TWI667480B - Gene marker, reagent group and detection method for detecting benign and malignant liver tumors - Google Patents

Abstract

本發明涉及用於檢測肝腫瘤良惡性的基因標誌物、試劑組及檢測方法。基因標誌物包括一個或兩個以上以下基因：FAT非典型鈣粘蛋白1、雌激素相關受體γ、性別決定基因y染色體區域盒家族成員9、纖毛狀絡合物子單元1、1號染色體開放閱讀框125抗體、絡絲蛋白、轉鐵蛋白、TNF受體超家族成員、胰腺和十二指腸同圓框1、α-酸性糖蛋白2；通過高通量測序檢測肝腫瘤基因標誌物中5-羥甲基胞嘧啶的含量，從而判定肝腫瘤良惡性。本發明檢測肝腫瘤良惡性具有安全無創、DNA來源廣泛、準確性高、操作方便、受檢者體驗好優點。本發明可與其他臨床指標相結合，為肝腫瘤後續篩查、診斷、治療與預後提供更準確的判斷。

Description

用於檢測肝腫瘤良惡性的基因標誌物、試劑組及檢測方法

本發明涉及肝腫瘤良惡性的臨床分子診斷技術領域。具體的，本發明涉及用於檢測肝腫瘤良惡性的基因標誌物、試劑組及肝腫瘤良惡性的檢測方法。

腫瘤分良性腫瘤和惡性腫瘤兩大類。良性腫瘤生長緩慢，除在要害部位占位有影響外，一般對健康和生命沒有危害。惡性腫瘤生長迅速，與人體爭奪營養，產生有害代謝產物，破壞人體正常器官組織結構，對人體健康極為有害，如不及時進行有效治療將會奪人生命。常見的肝良性腫瘤有肝細胞腺瘤、肝管細胞腺瘤、腎上腺殘餘瘤、血管瘤、錯構瘤(hamartoma)等。肝惡性腫瘤就是指肝細胞肝癌，即我們通常講的肝癌。肝癌是最常見的全球惡性腫瘤之一。據世界衛生組織2008年統計，全球每年新發病748300例，死亡695900例，其中50%以上發生在中國。

良性腫瘤與惡性腫瘤二者在細胞形態、組織結構、生長方式、增長速度和對人體影響等方面均有本質的不同，所以治療方式上也不一樣。把惡性腫瘤當作良性腫瘤治療就會貽誤病人。反之，若把良性腫瘤當作惡性腫瘤治療，不僅造成病人精神上負擔，而且由於採取許多不必要的治療手段，致使病人遭受痛苦和損失。但某些良性腫瘤和惡性腫瘤有著相近似的生長形式，給診斷造成很大的困難。如有的良性腫瘤生長較快，狀似惡性腫瘤；而有的惡性腫瘤有可能生長緩慢很像良性腫瘤。甚至有的腫瘤本身就具有良性惡性的兩種特點，雖然腫瘤細胞表現為良性，而且有完整包膜，但它是多中心性生長，治 療後較一般良性腫瘤復發率高，就其臨床的某些特點來看很似惡性腫瘤，固稱之為臨界性腫瘤。此外，某些良性腫瘤在其發展過程中有變為惡性的可能，也引起臨床的重視。

因此，針對肝良性腫瘤和惡性腫瘤尋找診斷標誌物，提高對肝良性腫瘤與惡性腫瘤區分鑒別能力，對臨床診斷具有非常重要的意義。

本發明通過對良性肝腫瘤樣品與肝癌樣品進行高通量測序，並對其中各基因上的5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5-hmC)含量進行分析，出乎意料地發現了多個極具資訊的可用於檢測肝腫瘤良惡性的基因標誌物。

因此，本發明的第一個方面涉及用於檢測肝腫瘤良惡性的基因標誌物，包括一個或兩個以上的以下基因：FAT非典型鈣粘蛋白1(FAT1)、雌激素相關受體γ(ESRRG)、性別決定基因y染色體區域盒家族成員9(SOX9)、纖毛狀絡合物子單元1(EVC)、1號染色體開放閱讀框125抗體(AXDND1)、絡絲蛋白(RELN)、轉鐵蛋白(TF)、TNF受體超家族成員(TNFRSF11B)、胰腺和十二指腸同圓框1(PDX1)、α-酸性糖蛋白2(ORM2)。較佳的是的，所述基因標誌物包括FAT1、ESRRG、SOX9、EVC、AXDND1、RELN、TF、TNFRSF11B、PDX1和ORM2。

本發明還涉及上述基因標誌物在檢測肝腫瘤良惡性中的用途，通過高通量測序檢測肝腫瘤良惡性基因標誌物中5-羥甲基胞嘧啶的含量，從而判定肝腫瘤的良惡性。

本發明的第二個方面涉及用於檢測肝腫瘤良惡性的方法，包括以下步驟：a)測定良性肝腫瘤樣品和肝癌受試者樣品中本發明所述的基因標誌物 的5-hmC的含量；b)用良性肝腫瘤樣品中所述基因標誌物的5-hmC含量作為對照，將肝癌受試者樣品中對應的基因標誌物的5-hmC含量標準化；c)對經標準化的所述基因標誌物的5-hmC含量進行數學關聯，並獲得評分；及d)根據所述評分獲得區分結果。

在一個實施方案中，所述樣品是受試者體液中游離的DNA片段，或來源於細胞器、細胞以及組織中的完整基因組DNA。其中，體液是血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁、胰腺液等。

在一個實施方案中，本發明所述的基因標誌物的5-hmC含量可通過本領域技術人員已知的任何方法進行測定，例如包括但不限於，葡糖基化法(glucosylation)、限制性內切酶法、化學標記法、與高通量測序方法聯用的沉澱法、單分子即時測序法(SMRT)、氧化重亞硫酸鹽測序法(OxBS-Seq)等。葡糖基化法的原理是採用T4噬菌體β-葡萄糖轉移酶(β-GT)，在葡萄糖供體受質尿核苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glu)存在下，將葡萄糖轉移至羥基位置，從而生成β-葡萄糖基-5-羥甲基胞嘧啶(5-ghmC)。同時可採用同位素標記受質進行定量。在葡糖基化法基礎上進一步發展出限制性內切酶法和化學標記法。限制性內切酶法的原理是：葡糖基化反應改變了一些限制性內切酶的酶切特性。甲基化依賴的限制性內切酶MspI和HpaII可識別同樣的序列(CCGG)，但它們對甲基化狀態的敏感性是不同：MspI識別並切割5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5-hmC，但不能切割5-ghmC；HpaII只切割完全未修飾的位點，胞嘧啶上的任何修飾(5-mC、5-hmC、5-ghmC)均阻礙切割。若CpG位點含有5-hmC，那麼糖基化、酶解之後能檢測到條帶，未糖基化對照反應中沒有條帶；同時可採用qPCR進行定量分析。另外，其他限制性內切酶也同樣存在阻礙5-ghmC酶切的情況，可應 用於5-hmC檢測(如：GmrSD，MspJI，PvuRts1I，TaqI等)。化學標記法的原理是：將酶反應受質上的葡萄糖進行化學修飾轉變成UDP-6-N3-glucose，將6-N3-glucose轉移到羥甲基位置，生成N3-5ghmC。隨後，通過點擊化學方法在每個5-hmC上添加一分子生物素，結合下一代高通量DNA測序技術或單分子測序技術，可分析5-hmC在基因組DNA中的分佈情況。沉澱法是將5-hmC用特殊方式修飾後再將其特異性地從基因組DNA中捕獲下來，並進行測序分析。氧化重亞硫酸鹽測序法是首個以單鹼解析度對5-hmC進行定量測序的方法。首先將5-hmC進行KRuO4氧化處理，生成5-甲醯胞嘧啶(5fC)，然後採用重亞硫酸鹽測序。在此過程中，5-hmC先氧化為5fC，而後脫氨形成U。通常，同時採用多種檢測方法對5-hmC進行定量檢測。

在本發明的一個實施方案中，利用化學標記法結合高通量測序來測定本發明的基因標誌物的5-hmC含量。在該具體的實施方案中，測定本發明的基因標誌物的5-hmC含量的方法包括以下步驟：將來自肝癌患者和良性肝腫瘤患者的DNA片段化；將所述片段化的DNA末端修復並末端補齊；將末端補齊的DNA與測序接頭連接，獲得連接產物；通過標記反應對連接產物中的5-羥甲基胞嘧啶進行標記；富集含有5-羥甲基胞嘧啶標記的DNA片段，獲得富集產物；對富集產物進行PCR擴增，獲得序列庫；對序列庫進行高通量測序，獲得測序結果；根據測序結果確定5-羥甲基胞嘧啶在基因上的含量。其中，標記反應包括：i)利用糖基轉移酶將帶有修飾基團的糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上，和ii)將直接或間接連有生物素的點擊化學受質與帶有修飾基團的5-羥甲基胞嘧啶反應。其中，步驟i)和步驟ii)可以按順序進行，也可以在一個反應中同時進行。這種標記方法減少了測序所需的樣本量，且5-羥甲基胞嘧啶上的生物素標籤使其在測序中顯示出更高的動力學信號，提高了核苷酸識別的準確性。在該實施方案中，所述糖基轉移酶包括但不限於：T4噬菌體β-葡糖基 轉移酶(β-GT)、T4噬菌體α-葡糖基轉移酶(α-GT)及其具有相同或相似活性的衍生物、類似物、或重組酶；所述帶有修飾基團的糖包括但不限於：帶有疊氮修飾的糖類(例如6-N3-葡萄糖)或帶有其他化學修飾(例如羰基、巰基、羥基、羧基、碳-碳雙鍵、碳-碳三鍵、二硫鍵、胺基、醯胺基、雙烯等)的糖類，其中較佳的是帶有疊氮修飾的糖類；所述用於間接連接生物素和點擊化學受質的化學基團包括但不限於：羰基、巰基、羥基、羧基、碳-碳雙鍵、碳-碳三鍵、二硫鍵、胺基、醯胺基、雙烯。在該實施方案中，較佳的是通過固相材料來富集含有5-hmC標記的DNA片段。具體地，可以通過固相親和反應或其他特異性結合反應將含有5-羥甲基胞嘧啶標記的DNA片段結合在固相材料上，然後通過多次洗滌去除未結合的DNA片段。固相材料包括但不限於帶有界面修飾的矽片或其他晶片，例如人工高分子小球(較佳的是直徑為1nm-100um)、磁性小球(較佳的是直徑為1nm-100um)、瓊脂糖小球等(較佳的是直徑為1nm-100um)。固相富集中所用的洗滌液是本領域技術人員熟知的緩衝液，包括但不限於：含有Tris-HCl、MOPS、HEPES(pH=6.0-10.0，濃度在1mM到1M之間)、NaCl(0-2M)或界面活性劑如Tween20(0.01%-5%)的緩衝液。在該實施方案中，較佳的是直接在固相上進行PCR擴增從而製備序列庫。如有需要，在固相上進行PCR擴增後，可以回收擴增產物後進行第二輪PCR擴增來製備序列庫。所述第二輪PCR擴增可用本領域技術人員已知的常規方法進行。任選地，在製備序列庫的過程中可進一步包括一個或多個純化步驟。本領域技術人員知曉的或可商購的任何純化試劑組均可用于本發明。純化方法包括但不限於：凝膠電泳切膠回收、矽膠膜離心柱法、磁珠法、乙醇或異丙醇沉澱法或其組合。任選地，在高通量測序之前，對序列庫進行品質檢查。例如，對序列庫進行片段大小分析並使用qPCR方法對序列庫的濃度進行絕對定量。通過品質檢查的序列庫可用于高通量測序。然後將一定數量(1-96個)含有不同barcode的 文庫按相同濃度混勻並根據二代測序儀的標準上機方法上機測序，獲得測序結果。本領域已知的各種二代測序平臺及其相關的試劑可用于本發明。

在本發明的一個實施方案中，較佳的是將測序結果與標準人類基因組參考序列進行比對，挑選出其中比對到本發明基因標誌物上的序列，即選擇比對位點與基因特徵(如組蛋白修飾位點、轉錄因子結合位點、基因外顯子內含子區域以及基因啟動子等)重合區域的讀段數量，以代表5-hmC在該基因上的修飾水準，從而測定5-hmC在該基因標誌物上的含量。較佳的是在進行比對前，首先將測序結果清除低品質測序位點，其中衡量測序位點品質的因素包括但不限於：鹼品質、序列片段(reads)品質、GC含量、重複序列和過表達(Overrepresented)序列數量等。該步驟中涉及的各種比對軟體和分析方法是本領域已知的。

在本發明的一個實施方案中，測定基因標誌物的5-hmC含量是指測定該基因標誌物全長上的5-hmC含量或測定該基因標誌物上某一片段的5-hmC含量或其組合。

根據本發明，在測定各基因標誌物上5-hmC含量之後，用良性肝腫瘤樣品中所述基因標誌物的5-hmC含量作為對照，將肝癌受試者樣品中對應的基因標誌物的5-hmC含量標準化。舉例而言，良性肝腫瘤樣品和肝癌受試者樣品中同一基因標誌物的5-hmC含量分別為X和Y，則肝癌受試者樣品中該基因標誌物的標準化5-hmC含量為Y/X。

根據本發明，在資料標準化後，對各基因標誌物的標準化5-hmC含量進行數學關聯以獲得評分，從而根據所述評分獲得檢測結果。如本文所用，“數學關聯”是指將來自生物樣品的基因標誌物的5-hmC含量與肝腫瘤診斷結果相關聯的任何計算方法或機器學習方法。本領域普通技術人員理解，可選擇不同的計算方法或工具用於提供本發明的數學關聯，例如彈性網路正則 化、決策樹、廣義線性模型、邏輯回歸、最高分值對、神經網路、線性和二次判別式分析(LQA和QDA)、樸素貝葉斯、隨機森林和支持向量機。

在本發明的一個實施方案中，對各基因標誌物的標準化5-hmC含量進行數學關聯並獲得評分的具體步驟如下：將各基因標誌物的標準化5-hmC含量乘以加權係數，獲得該基因標誌物的預測因數t；將各基因標誌物的預測因數t相加，獲得總預測因數T；將總預測因數T經過數學邏輯運算(Logistic)轉換獲得評分P；若P>0.5，則該受試者樣品患有肝癌；若P0.5，則該受試者患有良性肝腫瘤。本文所述的加權係數是指在考慮可能影響5-hmC含量的因素(例如受試者地域、年齡、性別、低於、吸煙史、飲酒史、家族史等)的情況下，通過本領域技術人員已知的各種高級統計分析方法獲得的係數。

本發明第三個方面還涉及利用上述基因標誌物進行肝腫瘤良惡性檢測的試劑組，其包括用於測定上述基因標誌物的5-hmC含量的試劑和說明書。用於測定基因標誌物的5-hmC含量的試劑是本領域技術人員已知的，例如T4噬菌體β-葡萄糖轉移酶和同位素標記(對於葡糖基化法)、限制性內切酶(對於限制性內切酶法)、糖基轉移酶和生物素(對於化學標記法)、PCR和測序所用試劑等。

與現有技術相比，本發明檢測肝腫瘤良惡性的方法是基於基因標誌物上的5-hmC含量，因此可以使用更為廣泛的DNA樣品來源。因此，本發明具有以下幾個優點：(1)安全無創口，即使無症狀人群也對該檢測接受度高；(2)DNA來源廣泛，不存在影像學中的檢測盲區；(3)準確性高，對肝癌有較高的靈敏度和特異性，更適用於肝腫瘤良惡性的區分；(4)操作方便，受檢者體驗好，容易進行肝腫瘤發展的動態監測。本發明的基因標誌物可與其他臨床指標相結合，為肝腫瘤後續的篩查、診斷、治療提供更準確的判斷。

圖1是本發明區惡性肝腫瘤樣品和良性肝腫瘤樣品對照的曲線圖。

下面結合實施例及附圖對本發明進行詳細說明，以使本領域技術人員更好的理解本發明，並能予以實施。

實施例1. 肝腫瘤基因標誌物的篩選

1)抽提血漿DNA：

從來自20位肝癌患者和20位良性肝腫瘤患者的樣品中分別抽提10ng血漿DNA。可利用本領域技術人員所熟知的任何適用於抽提血漿DNA的方法、和試劑進行此步驟。

2)將血漿DNA進行末端補齊、懸A並與測序接頭連接：

根據Kapa Hyper Perp Kit說明書製備含有50uL血漿DNA、7uL末端修復與腺嘌呤尾端緩衝液(End Repair & A-Tailing Buffer)和3uL末端修復與腺嘌呤尾端酵素混合物(End Repair & A-Tailing Enzyme mix)的反應混合液(總體積為60uL)，在20℃溫浴30分鐘，然後在65℃溫浴30分鐘。在1.5mL低吸附EP管中配置以下連接反應混合物：5uL無核酸酶的水(Nuclease free water)，30uL連接緩衝液(Ligation Buffer)以及10uL DNA連接酶(Ligase)。向45uL連接反應混合物中加入5uL的測序接頭，混合，於20℃加熱20分鐘，然後保持於4℃。使用AmpureXP beads對反應產物進行純化，用20uL含Tris-HCl(10mM，pH=8.0)及EDTA(0.1mM)的緩衝液進行洗脫獲得最終的DNA連接樣品。

3)標記5-羥甲基胞嘧啶：

製備總體積為26uL的標記反應混合液：疊氮修飾的二磷酸尿苷葡萄糖(即UDP-N3-Glu，終濃度為50uM)、β-GT(終濃度為1uM)、Mg2+ (終濃度為25mM)、HEPES(pH=8.0，終濃度為50mM)和來自上述步驟的20uL DNA。將混合液在37℃溫浴1小時。取出混合液，用AmpureXP beads純化，獲得純化的20uL DNA。

然後在上述純化的20uL DNA中加入1uL連接有生物素的二苯基環辛炔(DBCO-Biotin)，於37℃反應2小時，接著用AmpureXP beads純化，獲得純化的標記產物。

4)固相富集含有標記的5-羥甲基胞嘧啶的DNA片段：

首先，按以下步驟準備磁珠：取出0.5uL C1 streptadvin beads (life technology)並加入100uL緩衝液(5mM Tris，pH=7.5，1M NaCl，0.02% Tween20)，渦旋混合30秒，然後用100uL洗滌液(5mM Tris，pH=7.5，1M NaCl，0.02% Tween20)洗滌磁珠3次，最後加入25uL結合緩衝液(10mM Tris，pH=7.5，2M NaCl，0.04% Tween20或其他界面活性劑)，並混合均勻。

然後，在磁珠混合液中加入上述步驟獲得的純化的標記產物，並在旋轉混合器中混合15min使其充分結合。

最後，用100uL洗滌液(5mM Tris，pH=7.5，1M NaCl，0.02% Tween20)洗滌磁珠3次，離心去掉上清液，加入23.75uL不含核酸酶的水。

5)PCR擴增

向上述步驟的最終體系中加入25uL的2 X PCR master mix和1.25uL PCR引子對(總體積為50uL)，按照下述PCR反應循環的溫度和條件進行擴增：

將擴增產物用AmpureXP beads純化，得到最終序列庫。

6)對序列庫進行品質檢查後進行高通量測序：

將獲得的序列庫通過qPCR進行濃度測定，並用Agilent2100對文庫中DNA片段大小含量進行確定。將通過品質檢查的序列庫以相同濃度混合，用Illumina Hiseq 4000進行測序。

7)確定各基因標誌物的5-hmC含量和加權係數：

將獲得的測序結果進行初步品質控制評估，清除低品質測序位點後，將達到測序品質標準的讀段利用Bowtie2工具與人類標準基因組參考序列進行比較。然後利用featureCounts和HtSeq-Count工具來統計讀段數量以確定各基因標誌物的5-hmC含量。同時利用高通量測序結果，將可能影響5-hmC含量的因素作為共變數，通過邏輯回歸和彈性網路正則化獲得各基因標誌物的加權係數。結果如表1所示。

如上所述，平均標準化5-hmC含量是指肝癌樣品中該基因標誌物的平均5-hmC含量與良性肝腫瘤樣品中同一基因標誌物的平均5-hmC含量之比。從表1可以看出，本發明的肝腫瘤基因標誌物的5-hmC含量在良性肝腫瘤樣品中和肝癌樣品中存在顯著差異。

實施例2. 肝腫瘤基因標誌物的有效性

本實施例驗證本發明的肝腫瘤基因標誌物用於區分肝腫瘤良惡性的有效性。

根據實施例1的方法測定第一批164個樣品(82例肝癌和82例良性肝腫瘤)中本發明所述的10個肝癌基因標誌物的5-hmC含量。

將各基因標誌物的標準化5-hmC含量乘以該標誌物在實施例1中對應的加權係數，獲得該基因標誌物的預測因數t，之後將各基因標誌物的預測因數t相加，獲得總預測因數T，然後將總預測因數T根據以下公式經過數學邏輯運算(Logistic)轉換獲得評分P：

若P>0.5，則該受試者樣品患有肝癌；若P0.5，則該受試者患有良性肝腫瘤。

圖1示出了根據本發明的方法區分該批樣品的結果。如圖1所示，本發明的方法能夠達到95%的靈敏度和96%的特異性。

最後應當說明的是，以上內容僅用以說明本發明的技術方案，而非對本發明保護範圍的限制，本領域的普通技術人員對本發明的技術方案進行的簡單修改或者等同替換，均不脫離本發明技術方案的實質和範圍。

Claims (8)

1. 一種基因標誌物用於檢測肝腫瘤良惡性的用途，通過高通量測序檢測肝腫瘤基因標誌物中5-羥甲基胞嘧啶的含量，從而判定肝腫瘤良惡性，所述基因標誌物包括以下基因：FAT非典型鈣粘蛋白1(FAT1)、雌激素相關受體γ(ESRRG)、性別決定基因y染色體區域盒家族成員9(SOX9)、纖毛狀絡合物子單元1(EVC)、1號染色體開放閱讀框125抗體(AXDND1)、絡絲蛋白(RELN)、轉鐵蛋白(TF)、TNF受體超家族成員(TNFRSF11B)、胰腺和十二指腸同圓框1(PDX1)和α-酸性糖蛋白2(ORM2)。
2. 一種基因標誌物在製備檢測肝腫瘤良惡性試劑組的用途，所述基因標誌物包括以下基因：FAT1、ESRRG、SOX9、EVC、AXDND1、RELN、TF、TNFRSF11B、PDX1和ORM2。
3. 一種用於檢測肝腫瘤良惡性的方法，包括以下步驟：a)測定良性肝腫瘤樣品和肝癌受試者樣品中申請專利範圍第1或2項所述的基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶的含量；b)用良性肝腫瘤樣品中所述基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶含量作為對照，將肝癌受試者樣品中對應的基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶含量標準化，良性肝腫瘤樣品和肝癌受試者樣品中同一基因標誌物的5-羥甲基胞嘧啶含量分別為X和Y，則肝癌受試者樣品中該基因標誌物的標準化5-羥甲基胞嘧啶含量為Y/X；c)通過邏輯回歸和彈性網路正則化獲得各基因標誌物的加權係數；d)將各基因標誌物的標準化5-hmC含量乘以與其對應的加權係數，獲得該基因標誌物的預測因數t；將各基因標誌物的預測因數t相加，獲得總預測因數T；將總預測因數T根據以下公式經過Logistic轉換獲得評分P： e)若P>0.5，則該受試者樣品患有肝癌；若P0.5，則該受試者患有良性肝 腫瘤。
4. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其特徵在於步驟a)包括如下步驟：將來自肝癌患者和良性肝腫瘤患者的DNA片段化；將所述片段化的DNA末端修復並末端補齊；將末端補齊的DNA與測序接頭連接，獲得連接產物；通過標記反應對連接產物中的5-羥甲基胞嘧啶進行標記；富集含有5-羥甲基胞嘧啶標記的DNA片段，獲得富集產物；對富集產物進行PCR擴增，獲得序列庫；對序列庫進行高通量測序，獲得測序結果；根據測序結果確定5-羥甲基胞嘧啶在基因上的含量。
5. 如申請專利範圍第4項所述的方法，其特徵在於：所述標記反應包括：i)利用糖基轉移酶將帶有修飾基團的糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上，和ii)將直接或間接連有生物素的點擊化學受質與帶有修飾基團的5-羥甲基胞嘧啶反應。
6. 如申請專利範圍第3或4或5項所述的方法，其特徵在於：所述步驟(a)是測定所述基因標誌物全長或其片段上的5-hmC的含量。
7. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其特徵在於：所述樣品是來自受試者體液中游離的DNA片段，或來源於細胞器、細胞以及組織中的完整基因組DNA。
8. 如申請專利範圍第7項所述的方法，其特徵在於：所述體液是血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁或胰腺液。