CN108070655A - 用于预测肝癌发生风险的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预测肝癌发生风险的试剂盒及方法，涉及医学体外诊断技术领域，具体地说是通过SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3中单基因或多基因的CpG岛甲基化状态对肝癌发生的风险进行预测的试剂盒及方法。本发明多个基因的联合甲基化检测，灵敏度得到极大提高；对唾液、尿液、血液等的游离核酸进行检测，无需从癌组织中取材，检测无创，且操作简便。

Description

用于预测肝癌发生风险的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及医学体外诊断技术领域，具体地说是通过SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3中单基因或多基因的CpG岛甲基化状态对肝癌发生的风险进行预测的试剂盒及方法。
背景技术
肝癌是全世界第四常见的肿瘤。在中国，肝癌是仅次于肺癌、胃癌的诊断数量，居第三位的肿瘤，2015年肝癌的发病人数为46.6万人，因肝癌死亡人数在42.2万。高发病率和高死亡率是由于肝癌早期症状不明显，肝癌的预测和早期诊断很困难，通常在晚期才能得到确诊，此时往往已经发生了肿瘤细胞的转移，治疗难度高，患者的生存状况很难得到改善。
因此肝癌的早期发现对于治疗有重要意义，是肝癌患者获得长期生存和提高生存质量的重要途径。现有的早期筛查和诊断的方法有肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)检测和超声、常规CT扫描等影像学检查。然而单独用AFP检测灵敏度不高，约1/3的肝癌患者会因此而漏诊。而超声和CT扫描对于早期肿瘤组织较小的筛查也有灵敏度不高的特点，CT扫描肝脏占位直径大于1cm才能诊断为肝癌。无论是单独用AFP还是联合影像学检查，其在肝癌的预测和早期诊断中效果均不是太好。
随着分子生物学的发展，近年来在肝癌组织中，已经发现了大量与肝癌早期筛查、预后判断和复发预测相关的分子标志物，如基因突变、基因表达、基因甲基化和非编码RNA等。
其中，研究发现了基因甲基化可作为肝癌的早期筛查、患者分层和预后判断、提示复发的重要的生物标志物。如抑癌基因P16/CDKN2A、谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)基因、BSAP1、SRD5A2、RASSF1等。通过对肝癌发生高危人群和肝癌患者(主要是早期患者)的手术组织中这些基因的甲基化状态和甲基化水平进行检测，可以对肝癌进行筛查、预后判断和复发预测，多基因联合的甲基化检测的灵敏度比AFP及影像学检查要高。
然而，目前检测肝癌患者基因甲基化的标志物主要通过检测肝癌组织，由于肝癌组织在早期筛查中不易获取，主要来源于肝硬化等手术组织，大大缩小了其应用范围，且该筛查基本只能检测一次，难以在一段时间内连续获取标本和检测，因此无法监测病程的进展情况。
同时，由于肿瘤的异质性，组织中不同部位的甲基化水平可能会有所差异，因此手术组织的获取水平以及组织差异，可能会影响检测结果，导致检测结果的假阴性。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，其中最常见，研究最为清晰的是CpG位点中胞嘧啶第5位C原子的甲基化(5mC)，简而言之，就是在DNA甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸的作用下，DNA序列中的胞嘧啶被转化为5-甲基胞嘧啶。
DNA甲基化的主要位点是CpG岛，其甲基化状态对基因表达起着重要的调控作用。CpG岛是基因组DNA中CpG位点富集的区域，一般认为，CpG岛具有以下特点：1)长度大于200bp；2)GC含量大于50％；3)该段序列中，[CpG位点数*该段序列长度/(C碱基的个数*G碱基个数)]*100％＞60％。CpG岛所在的区域一般为转录起始位点上下游一段区域，大小在200-3000bp之间，最常见的区域为转录起始位点上下游，此外在基因间和基因内也会有CpG岛。
据统计，人类基因组中70％基因的启动子区域含有CpG岛。CpG岛中的CpG位点经常会发生甲基化，多位点的甲基化往往导致基因的表达沉默，这些基因的沉默又与人类生长发育、DNA错配修复等信号通路相关。
研究表明，DNA甲基化与肿瘤的发生关系密切。现已发现大量与DNA修复、细胞凋亡等相关的基因在肿瘤中发生高甲基化。在肿瘤中，由DNA高甲基化引起的基因失活数是基因突变引起的基因失活数的10倍以上。
在肝癌组织中，已经发现了大量基因存在甲基化，其中有一部分可作为肝癌的早期筛查、患者分层和预后判断、提示复发的重要的生物标志物。如抑癌基因P16/CDKN2A基因启动子甲基化水平在正常组织、肝硬化组织和肝癌组织中呈逐渐上升趋势，且在病毒性肝癌(HBV(乙型肝炎病毒)、HCV(丙型肝炎病毒)等引起)中P16甲基化水平远高于非病毒性肝癌。此外谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)基因在癌组织中甲基化水平也远高于癌旁组织，其预后更差。研究表明，BSAP1、SRD5A2、RASSF1等基因的甲基化与肝癌的复发相关。
然而以上生物标志物主要通过研究癌组织与癌旁组织的甲基化差异而来，其检测需要更多地采用组织标本，而对血液游离核酸等的检测灵敏度不高，因此其应用范围大大缩小，很难对大规模的高危肝癌发生人群进行筛查。
本发明通过对高危肝癌发生的人群进行游离核酸的CpG岛甲基化检测，具体包含SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3单基因或多基因，从而对肝癌发生的风险进行预测。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于预测肝癌发生风险的试剂盒及方法，通过检测游离核酸中SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3单基因或多基因的CpG岛甲基化水平，对肝癌发生的风险进行预测。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于预测肝癌发生风险的试剂盒，所述试剂盒为基于重亚硫酸盐转化的甲基化特异性荧光PCR试剂盒，包括：游离DNA(cfDNA)提取液、针对十二个目的基因SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3的引物探针对Ⅰ和内参基因ACTB非甲基化引物探针对Ⅰ；
所述十二个目的基因及内参基因的引物探针对Ⅰ核苷酸序列如表1所示：
表1十二个目的基因及内参基因的引物探针对Ⅰ核苷酸序列
表1中F表示上游引物，R表示下游引物，FP/RP表示水解探针。十二个目的基因中SCT和NR2F1设计了两种引物探针组合(1和2)，其余十个基因设计了一种引物探针组合。每一种引物探针组合设计了一条水解探针，所述水解探针的5’端设有荧光基团，3’端设有猝灭基团，表1中N表示荧光基团，所述荧光基团N可以为FAM、cy3、cy5、ROX、VIC、NED其中的一种，所述猝灭基团为BHQ1。设计多种引物探针组合于一管中进行qPCR时，每一种引物探针组合的水解探针中5’-N的修饰不一样。针对这十二个目的基因的相应检测区域设计的特异性PCR引物和探针也在保护范围。
另外，选择内参基因ACTB设计了非甲基化引物探针组合，其原则是引物探针区域无CpG位点。所述内参基因ACTB的水解探针的5’端设有荧光基团，3’端设有猝灭基团，所述荧光基团为HEX，所述猝灭基团为BHQ1；也可以选择NAPDH、EFBN等基因作为内参基因进行设计。
所述试剂盒还包括：阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为：模拟cfDNA长度的超声打断的正常人细胞系DNA；所述阳性质控品为：模拟cfDNA长度的超声打断的正常人细胞系DNA与甲基化酶M.sssI处理的正常人细胞系DNA的混合物。
本发明对于SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3基因的甲基化检测，主要检测这十二个目的基因的启动子CpG岛区域，包括这十二个目的基因的启动子CpG岛区域内所有的CpG位点或其中的一部分CpG位点。检测的以上基因的CpG岛区域的序列分别如SEQ ID NO.85-SEQ ID NO.96所示。
本发明检测游离DNA(cfDNA)中SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3基因的甲基化水平主要通过游离DNA的提取和基因甲基化检测试剂盒两个部分。
其中游离DNA的提取主要包括外周血、唾液和尿液等标本。以外周血为例，通过采血管采集外周血，采血管的设计需要对细胞进行稳定，以防止细胞裂解后DNA释放到血浆中，如Streck公司的Cell-Free DNA BCT采血管。外周血采集后可通过离心等方法分离出血浆，并对血浆中的游离DNA进行提取。血浆游离DNA的提取可通过柱分离法或磁珠法进行。其他类型的标本的采集与提取与外周血类似。
本发明检测游离DNA中SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3基因的甲基化基因的方法之一为甲基化特异性荧光PCR法(即MethyLight或qMSP)。该方法基于重亚硫酸盐转化，需要在基因甲基化检测之前，对提取后的DNA样品进行重亚硫酸盐转化(BS)前处理操作，其原理是：重亚硫酸盐会对非甲基化的胞嘧啶有脱氨基的作用，经过重亚硫酸盐处理以及一步脱硫基反应后，DNA序列的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，再经过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，则将序列的C:G配对转化为A:T配对；同时甲基化的胞嘧啶(mC)由于构象等的差异，在重亚硫酸盐处理后，仍保持胞嘧啶不变，因此可以通过检测C:G配对和A:T配对的差异来检测CpG甲基化。在BS处理之后，针对转化后的SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3基因DNA的CpG岛相应区域，分别设计特异性引物和Taqman等水解探针，对以上区域的甲基化序列进行特异性的PCR扩增。
对PCR扩增的结果进行分析，有扩增的引物探针对，其对应的区域即为DNA甲基化阳性。以上12个区域中，如果有一个区域以上为DNA甲基化阳性，提示该样本可能来源于肝癌患者。
一种基于重亚硫酸盐转化的甲基化特异性荧光PCR法检测基因组合的甲基化水平的方法，包括以下步骤：
1、从样本中提取游离DNA，得到游离DNA提取液；
2、对游离DNA提取液与阴性质控品、阳性质控品一起进行重亚硫酸盐转化；
3、针对转化后的SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3基因DNA的CpG岛区域，分别设计特异性引物探针对Ⅰ，进行甲基化特异性荧光PCR扩增；
4、对甲基化特异性荧光PCR扩增的结果进行分析，有扩增的引物探针对，其对应的区域为DNA甲基化阳性。
在上述方案的基础上，步骤1中所述样本包括外周血、唾液和尿液。
在上述方案的基础上，所述外周血可通过采血管采集，外周血采集后可通过离心等方法分离出血浆，并对血浆中的游离DNA进行提取，血浆游离DNA的提取通过柱分离法或磁珠法进行。
在上述方案的基础上，步骤2中使用重亚硫酸盐转化试剂盒进行重亚硫酸盐转化处理，或采用在磁珠富集cfDNA后，加入亚硫酸盐溶液以及DNA保护液对cfDNA进行重亚硫酸盐转化。
在上述方案的基础上，所述甲基化特异性荧光PCR扩增反应体系体积为20-100μL，包括：2×PCR缓冲液25μL、1～4mM MgCl2、200～500nM引物探针混合物T、200～500nM引物探针混合物C，其余为H2O；
所述引物探针混合物T为单个目的基因的上、下游引物探针对Ⅰ，引物探针混合物C为内参基因ACTB的非甲基化上、下游引物探针对Ⅰ。
一种用于预测肝癌发生风险的试剂盒，所述试剂盒为基于甲基化结合蛋白富集的甲基化特异性荧光PCR试剂盒，包括：针对十二个目的基因SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3的引物探针对Ⅱ和内参基因ACTB非甲基化引物探针对Ⅱ；
所述十二个目的基因及内参基因的引物探针对Ⅱ核苷酸序列如表2所示：
表2十二个目的基因及内参基因的引物探针对Ⅱ核苷酸序列
表2中Fb表示上游引物，Rb表示下游引物，FPb/RPb表示水解探针。其中每一种引物探针组合的水解探针的5’端设有荧光基团，3’端设有猝灭基团，所述荧光基团N可以为FAM、cy3、cy5、ROX、VIC、NED其中的一种，所述猝灭基团为BHQ1。设计多种引物探针组合于一管中进行qPCR时，每一种组合的水解探针中5’-N的修饰不一样。针对这十二个目的基因的相应检测区域设计的特异性PCR引物和探针也在保护范围。
所述试剂盒还包括：阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为：模拟cfDNA长度的超声打断的正常人细胞系DNA；所述阳性质控品为：模拟cfDNA长度的超声打断的正常人细胞系DNA与甲基化酶M.sssI处理的正常人细胞系DNA的混合物。
另外，选择内参基因ACTB设计了非甲基化引物探针组合，其原则是引物探针区域无CpG位点。所述内参基因ACTB的水解探针的5’端设有荧光基团，3’端设有猝灭基团，所述荧光基团为HEX，所述猝灭基团为BHQ1。也可以选择NAPDH、EFBN等基因作为内参基因进行设计。在每管检测体系中均进行内参基因的qPCR，对MBD的富集进行质控。
本发明检测游离DNA中SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3基因的甲基化基因的方法之二为基于甲基化DNA结合蛋白富集的方法。其原理为：利用MBD2b等CpG甲基化富集蛋白特异性的结合CpG甲基化的游离DNA，其后SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3基因的CpG岛区域，设计特异性引物，进行PCR扩增。
方法二可以设计普通PCR的引物和Taqman等水解探针，采用热耐受的聚合酶，在可变温的PCR仪器上进行PCR扩增和探针信号检测。
对方法二的PCR扩增的结果进行分析，有扩增的引物探针对，其对应的区域即为DNA甲基化阳性。以上12个区域中，如果有一个区域以上为DNA甲基化阳性，提示该样本可能来源于肝癌患者。
一种基于甲基化结合蛋白富集的甲基化特异性荧光PCR法检测基因组合的甲基化水平的方法，包括以下步骤：
1、从样本中提取游离DNA，得到游离DNA提取液；
2、利用CpG甲基化富集蛋白对游离DNA提取液与阴性质控品、阳性质控品进行孵育及洗脱；
3、针对SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3基因DNA的CpG岛区域，分别设计特异性引物探针对Ⅱ，采用热耐受的聚合酶，在可变温的PCR仪器上进行PCR扩增和探针信号检测；
4、对甲基化特异性荧光PCR扩增的结果进行分析，有扩增的引物探针对，其对应的区域为DNA甲基化阳性。
在上述方案的基础上，步骤1中所述样本包括外周血、唾液和尿液。
在上述方案的基础上，所述外周血可通过采血管采集，外周血采集后可通过离心等方法分离出血浆，并对血浆中的游离DNA进行提取，血浆游离DNA的提取通过柱分离法或磁珠法进行。
在上述方案的基础上，步骤2中采用MBD2b蛋白偶联的磁珠富集对cfDNA提取液、阴性质控品及阳性质控品进行孵育及洗脱；或直接采用MBD2b蛋白偶联的磁珠富集对分离的血浆、阴性质控品及阳性质控品进行孵育，对CpG甲基化的cfDNA进行富集，对磁珠富集后的cfDNA进行洗脱。
在上述方案的基础上，所述甲基化特异性荧光PCR扩增反应体系体积为20-100μL，包括：2×PCR缓冲液25μL、0.2U UDG酶、1～4mM MgCl2、200～500nM引物探针混合物T、200～500nM引物探针混合物C，其余为H2O；
所述引物探针混合物T为单个目的基因的上、下游引物探针对Ⅱ，引物探针混合物C为内参基因ACTB的非甲基化上、下游引物探针对Ⅱ。
本专利的关键点和欲保护点：
1、基因甲基化检测的方法，包括检测SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3共12个目的基因的CpG岛的其中一部分的甲基化状态(序列见SEQ ID NO.85-SEQ ID NO.96)。
2、以上甲基化检测的方法在检测前对需要分离外周血的游离DNA。
3、以上甲基化检测的方法采用甲基化特异性荧光PCR法。
4、基于重亚硫酸盐转化的甲基化特异性荧光PCR法(MethyLight)基于12个目的基因的检测区域设计的MethyLight引物及探针。
5、以上甲基化检测的方法也可以甲基化结合蛋白富集检测的方法，具体地，采用CpG甲基化结合蛋白MBD2b或其他CpG甲基化结合蛋白对外周血游离DNA进行富集后，进行特异性扩增。
6、甲基化结合蛋白富集检测的方法应附着在生物素标记的磁珠上或其他固态介质上。
7、甲基化结合蛋白富集检测的方法对12个目的基因的检测区域设计的引物及探针，该引物组合对CpG甲基化富集后的DNA进行PCR-荧光探针法扩增，以检测甲基化状态。
8、甲基化结合蛋白富集检测的方法对以上引物进行扩增的检测探针，探针为针对以上引物扩增区域区间的Taqman等水解探针。探针设计的区域为引物间的一段序列。
有益效果：
本发明提供了一种用于预测肝癌发生的方法，该方法通过检测游离核酸中SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3单基因或多基因的CpG岛甲基化水平，对肝癌发生的风险进行预测。与现有技术相比，本发明的技术优势在于：
1)多个基因的联合甲基化检测，灵敏度得到极大提高；
2)对唾液、尿液、血液等的游离核酸进行检测，无需从癌组织中取材，检测无创，且操作简便；
具体实施方式
下面通过优选实施例来描述本发明的最佳实施方式。具体实施方式在于详细解释本发明，而不是对本发明的限制，在不脱离本发明的精神和实质范围的情况下，可做出各种变形和修改，这些都应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1基于重亚硫酸盐转化的甲基化特异性荧光PCR法检测基因组合的甲基化水平
一、血液样本的收集及制备
1、采用Streck Cell-Free DNA BCT采血管等cfDNA保存管进行外周血的采集，采集的体积在1-10mL。
2、2～8℃保存或常温保存7天之内。
3、取cfDNA保存管采集的外周血2mL，经过离心分离血浆：1350±150rcf离心12分钟。
二、cfDNA的提取及BS转化
1、采用外周血游离DNA提取试剂盒如QIAGEN QIAseq cfDNA Extraction Kit，对分离后的血浆以及阴性、阳性质控品进行cfDNA的提取。该方法cfDNA的提取采用磁珠法对cfDNA进行吸附、纯化和洗脱富集，也可以采用分离柱的方式对cfDNA进行提取。
2、(可选)采用紫外分光光度计或者紫外分光光度计原理的DNA浓度测定仪器，进行富集后cfDNA浓度测定。
3、提取后的样本cfDNA与阴性质控品、阳性质控品一起，使用重亚硫酸盐转化试剂盒如QIAGEN Fast Bisulfite Conversion Kit进行BS转化处理，也可以采用在磁珠富集cfDNA后，加入亚硫酸盐溶液(亚硫酸铵)以及DNA保护液(含6-羟基-2-2,5,7,8-四甲基己烷-2-羧酸或对苯二酚等)对cfDNA进行BS转化。阴性质控品与阳性质控品分别为：模拟cfDNA长度的超声打断的正常人细胞系DNA以及模拟cfDNA长度的超声打断的正常人细胞系DNA与M.sssI(甲基化酶)处理的正常人细胞系DNA的混合物。
三、BisDNA(经过重亚硫酸盐转化后的DNA)的甲基化检测
使用荧光定量PCR仪进行以下基因的MethyLight检测：
1、配制PCR反应体系(50μL)：
其中引物探针混合物T分别为设计的单个靶基因的上下游引物及相应的探针，引物探针混合物C为内参基因ACTB的上下游引物及相应的探针。
2、配制好体系后，加入BisDNA，按以下程序进行荧光定量PCR。
3、结果分析：结果必须满足以下条件：
1)每个样本(含阴性质控品和阳性质控品)ACTB扩增Ct值≤30；
2)阴性质控品靶基因无扩增曲线或Ct值＞37，阳性质控品靶基因扩增Ct值≤37；
3)靶基因扩增Ct值≤37，相应的靶基因为甲基化阳性，如扩增Ct值＞37或无扩增曲线，则相应的靶基因为甲基化阴性；
4、以上检测体系可以分为多管PCR反应，每管检测一个基因，也可以将所有的检测管合为2管至多管。
实施例2甲基化结合蛋白富集-荧光PCR检测法检测基因组合的甲基化水平
一、血液样本的收集及制备
1、采用Streck Cell-Free DNA BCT采血管等cfDNA保存管进行外周血的采集，采集的体积在1-10mL。
2、2～8℃保存或常温保存7天之内。
3、取cfDNA保存管采集的外周血2mL，经过离心分离血浆：1350±150rcf离心12分钟。
二、cfDNA的提取及MBD蛋白的捕获富集
1、采用外周血游离DNA提取试剂盒如QIAGEN QIAseq cfDNA Extraction Kit，对分离后的血浆进行cfDNA的提取。该方法cfDNA的提取采用磁珠法对cfDNA进行吸附、纯化和洗脱富集，也可以采用分离柱的方式。
2、(可选)采用紫外分光光度计或者紫外分光光度计原理的DNA浓度测定仪器，进行cfDNA浓度测定。
3、采用MBD2b蛋白偶联的磁珠富集对提取的cfDNA、阴性质控品及阳性质控品进行孵育，以及后续的洗脱。也可以直接采用MBD2b蛋白偶联的磁珠富集对分离的血浆、阴性质控品及阳性质控品进行孵育，对CpG甲基化的cfDNA进行富集，对磁珠富集后的cfDNA进行洗脱。
三、cfDNA的甲基化检测
使用荧光定量PCR仪进行以下基因的qPCR检测：
1、配制PCR反应体系(50μL)：
组分 体积/浓度
2×PCR Buffer 25μL
UDG酶 0.2U
MgCl2 1～4mM
引物探针混合物T 200～500nM each
引物探针混合物C 200～500nM each
H2O 至50μL
其中引物探针混合物T分别为设计的单个靶基因的上下游引物及相应的探针，引物探针混合物C为内参基因ACTB的上下游引物及相应的探针。
2、配制好体系后，加入MBD2b富集后的cfDNA，按以下程序进行荧光定量PCR。
3、结果分析：结果必须满足以下条件：
1)阴性质控品靶基因无扩增曲线或Ct值＞37，阳性质控品靶基因扩增Ct值≤37；
2)靶基因扩增Ct值≤37，相应的靶基因为甲基化阳性，如扩增Ct值＞37或无扩增曲线，则相应的靶基因为甲基化阴性；
3)每个样本(含阴性质控品、阳性质控品)的ACTB扩增Ct值均＞37或无扩增；
4、以上检测体系可以分为多管PCR反应，每管检测一个基因，也可以将所有的检测管合为2管至多管。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (10)

1.一种用于预测肝癌发生风险的试剂盒，所述试剂盒为基于重亚硫酸盐转化的甲基化特异性荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括：游离DNA提取液、针对十二个目的基因SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3的引物探针对Ⅰ和内参基因ACTB非甲基化引物探针对Ⅰ；
所述SCT基因的引物探针对包括两种，分别为：
SCT上游引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，
SCT下游引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，
SCT探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
SCT上游引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，
SCT下游引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，
SCT探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
NFIX上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，
NFIX下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，
NFIX探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
IGF2上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，
IGF2下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，
IGF2探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
ABCG5上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，
ABCG5下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，
ABCG5探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
GSTO2上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，
GSTO2下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，
GSTO2探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
SARDH上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，
SARDH下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，
SARDH探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
E2F6上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，
E2F6下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，
E2F6探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
SHANK2上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，
SHANK2下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，
SHANK2探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
GATA4上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，
GATA4下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，
GATA4探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
OPLAH上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，
OPLAH下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示，
OPLAH探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；
所述NR2F1基因的引物探针对包括两种，分别为：
NR2F1上游引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示，
NR2F1下游引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示，
NR2F1探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；
NR2F1上游引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示，
NR2F1下游引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示，
NR2F1探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；
ZFHX3上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示，
ZFHX3下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示，
ZFHX3探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；
ACTB上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示，
ACTB下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示，
ACTB探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。
2.如权利要求1所述的用于预测肝癌发生风险的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为：模拟游离DNA长度的超声打断的正常人细胞系DNA；所述阳性质控品为：模拟游离DNA长度的超声打断的正常人细胞系DNA与甲基化酶M.sssI处理的正常人细胞系DNA的混合物；
所述十二个目的基因的探针为水解探针，所述水解探针的5’端设有荧光基团，3’端设有猝灭基团，所述荧光基团为FAM、cy3、cy5、ROX、VIC、NED中的一种，所述猝灭基团为BHQ1；所述内参基因ACTB的探针为水解探针，所述水解探针的5’端设有荧光基团，3’端设有猝灭基团，所述荧光基团为HEX，所述猝灭基团为BHQ1。
3.一种基于重亚硫酸盐转化的甲基化特异性荧光PCR法检测基因组合的甲基化水平的方法，应用如权利要求1-2任一权利要求所述的用于预测肝癌发生风险的试剂盒，包括以下步骤：
(1)、从样本中提取游离DNA，得到游离DNA提取液；
(2)、对游离DNA提取液与阴性质控品、阳性质控品一起进行重亚硫酸盐转化；
(3)、针对转化后的SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3基因DNA的CpG岛区域，分别设计权利要求1所述的引物探针对Ⅰ，进行甲基化特异性荧光PCR扩增；
(4)、对甲基化特异性荧光PCR扩增的结果进行分析，有扩增的引物探针对，其对应的区域为DNA甲基化阳性。
4.如权利要求3所述的基于重亚硫酸盐转化的甲基化特异性荧光PCR法检测基因组合的甲基化水平的方法，其特征在于：步骤1中所述样本包括外周血、唾液和尿液。
5.如权利要求3所述的基于重亚硫酸盐转化的甲基化特异性荧光PCR法检测基因组合的甲基化水平的方法，其特征在于：步骤3中SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3基因的CpG岛区域分别如SEQ ID NO.85-SEQ ID NO.96所示。
6.一种用于预测肝癌发生风险的试剂盒，所述试剂盒为基于甲基化结合蛋白富集的甲基化特异性荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括：针对十二个目的基因SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3的引物探针对Ⅱ和内参基因ACTB非甲基化引物探针对Ⅱ；
SCT上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示，
SCT下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示，
SCT探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；
NFIX上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示，
NFIX下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示，
NFIX探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示；
IGF2上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示，
IGF2下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示，
IGF2探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；
ABCG5上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示，
ABCG5下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示，
ABCG5探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示；
GSTO2上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示，
GSTO2下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.59所示，
GSTO2探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；
SARDH上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.61所示，
SARDH下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.62所示，
SARDH探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示；
E2F6上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示，
E2F6下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示，
E2F6探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示；
SHANK2上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.67所示，
SHANK2下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示，
SHANK2探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.69所示；
GATA4上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.70所示，
GATA4下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.71所示，
GATA4探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.72所示；
OPLAH上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.73所示，
OPLAH下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.74所示，
OPLAH探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.75所示；
NR2F1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.76所示，
NR2F1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.77所示，
NR2F1探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.78所示；
ZFHX3上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示，
ZFHX3下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示，
ZFHX3探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示；
ACTB上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示，
ACTB下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.83所示，
ACTB探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示。
7.如权利要求6所述的用于预测肝癌发生风险的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为：模拟游离DNA长度的超声打断的正常人细胞系DNA；所述阳性质控品为：模拟游离DNA长度的超声打断的正常人细胞系DNA与甲基化酶M.sssI处理的正常人细胞系DNA的混合物；
所述十二个目的基因的探针为水解探针，所述水解探针的5’端设有荧光基团，3’端设有猝灭基团，所述荧光基团为FAM、cy3、cy5、ROX、VIC、NED中的一种，所述猝灭基团为BHQ1；所述内参基因ACTB的探针为水解探针，所述水解探针的5’端设有荧光基团，3’端设有猝灭基团，所述荧光基团为HEX，所述猝灭基团为BHQ1。
8.一种基于甲基化结合蛋白富集的甲基化特异性荧光PCR法检测基因组合的甲基化水平的方法，应用如权利要求6-7任一权利要求所述的用于预测肝癌发生风险的试剂盒，包括以下步骤：
(1)、从样本中提取游离DNA，得到游离DNA提取液；
(2)、利用CpG甲基化富集蛋白对游离DNA提取液与阴性质控品、阳性质控品进行孵育及洗脱；
(3)、针对SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3基因DNA的CpG岛区域，分别设计权利要求6所述的引物探针对Ⅱ，采用热耐受的聚合酶，在可变温的PCR仪器上进行PCR扩增和探针信号检测；
(4)、对甲基化特异性荧光PCR扩增的结果进行分析，有扩增的引物探针对，其对应的区域为DNA甲基化阳性。
9.如权利要求8所述的基于甲基化结合蛋白富集的甲基化特异性荧光PCR法检测基因组合的甲基化水平的方法，其特征在于：步骤1中所述样本包括外周血、唾液和尿液。
10.如权利要求8所述的基于甲基化结合蛋白富集的甲基化特异性荧光PCR法检测基因组合的甲基化水平的方法，其特征在于：步骤3中SCT、NFIX、IGF2、ABCG5、GSTO2、SARDH、E2F6、SHANK2、GATA4、OPLAH、NR2F1和ZFHX3基因的CpG岛区域分别如SEQ ID NO.85-SEQ IDNO.96所示。
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