CN106893784A - 用于预测肝癌预后的lncRNA标志物 - Google Patents

用于预测肝癌预后的lncRNA标志物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于预测肝癌预后的lncRNA标志物，所述lncRNA标志物为lncRNA选自MKLN1‑AS、RP11‑133K1.6、RP1‑228H13.5、LRRC3‑AS1和AC127904.2中的一种或几种。本发明同时公开了预测肝癌预后的风险评分模型，根据该模型，作为辅助手段预测肝癌患者的预后，从而对患者进行风险评估和监测。

Description

用于预测肝癌预后的lncRNA标志物
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及用于预测肝癌预后的lncRNA标志物。
背景技术
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，是世界范围内肿瘤导致死亡的主要因素之一。80％的新发肝癌病例出现在发展中国家，肝细胞癌(HCC)是中国癌症死亡的主要原因之一。尽管局部治疗如手术和经导管动脉化学栓塞能够治疗肝癌，但肝癌病人仍有很高的复发率，因此手术对患者生存改善还很有限。目前，血清甲胎蛋白(AFP)的早期筛查及多学科综合治疗的应用，使肝癌的五年生存率有所提高，但由于其恶性生物学特性，其复发率和死亡率仍居高不下，因此如何进行风险评估和监测是一个重要的问题。
肝癌的发生发展是多因素、多步骤的复杂过程，肝癌的发病机制极其复杂，其发生、发展和转移与多种基因的突变、缺失、细胞信号转导通路异常及新生血管异常增生等密切相关，进一步探索肝癌的发病机制，了解其生物学特性，是确定新的肝癌生物标志物及寻找有效治疗靶点的基础。
基因组学研究表明，大约只有1％的基因可转录成有蛋白编码功能的RNA，而大部分则转录成无蛋白编码功能的RNA，即非编码RNA。其中，长链非编码RNA(long non-codingRNA，lncRNA)是真核细胞中一类转录本长度大于200个核苷酸，但无或很少具有蛋白编码功能的RNA，曾被认为是基因转录的副产物或“暗物质”，不具有生物学功能。随着lncRNA功能学的进展，越来越多的研究表明lncRNA在人类疾病中发挥重要作用。目前，研究表明lncRNA具有复杂的生物学功能，如与细胞代谢、细胞凋亡、细胞周期、细胞黏附运动等有关，并可通过多种途径如调节DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重构、作为miRNA的前体、mRNA降解、磷酸化作用、蛋白修饰等发挥功能，正如同内源性miRNA研究已取得重要成果一样，lncRNA在疾病诊断和治疗领域代表了另一类重要的分子来源，其研究前景巨大。
多项研究已证实lncRNA在肿瘤领域发挥重要作用，主要体现在肿瘤的发生、发展、浸润、转移及复发等多个方面。目前，在肿瘤组织中发现的异常表达的lncRNA可涉及全身各个系统，分布较为广泛，但是由于lncRNA数量庞大，目前针对lncRNA在癌症领域中的研究仍处在起步阶段。lncRNA影响肿瘤发生和/或发展的机制尚有待进一步揭示，众多针对癌症治疗的潜在靶点也有待于研究者们不断发现。因为lncRNA在肝癌的发生机制中的角色尚未阐明，因此探寻lncRNA肝癌的分子基础具有重要意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，在于提供一种预测肝癌预后的手段和产品。
本发明的目的之二，提供一种建立肝癌患者预后预测模型的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了lncRNA在制备预测肝癌预后的产品中的应用，所述lncRNA选自MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1和AC127904.2中的一种或几种。
进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒。所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测基因表达水平的针对MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1和AC127904.2基因的寡核苷酸探针；所述基因检测试剂盒包括用于检测MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1和AC127904.2基因表达水平的引物或芯片。
进一步，所述产品包括检测样本中MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2的表达水平的试剂。
进一步，所述试剂选自：
特异性识别MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2的探针；或
特异性扩增MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2的引物。
本发明提供了一种预测肝癌预后的产品，所述产品通过检测MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2表达水平来预测肝癌的预后结果。
进一步，所述产品通过检测标本中MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2表达水平来预测肝癌的预后结果。
进一步，所述产品包括(但不限于)：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测ENSG00000262155基因的表达水平。
其中，所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2基因的引物；所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2基因的引物；所述用原位杂交诊断肝癌的产品包括：与MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断肝癌的产品包括与ENSG00000262155基因的核酸序列杂交的探针。
进一步，每例标本在分别进行检测后，使用公式： 进行风险评分，其中，N为用于预测预后的lncRNA数，Expi为每个lncRNA的表达水平，Ci为每个lncRNA的回归系数；lncRNA MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2对应的回归系数分别为0.290、0.403、0.531、-0.175、-0.330，Ci小于0代表基因低表达，Ci大于0代表基因高表达。
进一步，评价个体肝癌预后的信息时，把患者的lncRNA的表达水平代入公式中，得出风险评分，然后与确定的cut-off值比较，小于该值的患者属于低危组，大于该值的患者属于高危组。
本发明提供了一种建立肝癌患者预后预测模型的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将患者分为训练组和验证组，从训练组受试者采集的标本中测定差异表达基因；
(2)根据所述差异表达基因，确定具有统计显著性的设定值范围；
(3)多变量Cox回归分析每个差异表达基因对生存期的贡献，建立风险评分模型；
(4)使用验证组对风险评分模型进行验证，检验所建模型的预测准确度。
进一步，所述差异表达基因为MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1和AC127904.2，其中，MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5在肝癌患者中表达上调，LRRC3-AS1、AC127904.2在肝癌患者中表达下调。
在本发明中，选自MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2的一种或几种进行了风险评分，发现一种或几种均具有预测肝癌预后的能力，但是把5中lncRNA联合起来预测肝癌预后则具有更强的判断效能。
进一步，所述风险评分模型为：风险评分＝(0.531×RP1-228H13.5的表达水平)+(0.403×RP11-133K1.6的表达水平)+(0.290×MKLN1-AS的表达水平)+(-0.330×AC127904.2的表达水平)+(-0.175×LRRC3-AS1的表达水平)，当风险评分大于0时，患者预后不良；当风险评分小于0时，患者预后良好。
所述“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施方式中，所述样本为组织。
在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。
在本发明中，“试剂盒”中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
在本发明中，“预后”用来预测本发明的肝癌的进展(包括复发、转移性扩散及耐药性)的可能性。术语“预后”用来说明本发明的患者在经过主要肿瘤的切除术后无癌症复发下生存特定期间的可能性。这种预测是通过对任一特定患者选择最适宜的疗法而在临床上可用来确定治疗。这种预测可在患者对治疗养生，例如能否易于对手术做出积极反应，或患者在手术结束后能否长期存活的判断成为宝贵的工具。术语“预后良好”或“良好预后”可表示为临床结果的积极临床结果的可能性的提高，术语“不良预后”或“预后不良”可表示为临床结果的积极临床结果的可能性的降低。
术语“差异表达基因”或“基因差异表达”是指，，与正常或对照用靶的表达相比，在患有肝癌的患者体内得到更高或更低水平的活化的基因。此外，“差异表达基因”或“差异基因表达”包括相同疾病的不同分期内得到更高或更低水平的活化的基因。这种差异可通过如多肽的mRNA水平、表面显示、分泌或其他分配上的变化而得以证明。从本发明的目的出发，将“差异基因表达”视为从正常的或患有疾病的受试者中，或从患有疾病的受试者的各分期中的取得的基因的表达之间存在1.5倍或以上、约4倍或以上、约6倍或以上、约10倍或以上的差异时存在的现象。
本发明中所测定的基因的表达水平进行归一化，所述“归一化”是指与标准基因集的转录本/产物的平均水平相比时的转录本或基因表达产物的水平，其中内参基因是通过患者、组织或治疗并基于这些基因的最低变化来进行选择(“管家基因(housekeepinggene)”)，或内参基因是指被测试的整体基因。当指后者时，通常被称为“整体归一化”，关键点在于所测基因的总数要较大，优选为超过50。具体地，与RNA转录本相关的术语“归一化”是指与标准基因集的平均转录水平相比时的转录水平。
P53(TP53)被誉为“分子警察”，其主要生物学功能是维持细胞基因组的稳定，负调节细胞的生长，诱导细胞凋亡，研究发现，人类恶性肿瘤中至少有50％发生了P53基因改变，临床中通过检测P53的突变和转录活性，作为肝癌肿瘤患者的诊断、预后和治疗的辅助因子。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1和AC127904.2在肝癌患者组织中差异表达，通过检测MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1和AC127904.2的表达水平可以判断预测患者的预后。
本发明提供了一种预测肝癌预后的模型，通过检测肝癌患者中MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1和AC127904.2的表达水平，代入预测肝癌预后的模型公式中，可以预测肝癌患者的预后，从而对患者进行风险评估和监测。
附图说明
图1是五个lncRNA标志物与训练组肝癌患者整体生存期的关系图；其中，图A是RS模型预测训练组肝癌患者预后的ROC曲线图；图B是肝癌患者的风险评分分布、整体生存期状态以及lncRNAs表达水平图；图C是RS模型预测肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图；
图2是RS模型对验证组肝癌患者和整体肝癌患者的预后分析图；其中，图A是RS模型预测验证组肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图；图B是RS模型预测整体肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图；
图3是RS模型预测不同分级的肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图；其中，图A是RS模型预测Ⅰ级肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图；图B是RS模型预测Ⅱ级肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图；图C是RS模型预测Ⅲ/Ⅳ级肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图；
图4是5个lncRNA标志物与临床结果在TP53突变型与野生型的肝癌患者中的关系图；其中，图A是RS模型预测TP53突变型肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图；图B是RS模型预测TP53突变型高风险组、突变型低风险组以及野生型组肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图；图C是RS模型预测TP53野生型肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图；图D是RS模型预测TP53野生型高风险组、野生型低风险组以及突变型组肝癌患者预后的Kaplan-Meier生存曲线图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与肝癌相关的基因标志物
1、样本
从TCGA数据库中筛选连续的病理确诊及手术切除的肝癌病例174例的肝癌组织和癌旁组织，随机分为训练组(91例)和验证组(83例)，纳入的病人的临床信息包括年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤分期、新发肿瘤以及生存期信息。
2、数据分析
提取lncRNA表达和生存时间数据，对训练组的lncRNA数据采用survival包的coxph函数做单因素Cox回归分析，筛选得到单因素Cox回归中p值<0.01。
3、结果
经单因素Cox回归分析，筛选得到五个与肝癌生存期有关的lncRNA，其中MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5在肝癌患者中表达上调，LRRC3-AS1、AC127904.2在肝癌患者中表达下调。
实施例2 RS模型预测肝癌患者预后的效能检测
1、数据分析
每个筛选的lncRNA的预后特征通过单变量Cox回归分析，在训练组，lncRNAs与病人的整体存活率相关(P<0.01)。然后使用R包中的多变量Cox回归计算每个lncRNA对生存预测的贡献值。建立风险评分模型来评估病人的风险，评分公示如下：
其中N代表用于预后预测的lncRNA数，Expi代表lncRNAi的表达水平，Ci代表从多变量Cox回归分析中获得的lncRNAi的回归系数。使用ROC曲线和AUC曲线来确定RS模型预测的敏感性和特异性。利用Kaplan-Meier生存曲线分析高风险组和低风险组的区别，使用Cox比例风险回归模型对lncRNA RS模型和其他临床特征进行独立危险因素分析，对风险评分、年龄、性别、肿瘤的分级、分期和临床辅助诊断因子进行多变量分析，得出风险比和95％置信区间(CI)，所有的数据分析使用R/Bio-conductor包(版本3.3.0)。
2、实验结果：
各临床指标与各基因的Cox风险回归模型预测患者的独立危险因素如下：
表1每组数据的单变量和多变量Cox回归分析
根据多变量Cox回归分析得到风险评分模型：风险评分＝(0.531×RP1-228H13.5的表达水平)+(0.403×RP11-133K1.6的表达水平)+(0.290×MKLN1-AS的表达水平)+(-0.330×AC127904.2的表达水平)+(-0.175×LRRC3-AS1的表达水平)。
使用RS模型预测肝癌患者预后的结果显示，5个lncRNA联合后可作为判断肝癌预后的独立预后因子，5个lncRNA联合后形成的曲线下面积(AUC)是最高的，如表2所示。同时5个lncRNA联合也具有较高的敏感性和特异性，如图1所示。
表2不同lncRNA形成的曲线下面积
对5个lncRNA联合后作为肝癌预后的预后因子进行验证，发现其能有效的预测肝癌患者的预后，高风险评分的患者生存期较短，低风险评分的患者生存期较长；同时实验结果显示，5个lncRNA作为预后因子可以独立性预测肝癌患者的预后，而不受年龄、性别、肿瘤分级和肿瘤分期等因素的影响。
实施例3 qPCR测序验证5个lncRNA在肝癌患者预后中的临床意义
1、样本收集
收集30例肝癌患者的手术标本存档蜡块，癌旁组织取自距离肿瘤病灶边缘大于2cm的组织，本发明中的标本纳入的病人的临床信息包括年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤分期、新发肿瘤以及生存期信息，本发明中肝癌标本的取得获得病人的知情同意，且均通过了组织伦理委员会的批准。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，按说明书的具体步骤进行操作。
3、逆转录：
采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
4、聚合酶链反应
根据5个lncRNA和和GAPDH基因的序列分别设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。
配制PCR反应体系：
2×qPCR混合液 12.5μl，基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl，ddH2O 8.0μl。
PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环，60℃5min延伸反应。75℃至95℃，每20s升温1℃，绘制溶解曲线。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学分析
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果显示，与肝癌癌旁组织相比，MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5在肝癌患者中表达上调，LRRC3-AS1、AC127904.2在肝癌患者中表达下调。
将五个lncRNA的表达水平带入RS模型中，将30例肝癌患者分成高风险组(n＝18)和低风险组(n＝12)；发现肝癌患者高风险组的平均生存期(10.8个月)显著低于低风险组(30个月)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.lncRNA在制备预测肝癌预后的产品中的应用，其特征在于，所述lncRNA选自MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1和AC127904.2中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括检测样本中MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2的表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：
特异性识别MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2的探针；或
特异性扩增MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2的引物。
5.一种预测肝癌预后的产品，其特征在于，所述产品通过检测标本中MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2表达水平来预测肝癌的预后结果。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2的表达水平。
7.根据权利要求5或6所述的产品，其特征在于，每例标本在分别进行检测后，使用公式：进行风险评分，其中，N为用于预测预后的lncRNA数，Expi为每个lncRNA的表达水平，Ci为每个lncRNA的回归系数；lncRNA MKLN1-AS、RP11-133K1.6、RP1-228H13.5、LRRC3-AS1或AC127904.2对应的回归系数分别为0.290、0.403、0.531、-0.175、-0.330，Ci小于0代表基因低表达，Ci大于0代表基因高表达。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，评价个体肝癌预后的信息时，把患者的lncRNA的表达水平代入公式中，得出风险评分，然后与确定的cut-off值比较，小于该值的患者属于低危组，大于该值的患者属于高危组。
9.一种建立肝癌患者预后预测模型的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将患者分为训练组和验证组，从训练组受试者采集的标本中测定差异表达基因；
(2)根据所述差异表达基因，确定具有统计显著性的设定值范围；
(3)多变量Cox回归分析每个差异表达基因对生存期的贡献，建立风险评分模型；
(4)使用验证组对风险评分模型进行验证，检验所建模型的预测准确度。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述风险评分模型为：风险评分＝(0.531×RP1-228H13.5的表达水平)+(0.403×RP11-133K1.6的表达水平)+(0.290×MKLN1-AS的表达水平)+(-0.330×AC127904.2的表达水平)+(-0.175×LRRC3-AS1的表达水平)，当风险评分大于0时，患者预后不良；当风险评分小于0时，患者预后良好。
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