0.71~0.85). 0.48 의 컷오프값에서, 트레이닝 세트는 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)는 각각 77.4%, 76.6%를 보였다. 테스트 세트에서는 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 각각 81.7%, 88.8로 증가하였다.

또한, 5개의 대사체 바이오마커의 결합은 HCC 환자를 진단하는 데 더 효과적이며, 보다 높은 정확도로 간경변 환자와 구별할 수 있었다. HCC의 조기 진단을 위한 모델은 다음과 같이 구성되었다.

[수학식 2]

대사체 바이오 마커 패널은 트레이닝 세트에서 receiver operating curve (AUC) 아래 면적이 0.82 (95 % CI (신뢰도 간격): 0.73-0.91) vs. 0.75 (95 % CI: 0.65 ~ 0.85)로 표시된 바와 같이, AFP의 패널과 비교하여 상당히 우수한 성능을 나타냈다(도 5 및 표 6). 대사체 바이오 마커를 AFP와 조합하여 AUC 값을 0.85로 증가시켰다. 대사 바이오 마커의 성능은 테스트 세트에서 추가로 검증되었다. 이로부터 이들의 신뢰성과 높은 진단 가능성을 확인하였다. 바이오 마커는 또한 테스트 세트에서 AFP를 상당히 능가 하였다 (AUC : 0.94; 95 % CI : 0.91-0.98 대 AUC : 0.78; 95 % CI : 0.71-0.85). AFP와 바이오 마커를 결합하면 테스트 세트의 AUC 값이 0.97로 약간 증가하였다. 컷오프 값 0.49에서, 트레이닝 세트는 민감도 및 특이성은 각각 표 6에 나타낸 바와 같이 79.20 % 및 78.70 %였다. 테스트 세트에서는 민감도 및 특이성은 각각 82.70 % 및 91.30 %로 증가하였다. 표 6에서 볼 수 있듯이 AFP는 AUC가 0.98 (95 % CI : 0.96-1.00)로, HCC와 간경변보다 HCC와 건강한 대상체를 더 높은 정확도로 구분하였다. 또한, 바이오 마커는 AUC가 0.99 (95 % CI : 0.98-1.00)로 HCC를 명확하게 예측하고 바이오 마커를 AFP와 조합하여 1.00 (95 % CI : 1.00-1.00)을 나타냈다. 차등 대사 산물 함량과 AFP 사이의 피어슨 상관 계수는 파이메릴카르니틴을 제외하고 유의한 상관 관계를 나타내지 않았는데, 이는 트레이닝 세트에서만 -0.2의 상관 계수 및 p-값 0.042를 나타냈다. 이러한 결과는 대사체 패널이 유용할 강력한 잠재력을 가지며, HCC의 차별에 대한 AFP의 예측 가능성에 비해 우수한 예측 가능성을 나타낸다는 것을 시사한다.

4. 경로 농축 분석

HCC와 간경변 사이의 생물학적 관련성을 제공하기 위해, 경로 농축 분석이 수행되었다. 전체 대사체 프로파일링에서 확인된 18 개의 대사체의 농도는 입력 데이터로 입력되었다. 대사체 경로 지형학적(topological) 분석은 간경변과 HCC의 차등 상관의 중심성을 측정하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, HCC-유도된 대사체 교란은 암모니아 재순환, 요소 순환, 및 글리신, 세린, 메티오닌 및 아르기닌 및 프롤린의 대사와 밀접한 관련이 있다. 또한, 글루탐산, 티로신, 알라닌, 베타-알라닌 및 아스파르트산의 대사 및 스퍼미딘(spermidine)과 스퍼민(spermine)의 생합성은 HCC와 간경변 사이의 대사체의 변화와 관련이 있었다. 도 6에 나와있는 대사체 경로의 힘은 0.001 미만의 FDR 조정된 p- 값 및 0.05 미만의 Holm p-값으로 승인되었다. 농축 폴드(fold)를 포함한 경로 농축에 대한 개요를 도 7에 나타냈다(각 막대 그래프의 너비는 fold enrichment의 크기를 나타내고, 막대 그래프의 색상은 각 대사체 경로의 p-value 값이다). 이러한 결과는 건강한 대상체 및 간경변 환자와 비교할 때, HCC 환자는 암모니아 재순환, 요소 순환 및 아미노산 대사에 더 많은 결함이 있을 수 있음을 나타낸다.

Claims

메티오닌에 특이적으로 결합하거나 반응하는 물질; 오르니틴에 특이적으로 결합하거나 반응하는 물질; 및 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일카르니틴에 특이적으로 결합하거나 반응하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 프롤린에 특이적으로 결합하거나 반응하는 물질을 더 포함하는, 조성물.
메티오닌; 오르니틴; 및 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일카르니틴의 농도 정량수단을 포함하는 간암 진단용 키트.
청구항 3에 있어서, 프롤린의 농도 정량수단을 더 포함하는 간암 진단용 키트.
진단대상으로부터 분리된 시료 내의 메티오닌 및 오르니틴의 농도를 측정하는 단계; 및
상기 측정된 농도를 하기 수학식 1에 대입하여 간암 발병 지수를 계산하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보제공방법:
[수학식 1]
Logit [P]= EXP(-3.495 + 0.038*[Methionine] + 0.015*[Ornithine]) / 1 + EXP(-3.495 + 0.038*[Methionine] + 0.015*[Ornithine])
(식 중, [Methionine] 및 [Ornithine]은 각각의 혈청 농도이다).
청구항 5에 있어서, 상기 메티오닌 및 오르니틴의 농도가 정상 대조군 보다 높으면 정상 대조군 대비 간암 발병 확률이 높다고 판단하는, 방법.
삭제
청구항 5에 있어서, 상기 수학식 1의 값이 간경변 환자의 값보다 큰 경우 간암이 발병되었다고 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 수학식 1의 값이 0.48 이상인 경우 간암이 발병되었다고 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.
진단대상으로부터 분리된 시료 내의 메티오닌; 오르니틴; 및 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일카르니틴의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 간암 진단을 위한 정보제공방법.
청구항 10에 있어서, 상기 파이메릴카르니틴 또는 옥타노일카르니틴 농도가 정상 대조군 보다 낮으면 정상 대조군 대비 간암 발병 확률이 높다고 판단하는, 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 측정하는 단계에서 상기 시료 내의 프롤린의 농도도 측정하고, 상기 측정된 농도를 하기 수학식 2에 대입하여 간암 발병 지수를 계산하는 단계를 더 포함하는, 방법:
[수학식 2]
Logit [P]= EXP(-1.716 + 0.035*[Methionine] + 0.002*[Proline] + 0.009*[Ornithine] + 24.584*[Pimelylcarnitine] - 14.088*[Octanoylcarnitine]) / 1 + EXP(-1.716 + 0.035*[Methionine] + 0.002*[Proline] + 0.009*[Ornithine] + 24.584*[Pimelylcarnitine] - 14.088*[Octanoylcarnitine])
(식 중, [Methionine], [Ornithine], [Proline], [Pimelylcarnitine] 및 [Octanoylcarnitine]은 각각의 혈청 농도이다)
청구항 12에 있어서, 상기 수학식 2의 값이 간경변 환자의 값보다 큰 경우 간암이 발병되었다고 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 수학식 2의 값이 0.49 이상인 경우 간암이 발병되었다고 판단하는 단계를 더 포함하는, 방법.