TW201934568A - 一種用於檢測食道癌的基因標誌物及其用途和檢測方法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及用於檢測食道癌的基因標誌物及其用途。本發明還涉及使用所述基因標誌物對食道癌進行檢測的方法。

Description

一種用於檢測食道癌的基因標誌物及其用途和檢測方法

本發明涉及食道癌的臨床分子診斷的領域。具體地，本發明涉及通過高通量定序檢測食道癌基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶含量從而檢測食道癌是否存在的方法和試劑盒。

食道癌作為我國惡性腫瘤發病率最高的癌症之一已經越來越被人們重視。食道癌的發病因素很多，目前公認飲酒、吸煙、對食道造成損傷的各類慢性刺激及環境因素是中國食道鱗狀細胞癌發病的主要原因。調查發現喜吃燙食、超量飲酒、低收入、低身體質量指數、既往食道病變、不按時用餐、喜食辣食及腫瘤家族史等均是增加食道癌患病風險的因素。

中國食道癌則一直以食道鱗狀細胞癌為主，食道腺癌的發病率未見明顯增長，食道鱗狀細胞癌已成為中國衛生部確定的十大特色腫瘤之一。據世界衛生組織公佈的最新資料顯示，2008年度全世界67億人口新發食道癌48.2萬例，發病率為7.0/10萬，居全部惡性腫瘤第9位；死亡40.7萬例，死亡率5.8/10萬，居第8位。中國大陸13.4億人口食道癌新發25.9萬例，發病率為16.7/10萬，居全國各類惡性腫瘤第5位；死亡21.1萬例，死亡率為13.4/10萬，居第4位。按性別統計，中國男性食道癌患者17.6萬，發病率為22.9/10萬；死亡14.4萬，死亡率18.7/10萬；女性患者8.3萬，發病率為10.5/10萬，死亡6.7萬，死亡率8.2/10萬，男性發病率居各類惡性腫瘤第4位，女性居第7位，而死亡率男女均居第4位。它的預後和患者的TNM(tumor-node-metastasis)分期密切相關，I期食道癌患者的5年生存率為50％～80％，而Ⅲ、Ⅳ期患者的5年生存率僅有5％~15％，因此早期診斷和準確分期就成為提高患者生存率的關鍵因素。

目前食道癌的檢測主要通過影像學、活體組織切片、血清學檢測等。然而，影像學易受操作者經驗影響，並且依賴於設備，費用昂貴，尤其是在醫療資源有限的情況下，其準確率難以保證，難以廣泛和常規應用。隨著在各級醫院普遍，以及高危險人群的隨訪和定期複查的完善，內視鏡檢查已逐步成為食道癌篩查的首選方法，但常規內視鏡檢查時早期食道癌仍容易漏診。活體組織切片是目前臨床上確診食道癌的標準診斷方法，但活體組織切片存在很大局限性，例如手術取樣的困難，或者某些癌症部位不易進行穿刺，並且穿刺本身也會帶來一定的臨床風險，反復穿刺篩查更會給患者帶來巨大痛苦。用於臨床的食道癌血清腫瘤標誌物為鱗狀細胞癌抗原(SCC-Ag)、癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白19片段(CYFRA 21-1)、P 53抗體等。但這些血清標誌物對早期食道癌的靈敏度和特異性都不高，往往在腫瘤發生轉移後才升高。

腫瘤標誌物由於其簡便、基本無創，如果在準確性上能有所突破，可能會大幅提高食道癌早期診斷率，最終實現降低食道癌患者病死率的目的。但目前缺乏簡單有效，尤其是適用於人群普查的診斷方法，所以尋找新的食道癌早期診斷標誌物意義重大。

發明人通過對正常樣品和食道癌樣品進行高通量定序，並對其中各基因上的5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）含量進行分析，出乎意料地發現了多個極具資訊的可用於檢測食道癌的基因標誌物。

因此，本發明的第一個方面涉及用於檢測食道癌的基因標誌物，包括一個或多個選自以下的基因：磷脂肌醇磷酸酯酶CX域包含蛋白3（PLCXD3）、硫酸酯酶1（SULF1）、F-Box和多白胺酸重複蛋白7（FBXL7）、Tolloid類蛋白1（TLL1）、RNA結合模體單股交互作用蛋白質3（RBMS3）、ADAMTS類蛋白1（ADAMTSL1）、磷酸二酯酶10A（PDE10A）、LIM域連接酶2（LDB2）、伽馬-氨基丁酸A型受體蛋白伽馬3次單元（GABRG3）和序列相似性155家族蛋白成員A（FAM155A）。優選的，所述基因標誌物包括至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個選自以下的基因：PLCXD3、SULF1、FBXL7、TLL1、RBMS3、ADAMTSL1、PDE10A、LDB2、GABRG3和FAM155A。更優選的，所述基因標誌物包括PLCXD3、SULF1、FBXL7、TLL1、RBMS3、ADAMTSL1、PDE10A、LDB2、GABRG3和FAM155A。

本發明還涉及上述基因標誌物在檢測食道癌中的用途。

本發明的第二個方面涉及用於檢測食道癌的方法，包括以下步驟： （a）測定正常樣品和受試者樣品中本發明所述的基因標誌物的5-hmC的含量； （b）用正常樣品中所述基因標誌物的5-hmC含量作為參照，將受試者樣品中對應的基因標誌物的5-hmC含量標準化； （c）對經標準化的所述基因標誌物的5-hmC含量進行數學關聯，並獲得評分；和 （d）根據所述評分獲得檢測結果。

在一個實施方案中，所述樣品是受試者或正常人體液中游離的DNA片段，或來源於胞器、細胞以及組織中的完整基因體DNA。其中，體液是血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁、食道液等。

在一個實施方案中，本發明所述的基因標誌物的5-hmC含量可通過本領域技術人員已知的任何方法進行測定，例如包括但不限於，葡糖基化法、限制性內切酶法、化學標記法、與高通量定序方法聯用的沉澱法、單分子即時定序法（SMRT）、氧化重亞硫酸鹽定序法（OxBS-Seq）等。葡糖基化法的原理是採用T4 噬菌體β-葡萄糖轉移酶(β-GT)，在葡萄糖供體受質尿核苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glu)存在下，將葡萄糖轉移至羥基位置，從而生成β-葡萄糖基-5-羥甲基胞嘧啶(5-ghmC)。同時可採用同位素標記受質進行定量。在葡糖基化法基礎上進一步發展出限制性內切酶法和化學標記法。限制性內切酶法的原理是：葡糖基化反應改變了一些限制性內切酶的酶切特性。甲基化依賴的限制性內切酶MspI和HpaII 可識別同樣的序列(CCGG)，但它們對甲基化狀態的敏感性是不同：MspI 識別並切割 5-甲基胞嘧啶（5-mC）和 5-hmC，但不能切割5-ghmC；HpaII 只切割完全未修飾的位點，胞嘧啶上的任何修飾(5-mC、5-hmC、5-ghmC)均阻礙切割。若CpG 位點含有5-hmC，那麼糖基化、酶解之後能檢測到條帶，未糖基化對照反應中沒有條帶；同時可採用qPCR 進行定量分析。另外，其他限制性內切酶也同樣存在阻礙5-ghmC 酶切的情況，可應用於5-hmC 檢測(如：GmrSD，MspJI，PvuRts1I，TaqI 等)。化學標記法的原理是：將酶反應受質上的葡萄糖進行化學修飾轉變成UDP-6-N3-glucose，將6-N3-glucose 轉移到羥甲基位置，生成N3-5ghmC。隨後，通過點擊化學(click chemistry)方法在每個5-hmC 上添加一分子生物素，結合次世代高通量DNA 定序技術或單分子定序技術，可分析5-hmC在基因體DNA中的分佈情況。沉澱法是將5-hmC用特殊方式修飾後再將其特異性地從基因體DNA中捕獲下來，並進行定序分析。氧化重亞硫酸鹽定序法是首個以單鹼基解析度對5-hmC 進行定量定序的方法。首先將5-hmC 進行KRuO4 氧化處理，生成5-甲醯胞嘧啶（5fC），然後採用重亞硫酸鹽定序。在此過程中，5-hmC先氧化為5fC，而後脫氨形成U。通常，同時採用多種檢測方法對5-hmC進行定量檢測。

在本發明的一個實施方案中，利用化學標記法結合高通量定序來測定本發明的基因標誌物的5-hmC含量。在該具體的實施方案中，測定本發明的基因標誌物的5-hmC含量的方法包括以下步驟：將來自食道癌患者和正常人的樣品的DNA片段化；將所述片段化的DNA末端修復並末端補齊；將末端補齊的DNA與定序接頭連接，獲得連接產物；通過標記反應對連接產物中的5-羥甲基胞嘧啶進行標記；富集含有5-羥甲基胞嘧啶標記的DNA片段，獲得富集產物；對富集產物進行PCR擴增，獲得定序庫；對定序庫進行高通量定序，獲得定序結果；根據定序結果確定5-羥甲基胞嘧啶在基因上的含量。其中，標記反應包括：i）利用糖基轉移酶將帶有修飾基團的糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上，和ii) 將直接或間接連有生物素的點擊化學受質與帶有修飾基團的5-羥甲基胞嘧啶反應。其中，步驟i）和步驟ii）可以按順序進行，也可以在一個反應中同時進行。這種標記方法減少了定序所需的樣本量，且5-羥甲基胞嘧啶上的生物素標籤使其在定序中顯示出更高的動力學信號，提高了核苷酸識別的準確性。在該實施方案中，所述糖基轉移酶包括但不限於： T4噬菌體β-葡糖基轉移酶（β-GT）、 T4噬菌體α-葡糖基轉移酶（α-GT）及其具有相同或相似活性的衍生物、類似物、或重組酶；所述帶有修飾基團的糖包括但不限於：帶有疊氮修飾的糖類（例如6-N3-葡萄糖）或帶有其他化學修飾（例如羰基、巰基、羥基、羧基、碳-碳雙鍵、碳-碳三鍵、二硫鍵、胺基、醯胺基、雙烯等）的糖類，其中優選帶有疊氮修飾的糖類；所述用於間接連接生物素和點擊化學受質的化學基團包括但不限於：羰基、巰基、羥基、羧基、碳-碳雙鍵、碳-碳三鍵、二硫鍵、胺基、醯胺基、雙烯。在該實施方案中，優選通過固相材料來富集含有5-hmC標記的DNA片段。具體地，可以通過固相親和反應或其他特異性結合反應將含有5-羥甲基胞嘧啶標記的DNA片段結合在固相材料上，然後通過多次洗滌去除未結合的DNA片段。固相材料包括但不限於帶有表面修飾的矽片或其他晶片，例如人工高分子小球(優選直徑為1nm-100μm)、磁性小球(優選直徑為1nm-100μm)、瓊脂糖小球等(優選直徑為1nm-100μm)。固相富集中所用的洗滌液是本領域技術人員熟知的緩衝液，包括但不限於：含有Tris-HCl、MOPS、HEPES（pH=6.0-10.0， 濃度在1mM到1M之間）、NaCl（0-2M）或表面活性劑如Tween20（0.01%-5%）的緩衝液。在該實施方案中，優選直接在固相上進行PCR擴增從而製備定序庫。如有需要，在固相上進行PCR擴增後，可以回收擴增產物後進行第二輪PCR擴增來製備定序庫。所述第二輪PCR擴增可用本領域技術人員已知的常規方法進行。任選地，在製備定序庫的過程中可進一步包括一個或多個純化步驟。本領域技術人員知曉的或可商購的任何純化試劑盒均可用於本發明。純化方法包括但不限於：凝膠電泳切膠回收、矽膠膜離心管法、磁珠法、乙醇或異丙醇沉澱法或其組合。任選地，在高通量定序之前，對定序庫進行品質檢查。例如，對定序庫進行片段大小分析並使用qPCR方法對定序庫的濃度進行絕對定量。通過品質檢查的定序庫可用於高通量定序。然後將一定數量（1-96個）含有不同barcode的定序庫按相同濃度混勻並根據二代定序儀的標準上機方法上機定序，獲得定序結果。本領域已知的各種二代定序平臺及其相關的試劑可用於本發明。

在本發明的一個實施方案中，優選將定序結果與標準人類基因體參考序列進行比對，挑選出其中比對到本發明基因標誌物上的序列，即選擇比對位點與基因特徵（如組蛋白修飾位點、轉錄因子結合位點、基因外顯子內含子區域以及基因啟動子等）重合區域的讀段數量，以代表5-hmC在該基因上的修飾水準，從而測定5-hmC在該基因標誌物上的含量。優選在進行比對前，首先將定序結果清除低品質定序位點，其中衡量定序位點品質的因素包括但不限於：鹼基品質、讀數（reads）品質、GC含量、重複序列和過表達（Overrepresented） 序列數量等。該步驟中涉及的各種比對軟體和分析方法是本領域已知的。

在本發明的一個實施方案中，測定基因標誌物的5-hmC含量是指測定該基因標誌物全長上的5-hmC含量或測定該基因標誌物上某一片段的5-hmC含量或其組合。

根據本發明，在測定各基因標誌物上5-hmC含量之後，用正常樣品中所述基因標誌物的5-hmC含量作為參照，將受試者樣品中對應的基因標誌物的5-hmC含量標準化。舉例而言，正常樣品和受試者樣品中同一基因標誌物的5-hmC含量分別為X和Y，則受試者樣品中該基因標誌物的標準化5-hmC含量為Y/X。

根據本發明，在資料標準化後，對各基因標誌物的標準化5-hmC含量進行數學關聯以獲得評分，從而根據所述評分獲得檢測結果。如本文所用，“數學關聯”是指將來自生物樣品的基因標誌物的5-hmC含量與食道癌診斷結果相關聯的任何計算方法或機器學習方法。本領域普通技術人員理解，可選擇不同的計算方法或工具用於提供本發明的數學關聯，例如彈性網路正則化、決策樹、廣義線性模型、邏輯迴歸、最高分值對、神經網路、線性和二次判別式分析(LQA 和QDA)、單純貝葉斯、隨機森林和支援向量機。

在本發明的一個實施方案中，對各基因標誌物的標準化5-hmC含量進行數學關聯並獲得評分的具體步驟如下：將各基因標誌物的標準化5-hmC含量乘以加權係數，獲得該基因標誌物的預測因子t；將各基因標誌物的預測因子t相加，獲得總預測因子T；將總預測因子T經過Logistic轉換獲得評分P；若P＞0.5，則該受試者樣品患有食道癌；若P≤0.5，則該受試者樣品為正常。本文所述的加權係數是指在考慮可能影響5-hmC含量的因素（例如受試者地域、年齡、性別、吸煙史、飲酒史、家族史等）的情況下，通過本領域技術人員已知的各種高級統計分析方法獲得的係數。

本發明第三個方面還涉及利用上述基因標誌物進行食道癌檢測的試劑盒，其包括用於測定上述基因標誌物的5-hmC含量的試劑和說明書。用於測定基因標誌物的5-hmC含量的試劑是本領域技術人員已知的，例如T4 噬菌體β-葡萄糖轉移酶和同位素標記（對於葡糖基化法）、限制性內切酶（對於限制性內切酶法）、糖基轉移酶和生物素（對於化學標記法）、PCR和定序所用試劑等。

與現有技術相比，本發明中用於檢測食道癌的方法是基於基因標誌物上的5-hmC含量，因此可以使用更為廣泛的DNA樣品來源。因此，本發明中用於檢測食道癌的方法具有以下幾個優點：（1）安全無創，即使無症狀人群也對該檢測接受度高；（2）DNA來源廣泛，不存在影像學中的檢測盲區；（3）準確性高，對早期食道癌有較高的靈敏度和特異性，適合用於食道癌的早期篩查；（4）操作方便，用戶體驗好，容易進行食道癌復發和轉移的動態監測。本發明的基因標誌物可與其他臨床指標相結合，為食道癌篩查、診斷、治療與預後提供更準確的判斷。

下面將參考附圖並結合實施例來詳細說明本發明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發明並能予以實施。需要說明的是，本領域的技術人員應該理解本發明的附圖及其實施例僅僅是為了說明的目的，並不能對本發明構成任何限制。在不矛盾的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特徵可以相互組合。

實施例1. 食道癌基因標誌物的篩選

（1）萃取血漿DNA：

從來自20位食道癌患者和20位正常人的樣品中分別萃取10 ng血漿DNA。可利用本領域技術人員所熟知的任何適用於萃取血漿DNA的方法、和試劑進行此步驟。

（2）將血漿DNA進行末端補齊、懸A並與定序接頭連接：

根據Kapa Hyper Perp Kit說明書製備含有50μL 血漿DNA、7μL End Repair & A-Tailing Buffer和3μL End Repair & A-Tailing Enzyme mix的反應混合液（總體積為60 μL），在20℃溫浴30分鐘，然後在65℃溫浴30分鐘。在1.5mL低吸附EP管中配製以下連接反應混合物：5μL Nuclease free water，30μL Ligation Buffer以及10 μL DNA Ligase。向45μL連接反應混合物中加入5μL 的定序接頭，混合，於20℃加熱20分鐘，然後保持於4℃。使用AmpureXP beads對反應產物進行純化，用20μL含Tris-HCl（10mM， pH=8.0）及EDTA（0.1mM）的緩衝液進行洗脫獲得最終的DNA連接樣品。

（3）標記5-羥甲基胞嘧啶：

製備總體積為26 μL的標記反應混合液：疊氮修飾的二磷酸尿苷葡萄糖（即UDP-N3-Glu，終濃度為50μM）、β-GT（終濃度為1μM）、Mg²⁺ （終濃度為25mM）、HEPES（pH=8.0，終濃度為50mM）和來自上述步驟的20μL DNA。將混合液在37℃溫浴1小時。取出混合液，用AmpureXP beads純化，獲得純化的20μL DNA。

然後在上述純化的20μL DNA中加入1μL連接有生物素的二苯基環辛炔（DBCO-Biotin），於37℃反應2小時，接著用AmpureXP beads純化，獲得純化的標記產物。

（4）固相富集含有標記的5-羥甲基胞嘧啶的DNA片段：

首先，按以下步驟準備磁珠：取出0.5μL C1 streptadvin beads（life technology）並加入100μL緩衝液（5mM Tris， pH=7.5， 1M NaCl， 0.02% Tween20），渦旋混合30秒，然後用100μL洗滌液（5mM Tris， pH=7.5， 1M NaCl， 0.02% Tween20）洗滌磁珠3次，最後加入25 μL結合緩衝液（10mM Tris， pH=7.5， 2M NaCl， 0.04% Tween20或其他表面活性劑），並混合均勻。

然後，在磁珠混合液中加入上述步驟獲得的純化的標記產物，並在旋轉混合器中混合15min使其充分結合。

最後，用100μL洗滌液（5mM Tris， pH=7.5， 1M NaCl， 0.02% Tween20）洗滌磁珠3次，離心去掉上清液，加入23.75μL不含核酸酶的水。

（5）PCR擴增：

向上述步驟的最終體系中加入25μL的2 X PCR master mix和1.25μL PCR引子（總體積為50μL），按照下述PCR反應迴圈的溫度和條件進行擴增： 將擴增產物用AmpureXP beads純化，得到最終定序庫。

（6）對定序庫進行品質檢查後進行高通量定序：

將獲得的定序庫通過qPCR進行濃度測定，並用Agilent2100對庫中DNA片段大小含量進行確定。將通過質檢的定序庫以相同濃度混合，用Illumina Hiseq 4000進行定序。

（7）確定各基因標誌物的5-hmC含量和加權係數

將獲得的定序結果進行初步品質控制評估，清除低品質定序位點後，將達到定序品質標準的讀段利用Bowtie2工具與人類標準基因體參考序列進行比較。然後利用featureCounts和HtSeq-Count工具來統計讀段數量以確定各基因標誌物的5-hmC含量。同時利用高通量定序結果，將可能影響5-hmC含量的因素作為共變數，通過邏輯迴歸和彈性網路正則化獲得各基因標誌物的加權係數。結果如表1所示。 表一：本發明的食道癌基因標誌物的平均標準化5-hmC含量和加權係數

如上所述，平均標準化5-hmC含量是指食道癌樣品中該基因標誌物的平均5-hmC含量與正常樣品中同一基因標誌物的平均5-hmC含量之比。從表1可以看出，本發明的食道癌基因標誌物的5-hmC含量在正常樣品中和食道癌樣品中存在顯著差異，並且除ADAMTSL1、LDB2之外，其餘基因標誌物的5-hmC含量相對於正常人均顯著增加。

實施例2. 食道癌基因標誌物的有效性

本實施例驗證本發明的食道癌基因標誌物用於檢測食道癌的有效性。

根據實施例1的方法測定第一批148個樣品（41例食道癌和107例健康對照）中本發明所述的10個食道癌基因標誌物的5-hmC含量。

將各基因標誌物的標準化5-hmC含量乘以該標誌物在實施例1中對應的加權係數，獲得該基因標誌物的預測因子t，之後將各基因標誌物的預測因子t相加，獲得總預測因子T，然後將總預測因子T根據以下公式經過Logistic轉換獲得評分P：

若P＞0.5，則該受試者樣品患有食道癌；若P≤0.5，則該受試者樣品為正常。

圖1示出了根據本發明的方法區分該批樣品的結果。如圖1所示，本發明的方法能夠達到90%的靈敏度和92%的特異性。

無

圖1用本發明的食道癌基因標誌物區分食道癌樣品和健康對照的結果。

Claims (10)

1. 一種用於檢測食道癌的基因標誌物，包括一個或多個選自以下的基因：磷脂肌醇磷酸酯酶CX域包含蛋白3（PLCXD3）、硫酸酯酶1（SULF1）、F-Box和多白胺酸重複蛋白7（FBXL7）、Tolloid類蛋白1（TLL1）、RNA結合模體單股交互作用蛋白質3（RBMS3）、ADAMTS類蛋白1（ADAMTSL1）、磷酸二酯酶10A（PDE10A）、LIM域連接酶2（LDB2）、伽馬-氨基丁酸A型受體蛋白伽馬3次單元（GABRG3）和序列相似性155家族蛋白成員A（FAM155A）。
2. 如請求項1所述的基因標誌物，包括PLCXD3、SULF1、FBXL7、TLL1、RBMS3、ADAMTSL1、PDE10A、LDB2、GABRG3和FAM155A。
3. 如請求項1或2所述的基因標誌物在用於檢測食道癌的方法中的用途。
4. 一種用於檢測食道癌的方法，包括以下步驟： （a）測定正常樣品和受試者樣品中請求項1或2所述的基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）的含量； （b）用正常樣品中所述基因標誌物的5-hmC含量作為參照，將受試者樣品中對應的基因標誌物的5-hmC含量標準化； （c）對步驟（b）中經標準化的所述基因標誌物的5-hmC含量進行數學關聯，並獲得評分P；和 （d）根據所述評分P獲得檢測結果，評分P大於0.5表明該受試者樣品患有食道癌。
5. 如請求項4所述的方法，其中步驟（a）是測定所述基因標誌物全長或其片段上的5-hmC的含量。
6. 如請求項4所述的方法，其中所述樣品是來自正常人或受試者體液中游離的DNA片段，或來源於胞器、細胞以及組織中的完整基因體DNA。
7. 如請求項6所述的方法，其中所述體液是血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁或食道液。
8. 一種用於測定如請求項1或2所述的基因標誌物的5-hmC含量的試劑在製備用於檢測食道癌的試劑盒中的用途。
9. 一種用於檢測食道癌的試劑盒，包括： （a）用於測定如請求項1或2所述的基因標誌物的5-hmC含量的試劑；和 （b）說明書。
10. 如請求項9所述的試劑盒，其中所述5-hmC含量是指所述基因標誌物全長或其片段上的5-hmC的含量。