CN111304326A - 检测及靶向lncRNA生物标志物的试剂及其在肝细胞癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测及靶向lncRNA生物标志物的试剂及其在肝细胞癌中的应用，本发明首次发现了CTD‑2561J22.5在肝癌患者中表达上调，通过对有关数据进行ROC曲线分析，发现CTD‑2561J22.5具有较高的诊断效能。本发明同时通过细胞实验证明了下调CTD‑2561J22.5的表达水平可以降低肝癌细胞的增殖活性，说明CTD‑2561J22.5可作为分子靶标应用于肝细胞癌的治疗。

Description

检测及靶向lncRNA生物标志物的试剂及其在肝细胞癌中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及检测及靶向lncRNA生物标志物的试剂及其在肝细胞癌中的应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma)的发病率在世界范围内总体呈明显上升的趋势，作为全球最常见的恶性癌症之一，肝细胞癌具有高致死率的特征(Forner A,ReigM,Bruix J[J].Hepatocellular carcinoma.Lancet.2018,391(10127):1301-14.)。目前，肝细胞癌的潜在治愈性治疗包括肝切除和移植，但五年的术后生存率仍然很低。在所有恶性癌症中肝细胞癌发病率目前排在的第五位。作为全球最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率中极高，排名前三名分别是胃癌、肺癌、肝癌。最近几年，肝细胞癌的发病率在非洲和亚洲这样的发展中国家依然居高不下，其中我国目前肝细胞癌患者总人数比重已经超过全球肝细胞癌患者总数的50％(Liu Y，He H，Wu G，et al.CIP2A is highly expressed inhepatocellular carcinoma and predicts poor prognosis.[J].Diagnostic MolecularPathology,2012,21(3):143-149.)。我国肝细胞癌患者中最主要的病因各类病毒性肝炎，其中主要部分是慢性病毒性乙型肝炎和病毒性丙型肝炎；由于长期的饮酒导致的酒精性肝硬化，以及饮用水被污染同样也是诱发肝细胞癌发生的重要原因。许多原发性肝癌的患者早期并无任何特殊症状，直至进展期出临床症状才得以发现(Feng J T，Shang S，BerettaL.Proteomics for the early detection and treatment of hepatocellularcarcinoma[J].Oncogene,2006,25(27):3810-3817.)。近年来，伴随着有效的外科手术技术的发展以及诊断水平的提高，原发性肝癌患者的预后较过去已有所改善，然而，由于肝细胞癌患者外科切除术后复发率高达50-70％，患者的长期预后仍然不太理想。由于人们对肝细胞型肝癌发病的分子机制了解太少，因此对于肝细胞癌患者来讲迫切需要确定可靠的有价值的诊断及与预后相关的生物指标，以此改善患者的临床结局以及发展有效的个体化治疗策略。
长链非编码RNA (long non-coding RNAs,1ncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸、不编码蛋白的内源性RNA。它们通常位于相邻基因间或编码蛋白的序列重叠区，并由RNA聚合酶II转录(Quinn JJ,Chang HY.Unique features of long non-coding RNAbiogenesis and function[J].Nat Rev Genet,2016,17(1):47-62)。LncRNAs可以折叠形成独特的二级结构，包括DNA结合结构域、RNA结合结构域以及蛋白质结合结构域，从而广泛调节DNA,RNA和蛋白质的功能。大量研究表明，1ncRNAs可以在转录水平或转录后水平以多种机制调控蛋白编码基因的表达，如参与染色质重塑、作为ceRNAs抑制miRNA的功能或影响mRNA的稳定性等(Huynh NP,Anderson BA,Guilak F,McAlinden A.Emerging roles forlong noncoding RNAs in skeletal biology and disease[J].Connect Tissue Res,2017,58(1):116-141.)。近年来，越来越多的证据表明，1ncRNAs参与调控细胞的增殖、凋亡、分化以及肿瘤的发生发展等正常生理以及病理过程(Shin VY,Chen J,Cheuk IW,SiuMT,Ho CW,Wang X,Jin H,Kwong A.Long non-coding RNA NEAT1 confers oncogenicrole in triple-negativebreast cancer through modulating chemoresistance andcancer sternness[J].Cell Death Dis,2019,10(4):270.)。
随着lncRNA研究的进展，寻找更多对肝细胞癌具有重要调控作用的长链非编码RNA对认识肿瘤的发生发展，并以此提供相应的防治措施有不可忽略的作用，成为目前研究的热点。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与肝细胞癌发生发展相关的生物标志物及其在诊断和治疗肝细胞癌中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了用于测定肝细胞癌病相关基因的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用，相关基因包括生物标志物CTD-2561J22.5。
进一步，相比于生物标志物CTD-2561J22.5正常对照表达水平，肝细胞癌患者中生物标志物CTD-2561J22.5的表达水平升高。
进一步，在转录水平上测定生物标志物CTD-2561J22.5的表达水平。
进一步，通过检测探针与所述生物标志物CTD-2561J22.5杂交或通过扩增所述生物标志物CTD-2561J22.5来测定生物标志物CTD-2561J22.5的表达水平。
进一步，杂交步骤在核酸微阵列芯片或微流体测定板中进行。
进一步，扩增反应。包括聚合酶链式反应(PCR)。
进一步，聚合酶链式反应包括实时定量聚合酶链式反应。
进一步，实时定量聚合酶链式反应的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
进一步，在选自血液、血清、血浆和组织的生物样本中检测所述表达水平。
在本发明的具体实施方式中，所述样本为组织。
本发明提供了一种诊断肝细胞癌的产品，所述产品包括检测生物标志物CTD-2561J22.5的试剂。
本发明提供了CTD-2561J22.5在构建预测肝细胞癌的计算模型中的应用。
本发明提供了CTD-2561J22.5作为分子靶标在制备治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物包括生物标志物CTD-2561J22.5的抑制剂。
进一步，所述抑制剂降低CTD-2561J22.5的表达。
进一步，所述抑制剂为siRNA。
进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。
本发明提供了一种治疗肝细胞癌的药物组合物，所述药物组合物包括生物标志物CTD-2561J22.5的抑制剂。
进一步，所述抑制剂为降低CTD-2561J22.5表达水平的物质，优选的，所述抑制剂为siRNA。
进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
本发明提供了CTD-2561J22.5在筛选治疗肝细胞癌的候选药物中的应用，包括以下步骤：
1)使测试物质与表达CTD-2561J22.5基因的细胞接触；并
2)选择与在该测试物质不存在时检测到的表达水平相比降低CTD-2561J22.5基因的表达水平的测试物质。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了CTD-2561J22.5基因表达与肝细胞癌病相关，通过检测受试者样品尤其是组织中的CTD-2561J22.5的表达水平，可以有效的判断受试者患有肝细胞癌的风险。
本发明基于CTD-2561J22.5在肝细胞癌患者中表达上调，设计针对CTD-2561J22.5的siRNA进行细胞实验，发现改变细胞中CTD-2561J22.5的表达水平可以改变肝细胞癌细胞的增殖活性，提示CTD-2561J22.5作为分子靶标应用于肝细胞癌的治疗具有较好的应用前景。
附图说明
图1是CTD-2561J22.5基因在样本中的表达情况图；
图2是CTD-2561J22.5基因在细胞中的表达情况图；
图3是siRNA对细胞中的CTD-2561J22.5的干扰情况图；
图4是CCK-8检测CTD-2561J22.5基因对细胞增殖的影响图。
具体的实施方式
术语或“标志物”或“生物标志物”一般指其在组织或细胞中/上表达或分泌的可以通过已知的方法(或本文所披露的方法)来检测且是预测性的或以用于预测(或帮助预测)患者患病风险的分子，包括基因、mRNA、蛋白质、碳水化合物结构或糖脂。本文中特别感兴趣的生物标志物是CTD-2561J22.5。
在本发明中，CTD-2561J22.5包括野生型、突变型或其片段。对于本发明的目的，“CTD-2561J22.5”指CTD-2561J22.5的DNA或RNA，包括其中任意一种样品中CTD-2561J22.5检测的片段或部分。一种代表性的CTD-2561J22.5基因具有ENST00000599993.1所示的序列。
与肝细胞癌患者临床受益有关的生物标志物的“量”或“水平”是生物学样品中可检测的水平。这些可以通过本领域中技术人员已知的方法来测量。
术语“表达的水平”或“表达水平”通常可互换使用，且一般指生物学样品中多核苷酸、mRNA或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因所编码的信息转换成细胞中存在的和运行的结构的过程。因此，依照本发明，基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录得到的多核苷酸的、翻译得到的蛋白质的、或翻译后修饰得到的蛋白质的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自蛋白质的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)、然后翻译成蛋白质的基因，还有转录成RNA但不翻译成蛋白质的基因(例如miRNA，lncRNA)。
生物标志物的“升高”或“较高”的量或水平指所述量等于或大于健康对照群体中生物标志物表达水平，生物标志物相对于对照表达水平过表达至少1.5倍，例如至少1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多倍。
生物标志物的“降低”或“较低”的量或水平指所述量小于健康对照群体中生物标志物的中值量，生物标志物相对于对照表达水平低表达至少1.5倍，例如至少1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍或3.5倍或更多倍。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可交换使用，指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及它们的聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，与参照核酸具有相似的结合特性，以及与参照核酸以相似的方式代谢。这类类似物的实例包括但不限于，硫代磷酸、磷酰胺、甲基磷酸、手性甲基磷酸、2-O-甲基核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另外指出，具体的核酸序列还包括其保守型修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指明的序列。具体来说，简并密码子取代可以通过产生下述序列来实现，该序列中一个或多个选择(或全部)的密码子的第三位用混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可交换使用。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术，本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。
如本文所用的药物组合物，它含有有效量的所述的CTD-2561J22.5的抑制剂，以及药学上可接受的载体，所述的药物组合物可用于治疗肝细胞癌。
作为本发明的一种优选方式，所述的CTD-2561J22.5的抑制剂是针对CTD-2561J22.5的小干扰RNA。本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
本发明所述药物可以是适合注射给药的剂型、适合口服摄取的剂型(如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适合局部给药的油膏、乳膏或洗剂形式、适合用作滴眼剂的递送剂型、适合通过吸入给药的气雾剂形式(如通过鼻内吸入或口吸入)、适合胃肠外给药的剂型，即皮下、肌肉内或静脉内注射。
本发明的药物组合物还可以与其他治疗肝细胞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的药物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1QPCR测序验证CTD-2561J22.5基因的表达情况
1、样品收集
选取诊断为肝癌的患者的肝癌组织和相应的正常癌旁组织各42例，所有入组患者外科手术前均未曾接受过化疗或者放疗。
2、Trizol法提取样本中的RNA
使用Trizol试剂从组织样本中提取总RNA。用剪刀将组织剪碎，加入1ml预冷的TRizol，混匀直至透明状溶液。将裂解液转移至1.5m1离心管中，室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。加入氯仿，振荡，离心。吸取无色上清液移至另一离心管，向上清液中加入异丙醇，静置，离心，移去上清液，加入乙醇，离心，移去上清液，室温干燥RNA沉淀，加入适量的无酶水溶解沉淀
3、qRT-PCR检测
应用GeneCopoeia逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，反应条件：42℃15min，95℃2min。以cDNA为模版，进行qRT-PCR，以GAPDH为内参照进行扩增，反应条件：95℃3min，(95℃15s，60℃15s，72℃40s)×40。引物由公司合成，相关引物序列如下：
CTD-2561J22.5(F：5’-TCAGGTAGGTGTTCAGAGTAA-3’，SEQ ID NO.1；R：5’-CCAGAGATCGTGCCAATG-3’，SEQ ID NO.2)；GAPDH(F：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，SEQ IDNO.3；R：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’，SEQ ID NO.4)，通过qRT-PCR仪特定软件程序记录并分析检测数据结果，根据公式倍数＝2-ΔΔCt计算各检测目的基因的相对表达量。
4、统计学分析
实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义，所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图。对变量CTD-2561J22.5使用SPSS软件进行ROC分析，判断基因的诊断效能、灵敏度和特异性。
5、结果
与正常对照相比，CTD-2561J22.5基因在肝细胞癌病患者组织中的表达显著上调，上调约4.4倍，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1)。
ROC分析表明CTD-2561J22.5可以作为生物标志物应用于肝细胞癌的诊断，其曲线下面积为0.929，具体数值如表1所示，说明CTD-2561J22.5表达对肝癌的诊断具有高度敏感性和特异性。
表1曲线下的面积
检验结果变量:CTD-2561J22.5
Figure BDA0002389491700000081
a.在非参数假设下
b.零假设：实面积＝0.5
实施例2CTD-2561J22.5基因的沉默及对细胞的影响
1、细胞培养
肝癌细胞株HepG2、和正常细胞系LO2购自ATCC。细胞系均以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2的培养箱中培养。每天观察细胞生长情况，隔天换液。
2、转染
由上海吉码制药技术有限公司设计并合成针对CTD-2561J22.5的siRNA，具体序列为5’-AACAUGUUUUCUUCUCAUGAU-3’，SEQ ID NO.5；反义链为5’-CAUGAGAAGAAAACAUGUUUA-3’，SEQ ID NO.6，对照为通用的siRNA-NC。
按照Lipofectamine 3000试剂说明书步骤，分别混匀脂质体和OPTI-MEM减血清培养基以及siRNA和OPTI-MEM培养基，室温放置5min，然后将脂质体、siRNA和OPTI-MEM培养基混合，室温放置20min。将混合溶液加入无血清细胞培养基中，轻轻晃动混匀，孵育8h后换成含有10％胎牛血清的完全培养基继续培养。
3、qRT-PCR检测细胞中CTD-2561J22.5的表达水平
使用Trizol法提取细胞总RNA，然后按照实施例1中的方法进行逆转录以及实时定量PCR检测。
4、CCK-8法检测细胞的增殖活性
取对数生长期的细胞，进行重悬计数，以5000个细胞/孔接种于96孔板，每组设置5个复孔；在72h加入CCK8试剂，37℃避光孵育1h，用酶标仪在450nm波长下检测吸光值(OD)，收集数据进行相关统计分析。
5、统计学分析
所有数据采用均数±标准差表示。两组间比较采用双侧Student's t检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPad Software软件进行绘图。P<0.05定义为差异有统计学意义。
6、结果
相比正常肝细胞LO2，CTD-2561J22.5在肝癌细胞系HepG2中的表达水平显著增加(图2)。
相比siRNA-NC组和空白对照组，转染siRNA-CTD-2561J22.5实验组中的CTD-2561J22.5基因表达水平显著下调，差异有统计学意义，而siRNA-NC组和空白对照组之间没有显著的差异(图3)。
转染siRNA-CTD-2561J22.5实验组的细胞增殖活性相比于对照组显著降低，说明CTD-2561J22.5在肝癌细胞细胞增殖中起着重要的作用(图4)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 四川省人民医院
<120> 检测及靶向lncRNA生物标志物的试剂及其在肝细胞癌中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaggtaggt gttcagagta a 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagagatcg tgccaatg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctctggtaaa gtggatattg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggaatca tattggaaca 20
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacauguuuu cuucucauga u 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caugagaaga aaacauguuu a 21

Claims (10)

1.用于测定肝细胞癌相关基因的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用，其特征在于，相关基因包括生物标志物CTD-2561J22.5。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，相比于生物标志物CTD-2561J22.5在正常对照中的表达水平，肝细胞癌患者中生物标志物CTD-2561J22.5的表达水平升高。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过检测探针与所述生物标志物CTD-2561J22.5杂交或通过扩增所述生物标志物CTD-2561J22.5来测定生物标志物CTD-2561J22.5的表达水平。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，扩增反应包括实时定量聚合酶链式反应，优选的，实时定量聚合酶链式反应的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
5.一种诊断肝细胞癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测生物标志物CTD-2561J22.5的试剂。
6.CTD-2561J22.5在构建预测肝细胞癌的计算模型中的应用。
7.CTD-2561J22.5作为分子靶标在制备治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括生物标志物CTD-2561J22.5的抑制剂，优选的，所述抑制剂降低CTD-2561J22.5的表达，优选的，所述抑制剂为siRNA，更为优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。
9.一种治疗肝细胞癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括生物标志物CTD-2561J22.5的抑制剂，优选的，所述抑制剂为siRNA，优选的，所述siRNA的序列如SEQ IDNO.5～6所示，优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
10.CTD-2561J22.5在筛选治疗肝细胞癌的候选药物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)使测试物质与表达CTD-2561J22.5基因的细胞接触；并
2)选择与在该测试物质不存在时检测到的表达水平相比降低CTD-2561J22.5基因的表达水平的测试物质。
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