KR101788414B1

KR101788414B1 - 간암 조기 진단용 바이오마커 및 그 용도

Info

Publication number: KR101788414B1
Application number: KR1020150172020A
Authority: KR
Inventors: 김영수; 윤정환; 김현수
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-12
Filing date: 2015-12-04
Publication date: 2017-10-19
Also published as: EP3232198A1; KR20160072027A; CN107110867A; EP3232198A4; CN107110867B

Abstract

본원은 간암을 높은 정확도와 민감도로 간암의 진단, 예후 또는 치료 모니터링이 가능한 마커 또는 마커의 조합을 개시한다. 본원에 따른 마커는 혈액을 이용한 비침습성 검사로 간단하고 유효성 있는 간암 진단 또는 모니터링이 가능하여, 다양한 검사 키트로 개발될 수 있으며, 예를 들면 POCT 개발을 통한 가정 및 일반 의원에서의 간암 조기 발견에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

간암 조기 진단용 바이오마커 및 그 용도 {Biomarker for diagnosis of liver cancer and use thereof}

본 발명은 간암 진단용 바이오마커 및 그 용도와 관련된 것이다.

간암 또는 간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)은 성인 간암에서 가장 흔한 유형으로, 암으로 인한 사망원인 중 세 번째를 차지한다 (Stefaniuk P, et al., 2010, World J Gastroenterol 16: 418-424). 간암은 상당히 진행 되서야 증상이 나타나는 질환으로 이로 인해 적절한 치료시기를 놓치는 경우가 빈번하고, 치료를 하는 경우도 예후가 극히 나쁘다. 특히 수술로 절제가 불가능한 경우는 1년 내 사망하는 심각한 질환으로, 이러한 임상적 현실을 고려할 때 암의 조기 진단 및 예후를 예측할 수 있는 기술은 암 치료의 가장 현실적 대안이고 차세대 간암 진료의 가이드라인이다.

특히 간세포암은 간염바이러스나 알코올, 간경화와 같은 위험인자를 가지고 있는 환자에게서 호발하는 것으로 알려져 있고 조기진단 마커를 이용하여 고위험군에 대한 선별적 감시 검사(surveillance)를 시행할 대상이 명확하다. 실제로, 6개월 간격으로 시행하는 조기진단은 간암 환자의 생존율 증대 (사망률 37% 감소)하는 것으로 나타났다.

정상인에서 간암을 조기에 정확하게 발견해 낼 수 있는 바이오마커 검사는 아직까지 개발되지 못했으며, 고위험군에서 비침습적인 조기 간암 진단을 위하여 사용하고 있는 검사 방법이 혈청 알파태아단백 검사이다. AFP는 개발 당시 민감도와 특이도를 모두 양호한 수준으로 달성할 수 있는 기준값이 20 ng/mL로 제시되었으나, 이 경우 민감도가 60%에 지나지 않으며 현재 국제 학회의 간암 진단 가이드라인에 따라 200 ng/mL를 기준으로 간암을 진단할 경우 특이도는 상승하지만 민감도가 22%에 불과하다. 기존의 연구 결과, AFP는 전체적으로 약 66%의 민감도와 82%의 특이도를 갖는 것으로 알려져 있어 모든 간암 환자를 진단하는 데에 제한이 있다.

그 외 진단 기준으로 확립되어 있지는 않으나 간암 진단에 도움이 되는 혈청 마커로는 Descarboxyprothrombin (DCP), Prothrombin Induced by Vitamin K Absence II (PIVKA-II), 글리코실화 AFP 대 총 AFP (L3 fraction) 분포, alpha fucosidase, glypican 3, HSP-70 등이 있다. 그러나 각각은 예후 인자로서 의미를 가지는 것이 대부분이고, 단독으로 사용하였을 때 정확도가 낮아 아직 선별 검사로 사용되지 못하고 있으며, 단일 혈청학적 마커로 간암을 조기 진단하는 것은 이미 한계에 다다른 것으로 판단된다. 아울러 실제 수술이나 고주파 열치료술과 같은 근치적 치료가 가능한 단계에서 진단되는 환자들은 전체 간암 환자의 30% 정도에 국한된다.

미국 공개특허공보 제2010/0304372호는 간암 진단 방법 및 조성물에 관한 것으로, BASF1, SPINT2, APC, CCND2, CFTR, RASSF1 및 SRD5A2 유전자에 CpG 섬을 검출하여 간암을 진단하는 방법을 개시한다.

대한민국 특허 제1161789호는 간암에 대한 신규 바이오마커 및 그 용도에 관한 것으로, NK4 단백질 등의 검출을 통한 간암 진단 또는 예후 분석용 마커를 개시한다.

따라서, 간암의 근치적 치료가 가능한 단계에서 최대한 조기진단 할 수 있는 특이성과 민감도가 향상된 개별검사의 한계점을 극복할 수 있는 마커의 개발이 시급하다.

본원에서는 간암을 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하고자 한다.

일 구현예에서 본원은 ALS (Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit); AMBP (Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor); CPB2 (Carboxypeptidase B2); CHLE (Cholinesterase); CLUS (Clusterin); CNDP1 (Beta-Ala-His dipeptidase); CO6 (Complement component C6); CPN2 (Carboxypeptidase N subunit 2); FA11 (Coagulation factor XI); FINC (Fibronectin); HGFA (Hepatocyte growth factor activator); IBP3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3); IGF2 (Insulin-like growth factor II); ITIH1 (inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1); KAIN (Kallistatin); KLKB1 (Plasma kallikrein); LCAT (Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase); PLGA (Plasminogen-related protein A); PLMN (Plasminogen); THRB (Prothrombin); VTDB (Vitamin D binding protein); 및 VTNC (Vitronectin)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 검출시약을 포함하는, 간암 진단 또는 예후 측정용 조성물을 제공한다.

다른 양태에서 본원은 간암의 진단 또는 예후 측정 또는 이에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 ALS (Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit); AMBP (Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor); CPB2 (Carboxypeptidase B2); CHLE (Cholinesterase); CLUS (Clusterin); CNDP1 (Beta-Ala-His dipeptidase); CO6 (Complement component C6); CPN2 (Carboxypeptidase N subunit 2); FA11 (Coagulation factor XI); FINC (Fibronectin); HGFA (Hepatocyte growth factor activator); IBP3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3); IGF2 (Insulin-like growth factor II); ITIH1 (inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1); KAIN (Kallistatin); KLKB1 (Plasma kallikrein); LCAT (Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase); PLGA (Plasminogen-related protein A); PLMN (Plasminogen); THRB (Prothrombin); VTDB (Vitamin D binding protein); 및 VTNC (Vitronectin)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 존재 여부 및/또는 농도를 검출하는 단계; 상기 핵산 또는 단백질의 수준 또는 존재에 대한 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 핵산 또는 단백질 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 간암으로 판정하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 간암 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본원에 따른 마커는 혈액시료를 이용하여 검출이 가능하며, 정상인, 간염, 간경화 또는 간암으로 치료 후 완치된 환자 유래의 시료와 비교하여 간암환자에서 차별적으로 발현되어, 간암 환자의 진단, 간경화 환자에서 간암으로 이행되는 조기 진단, 치료 후 경과 측정에 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 바이오마커는 간암을 높은 특이성과 민감도로 진단할 수 있다. 특히 간암 환자는 물론, 간경화와 간암환자를 구분할 수 있어, 간경화 환자에서 간암 환자로 진행되는 환자를 미리 조기진단 할 수 있고, 간암이 완치되어 간암이 제거 된 상태의 간경화 환자를 구분할 수 있어, 간암 치료 예후를 예측하는데 이용할 수 있다.

또한, 본원에 따른 마커는 혈액을 이용한 비침습성 진단을 가능하게 가정 및 일반 의원에서의 조기 발견에 매우 유용하며, 건강 검진 시 단순한 혈액 검사를 통해 간암을 검출할 수 있어 국가적인 관점에서 의료 비용의 절감 효과를 가지고 올 수 있다.

본원에 따른 바이오마커는 이에 대한 항체, 단백질 또는 펩타이드를 이용한 진단키트 예를 들면 ELISA, 딥스틱 형태의 래피드 키트, 펩타이드를 근간으로 하는 MRM 키트 형태로 개발이 가능하다. 특히 기존 병원 임상 영역에서의 면역분석 방법 대신에 펩타이드를 MRM 으로 검사하는 방법으로 산업화할 수 있고, 나아가 간암 마커로 알려진 AFP 와 함께 가중치를 두어 분석을 하면, 기존의 간암 진단법을 개선하고 능가하는 방법으로 활용될 수 있다.

도 1은 바이오마커 발굴 및 분석에 사용된 MRM 분석 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 혈액의 내인성 펩타이드와 합성 펩타이드의 동시-용출(coelution) 여부를 나타낸 것이다.
도 3은 혈액의 내인성 펩타이드와 합성 펩타이드의 Q3 강도 패턴을 나타낸다.
도 4는 혈액의 내인성 펩타이드 수준 확인방법을 나타낸다.
도 5는 혈액의 내인성 펩타이드 농도 측정 후 그 결과를 다이내믹 레인지(dynamic range) 분포로 나타낸 것이다.
도 6은 저량 및 고량(low and high abundance) 타겟에 대한 혈액 내 수준을 나타낸 것이다.
도 7은 SIS 펩타이드 주입 농도 결정 방식을 모식도로 나타낸 것이다.
도 8은 LC 그룹 대 HCC 그룹 사이의 다중단백질 마커 패널 구축 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 HCC 그룹 대 회복 그룹 사이의 다중단백질 마커 패널 구축 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 조기진단 마커를 검증하기 위해, 발현 경향성이 일치한 10개의 타겟 단백질에 대한 웨스턴 블랏팅 결과를 나타낸 것으로, 도 10a는 단백질-01, A2AP (alpha-2 -antiplasmin), 도 10b는 단백질-02, AMBP, 도 10c는 단백질-03, AFP(alpha- fetoprotein), 도 10d는 단백질-04, CATB(cathepsin B), 도 10e는 단백질-05, FETUA(alpha-2- HS-glycoprotein), 도 10f는 단백질-06, FINC(fibronectin), 도 10g는 단백질-07, ITIH1(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1), 도 10h는 단백질-08, ITIH3(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3), 도 10i는 단백질-09, PLGA(Plasminogen-related protein A), 도 10j는 단백질-10. THRB(Prothrombin)을 나타낸다.
도 11은 표 2에 해당하는 결과를 나타낸다.

본원은 MRM 기술을 이용하여 간경변, 간암 환자 치료 전 및 치료 후의 시료를 대상으로 차별적으로 발현되는 단백질/펩타이드 발현량을 순차적으로 스크리닝하고 검증하여, 그룹 간에 유의적 차이를 나타내어 간암 진단용 바이오마커로 유용한 단백질/펩타이드 발견을 근거로 한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 IGFALS (Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit); AMBP (Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor); CPB2 (Carboxypeptidase B2); CHLE (Cholinesterase); CLUS (Clusterin); CNDP1 (Beta-Ala-His dipeptidase); CO6 (Complement component C6); CPN2 (Carboxypeptidase N subunit 2); FA11 (Coagulation factor XI); FINC (Fibronectin); HGFA (Hepatocyte growth factor activator); IBP3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3); IGF2 (Insulin-like growth factor II); ITIH1 (inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1); KAIN (Kallistatin); KLKB1 (Plasma kallikrein); LCAT (Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase); PLGA (Plasminogen-related protein A); PLMN (Plasminogen); THRB (Prothrombin); VTDB (Vitamin D binding protein); 및 VTNC (Vitronectin)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 검출시약을 포함하는, 간암 진단 또는 예후 측정용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

본원에서 간암 또는 간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)은 알콜 남용, 바이러스성 간염 및 대사성 간질환과 같은 위험인자를 갖는 환자에서 발생하는 간조직 자체에서 발생하는 원발성 악성 종양을 일컫는 것이다. 간암은 섬유성 스트로마가 없어 출혈과 세포괴사가 발생하며, 간문맥 시스템으로의 혈관침윤이 일어나며, 심한 경우 간파열 및 복강내혈액삼출로 이어질 수 있다. 이러한 간암은, 간에서 발생 된 만성 염증으로, 간조직이 재생결절화되고 섬유화되어 결국 간세포 손상, 반흔, 간기능 감소, 복수, 출열성 질환, 간성 혼수 증상을 나타내는 간경변증 또는 간경화증과 구별된다. 간암 환자의 경우 보통 간염 (inflammation) 및 간경화 (fibrosis) 를 모두 가지고 있는데, 간염의 경우 약제에 의해 대부분의 간암 환자에서 없어지지만, 간경화 환자에서 90% 정도가 간암으로 진단되기 때문에 간경화증과 간암을 구별하는 것이 중요하다.

본원에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 트랜지션성 암 상태의 동정, 암의 단계 또는 진행상태 판별 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정을판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본원에서 예후 측정은 간암으로 진단 후 치료를 받고 회복 여부를 판별하는 것을 포함하는 것이다.

본원에서 용어 진단용 바이오마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 간암이 발생한 환자를, 간경변, 정상 세포 또는 적절한 간암치료를 받은 환자와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 대조군 검체에 비하여 간암이 발생한 환자 유래의 시료 특히 혈액에서의 농도 변화를 나타내는 단백질, 상기 단백질 유래의 폴리펩타이드, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 포함한다.

본원에 따른 바이오마커는 대조군의 시료와 비교하여 간암 환자의 혈액에서 그 양이 증가한 것으로, 그 서열은 예를 들면 표 1에 기재된 ID로 UniProt DB (www.uniprot.org)에서 검색가능하다.

본원에 따른 마커는 하나 또는 두 개 이상의 조합, 예를 들면 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개의 조합으로 사용될 수 있으며, 기존의 마커 예를 들면 AFP, 및/또는 진단방법 예를 들면 간초음파 등과 함께 사용될 수 있다. 당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법과 같은 정상인 및 환자를 포함하는 대상체의 생물학적 시료를 사용한 분석 및/또는 Logistic regression 분석과 같은 방법을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있을 것이다.

본원에 따른 일 구현예에서는 특히 ALS, CBPB2, CLUS, CNDP1, CPN2, FA11, FINC, 또는 HGFA 중 하나 이상의 마커가 사용되며, 상기 마커는 본원에 실시예에 기재된 바와 같은 일차 및 이차 시료군 모두에서 높은 AUC 값으로 대조군과 간암 환자에서 차별적 발현을 나타냈다.

본원에 따른 다른 구현예에서는 FINC 마커 단독, 또는 THRB 및 FINC; 또는 ALS, ITIH1, THRB 및 FINC 조합으로 사용된다.

본원에 따른 다른 구현예에서 간암 치료 후 회복여부를 판별하는 바이오마커는 THRB, FINC, ITIH1, IBP3, PLMN, CBPB2 및 PLGA로 구성되는 군으로부터 선택되며, 상기 마커 또는 마커의 조합은 특히 높은 AUC 값을 가지나, 다른 마커의 조합을 배제하는 것은 아니다.

다른 구현예에서 본원에 따른 하나 이상의 마커는 AFP 마커와 조합으로 사용될 수 있다.

본원에 따른 마커는 정량적 또는 정성적 분석을 통해 핵산, 특히 단백질 및/또는 mRNA의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출될 수 있다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

이러한 본원에 따른 마커의 검출은 마커의 기능적 특징 및/또는 항원적 특징에 기반을 둔 것일 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커는 마커의 활성 또는 기능의 검출, 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준에서 특이적으로 상호작용하는 물질을 사용하여 검출될 수 있다.

다른 구현예에서 본원에 따른 마커의 검출은 마커 단백질 유래의 상응하는 펩타이드 예를 들면 표 1-1 및 2에 기재된 각 마커별로 상응하는 펩타이드의 검출을 통해 수행될 수 있다. 하나의 단백질에 대하여 하나 또는 두 개 이상의 펩타이드가 사용될 수 있다.

이런 측면에서 본원에 따른 조성물에 포함되는 검출시약은 본원에 따른 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 다양한 방식으로 정량적 또는 정성적 분석을 통해 검출할 수 있는 시약이다.

본원에 따른 마커의 정량적 및 정성적 분석에는 공지된 단백질 또는 핵산을 정성 또는 정량적으로 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있다.

단백질 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합, 질량분석기 또는 항체를 이용한 단백질 어레이 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

또는 핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 핵산 전사 및 증폭 방법, eTag 시스템, 표지된 비드를 기본으로 하는 시스템, 핵산 어레이와 같은 어레이 시스템 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 chip-based capillary electrophoresis: Colyer et al. 1997. J Chromatogr A. 781(1-2):271-6; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 질량분석법 (Mass spectrometry)을 이용하여 마커를 검출할 수 있으며, 이는 검체로부터 단백질 또는 펩타이드를 분리한 후 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방식대로 분석될 수 있으며, 또한 예를 들면 (Kim, et al. 2010 J Proteome Res. 9: 689-99; Anderson, L et al. 2006. Mol Cell Proteomics 5: 573-88.)를 참조할 수 있다. 한 구현예에서는 예를 들면 Triple Quadrupole LC-MS/MS, QTRAP 등을 이용한 다중반응모니터링 (Multiple reaction monitoring, MRM) 기술이 사용된다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 전구이온 또는 모이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 전구이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 산물이온 또는 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. 예를 들면 Gillette et al., 2013, Nature Methods 10:28-34에 기재된 것을 참조할 수 있다.

다른 구현예에서는 각 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA와 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용된다.

또 다른 구현예에서는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출할 수 있다.

다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 또는 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자 등이 사용될 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다.

본원의 마커는 또한 핵산 수준 특히 mRNA 수준에서의 공지된 다양한 방법을 사용하여 정량적 및/또는 정성적으로 검출될 수 있다.

핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 mRNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석(NPA) 예를 들면 RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 노던블랏은 세포에 존재하는 전사체의 크기를 알 수 있으며, 다양한 프로브를 사용할 수 있는 장점이 있으며, NPA는 다중 마커 분석에 유용하며, in situ 교잡법은 mRNA와 같은 전사체의 세포 또는 조직내 위치 파악에 용이하며, 역전사 중합효소연쇄반응은 적은 량의 시료 검출에 유용하다. 또한 본원에 따른 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA 또는 cRNA와 같은 핵산과 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용될 수 있다.

상기 핵산 수준에서의 바이오마커의 검출 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 mRNA의 존재 여부와 그 양을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로는 예를 들면 중합효소, 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍을 포함한다. “프라이머” 또는 “프로브”는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 상술한 바와 같은 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 mRNA 검출을 위해 노던블랏 또는 역전사 PCR (중합효소연쇄반응)이 사용된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H. et al, 2002. Cancer Res. 62: 2890-6)에 기재되어 있다.

본원에 따른 조성물에 포함되는 검출시약은 검출에 사용되는 구체적 방법에 따라 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3, Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성입자 및 고밀도전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.

본원의 조성물은 추가로 결합분석에 필요한 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들면 결합 버퍼, 시료 준비에 필요한 시약, 혈액채취용 주사기 또는 음성 및/또는 양성대조군을 추가로 포함할 수 있다.

상술한 바와 같은 다양한 검출시약을 포함하는 본원의 조성물은 분석양태에 따라 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, MRM 분석용 키트, 마이크로어레이용, 유전자증폭용, 또는 면역분석용 등으로 제공될 수 있으며, 분석 양태에 맞추어 적절한 검출시약을 선별할 수 있을 것이다.

일 구현예에서는 ELISA 또는 딥스틱 래피드 키트가 사용되며, 이 경우 본원에 따른 하나 이상의 마커를 인식하는 항체가 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다. 딥스틱의 경우, POCT (Point of Care Test) 분야에서 널리 이용되는 기술로, 본원에 따른 바이오마커를 인식하는 하나 이상의 항체가 나이트로셀룰로스와 같은 기질에 결합되어 있고, 이를 혈청과 같은 시료와 접촉시 예를 들면 딥스틱의 일 말단을 혈청시료에 답그면, 시료가 모세관 현상에 의해 기질을 이동하여, 기질 중의 항체와 결합시 발색하는 방식으로, 마커를 검출하는 것이다.

다른 구현예에서는 펩타이드를 근간으로 하는 MRM 키트가 제공되며, MRM 방식에 대하여는 앞서 설명한 바와 같다. MRM 방법은 특정 단백질을 선택적으로 인식하는 펩타이드를 이용하는 것으로, 온도, 습도 등 환경에 민감한 항체를 이용하는 기존의 방법과 비교하여, 보다 안정적으로 생체시료에서 마커를 검출할 수 있다. 예를 들면 펩타이드는 본원 표 1-1 및 1-2에 기재된 것이 사용될 수 있으며, 하나의 마커에 하나 또는 두 개 이상의 펩타이드가 사용될 수 있다. 예를 들면 단백질에 해당하는 펩타이드(단문자 아미노산으로 표시)는 Prothrombin (THRB) - HQDFNSAVQLVENFCR, SGIECQLWR; Fibronectin (FINC)-WCGTTQNYDADQK, GEWTCIAYSQLR, HTSVQTTSSGSGPFTDVR; ITIH1-EVAFDLEIPK, LDAQASFLPK; IBP3-ALAQCAPPPAVCAELVR; PLMN-LSSPAVITDK, EAQLPVIENK; CBPB2-DTGTYGFLLPER, YPLYVLK; PLGA-DVVLFEK와 같다.

다른 구현예에서, 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 제공될 수 있다. 유리 또는 나이트로셀룰로스와 같은 기질의 표면에 검출시약이 부착될 수 있으며, 어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 어레이에 부착될 수 있는 검출시약은 예를 들면 한 단백질에 특이적 결합이 가능한 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함한다.

다른 양태에서 본원은 바이오마커의 검출시약을 포함하는 간암 진단 또는 예후 분석용 키트 또는 시스템에 관한 것이다. 검출 시약 및 이러한 시약이 사용되는 방법은 상술한 바와 같다. 이러한 본원의 마커를 검출할 수 있는 시약은 구획이 되어 있는 용기에 개별적으로 분주되어 존재할 수 있으며, 이러한 의미에서 본원은 또한 본원의 마커 검출시약을 구획되어 포함하는 장치/기구에 관한 것이다. 또한 키트는 사용안내서를 추가로 포함할 수 있다.

또다른 양태에서 본원은 간암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 ALS (Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit); AMBP (Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor); CPB2 (Carboxypeptidase B2); CHLE (Cholinesterase); CLUS (Clusterin); CNDP1 (Beta-Ala-His dipeptidase); CO6 (Complement component C6); CPN2 (Carboxypeptidase N subunit 2); FA11 (Coagulation factor XI); FINC (Fibronectin); HGFA (Hepatocyte growth factor activator); IBP3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3); IGF2 (Insulin-like growth factor II); ITIH1 (inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1); KAIN (Kallistatin); KLKB1 (Plasma kallikrein); LCAT (Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase); PLGA (Plasminogen-related protein A); PLMN (Plasminogen); THRB (Prothrombin); VTDB (Vitamin D binding protein); 및 VTNC (Vitronectin)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 존재 여부 및/또는 농도를 검출하는 단계를 포함하는 간암 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

이러한 본원은 방법은 추가로 상기 핵산 또는 단백질의 수준 또는 존재에 대한 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 핵산 또는 단백질 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재 여부에 변화가 있는 경우, 이를 간암으로 판정하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 방법에서 간암 환자의 진단을 위해 대조군으로 사용될 수 있는 시료는 정상인, 간염, 간경화 또는 간암으로 치료 후 완치된 환자 (간경화 유지) 유래의 시료가 사용될 수 있다. 이러한 대조군 환자와 비교하여, 간암 환자에서 본원에 따른 마커의 발현량이 증가된다.

본원에 따른 방법에 사용되는 생물학적 시료는 전혈, 혈청 또는 혈장이 사용된다.

본원에 따른 마커는 정상인 유래의 시료는 물론, 간경화 환자와 비교하여 간암환자에서 그 발현량이 증가한다.

따라서 본원에 따른 방법에서 간암 진단은 간경화와 간암 환자를 구분할 수 있기 때문에 간경화에서 간암으로 진행되는 환자를 진단할 수 있어 특히 조기 진단에 유리하다. 이 경우, 대조군으로서 간경화 환자 유래의 시료를 포함할 수 있으며, 간경화 환자 유래의 시료는 간경화를 유지하는 간암 완치 환자를 포함하는 것이다. 또한 간암 치료 후 회복된 환자의 판별에도 유리하다. 이 경우, 동일 환자의 유래의 간암 시료가 대조군으로 사용될 수 있다.

본원에서 생물학적 시료란 바이오마커 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 체액, 특히 전혈, 혈장, 혈청 또는 뇨를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 다른 구현예에서는 치료 후 회복여부를 판별하는 바이오마커는 THRB, FINC, ITIH1, IBP3, PLMN, CBPB2 및 PLGA로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

본 방법에 사용되는 대조군 또는 참조군, 바이오마커 검출 방법 및 이에 사용되는 시약 및 판정을 위한 데이터 분석 방법은 앞서 설명한 것 및 후술하는 것을 참고할 수 있다.

본원에 따른 방법은 앞서 언급한 방법, 또는 검출 시약을 사용하는 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 특히 단백질 또는 핵산 마이크로어레이 분석법, 핵산증폭, 항원-항체 반응, 또는 질량분석 방식으로 실시될 수 있다.

본원의 방법은 포유류 특히 인간을 대상으로 포함한다. 인간 대상체는 HCC가 발병했을 것으로 의심되는 사람, 간염, 간경화 환자, 또는 의심되지 않는 사람으로 HCC 진단여부가 필요한 사람을 포함한다. 일 구현예에서, 본 방법은 간질환 관련 증상 예를 들면 복부통증, 비대간, 복수, 황달, 근육쇠약, 간염 (예를 들면 HCV 감염), 또는 식도 정맥류 등과 같은 대상체가 HCC 여부를 결정하기 위한 다른 증상을 가진 대상체에게 수행될 수 있다. 다른 구현예에서는 외관상으로는 정상으로 HCC 증상을 나타내지 않는 대상체이다.

다른 구현예에서, 대상체는 혈장 AFP 농도가 낮거나 또는 정상일 수 있어, AFP를 기준으로는 HCC로 진단되지 않을 수도 있는 사람이다. 이러한 경우, AFP의 혈청 농도는 약 0 μg/l (비검출) 내지 20 μg/l, e.g., 0 μg/l (비검출) 내지 5 μg/l, 5 μg/l 내지 10 μg/l, 10 μg/l 내지 15 μg/l, 또는 15 μg/l 내지 20 μg/l 일 수 있다.

상술한 방법을 사용하여 두 개 이상을 포함하는 마커의 조합을 사용하는 경우 프로파일, 즉 시료 중 마커 단백질 발현과 관련된 정량적 정보를 포함하는 데이터세트가 생성될 수 있다.

마커를 이용하여 프로파일을 수득한 후에, 참조군 또는 대조군과의 결과 비교를 통해 대상체의 시료의 간세포암 여부를 판별한다. 대조군 또는 참조군으로는 음성 대조군으로 정상 시료, 또는 간세포암에 걸린 후 치료된 환자 유래의 시료, 양성대조군으로 본원에 따른 마커 이외에 방법으로 간세포암으로 판정된 환자 유래의 시료, 간경화 환자 유래의 시료, 간염 유래 환자의 시료일 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 정상인 유래의 시료, 간세포암으로 판정후 치료를 받은 환자 유래의 시료가 대조군 또는 참조군으로 사용되어, 수득된 프로파일의 비교에 사용된다.

대조군과 시료를 이용한 시험군 사이의 마커 프로파일의 비교에는 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 발현 프로파일의 디지털 영상 비교, 발현 데이터에 대한 DB를 이용한 비교, 또는 U.S. 특허 6,308,170 및 6,228,575에 기재된 것을 참조할 수 있다.

본원에 따른 마커 검출을 통하여 수득된 프로파일은 공지의 데이터 분석방법을 이용하여 처리될 수 있다. 예로는 nearest neighbor classifier, partial-least squares, SVM, AdaBoost 및 clustering-based classification 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Ben-Dor et al (2007, J. Comput. Biol. 7: 559-83), Nguyen et al (2002, Bioinformatics 18:39-50), Wang et al (2003, BMC Bioinformatics 4:60), Liu et al (2001, Genome Inform. Ser. Workshop Genome Inform.12:14-23), Yeang et al (2001, Bioinformatics 17 Suppl 1:S316-22) 및 Xiong (2000, Biotechniques 29(6):1264-8, 1270) 등을 포함하는 문헌을 참조할 수 있다.

또한 본원의 마커를 통하여 검출된 결과가 간세포암 판별에 유의한 것으로 판정하기 위해 다양한 통계처리 방법이 사용될 수 있다. 통계적 처리 방법으로 일 구현예에서는 logic regression 방법이 사용되며, Ruczinski, 2003, Journal of Computational and Graphical Statistics 12:475-512를 참조할 수 있다. 상기 방법은 클래시파이어가 바이너리 트리로 제시되는 CART 방법과 유사하나, 각 노드는 CART에 의해 생성되는 “and” 연산자와 비교하여 보다 일반적인, 특성과 관련된 불린(Boolean) 연산자가 사용된다. 다른 분석 방법의 예로는 nearest shrunken centroids (Tibshirani. 2002 PNAS. 99:6567-72), random forests (Breiman. 2001. Machine Learning 45:5-32 및 MART (Hastie. 2001. The Elements of Statistical Learning, Springer)을 들 수 있다.

일 구현예에서, 통계처리를 통해 HCC로 진단하기 위해 시험물질과 대조군간의 유의한 차이에 관한 신뢰수준을 결정할 수 있다. 통계 처리에 사용되는 원 데이터는 각 마커에 대하여 이중, 삼중 또는 다중으로 분석된 값이다.

이러한 통계적 분석 방법은 바이오마커는 물론, 임상 및 유전적 데이터의 통계적 처리를 통하여 임상적으로 유의한 판단을 하는데 매우 유용하다.

본원에 따른 방법은 HCC가 심각성 정도를 판단하는데 사용될 수 있다. 예를 들면 양성대조군 및 음성대조군의 프로파일과 비교하여, 경증 HCC, 중간정도 HCC 또는 중증 HCC로 평가될 수 있다. 나아가 일정 HCC 집단에 대한 마커 프로파일 분석을 수행하여, 프로파일 결과를 근거로 일정 기준에 따라 분류할 수 있다. 이런 방식으로 조기발견을 통해 자기공명영상(MRI)와 같은 고가의 검사를 하지 않을 수도 있다.

다른 구현예에서, 본 방법은 특정 기간 동안 예를 들어 1년에 걸쳐 수차례 수행될 수 있으며, 발현 패턴의 변화 추이 모니터링에 사용될 수 있다. 마커의 종류에 따라 발현의 증가 또는 감소를 HCC의 상태와 연관지을 수 있다. 동일 대상체에 대한 종전의 검사수치 또는 대조군의 수치와 비교하여, HCC 발병, 진행, 악화 등의 판단에 사용될 수 있다. 시간의 경과에 따른 HCC 마커의 변화를 근거로 간세포암 또는 중증 간세포암으로의 진행을 막기 위한 예방적 조치를 취할 수 있다. HCC의 확진을 위해, 바이오마커는 보조 수단으로 사용될 수 있으며, 다른 진단 방법 예를 들면 AFP 테스트, 초음파, 컴퓨터단층촬영 (computerized axial tomography (CT scan)) 또는 자기공명영상(magnetic resonance imaging (MRI)) 검사와 함께 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실 시 예

실시예 1. 본원에 사용된 임상 시료 정보

본 실험은 서울대학교의 의학연구윤리심의위원회의 허가된 프로토콜에 따라 수행되었으며, 각 환자로부터 충분한 설명에 근거한 서면동의를 수득하였으며, 임상정보는 다음과 같다.

마커 후보군 선정을 위해 정상인과 간암 환자의 통합(pooling) 시료에서 발현차이를 보이는 단백질 후보군 선정을 위해, 정상인 60명(남/여=41/19)과 간암 환자 60명(남/여=42/18)의 시료를 가지고 초기 연구를 진행했다. 실제로 개별 시료에 적용 및 분석하기 위해서 1차 시료군은 간경화 환자 30명, 간암 치료전 환자 30명, 간암 치료 후 완치 환자 30명 시료와 2차 시료군은 간경화 환자 50명, 간암 치료전 환자 50명, 간암 치료 후 완치 환자 50명 시료를 사용했다. 간암 치료 전과 치료 후 시료는, 동일한 환자에서 추출한 것이고, 간암을 치료하기 전에 혈청 시료를 취한 다음, 간암 치료를 하고 나서 6개월 이상 추적자료(follow-up data)를 근거로 간암이 재발하거나 전이되지 않고, 완전히 완치가 된 건강한 간암 환자의 시료만을 분석에 포함시켰다.

실시예 2. 표적 후보군 선정을 위한 데이터 마이닝

타겟의 후보군은 다음과 같이 선정하였다. 현재 간 질환과 관련된, 가장 포괄적 자원(comprehensive resource)인 Liver Atlas 데이타베이스를 이용해서 간암 조기진단 단백질 마커 후보군을 확보했다. Liver Atlas 데이타베이스 상에서 간질환과 관련 있다고 알려진 단백질은 총 50,265개인데, 이 중에서 혈액 내에서 검출 가능한 단백질만을 선정하기 위해, 혈액 내로 분비되거나 분비될 가능성이 있는 단백질 (Uniprot database 기준)만을 선별한 결과, 총 1,683개 단백질이 선정 되었다. 최종, 질량 분석 장비로 검출이 가능한 단백질만을 선정하기 위해서 4개의 서로 다른 펩타이드 MS/MS 라이브러리 소스(NIST Ion-Trap, NIST Q-TOF, ISB human plasma, Home made library)를 이용해서 펩타이드 MS/MS 데이타가 존재하는 단백질만을 선정한 결과, 총 960개 단백질이 최종 선정되었다. 이어 검출 가능한 타겟 후보군 선정은 다음과 같이 수행하였다. 실제, 질량분석 장비로 검출이 가능한 타겟만을 선정하기 위해서, 정상 그룹 60명, HCC 그룹 60명을 통합한 시료를 대상으로, MRM 분석을 통해 시그널이 제대로 검출되는 펩타이드 만을 선정한 결과, 최종 537개 단백질, 1316개 펩타이드가 선정되었다.

실시예 3. MRM 분석을 통한 타켓 마커 후보군 도출

실시예 3-1. 혈청 시료 준비

실험에 사용한 혈청 시료는 다음과 같이 준비하였다. BD Vacutainer 혈청 분리관(serum separation tube)(BD, USA)을 이용하여 채혈하였다(Silica clot activator, 10 mL, 16 X 100 mm ; Product number = #367820). 채혈된 혈액에 페닐메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF)를 최종 1.0 mM 되도록 첨가하였다. 10번 정도 인버팅 믹싱(inverting mix)을 한 후, 3000 rpm 에서 10 분간 원심분리(4℃ 유지)하여 상층액을 수집하였다(색깔 관찰 후, 용혈된 붉은색 샘플은 사용하지 않았다).

1.5 mL 에?도르프 튜브에 100 μL 씩 분주하였고, 분주 즉시 얼음에 두었고, 튜브에 라벨링하였다(라벨링할 때 시료군에 해당하는 코드 기입하였다(예: NC-01, MC-01, PD-01등). 그 후 -80℃에 즉시 보관하였다. 상기 절차는 얼음에서 실시하며 채혈 후 1시간 이내에 모두 종료하였다.

실시예 3-2. 혈청 단백질 감손(depletion) 처리

혈액 내에 저농도로 존재하는 마커 발굴을 위해 우선 혈액 내에 고량(high-abundant)으로 존재하는 단백질 6종 (albumin, IgG, IgA, haptoglobin, transferrin, alpha-1-antitrypsin)을 제거하는 감손 과정을 실시하였다. 6개의 다량 단백질 제거를 통해서, 혈액 내에는 총 단백질 매스(mass)의 85% 정도가 제거 되고, 나머지 15% 단백질 매스에 해당되는 단백질만 남게 되어 이를 분석에 사용하였다. 감손은 MARS (Multiple affinity removal system)(Agilent, USA) 을 제조사의 방법대로 이용하여 혈액에서 양이 가장 많은 6개의 단백질은 컬럼에 결합시켜 제거하고, 결합하지 않은, 소량으로 존재하는 단백질은 용출시켜 분석에 사용하였다.

실시예 3-3. 혈청 단백질의 펩타이드화

상기 감손 과정 후 얻어진 혈청 시료는 농축 (w/ 3K filter)한 다음, BCA (Bicinchoninic acid) 분석 방식으로 단백질 농도를 정량하였다. 100㎍ 혈청 시료를 취한 다음, 최종 농도 6M 유레아/20mM DTT로 처리 (Tris pH 8.0)한 다음, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션을 진행하였다. 최종 농도 50mM IAA(Iodoacetamide) 처리 한 다음, 상온에서 30분 동안 인큐베이션을 진행하였다. 유레아의 농도가 0.6M 이하가 되도록 100mM Tris pH 8.0 처리하였다. 트립신과 혈청 농도 비율이 1:50 이 되도록 트립신 처리 후, 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션을 진행하였다. 포름산 용액을 최종농도 5% 가 되도록 처리한 다음, 하기 탈염 과정을 시행하였다.

실시예 3-4. 혈청 단백질의 탈염

OASIS 컬럼 (Waters, USA)에 60% ACN/0.1% 포름산 1mL를 3번 흘려줘서 활성화를 시행하였다. OASIS 컬럼에 0.1% 포름산 1mL를 5번 흘려줘서 평형화(equilibration)를 시행하였다. 펩타이드 시료를 넣어주고, 0.1% 포름산 1mL로 5번 흘려줘서 세척하였다. 40% ACN/0.1% 포름산 1mL와 60% ACN/0.1% 포름산 1mL 처리해서 펩타이드를 용출(elution)시켰다. 1시간 이상 -70℃에서 얼린 다음, Speed-vac으로 건조시켰다. 건조된 펩타이드 시료는 Sol A 버퍼(3% ACN / 0.1% formic acid) 50㎕에 녹인 다음, 15,000 rpm 에서 60 min 동안 원심분리 하고, 이 중에서 40㎕ 만 바이알에 옮겨서 분석을 시행하였다.

실시예 3-5. MRM 분석

MRM 분석을 위해 실시예 2에서와 같이 선정된 537개 단백질, 1316개 펩타이드를 대상으로 재현성 있는 검출 (Technical reproducibility)이 가능하고, 정상 그룹과 HCC 그룹 간 발현 차이를 보이는 타겟을 선정하기 위해서, 정상 그룹 60명을 20명씩 3 세트로 통합(pooling)한 시료, HCC 그룹 60명을 20명씩 3 세트로 통합한 시료를 각각 만들어서 세트 당 3번씩 상기와 같이 MRM 으로 반복 분석을 진행했다.

MRM 분석은 각 표적 단백질에 대하여, Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline)을 사용하여 MRM 분석용 펩타이드 및 단편 이온을 선별하였다. Skyline은 MRM 방법 개발 및 분석용의 오픈 소스 소프트웨어이다 (Stergachis AB, et al., 2011, Nat Methods 8: 1041-1043).

요약하면, 전장의 단백질 서열을 FASTA 포맷으로 Skyline에 입력한 후, 이를 펩타이드로 디자인하여 산물 이온 리스트를 생성하였고, 이를 MRM으로 모니터링하였다. 트랜지션 선택에 사용된 펩타이드 필터 조건은 다음과 같다: 펩타이드 최대 길이는 30, 최소 길이는 6개 아미노산으로, 반복되는 알지닌 (Arg, R) 또는 라이신 (Lys, K)은 포함시키지 않았다. 메티오닌 (Met, M)도 펩타이드에 포함되면, 변형가능성으로 인해 제거하였다. 프롤린이 알지닌 또는 라이신 다음에 오는 경우도 사용하지 않았으며, 히스티딘 (His, H)이 포함되는 경우에는 전하가 변경되지만 사용되었다.

이러한 조건을 만족하는 펩타이드를 Q1 트랜지션으로 사용하였다. 쿼드러플(Quadruple) 1 (Q1) 은 특정 Q1 m/z 만을 통과시킬 수 있는 필터 역할을 수행하였다. Q1 필터를 통과한 전구 이온(precursor ion)은 쿼드러플(Quadruple) 2 (collision cell)에서 전기적인 에너지에 의해 단편화(fragmentation)가 일어나 생성 이온(product ion)으로 분해되었다. 이 생성 이온은 쿼드러플 1 (Q1)에서처럼 필터 역할을 수행하는 쿼드러플 3 (Q3)을 통해 특정 생성 이온만이 통과될 수 있다. 쿼드러플 3 (Q3)을 통과한 이온은 검출기(detector)에서 디지털 시그널로 전환되어 피크 크로마토그램으로 보여지게 되며, 이 피크의 면적을 분석하여 상대 및 절대 정량 분석을 수행하였다. 이러한 정보를 포함하는 파일을 MRM 분석을 위해 Analyst (AB SCIEX, USA)에 입력한 후 nonscheduled MRM 방법으로 분석하였다. MRM 결과는 wiff 및 wiff.scan 파일로 생성되었으며, 이를 mzWiff를 사용하여 mzXML 포맷으로 변환하여 MRM 데이터 처리를 위해 Skyline에 입력하여, MRM 트랜지션의 피크 강도를 구하였다. 도 1은 그 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.

정량성 확보를 목적으로 농도를 이미 알고 있는 특정 펩타이드를 사용해서 모든 MRM 분석 시, 해당 펩타이드의 피크 면적 값으로 표준화하는 작업을 거치게 되는데, 여기에 해당되는 펩타이드를 내부 표준 펩타이드라 하는데 이는 안정한 동위원소가 포함된 아미노산을 갖고 있는 펩타이드이다. 본 연구에서는 인간 프로테옴에서는 존재하지 않는 E.coli 유래인 beta-갈락토시다아제(lacZ)의 heavy-labeled 펩타이드인 LNVENPK를 이용해서 모든 시료 분석 시, 5-fmol의 동일한 내부 표준 펩타이드를 주입해서, MRM 분석으로부터 나온 모든 타겟 펩타이드의 피크 면적 값을 해당 내부 표준 펩타이드의 피크 면적 값으로 표준화하는 작업을 거쳤다.

상기와 같이 반정량 (Semi-quantitative) MRM 분석을 통해서, 질량 분석 장비 (MRM-technique)로 재현성 있게 검출이 가능한 단백질/펩타이드 만을 선정하기 위해 세트 당 3번 반복 분석을 한 후, 두 그룹 (정상 그룹 혹은 HCC 그룹) 중에서 적어도 한쪽 그룹에서 % CV 값이 20 이내인 타겟 만을 선정한 결과, 재현성 있는 타겟으로 347개 단백질, 754개 펩타이드를 선정하였다.

이어 재현성 있게 검출되는 타겟 대상으로 정상 그룹과 HCC 그룹 간 발현 차이를 보이는 타겟을 선정하기 위해서 그룹 간 p-value 및 배수 변화 수준(fold-change level)을 확인했다. 재현성있는 (Reproducible) 타겟 (347-단백질, 754-peptides)을 대상으로 정규성 검정 (Normality test, Shaipro-Wilk)을 통해서 정규분포를 따르는 경우 (p-value > 0.05)는 모수 방법인 독립적 T-test 로, 정규분포를 따르지 않는 경우 (p-value ≤ 0.05) 는 비모수 방법인 Mann-Whitney test 로 분석을 진행했다. 독립적 T-test의 경우, 등분산성 검정 (Levene's test)을 통해 등분산성을 따르는 경우 (p-value > 0.05)와 따르지 않는 경우 (p-value ≤ 0.05)로 나눠서 p-value 값을 확인했고, 이를 통해서 독립적 T-test와 Mann-Whitney test로 정상 그룹과 HCC 그룹 간에 유의적인 차이 (p-value ≤ 0.05)를 보이는 타겟 단백질/ 펩타이드임을 확인했다.

여기에 더하여, 정상 그룹과 HCC 그룹 간 fold-change 수준이 1.5-배이상으로 증가 또는 감소의 패턴을 보이는 단백질 마커 후보군을 추가로 선정하였다. 이를 통해서, 정상 그룹과 HCC 그룹 간 p-value 0.05 이하인 단백질은 195개, 펩타이드는 443개로 확인되었고, 1.5 fold-change 이상인 단백질은 191개, 펩타이드는 389개로 확인되었으며, 이를 통해서 최종 227개 단백질과 492개 펩타이드를 타겟 후보군으로 선정하였다.

이어 선정된 227개 단백질, 492개 펩타이드가 전체 인간 프로테옴 상에서 유일한(unique) 펩타이드인지 여부를 확인하기 위해 NCBI의 BlastP search program 을 이용해서 unique 펩타이드 여부를 확인했다. 이를 통해서, unique 하지 않은 37개 펩타이드에 해당되는 15개 단백질을 제외하였으며, 최종 정상 그룹과 HCC 그룹 간에 유의적인 차이를 보이면서 유니크한 펩타이드인 타겟 후보군으로 216개 단백질, 460개 펩타이드를 최종 선정하였다.

실시예 4. 타겟 후보군 마커의 혈액 내인성 펩타이드 여부 확인

실시예 3에서 선정된 단백질 및 펩타이드가 실세 혈액 내에 존재하는지 여부를 다음과 같이 확인하였다.

이를 위해 216개 단백질에 해당되는 SIS (stable-isotope labeled standard) 펩타이드를 이용하여 정상 그룹 60명, HCC 그룹 60명을 함께 통합(pooling)한 시료를 이용해서, 선정된 펩타이드가 실제 혈액 내에 존재하는 펩타이드가 맞는지 여부를 재확인했다. SIS 펩타이드는 펩타이드 C-말단의 라이신(Lys, K)이나 아르기닌Arg, R) 아미노산에 있는 ¹²C 와 ¹⁴N를 ¹³C 와 ¹⁵N로 치환한 펩타이드이다. 이는 혈액 내에 존재하는 내인성 펩타이드(endogenous peptide)와는 질량 값이 차이가 나지만, 동일한 서열을 갖기 때문에, 펩타이드 소수성(hydrophobicity)이 동일하므로, 크로마토그램 상에서 혈액 내 펩타이드와 동일한 시간(RT)에 용출(elution)된다 (도 2 참조).

MRM 분석 시, 복합(Complex) 혈액 시료에서 타겟 펩타이드 이외의 다른 펩타이드에 의해서 시그널 간섭(interference) 현상을 보이는지 확인하기 위해서, SIS 펩타이드와 혈액 내인성 펩타이드의 생성 이온(Q3) 강도 패턴(intensity pattern)을 확인했다(도 3).

시그널 간섭현상 여부를 판단하기 위해서, AuDIT (Automated detection of inaccurate and imprecise transitions) 프로그램을 이용해서, 혈액 내 펩타이드 와 SIS 펩타이드의 상대적인 생성이온 강도를 비교하고(P-value threshold : 0.05), 혈액 내 펩타이드와 SIS 펩타이드의 피크 면적 값이 반복 측정 시 일정하게 검출되는지 여부(CV threshold : 0.2)를 확인했다. 이를 통해서, 시그널 간섭현상이 없이 정량 가능한 혈액의 내인성 타겟 단백질/펩타이드로 최종적으로 123개 단백질, 231개 펩타이드가 선정되었다.

실시예 5. 혈액 내인성 펩타이드의 수준 확인

실시예 4에서와 같이 정량 가능한 혈액 내인성 타겟 (123개 단백질, 231개 펩타이드)을 대상으로 혈액 내에 존재하는 농도를 확인했다. 정상 그룹 60명, HCC 그룹 60명을 모두 통합한 시료 10 μg 에 231개 SIS 펩타이드 혼합물을 3-포인트(20nM, 200nM, 2000nM)로 순차적으로 희석한 것을 서로 섞은 시료를, MRM 분석을 수행하여 혈액 내인성 펩타이드에 대한 시그널과 이에 상보적인 합성 (SIS) 펩타이드의 시그널을 함께 확인했다.

간섭현상(Interference)이 존재하지 않는 생성 이온(Q3) 만을 대상으로 혈액 내 펩타이드의 피크 면적 값과 이와 상보적인 SIS 펩타이드(3-points)에 대한 피크 면적 값을 각각 구해서 상대적인 비율(ratio)을 계산하고, 여기에, 주입한 SIS-펩타이드 양을 곱해서 타겟 펩타이드에 대한 혈액 내 수준을 최종 확인했다(도 4 참조).

231개 펩타이드에 대해 혈액 내 수준을 확인한 결과, 혈청에서 가장 낮은 농도로 확인된 단백질은 ISLR (Immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat protein)이고, 농도는 0.15-fmol/μg인 것으로 확인되었으며, 가장 높은 농도로 확인된 단백질은 A2MG (Alpha 2 macroglobulin)이며, 농도는 5.57-pmol/μg인 것으로 확인되었다(Dynamic range : 3.7×10^4 order)(도 5).

혈액의 내인성 펩타이드의 농도 측정 결과, 혈액 농도가 20-fmol/㎍이하인 것으로 측정된 소량(Low-abundance) 타겟은 34개 단백질, 36개 펩타이드인 것으로 확인되었고, 20-fmol/㎍과 2000-fmol/㎍ 사이로 측정된 중간량(Middle-abundance) 타겟은 93개 단백질, 174개 펩타이드인 것으로 측정되었으며, 2000-fmol/㎍ 이상으로 측정된 고량(High-abundance) 타겟은 11개 단백질, 22개 펩타이드인 것으로 확인되었다(도 6).

실시예 6. 실제 개별 시료 적용을 통한 간암 조기진단 마커 후보군 도출

간경화 환자에서 90% 정도가 간암으로 진단되므로 간경화 환자는 간암 고위험군으로 분류할 수 있지만, 간암 진단에 이용되는 기존 혈청학적 검사 (AFP, PIVKAⅡ) 의 경우 진단력(민감도 : 30-40%) 이 낮은 문제가 있다. 따라서 간경화 환자와 간암 환자 간 차이를 보이는 단백질 양을 MRM 기법으로 미리 확인할 수 있다면, 간경화 환자에서 간암 환자로 진행되는 환자를 미리 조기진단 할 수 있다.

혈액에서 검증된 내인성 펩타이드를 대상으로 이에 상보적인 SIS 펩타이드 주입 농도를 결정했다. 소량(low abundance) 타겟(혈액 내 수준 < 20-fmol/㎍)의 경우, 모두 일괄적으로 20-fmol의 SIS-펩타이드를 주입했고, 중간량(Middle-abundance) 타겟 (20-fmol/μg < 혈액 내 수준 < 2000-fmol/μg)의 경우, 혈액 내 펩타이드 양과 동일하게 SIS 펩타이드 양을 주입했으며, 다량(High-abundance) 타겟(혈액 내 수준 > 2000-fmol/μg)의 경우, 모두 일괄적으로 2000-fmol 양의 SIS-펩타이드를 주입했다.

혈액 내 수준이 가장 낮게 측정된 ISLR 단백질의 경우, 20-fmol의 SIS-펩타이드를 주입할 경우, 혈액 내 수준에 비해 최대 13배 만큼 높은 양으로 주입했고, 혈액 내 수준이 가장 높게 측정된 A2MG 단백질의 경우, 2000-fmol의 SIS-펩타이드를 주입할 경우, 혈액 내 수준에 비해 최대 1/28 배 만큼 희석된 낮은 양으로 주입했다(도 7).

위와 같이 최종 검증된 타겟 후보군 (123개 protein, 231개 peptide)를 대상으로 조기진단 목적으로 1차 시료로 간경변 환자 30명, 간암환자 30명, 간암 발병 후 완치환자 30명의 시료를 사용하였으며, 2차 시료로 1차 시료군과 독립적인 간경변 환자 30명, 간암환자 30명, 완치환자 30명의 시료를 이용해서 3 그룹에서 차이를 보이는 간암 진단용 마커를 도출하였다.

실험자가 환자 군을 확인할 수 없도록 블라인딩 후 MRM 분석 순서는 무작위로 하여 분석하였으며, 분석은 시료 당 3번씩 반복 분석했다. 이를 통해서 얻어진 타겟 펩타이드에 대한 피크 면적 값을 혈액 내 펩타이드의 피크 면적 값을 이와 상보적인 SIS 펩타이드의 피크 면적 값으로 표준화(normalization) 한 다음, IBM SPSS statistics (version 21.0) 및 GraphPad (version 6.00)을 통해서 분석을 진행했다.

실시예 7. 간암 조기진단 단일 마커 군 도출

기존 알파-태아단백 (AFP)에 의한 조기진단 검사는 만성 간질환 (만성간염 및 간경변)과 간암과의 구별이 어려워서, 간암 조기진단에 사용할 수 없기 때문에, 이를 대체할 새로운 조기진단 마커를 제시하기 위해, LC (간경변) 그룹과 HCC 그룹 간 비교와 HCC 그룹과 회복(Recovery) 그룹(간암이 완치 된 LC group 상태) 간 발현차이를 보이는 타겟에 대하여 분석을 진행하였다. 결과는 하기 표 1에 기재되어 있다.

간암 조기진단 목적으로 실제 임상영역(병원) 에서 적용될 수 있는 진단력이 검증(독립 시료군에서 동일한 발현 경향성 여부 확인)된 단일 마커 후보군을 확인하기 위해, 1차 시료 (Training set)로 분석한 결과와 2차 시료 (Test set) 로 분석한 결과에서 공통적으로 AUC 값이 높은 마커를 확인하였다. 그 결과 1차 시료(Training set) 로 분석한 결과와 2차 시료(Test set)로 분석한 결과에서 공통적으로, LC 그룹과 HCC 그룹, HCC 그룹과 회복 그룹 간 유의적인 차이 (P-value ≤ 0.05)를 보이고, 진단력이 높은 (AUC-value ≥ 0.700) 타겟을 23개 단백질 및 상기 단백질 유래의 51개 펩타이드인 것으로 최종 확인하였다(표 1-1 및 1-2). 표 1-1 및 1-2는 트레이닝 세트/테스트 세트 개별시료 분석 후 AUC 값 0.700 이상 타겟 단백질 및 펩타이드를 나타낸다. 하기 표에서 적색은 그룹간 비교에서 발현량이 증가된 경우를 표시한 것이며, 파란색은 발현량이 감소되는 경우를 나타낸다.

[표 1-1]

[표 1-2]

실시예 8. 간암 다중 마커 도출

실시예 7에서와 같이 1차 분석 (Training set) 결과와 2차 분석 (Test set) 결과에서 LC 그룹과 HCC 그룹, HCC 그룹과 회복 그룹에서 공통적으로 높은 진단력을 보인 23-단백질, 51-펩타이드를 대상으로 다변량 분석 (Multi-variate Analysis, MA)을 통해 다중 단백질 마커 패널 구축 및 비교를 진행했다.

통계 분석법 중 하나인 로지스틱 회귀법을 이용하여 하나의 패널로 결합하는 분석을 수행한 결과, LC 그룹과 HCC 그룹 간 비교 시에는 4개의 펩타이드 패널 (ALS + ITIH1 + THRB + FINC)이 가장 높은 진단력을 보이는 조합인 것으로 확인되었고, HCC 그룹과 회복 그룹 간에는 2개의 펩타이드 패널 (THRB, FINC)이 가장 높은 진단력을 보이는 조합인 것으로 확인되었다. 구체적으로 LC 그룹과 HCC 그룹 간 비교 시, 확인된 4개의 펩타이드 패널은 AUC 값이 0.994로 확인되었고, 이는 전체 60명 간경변 환자 중에서 57명을 간경변 환자 (Accuracy 95.0%) 로, 전체 60명 간암 환자 중에서 58명 (Accuracy 96.7%) 을 간암 환자로 진단할 수 있으므로 4개의 펩타이드(4-단백질) 마커 패널을 이용한 진단 정확도는 95.8% 로 확인 되었다(도 8). 또한, 해당 4-단백질(4-펩타이드)에 나머지 19-단백질 (47-펩타이드)을 추가할 경우, AUC 0.990 이상 되는 단백질 조합을 무수히 만드는 것이 가능함을 확인했다.

HCC 그룹과 회복 그룹 간 비교 시, 확인된 2개의 펩타이드 패널은 AUC 값이 0.957로 확인되었고(도 9), 이는 전체 60명 간암 환자 중에서 53명을 간암 환자 (Accuracy 88.3%)로, 전체 60명 간암 치료 후 환자 (간경변 환자) 중에서 52명 (Accuracy 86.7%)을 간암 환자로 진단할 수 있으므로 2개의 펩타이드 마커 패널을 이용한 진단 정확도는 87.5%로 확인 되었다. 또한, 해당 2-단백질(2-펩타이드)에 나머지 21개-단백질(49-펩타이드)을 추가할 경우, AUC 0.950 이상 되는 단백질 조합을 무수히 만드는 것이 가능함을 확인했다.

실시예 9. 간암 마커에 대한 항체를 이용한 추가 검증

본원에 따른 마커는 단백질 수준에서 검출될 수 있으며, 단백질 수준에서의 검출방법은 본 실시예에서 사용한 MRM 분석 및 항체를 사용한 분석을 들 수 있으며, 한 가지 즉 MRM 분석만으로도 본원에 따른 목적하는 결과를 얻을 수 있거나, 또는 재확인을 위해 두 가지 방법을 모두 사용할 수도 있다.

항체 분석을 통한 재확인을 위해, 간암진단 마커로서 MRM 분석 (Peptide Level)으로 검증된 23개 단백질 중에서 상위 AUC 값을 갖는 7개 단백질을 선별하여 항체를 이용한 분석을 추가로 수행하였다 (표 2).

항체는 전체 단백질 (whole protein) 중 일부 잔기로 구성되는 항원을 인식하기 때문에, 항체 선정 기준은 MRM으로 분석한 펩타이드 부분이 항체 면역원 부분에 포함(또는 가능하면 근접)되도록 하였고, 혈장/혈청에 대한 웨스턴 블랏팅 결과가 있는 것, 그리고 단일클론 항원이 존재하는 것을 우선으로 선정했으며, A2AP(alpha-2-antiplasmin)(Mouse monoclonal), AMBP(Rabbit monoclonal), AFP(alpha- fetoprotein)(Mouse monoclonal), FETUA(Rabbit monoclonal), FINC(fibronectin)(Rabbit monoclonal), ITIH1(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain (Mouse polyclonal), ITIH3(Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3)(Goat polyclonal), PLGA(Plasminogen-related protein A)(Rabbit polyclonal). THRB(Prothrombin)(Rabbit monoclonal)에 대하여 괄호에 기재된 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다(Santa Cruz Biotechnology, USA).

이를 위해 3개 그룹(LC, HCC, 및 회복) 당 12명의 시료를 선별했으며, 이는 1차와 2차 MRM 분석에 사용하지 않은 독립적인 시료군을 사용하였다. 선별한 HCC/회복 그룹 시료는 StageⅠ(간암 초기) 시료를 선별하였고, 대조군 (loading control)에서 측정된 O.D (흡광도)로 노말라이즈하여서 SDS-PAGE 겔 간 편차(Variation) 보정을 진행했다. 대조군으로는 베타엑틴과 트렌스페린에 대한 mouse monoclonal 항체를 사용하였다.

결과는 도 10에 기재되어 있다. 이러한 결과는 본원에 따른 마커는 다양한 단백질 분석 방법을 통해 분석이 가능함을 나타낸다.

이어 상기 항체를 이용한 웨스턴 블랏에서 그룹 간 구분력이 가장 높은 타겟 단백질 1종 (FINC)에 대해 실제 임상에 적용/이용하기 위한 목적으로 ELISA 분석 (Protein Level, Native form)을 추가 진행했다. ELISA 분석을 수행하기 위하여 3-그룹(LC, HCC, and Recovery) 당 20명의 시료를 선별했으며, 이는 1차와 2차 MRM 분석에 사용하지 않은 독립적인 시료군을 사용하였다.

해당 타겟 단백질 1종 (FINC)에 대한 ELISA (Uscn Life Science Inc.Korea) 키트를 제조사의 방법대로 사용하여 분석한 결과, 시료군간 발현 양상이 MRM 분석 및 웨스턴 블랏팅 분석 결과와 모두 일치하였고, 간경변군과 간암군 비교 시, AUC 값은 0.832, 간암군과 간암 회복군 비교 시, AUC 값은 0.658 로 최종 확인되었다(표 2). 이러한 결과는 본원에 따른 마커는 MRM, 웨스턴 블랏, ELISA와 같은 다양한 단백질 분석 키트로 개발되어 사용될 수 있음을 나타낸다.

[표 2] ELISA 분석 정보

Claims

혈액에서 바이오마커로서 FINC (Fibronectin) 검출시약을 포함하는, 간암 고위험군인 간경화 환자에서 간암 진단 또는 예후 측정용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 바이오마커는 THRB; 또는 ALS, ITIH1 및 THRB 조합을 추가로 포함하는 것인, 간암 고위험군인 간경화 환자에서 간암 진단 또는 예후 측정용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 바이오마커는 AFP를 추가로 포함하는 것인, 간암 고위험군인 간경화 환자에서 간암 진단 또는 예후 측정용 조성물.
제 1 항 또는 2 항에 있어서,
상기 검출 시약은 상기 바이오마커를 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약인, 간암 고위험군인 간경화 환자에서 간암 진단 또는 예후 측정용 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 단백질 수준의 검출 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이용 시약인, 간암 고위험군인 간경화 환자에서 간암 진단 또는 예후 측정용 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 단백질 수준의 검출 시약은 상기 바이오마커 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics), 수용체, 리간드 또는 보조인자를 포함하는, 간암 고위험군인 간경화 환자에서 간암 진단 또는 예후 측정용 조성물.
간암 고위험군인 간경화 환자의 간암 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
간경화 환자로부터 수득된 혈액 시료에서 바이오마커로서 FINC (Fibronectin) 단백질 농도를 검출하는 단계;
상기 단백질 농도 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및
상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 간경화 환자로부터 수득된 혈액 시료의 단백질 농도가 증가한 경우, 이를 간암으로 판정하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 바이오마커를 검출하는 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 바이오마커를 검출하는 단계는 AFP를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
상기 방법은 단백질 마이크로어레이 분석법, 항원-항체 반응, 또는 질량분석 방식으로 실시되는, 방법.
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