WO2022057193A1 - 一种长链非编码rna及其抑制剂的应用 - Google Patents

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WO2022057193A1
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breast cancer
cisplatin
linc01778
triple
negative breast
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姚燕丹
李舜颖
黄松音
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中山大学孙逸仙纪念医院
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the existence of such markers is also helpful for the follow-up research on cisplatin resistance reversal, to find the target of drug resistance in triple-negative breast cancer, and to solve the problem.
  • platinum drug resistance combining with cisplatin can help to solve the problems of low therapeutic effect, lack of effective treatment and short survival period for patients due to drug resistance.
  • the drug resistance mechanism of other types of breast cancer may be similar to that of triple-negative breast cancer, so the acquisition of drug resistance targets can also help to provide relevant treatment methods and guidelines for other types of breast cancer.
  • lncRNAs have been found to be involved in a variety of biological processes, play important roles in multiple pathological and physiological processes, and are closely related to the occurrence, development and metastasis of tumors.
  • the research began to pay attention to the relationship between LncRNA and tumor resistance.
  • Lin et al. reported that the long noncoding RNA HOXD-AS1 promotes chemotherapy resistance in prostate cancer.
  • Jiang et al. reported that long non-coding RNA Lnc-TALC promotes TMZ resistance in gliomas by binding to miR-20b-3p.
  • the present application intends to obtain markers and therapeutic targets of breast cancer from the level of long non-coding RNA, especially for triple-negative breast cancer and triple-negative breast cancer that is resistant to cisplatin.
  • LINC01778 V2 After down-regulating the expression of LINC01778 V2, the proliferation of the corresponding triple-negative breast cancer cells was inhibited, and the apoptosis of the triple-negative breast cancer cells was promoted, so the therapeutic effect on breast cancer can be achieved by down-regulating the expression of LINC01778 V2. Based on LINC01778 V2, it can be used to prepare products or drugs for the treatment of breast cancer.
  • long non-coding RNA LINC01778 V2 is differentially expressed in cisplatin-resistant breast cancer and cisplatin-sensitive breast cancer
  • detecting the expression of long non-coding RNA LINC01778 V2 is helpful for breast cancer and cisplatin-resistant breast cancer.
  • drug diagnosis More specifically, because long non-coding RNALINC01778 V2 is differentially expressed in triple-negative breast cancer and cisplatin-resistant triple-negative breast cancer, it is expressed at a higher level in cisplatin-resistant triple-negative breast cancer, so by detecting LINC01778 V2 can better realize the diagnosis of triple-negative breast cancer and the diagnosis of cisplatin resistance in triple-negative breast cancer.
  • long-chain non-coding LINC01778 V2 detection described in this application when combined with the BRCA1/2 mutation detection, it can more effectively obtain the conditions that may occur in patients treated with cisplatin drugs, thereby achieving more accurate follow-up. Medication and treatment.
  • the LINC01778 V2 applied to the detection of cisplatin resistance in triple-negative breast cancer has the advantages of strong specificity and high sensitivity, and the detection results have high accuracy, which can be used for the diagnosis of cisplatin resistance in triple-negative breast cancer, and cisplatin-based drug resistance. Prediction, prognosis or monitoring of efficacy of drug therapy for triple-negative breast cancer provides reliable information.
  • long non-coding RNA genes can also be used as targets for the treatment of breast cancer, for example, can be used as targets to treat triple-negative breast cancer in one embodiment of the present invention.
  • long non-coding RNA is closely related to the occurrence of cisplatin resistance in triple-negative breast cancer
  • the long non-coding RNA can also be used as a therapeutic target to improve cisplatin-resistant triple-negative breast cancer by adjusting the expression of LINC01778 V2
  • the degree of drug resistance can be increased or the reversal of drug resistance can be achieved, which facilitates the combined treatment of reagents that regulate the expression of LINC01778 V2 and cisplatin drugs to improve the therapeutic effect.
  • the development of anticancer drugs using markers as therapeutic targets for cisplatin-resistant triple-negative breast cancer has the advantages of strong specificity, good targeting effect and good therapeutic effect.
  • LINC01778 V2 can also be detected by probes, and diagnostic results can also be obtained based on the detection results to achieve diagnostic purposes.
  • the specific primers include the following primers: LINC01778-Forward, whose nucleotide sequence is 5'-GTCAGAAGCCTGGAAAGCCC-3'; LINC01778-Reverse, whose nucleotide sequence is 5'-CACGACATGGGTGGGGTAAAT-3' .
  • the above primers can be used to clone the LINC01778 V2 sequence shown in SEQ ID NO. 1, so that it is convenient to combine RT-PCR and quantitative PCR to realize the detection of LINC01778 V2, and further realize the diagnosis of whether triple-negative breast cancer patients are resistant to cisplatin drugs Purpose.
  • the breast cancer is cisplatin-resistant triple-negative breast cancer
  • the drugs for preventing or treating breast cancer include drugs for reversing cisplatin-resistant triple-negative breast cancer. That is, the inhibitor that downregulates the expression of LINC01778 V2 can be directly applied to the treatment of breast cancer including triple-negative breast cancer and cisplatin-resistant triple-negative breast cancer to kill tumor cells. After inhibiting the expression of LINC01778 V2 with cisplatin, the drug resistance of cisplatin-resistant triple-negative breast cancer cell lines was reversed and re-sensitized to cisplatin.
  • the cisplatin-resistant triple-negative breast cancer cell line expressed by LINC01778 V2 and the cisplatin-resistant triple-negative breast cancer cell line expressed by LINC01778 V2 were inhibited.
  • the inhibitor acts on cisplatin-resistant triple-negative breast cancer cells, the reversal of cisplatin resistance is achieved.
  • Combining cisplatin and cisplatin-resistant triple-negative breast cancer cells can significantly improve the resistance Therapeutic effect of drug triple-negative breast cancer cells. Therefore, the inhibitor that inhibits the expression of LINC01778 V2 can be used in the preparation of drugs or products for preventing or treating cisplatin-resistant triple-negative breast cancer.
  • siRNA when used for gene inhibition, the interference effect is good, which can effectively inhibit the expression of LINC01778 V2 gene, and inhibit the proliferation, invasion and metastasis of tumor cells.
  • siRNA can not only avoid affecting the expression of other genes, but also avoid negative effects on the therapeutic effects of other drugs when combined with other drugs; A therapeutically beneficial effect is achieved in combination with other drugs or carriers.
  • SEQ ID NO.4 and SEQ ID NO.5 form another corresponding pair of siRNAs that can also silence the expression of LINC01778 V2, and this pair of siRNAs is designated as si2.
  • SEQ ID NO.2 to SEQ ID NO.5 are all sequences represented by the 5' ⁇ 3' sequence. So in fact, the sense strand corresponding to si1 is 5′-CAUGGUUCAAUCUUCUGGATT-3′, and the antisense strand is 3′-UCCAGAAGAUUGAACCAUGTT-5′; the sense strand corresponding to si2 is 5′-GUGUUUGAAUUGGCUAAAUTT-3′, and the antisense strand is 3′- AUUUAGCCAAUUCAAACACTT-5'.
  • Figure 8 shows the results of the LINC01778 V2 inhibitor and its combination with cisplatin in the killing assay of breast cancer cells.
  • RNA LINC01778 V2 was expressed in cisplatin-resistant cell lines based on the expression profile.
  • the expression level was low in sensitive triple-negative breast cancer cell lines, so the long non-coding RNA LINC01778 V2 was initially screened.
  • the expression profile is shown in Figure 1, and the expression of LINC01778 is significantly different between the two cell lines. For this reason, the present application conducts further analysis based on LINC01778.
  • the cisplatin drug used in this example and subsequent examples is sigma cisplatin.
  • primer sequences are as follows: LINC01778-Forward: 5'-GTCAGAAGCCTGGAAAGCCC-3'; LINC01778-Reverse: 5'-CACGACATGGGTGGGGGTAAAT-3';
  • the sequence of LINC01778 V2 was identified by first-generation sequencing technology and compared with the gene sequence of UCSC to obtain the full-length sequence of LINC01778 V2 after verification.
  • Figure 5 shows the significant difference in the expression of LINC01778 V2 in cisplatin-resistant/cisplatin-sensitive triple-negative breast cancer cell lines
  • the expression level of LINC01778 V2 in MDA-MB-231 CisR is that of LINC01778 in MDA-MB-231 parental
  • the expression level of V2 is more than 4 times higher, which is enough to show the difference in triple-negative breast cancer with different responses to cisplatin.
  • LINC01778 V2 can be used as a marker to judge triple-negative breast cancer.
  • the cisplatin resistance of cancer, and based on the significant difference, the diagnosis based on the detection of LINC01778 V2 expression also has sufficient diagnostic accuracy.
  • reaction was carried out in the Roche PCR system LightCycler480 system and the data was analyzed.
  • the present inventors After obtaining the full-length sequence corresponding to LINC01778 V2, in addition to the above-mentioned detection of various cell lines, the present inventors also performed LINC01778 V2 on the breast cancer tissue of patients who were sensitive to cisplatin chemotherapy and the breast cancer tissue of patients who were not sensitive to cisplatin chemotherapy. Detection of gene expression.
  • 231 CisR is used to represent the MDA-MB-231 CisR drug-resistant cell line
  • 231 is used to indicate the MDA-MB-231 non-resistant cell line.
  • drug cell line the results are shown in Figure 8A
  • NC is the control group without adding siRNA
  • si1 is the experimental group adding siRNA including SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3, the results show that siRNA can effectively reduce the Expression of LINC01778 V2.
  • the inventors also combined siRNA and cisplatin to study the effect of siRNA on the activity of triple-negative breast cancer cells and the resistance of triple-negative breast cancer cells to cisplatin after down-regulating the expression of LINC01778 V2.
  • the results are shown in Figure 8B, where w /o means without cisplatin, with cisplatin means cisplatin. It can be seen from the figure that without cisplatin, the cell activity was significantly inhibited after down-regulating the expression of LINC01778 V2 by siRNA.
  • the inventors also conducted apoptosis studies with and without cisplatin in the 231 original cell line, 231 CisR cell line, and 231 CisR cell line + si1 experimental group by Annexin-V/PI staining flow analysis, where w/o Cis stands for no cisplatin, with Cis stands for cisplatin, and the results are shown in Figure 8D.

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Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA ，即RNA LINC01778 V2的全长序列。本发明还公开了检测RNA LINC01778 V2的试剂在诊断乳腺癌，具体是乳腺癌顺铂耐药性中的应用。本发明还公开了RNA LINC01778 V2的抑制剂在制备药物中的应用，所述药物用于预防、治疗乳腺癌，尤其是预防、治疗发生顺铂耐药的三阴性乳腺癌。

Description

一种长链非编码RNA及其抑制剂的应用 技术领域
本发明涉及肿瘤分子生物学领域，更具体地，涉及一种长链非编码RNA及其抑制剂的应用。
背景技术
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，根据2018年GLOBOCAN及2019年中国肿瘤登记中心的数据，乳腺癌在全球和我国均为发病率最高的女性恶性肿瘤，严重影响女性的生命健康。在临床实践中，根据乳腺癌细胞的雌/孕激素受体(ER/PR)是否阳性、人类表皮生长因子受体2(HER2)是否过表达、Ki67百分比，可以把乳腺癌分成四个不同的分子亚型：Luminal A型，Luminal B型，HER2过表达型，三阴型(TNBC)。不同类型的乳腺癌预后不同，采取的治疗方式也不一样。目前乳腺癌现有治疗手段主要包括外科手术、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗。近年来，随着肿瘤分子生物学研究的日趋深入，肿瘤的基因治疗以其治疗的高特异性和相对较低的毒副作用为乳腺癌的治疗开辟了一个新天地。因此，寻找可用于诊断的生物标志物，并由此引出新的治疗靶点，是当今肿瘤学研究的重要内容。
尤其是对于三阴性乳腺癌而言，寻找相关诊断或治疗靶点更为重要；三阴型乳腺癌因为肿瘤细胞不表达激素受体与HER2受体，缺乏有效的内分泌治疗和靶向治疗靶点，是乳腺癌中预后最差的类型。目前，TNBC的系统治疗仍以化疗为主，但大多数患者很快发生耐药，一旦肿瘤发生转移，生存期通常只有12到15个月。在三阴性乳腺癌的化疗中，铂类药物是一种较为常用也较为有效的化疗药物，但如果化疗前或化疗中患者即产生耐药性，不仅会浪费患者的治疗时间，且随着化疗治疗效果的显著降低，还会直接影响到患者的生存期限，不利于患者生存。所以，亟需一种标志物或标志物的应用以获取三阴性乳腺癌的顺铂耐药性结果，从而方便在治疗前、治疗过程中给予有效的治疗方案，以便提高治疗效果、延长患者生存期。同时，往往该类标志物与耐药性的产生相关，所以，该类标志物的存在也有助于后续进行顺铂耐药逆转的研究，寻找到三阴性乳腺癌耐药治疗的靶点，解决对铂类药物耐药的状况，结合顺铂药物有助于解决当前因耐药而导致的治疗效果低下、患者得不到有效治疗、生存期短 的问题。同时，其他类型乳腺癌的耐药机制可能与三阴性乳腺癌相似，所以，耐药靶点的获取也有助于对其他类型乳腺癌提供相关的治疗手段、指引。
长非编码RNA是近年来发现与肿瘤的发生、发展和转移密切相关的分子。人类基因组当中只有大约3％的转录本是编码蛋白的，其他97％的转录本并不翻译成蛋白。但是，这些不编码蛋白的基因组在各种状态下依然会被转录，被称为非编码。其中，长非编码RNA(long non coding RNA，lncRNA)是一组不翻译蛋白，长度大于200nt的RNA。过去，lncRNA被认为是基因组转录过程中的“噪音”，不发挥生物学功能。然而，近来已经发现lncRNA参与多种生物学过程，在多个病理、生理过程中均发挥着重要的作用，其与肿瘤的发生、发展和转移过程也密切相关。随着对LncRNA的研究逐渐深入，研究开始关注LncRNA与肿瘤治疗耐药之间的关系。2017年，Lin等人报道长非编码RNA HOXD-AS1促进了前列腺癌的化疗耐药。2019年，Jiang等人报道长非编码RNA Lnc-TALC通过与miR-20b-3p的结合，促进脑胶质瘤的TMZ耐药。本申请在此基础上，意在从长非编码RNA层面获取乳腺癌的标志物以及治疗靶点，尤其是针对于三阴性乳腺癌以及对顺铂耐药的三阴性乳腺癌。
发明内容
本发明首次发现核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的长链非编码RNA(以下记作LINC01778 V2)在顺铂耐药乳腺癌组织中相比顺铂敏感乳腺癌组织明显上调，其至少通过调控热休克蛋白27(Hsp27)的表达发挥促进肿瘤细胞增殖、抵抗凋亡以及产生铂类药物耐药性的生物学功能。本发明人通过顺铂药物进行诱导，建立起对顺铂药物耐药的顺铂耐药三阴性乳腺癌稳定细胞株后，提取顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞株和顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株的总RNA进行lncRNA芯片检测并通过生物信息学的分析得到差异表达的新的长链非编码RNA，验证发现LINC01778 V2在顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞株表达水平高，而在顺铂药物敏感三阴性乳腺癌细胞株中表达水平较低；表明LINC01778 V2能作为判断三阴性乳腺癌顺铂耐药或顺铂敏感的分子标志物，也为顺铂耐药三阴性乳腺癌的治疗提供了新的靶点；也表明了LINC01778 V2还可以应用于三阴性乳腺癌顺铂治疗的疗效预测、预后评估。随后，通过RACE实验技术获取长链非编码RNA LINC01778 V2的全长序列。且由LINC01778 V2在三阴性乳腺癌中表现的特点，提示LINC01778 V2或许也能作为其他类型乳腺癌的诊断或治疗靶点，用于制备诊断乳腺癌的产品或药物。且本发明人下调LINC01778 V2表达后发现，对应的三阴性乳腺癌细胞增殖受到抑制，三阴性乳腺癌细胞的凋亡被促进，所以通过下调 LINC01778 V2表达还能实现对乳腺癌的治疗作用，所以基于LINC01778 V2能用于制备治疗乳腺癌的产品或药物。同时，本发明人还发现下调LINC01778 V2表达后能实现顺铂耐药乳腺癌细胞株的耐药性逆转，使耐药乳腺癌细胞株恢复对顺铂类药物的敏感性，结合下调LINC01778 V2表达和顺铂药物能实现更为显著的治疗效果。
本发明首次运用5′RACE和3′RACE技术鉴定长链非编码RNA LINC01778 V2的序列为1542bp，长非编码RNA在不同的细胞、组织中可有变异，本申请中所指的LINC01778 V2序列为本发明人在人乳腺癌细胞中通过RACE实验证实的长非编码RNA LINC01778全长序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即：
Figure PCTCN2021074466-appb-000001
本发明提供了一种长链非编码RNA LINC01778 V2在制备诊断、治疗乳腺癌产品中的应用，所述LINC01778 V2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次克隆了LINC01778的全长cDNA序列，cDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。现有技术中还未公开如本申请所获得的LINC01778 V2，也未公开本申请所获得的长度的LINC01778 V2。因为长链非编码RNA LINC01778 V2在顺铂耐药乳腺癌、顺铂敏感乳腺癌中差异表达，提示通过检测长链非编码 RNA LINC01778 V2的表达有助于应用于乳腺癌以及乳腺癌顺铂耐药的诊断。更具体的，因长链非编码RNALINC01778 V2在三阴性乳腺癌和顺铂耐药三阴性乳腺癌中差异表达，其在顺铂耐药三阴性乳腺癌中为更高水平的表达，所以通过检测LINC01778 V2更能实现三阴性乳腺癌诊断以及三阴性乳腺癌的顺铂耐药性诊断。同时，本发明人发现通过抑制LINC01778 V2的表达，能抑制乳腺癌肿瘤细胞的增殖、促进乳腺癌肿瘤细胞的凋亡。所以LINC01778 V2能实现在制备诊断、治疗乳腺癌产品中的应用。
基于本申请中的LINC01778 V2序列设计的检测引物，有助于减少检测过程中的干扰，提高检测准确率。同时，基于LINC01778 V2的cDNA序列，能为进一步研究LINC01778在三阴性乳腺癌顺铂耐药性的发生、发展过程中的功能奠定基础。当LINC01778 V2作为标志物时，基于本申请所公开的序列设计的引物能够提高检测LINC01778 V2基因表达的准确率，从而提高LINC01778 V2作为基因标志物提供检测信息的可靠性。当LINC01778 V2作为治疗靶点时，基于本申请所公开的LINC01778 V2序列也有助于准确的设计抑制剂，如siRNA，从而实现精准的抑制，提高治疗效果。基于LINC01778 V2的cDNA序列设计的靶位点序列具有更高的靶向准确性，为乳腺癌，更具体的为三阴性乳腺癌、顺铂类药物耐药三阴性乳腺癌治疗药物的研发和治疗提供了更多以及更为有效的功能靶点，有助于显著提高治疗药物的靶向治疗效果。
本发明提供了一种长链非编码RNA在制备诊断、治疗乳腺癌产品中的应用。所述长链非编码RNA是能够用于乳腺癌的诊断，如在本发明的一个实施例中，作为三阴性乳腺癌的顺铂耐药检测的标志物，可以精确筛选出顺铂化疗药物有效或者顺铂化疗药物无效的三阴性乳腺癌患者，所述长链非编码RNA即长链非编码RNA LINC01778 V2。当LINC01778 V2应用于三阴性乳腺癌顺铂耐药检测时，能通过检测LINC01778 V2的表达水平以获取当前三阴性乳腺癌患者是否具有对顺铂类药物的耐药特性。通过对LINC01778 V2的检测，有助于及时在治疗前、治疗中进行治疗方案的调整，从而有助于实现针对性的治疗，一方面能节省患者的试药时间，避免浪费患者的生存期时间；另一方面，在获取到三阴性乳腺癌对顺铂类药物耐药时可及时采用其他有效的治疗方案、治疗药物进行治疗，从而把握患者紧张的生存期限，以促进患者的治疗效果，从而延长生存期限。在治疗前检测则便于预测顺铂类药物治疗效果，从而针对性的拟定治疗方案。在治疗过程中，通过对患者的定期检测，则能及时获取患者的耐药情况，从而有针对性的施加其他药物或可逆转顺铂耐药性药物或采取其他治疗方案，从而使患者得到有效的治疗。更进一步地，当本申请所述的长链非编码LINC01778 V2检测结 合BRCA1/2突变检测时，能更为有效的获取顺铂类药物治疗患者所可能发生的状况，从而实现后续更为精准的用药和治疗。所述LINC01778 V2应用于三阴性乳腺癌顺铂耐药的检测具有特异性强、灵敏度高的优势，其检测结果的准确度高，能为三阴性乳腺癌顺铂耐药的诊断、顺铂类药物治疗三阴性乳腺癌的预测、预后或疗效监测提供可靠信息。进一步地，长链非编码RNA基因也能作为靶点用于治疗乳腺癌，如，在本发明的一个实施例中能作为靶点被作用而治疗三阴性乳腺癌。
进一步地，本发明提供了上述三阴性乳腺癌顺铂耐药性诊断标志物在制备三阴性乳腺癌疗效预测、预后评估和/或治疗的产品中的用途。通过治疗前对三阴性乳腺癌患者的LINC01778 V2基因表达量检测，有助于预测三阴性乳腺癌采用顺铂类药物治疗产生的效果；在三阴性乳腺癌各个阶段治疗后或整体治疗后对LINC01778 V2基因表达量检测，则能获取患者对顺铂类药物的耐药性，从而基于该结果进行后续阶段治疗的调整或进行预后评估；LINC01778 V2作为标志物具有其敏感性、特异性的特点，能提高早期疗效预测、诊断和预后评估的效率和准确性。由于长非编码RNA与三阴性乳腺癌的顺铂耐药性发生密切相关，所以该长非编码RNA也可以作为一个治疗靶点，从而通过调整LINC01778 V2表达而改善顺铂耐药三阴性乳腺癌的耐药程度或实现耐药性的逆转，从而便于调节LINC01778 V2表达的试剂与顺铂类药物联合治疗，提高治疗效果。且以标志物作为顺铂耐药三阴性乳腺癌治疗靶点研发抗癌药物，具有特异性强、靶向效果和治疗效果好的优势。
进一步地，本发明提供了一种用于三阴性乳腺癌顺铂耐药性诊断的引物对，所述引物对包括基于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计的引物。基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计的引物对能通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆得到LINC01778 V2的cDNA序列，cDNA序列结果准确，且克隆过程步骤简单、易操作。利用该引物对，能通过实时荧光定量PCR技术实现LINC01778 V2在细胞和组织中的高精度检测，从而为三阴性乳腺癌的顺铂耐药诊断、顺铂药物治疗预后评估、顺铂药物治疗效果预测、监测提供可靠信息。
进一步地，所述引物对包括如下所述引物：LINC01778-Forward，其核苷酸序列为5’-GTCAGAAGCCTGGAAAGCCC-3’；LINC01778-Reverse，其核苷酸序列为5’-CACGACATGGGTGGGGTAAAT-3’。采用LINC01778-Forward和LINC01778-Reverse对LINC01778 V2进行扩增具有特异性强、效率高和扩增结果准确的优势，通过RT-PCR技术能够实现对LINC01778 V2表达的准确定量。
进一步地，本发明提供了长链非编码RNA的检测试剂在制备用于三阴性乳腺癌顺铂耐 药诊断的试剂中的应用。所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步地，所述检测试剂为检测长链非编码RNALINC01778 V2表达量的检测试剂。通过检测长链非编码的检测试剂能够检测三阴性乳腺癌患者的LINC01778 V2表达等情况，由于LINC01778 V2在顺铂耐药三阴性乳腺癌和顺铂敏感三阴性乳腺癌中的表达状况不同，所以基于该试剂有助于制备用于诊断三阴性乳腺癌顺铂耐药性诊断的试剂，从而及时诊断是否具有或后天产生的对顺铂类药物的耐药性。
进一步地，所述用于三阴性乳腺癌顺铂耐药诊断的试剂包括实时荧光定量PCR检测试剂。通过实时荧光定量PCR能够直接检测三阴性乳腺癌患者LINC01778 V2表达情况，从而进行疗效预测、顺铂耐药诊断、预后评估，且便于实现针对性的治疗。结合RT-PCR和实时荧光定量PCR能够准确、快速的获取对应患者的LINC01778 V2表达情况，简化诊断过程的同时还能保证准确率。有助于实际应用于临床治疗上，从而为现有的三阴性乳腺癌患者提供有效的诊断技术。
进一步地，用于三阴性乳腺癌顺铂耐药性诊断的试剂包括用于检测所述长链非编码RNA的特异性探针，和/或，基于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计的用于检测所述长链非编码RNA的特异性引物。当试剂涉及到PCR扩增时，利用基于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计的能克隆完整LINC01778 V2序列的特异性引物，有助于结合定量PCR技术实现诊断目的。除了利用引物和RT-PCR、定量PCR实现诊断目的外，还能通过探针实现对LINC01778 V2的检测，同样能基于检测结果获取诊断结果，达到诊断目的。更进一步地，所述特异性引物包括如下所述引物：LINC01778-Forward，其核苷酸序列为5’-GTCAGAAGCCTGGAAAGCCC-3’；LINC01778-Reverse，其核苷酸序列为5’-CACGACATGGGTGGGGTAAAT-3’。采用上述引物能克隆出如SEQ ID NO.1所示的LINC01778 V2序列，从而便于结合RT-PCR、定量PCR实现LINC01778 V2检测，进一步实现三阴性乳腺癌患者是否对顺铂类药物耐药的诊断目的。
本发明提供了一种如SEQ ID NO.1所示的长链非编码RNA的检测方法，包括步骤：
(1)样品RNA的提取：采用RNA提取试剂盒进行样本细胞总RNA的提取；
(2)样品cDNA的制备：基于逆转录酶和步骤(1)获得的总RNA进行逆转录以获取cDNA；
(3)实时荧光定量PCR：基于包括步骤(2)获取的cDNA和用于克隆SEQ ID NO.1所示序列的引物对的荧光定量PCR体系进行荧光定量PCR反应，并获取样本中LINC01778 V2 表达的分析结果。
本发明的再一目的在于提供上述长链非编码RNA LINC01778 V2的抑制剂在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用，所述抑制剂特异性抑制LINC01778 V2基因的表达，所述LINC01778 V2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明的一个实施例中，通过抑制剂siRNA抑制LINC01778 V2的表达后，三阴性乳腺癌细胞增殖明显受到抑制，同时，还促进了三阴性乳腺癌细胞的凋亡。所以，下调LINC01778 V2表达的抑制剂能够实现三阴性乳腺癌的治疗，同时，也有助于在预防三阴性乳腺癌上实现应用。
进一步地，乳腺癌为顺铂耐药的三阴性乳腺癌，预防或治疗乳腺癌的药物包括逆转三阴性乳腺癌顺铂耐药的药物。即下调LINC01778 V2表达的抑制剂，除了能直接能应用于治疗包括三阴性乳腺癌、顺铂耐药三阴性乳腺癌的乳腺癌以杀伤肿瘤细胞外，在本发明的一个实施例中，采用抑制剂抑制LINC01778 V2表达后，顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株的耐药性被逆转，重新对顺铂药物敏感，同时利用顺铂药物作用于三阴性乳腺癌细胞时，相比于未抑制LINC01778 V2表达的顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株，抑制LINC01778 V2表达的顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株实验组肿瘤细胞活性明显降低，且肿瘤细胞的增殖受抑制、肿瘤细胞的凋亡加快；即抑制剂作用于顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞时实现了顺铂耐药的逆转，结合顺铂药物同时作用于顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞能显著提高对顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞的治疗效果。所以抑制LINC01778 V2表达的抑制剂能在制备预防或治疗顺铂耐药三阴性乳腺癌的药物或产品中应用。尤其是能直接在制备逆转三阴性乳腺癌顺铂耐药的药物中应用，以便逆转耐药性后进行顺铂药物的持续治疗，因为顺铂药物仍然是目前三阴性乳腺癌化疗的主要治疗手段，所以通过逆转顺铂耐药性有助于避免产生顺铂耐药性的三阴性乳腺癌患者缺失有效的治疗手段。
进一步地，所述抑制剂为siRNA分子；siRNA能够靶向作用于LINC01778 V2，一方面基于其靶向性能够提高作用靶基因的效率，实现靶向沉默LINC01778 V2对应的基因片段，同时，还能避免对其他基因的表达造成干扰而导致副作用，有助于实现对乳腺癌组织、细胞的靶向杀伤、治疗。且当抑制剂为siRNA分子时还有利于借助其他载体实现更进一步的高效运输、靶向运输，有助于基于较少的剂量即能实现显著的治疗效果，能有效避免剂量过多而可能导致的副作用。且siRNA用于基因抑制时，干扰效果好，能够有效抑制LINC01778 V2基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。相比于非靶向性的治疗药物或抑制剂，siRNA能够除了能避免对其他基因表达造成影响外，还能在联合其他药物治疗时避免对其他药物的 治疗效果产生负向影响；有助于结合其他药物或载体实现在治疗上增益的效果。
进一步地，所述siRNA为si1，si1的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述si1的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或，所述siRNA为si2，所述si2的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述siRNA-2的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；其中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3形成相应的一对siRNA，记该对siRNA为si1。SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5形成相应的另一对同样能沉默LINC01778 V2表达的siRNA，记该对siRNA为si2。SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.5均为由5’→3’顺序表现的序列。所以实际上si1对应的正义链为5′-CAUGGUUCAAUCUUCUGGATT-3′，反义链为3′-UCCAGAAGAUUGAACCAUGTT-5′；si2对应的正义链为5′-GUGUUUGAAUUGGCUAAAUTT-3′，反义链为3′-AUUUAGCCAAUUCAAACACTT-5′。在本发明的多个实施例中，采用si1、si2均能对LINC01778 V2实现有效的沉默，从而抑制其表达，以达到对包括三阴性乳腺癌、顺铂耐药三阴性乳腺癌的乳腺癌的治疗效果。
进一步地，所述siRNA分子为被修饰的siRNA分子，所述被修饰的siRNA分子使所述LINC01778 V2基因的表达沉默；即所述siRNA分子为被修饰的si1或si2分子，所述被修饰的si1或si2分子沉默所述长链非编码RNA基因的表达。所述修饰包括核糖修饰、碱基修饰或磷酸骨架修饰。由于siRNA是基于SEQ ID NO.1核苷酸序列而设计的，所以往往不单单只有与si1或si2完全相同的siRNA才能实现沉默的效果，当对所述siRNA进行修饰并使得修饰后的siRNA仍能抑制LINC 01778 V2表达时，修饰后的siRNA同样能起到预防、治疗三阴性乳腺癌的效果。且为了siRNA的运输以及靶向作用，对siRNA进行修饰还有助于改进siRNA在临床上的实际应用，有助于进一步提高单独的siRNA或siRNA联合其他物质时的治疗效果。针对性的修饰除了能产生上述效果外，还能利用核糖、碱基、磷酸骨架的修饰进一步研究后续siRNA沉默机制以及沉默所引发的生物学过程，如应用标记进行修饰，有助于研究siRNA在临床使用时的运输效率以及可能引发的生物机制、其他抑癌机制，从而有助于基于该研究基础实现更为有效的治疗药物或方案，以提高治疗效果、患者的生存率。
进一步地，所述siRNA分子的核苷酸被部分替换和/或增减，核苷酸被部分替换和/或增减后的siRNA分子使所述LINC01778 V2基因的表达沉默；即所述si1或si2分子的核苷酸被部分替换和/或增减，核苷酸被部分替换和/或增减后的siRNA分子沉默所述长链非编码RNA基因的表达。所述siRNA是作为LINC01778 V2表达抑制剂而存在，而基于同一LINC01778 V2对应的核苷酸序列，除了si1、si2外，部分在si1、si2基础上增减和/或替换部分核苷酸所 产生的siRNA同样能抑制LINC01778 V2的表达，所以，siRNA并不局限于只有si1、si2对应的核苷酸序列，且在si1、si2基础上进行部分核苷酸的增加和/或替换有助于随着对LINC01778 V2研究的深入而获取能进一步高效抑制LINC01778 V2表达或便于联合其他治疗物质实现治疗的siRNA。
本发明还提供了一种抑制剂在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用，所述抑制剂特异性抑制HSPB1基因表达和/或抑制Hsp27蛋白产生。在本发明的一个实施例中，发现LINC01778 V2是通过影响HSPB1基因表达和/或Hsp27蛋白产生而促进乳腺癌耐药性产生的。进一步地，所述抑制剂通过抑制LINC01778 V2表达以抑制HSPB1基因表达和/或Hsp27蛋白产生。
本发明提供了一种药物组合物，包括特异性抑制LINC01778 V2基因表达的抑制剂，所述LINC01778 V2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步地，还包括顺铂药物。所述药物组合物同时包含抑制LINC01778 V2基因表达的抑制剂和顺铂药物时，一方面能基于抑制剂直接实现对肿瘤细胞的靶向杀伤，另一方面，抑制剂还能逆转对顺铂耐药三阴性乳腺癌的顺铂耐药性，所以结合同时作用的顺铂能够实现效果更为显著的治疗作用。在本发明中的一个实施例中，同时包含抑制剂和顺铂药物的实验组对肿瘤细胞的杀伤、抑制效果达到最佳。同时，药物组合物还包含顺铂药物时，能应用于三阴性乳腺癌治疗中预防可能产生的顺铂耐药性，从而使顺铂药物顺利实现对应的药物作用。
进一步地，所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。所述与抑制剂配伍的载体和/辅料有助于抑制剂快速作用；进一步地，载体选择病毒、纳米颗粒、胆固醇或脂质体中的一种或多种，纳米粒子不仅便于抑制剂的包裹，还有助于基于纳米粒子进行修饰以便实现更为多样的靶向治疗。病毒、胆固醇、脂质体载体也能为抑制剂提供适用多种场景下的载体环境。
进一步地，所述药物组合物的剂型选自溶液剂、悬液剂、乳剂、粉剂、控制释放剂或持续释放制剂。进一步地，所述药物组合物的给药方式选自注射给药或灌注给药。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：基于LINC01778 V2在不同组织中的差异表达，LINC01778 V2能作为一种标志物而应用于乳腺癌、三阴性乳腺癌以及三阴性乳腺癌顺铂耐药性的诊断，有助于及时判断病症，从而实现对症下药。如，在本发明的一个实施例中发现，长非编码RNA LINC01778 V2在顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞与顺铂药物敏感三阴性乳腺癌细胞中表达显著不同，在顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞中高表达，在顺铂药物敏感三阴 性乳腺癌细胞中低表达，所以，通过检测三阴性乳腺癌患者样本中长非编码RNALINC01778 V2能够帮助判断三阴性乳腺癌患者是否对顺铂类药物具有耐药性，从而基于是否耐药的判断实施更为有效的治疗方法，而不是进行盲目的治疗；有助于对症下药，提高治疗效果，避免盲目使用带来较多副作用或降低治疗效果。由于顺铂类药物对敏感患者、耐药患者所产生的疗效具有显著差别，所以长非编码RNA LINC01778 V2还能应用于对三阴性乳腺癌顺铂治疗效果的预测、顺铂药物治疗的预后评估。有助于获取准确的预测、预后结果，从而方便后续采用针对性、有效的治疗方案进行治疗，避免浪费无效治疗所消耗的时间，有助于延长患者的生存期。同时，由于长非编码RNA LINC01778 V2与顺铂类药物耐药的产生、发展相关，所以研究长非编码RNALINC01778 V2作为改变顺铂耐药性的靶点，有助于为现有的顺铂耐药三阴性乳腺癌患者提供有效的治疗药物或方案，尤其是对于部分只能采用化疗治疗的患者，顺铂类药物具有的有效性若能同样出现于该类患者治疗过程中，则能基于顺铂类药物显著的治疗效果而提高整体治疗效果。以LINC01778 V2作为治疗靶点，有助于改善顺铂耐药患者的耐药情况或逆转耐药情况，从而结合顺铂类药物得到有效治疗。即将长非编码RNA LINC01778 V2作为新的三阴性乳腺癌顺铂耐药标志物和顺铂耐药治疗靶点，具有诊断、预后和/或治疗中的靶点的特异性以及高效性，为耐药性诊断和治疗三阴性乳腺癌提供有力的技术手段。如，本发明的一个实施例中，通过抑制剂以沉默LINC01778 V2的表达，从而实现对三阴性乳腺癌细胞的杀伤作用，为现代乳腺癌的治疗提供新的靶点；有助于基于该治疗靶点提高治疗效果，延长患者的生存期。且通过抑制剂沉默LINC01778 V2表达还能逆转顺铂耐药三阴性乳腺癌的耐药性，从而使其恢复对顺铂药物的敏感性，能为当前临床治疗中因产生耐药机制而无法获得有效治疗的患者提供新的治疗方案和治疗靶点，提高患者的生存率和生存期。当抑制剂结合顺铂药物同时作用时，则能实现双重的治疗效果，相比于现有技术单独的顺铂药物治疗，效果得到明显提升，实现协同治疗效果。本发明将siRNA作为抑制剂，不仅有助于实现靶向性的治疗，减少副反应。还有助于后续应用其他载体或辅助药物进行更为高效的治疗过程，为患者的治疗提供更为多样、有效的选择。促进在乳腺癌治疗方向上的研究，以便为临床治疗提供快速有效的治疗方案，克服当前临床治疗乳腺癌所存在的缺陷，为乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌提供强有力的治疗手段。
附图说明
图1为顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株和顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株的lncRNA表达谱；
图2为经RACE实验验证的LINC01778 V2转录本全长示意图；
图3为基于Mfold和RNAfold软件包预测的RNA二级结构示意图；
图4为LINC01778 V2在231 CisR中的荧光原位杂交结果图。
图5为顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-231 CisR)和顺铂敏感三阴性乳腺癌菌株(MDA-MB-231 parental)在顺铂药物下的细胞活性折线图(左)和LINC01778 V2在顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-231 CisR)和顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-231 parental)中的表达水平柱状图(右)；
图6为顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-468 CisR)和顺铂敏感三阴性乳腺癌菌株(MDA-MB-468 parental)在顺铂药物下的细胞活性折线图(左)和LINC01778 V2在顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-468 CisR)和顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-468 parental)中的表达水平柱状图(右)。
图7为原位杂交实验检测LINC01778 V2分别在顺铂化疗不敏感患者乳腺癌组织(右)、顺铂化疗敏感患者乳腺癌组织(左)中的表达情况。
图8为LINC01778 V2抑制剂及其联用顺铂于乳腺癌细胞杀伤实验的结果。
图9为LINC01778 V2表达下调后乳腺癌细胞部分基因表达结果以及HSPB1与乳腺癌患者、化疗乳腺癌患者的不良预后相关性分析。
图10为LINC01778 V2与多个基因表达的相关性研究结果。
具体实施方式
下面结合具体的实施案例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。除非另外说明，实施例所公开的实验方法均采用本领域常规技术，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施。
实施例1
长链非编码RNA LINC01778 V2的获取及分析
一、筛选长链非编码RNA LINC01778 V2
使用顺铂药物进行诱导，建立对顺铂药物耐药的三阴性乳腺癌稳定细胞株，本实施例中是通过浓度梯度递增法，从低浓度开始，经过两年时间，建立对顺铂完全耐药的三阴性乳腺 癌稳定耐药细胞株。然后，通过lncRNA的芯片检测，对比顺铂药物耐药三阴性乳腺癌细胞株和顺铂药物敏感三阴性乳腺癌细胞株，筛选出一批差异表达的lncRNA；所述的顺铂药物敏感即对顺铂药物不耐药；具体的，利用华大基因测序基于Illumina四代高通量测序平台的lncRNA高通量测序进行准确筛选，lncRNA高通量测序包括lncRNA鉴定、lncRNA定量及差异分析、lncRNA表达聚类、lncRNA靶基因分析、转录本mRNA鉴定、mRNA定量及差异分析、mRNA表达聚类、mRNA功能及结构分析、circRNA鉴定、circRNA定量及差异分析、circRNA表达聚类，并基于上述分析结果获取包括靶基因分析、ceRNA互作网络分析、蛋白互作网络分析、共表达互作网络分析、关键驱动基因网络分析的分析结果。通过华大公司lncRNA高通量测序筛选出一批差异表达的lncRNA后，本发明人进行了差异lncRNA表达的验证，基于表达谱发现长非编码RNA LINC01778 V2在顺铂药物耐药细胞株表达水平高，而在敏感三阴性乳腺癌细胞株中表达水平较低，从而初步筛选出该长链非编码RNA LINC01778 V2。具体的，表达谱如图1所示，LINC01778在两种细胞株中表达差异明显，为此，本申请基于LINC01778进行了后续的进一步分析。本实施例以及后续实施例所采用的顺铂药物为sigma的顺铂。
二、利用RACE对筛选出的长链非编码RNALINC01778 V2进行序列分析
RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是一种获得RNA转录本全长序列的技术。利用RACE技术可以根据转录本中的一小段已知序列获得转录本的5′端(5′RACE-PCR)或3′端(3′RACE-PCR)序列。本实施例中通过SMARTerRACE方法(clontech公司专利技术)，扩增长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)的末端未知序列。
具体包括以下步骤：
1、从顺铂耐药乳腺癌细胞中提取总RNA
采用普洛麦格的total RNA抽提试剂盒(SV Total RNA Isolation System Start-Up Kit)，利用改进型重组DNA酶I从细胞样品中高效快速除掉基因组DNA，分离纯化和富集包括有长非编码RNA在内的总RNA。
2、基于RACE技术获取完整cDNA
(1)利用SMARTer RACE 5’/3’试剂盒，完整地反转录包括LINC01778 V2在内的总RNA的带有完整5’和3’序列的cDNA。
(2)根据NCBI数据库中已知的长LINC01778 V2的部分序列，设计与其互补配对的特异性引物，并进行PCR扩增。
引物序列如下：LINC01778-Forward：5’-GTCAGAAGCCTGGAAAGCCC-3’；LINC01778-Reverse：5’-CACGACATGGGTGGGGTAAAT-3’；
(3)通过DNA凝胶电泳判断和分离PCR的扩增长度。使用胶回收试剂盒回收和纯化扩增后的cDNA。
3、利用一代测序技术鉴定LINC01778 V2的序列并与UCSC的基因序列进行比对，从而获取验证后的LINC01778 V2全长序列。
过程及结果如图2所示，通过RACE实验验证了LINC01778 V2的转录本全长。
三、利用结构预测软件预测LINC01778 V2的二级结构
在基于实施例2的RACE实验获得LINC01778 V2的序列全长后，利用Mfold和RNAfold软件包对LINC01778 V2的RNA二级结构进行预测，结果如图3所示，LINC01778 V2具有茎环结构。
四、利用RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)实验定位LINC01778 V2
基于实施例3的RACE实验获得LINC01778 V2的序列全长后，设计并通过Exiqon公司合成具有5’地高辛标记的锁核酸(LNA)探针，并利用LNA探针原位检测细胞中LINC01778 V2的表达。
包括以下步骤：
1、用多聚甲醛将乳腺肿瘤细胞固定于载玻片上，通过0.5％triton冰上破膜5分钟，0.05％胰蛋白酶消化蛋白，暴露RNA位点，通过LINC01778 V2特异的地高辛标记探针于52℃杂交炉杂交过夜。
2、严格清洗后用带绿色荧光的抗地高辛抗体在4℃孵育过夜。
3、在DAPI孵育后封片，在荧光显微镜下观察LINC01778 V2在乳腺肿瘤细胞中的定位，结果如图4所示，显示其主要分布于细胞浆，有助于基于LINC01778 V2制备的药物设置为靶向细胞浆，从而提高检测准确率或靶向作用效率。
实施例2
基于MDA-MB-231细胞系检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞在顺铂药物作用下的活性变化，并采用荧光定量PCR(qPCR)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中LINC01778 V2的表达
1、检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞在顺铂药物作用下的活性变化
顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株为MDA-MB-231 CisR，顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株为 MDA-MB-231 parental，在同一时间分别施加同剂量的顺铂药物，并观察2d内MDA-MB-231 CisR和MDA-MB-231 parental的细胞活性变化，结果如图5(左)所示，MDA-MB-231 CisR细胞活性在2d内总体上仍然是保持升高，而顺铂药物治疗MDA-MB-231 parental则能获取有效的治疗效果，MDA-MB-231 parental细胞组2d内的细胞活性在顺铂药物起效后显著下降。表明构建的MDA-MB-231 CisR对顺铂药物耐药，而MDA-MB-231 parental不耐药。
2、荧光定量PCR(qPCR)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中LINC01778 V2的表达
其中，荧光定量PCR检测顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231 CisR中LINC01778 V2的表达的步骤如下所示：
(1)利用NCBI数据库的primer blast功能，基于如SEQ ID NO.1所示序列设计LINC01778 V2的引物。引物序列如下：
LINC01778-Forward：5’-GTCAGAAGCCTGGAAAGCCC-3’；
LINC01778-Reverse：5’-CACGACATGGGTGGGGTAAAT-3’。
(2)提取顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231 CisR的总RNA。
(3)样品cDNA的制备：采用TAKARA公司的PrimeScript RT逆转录酶，并按说明书操作：①RT-PCR体系：提取的总RNA 500ng、PrimeScript RT逆转录酶2ul，利用无RNA酶的ddH 2O补到10μl；②置于PCR仪中37℃孵育15min，85℃孵育5s以灭活逆转录酶，获得cDNA。
(4)荧光定量PCR
①采用TAKARA公司的TB Green Premix Ex Taq II试剂盒，其反应体系如下：TB Green 5ul、LINC01778 V2正向引物0.4μL、LINC01778 V2反向引物0.4μL、cDNA 1μL、ddH2O 3.2μL，总体积10μL。
②基于①反应体系在罗氏PCR系统LightCycler480 system中进行反应并分析数据。
荧光定量PCR检测顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231 parental中LINC01778 V2的表达的步骤与上述荧光定量PCR检测顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株中LINC01778 V2的表达步骤相同；最后，荧光定量PCR(qPCR)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中LINC01778 V2的结果如图5(右)所示。图5(右)显示了顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株中LINC01778 V2表达的显著差异，MDA-MB-231 CisR中LINC01778 V2的表达水平是MDA-MB-231 parental的LINC01778 V2表达水平的4倍多，足以显示其在对顺铂不 同反应的三阴性乳腺癌中的差别，结合图5(左)对细胞株的验证结果，证明LINC01778 V2能作为标志物判断三阴性乳腺癌的顺铂耐药性，且基于其差异的显著，基于检测LINC01778 V2表达的诊断也具备充足的诊断准确性。
实施例3
基于MDA-MB-468细胞系检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞在顺铂药物作用下的活性变化，并采用荧光定量PCR(qPCR)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中LINC01778 V2的表达
1、检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞在顺铂药物作用下的活性变化
顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株为MDA-MB-468 CisR，顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株为MDA-MB-468 parental，在同一时间分别施加同剂量的顺铂药物，并观察2d内MDA-MB-468 CisR和MDA-MB-468 parental的细胞活性变化，结果如图6(左)所示，MDA-MB-468 CisR细胞活性在2d内总体上仍然是保持升高，而顺铂药物治疗MDA-MB-468 parental则能获取有效的治疗效果，MDA-MB-468 parental细胞组2d内的细胞活性在顺铂药物起效后显著下降。表明构建的MDA-MB-468 CisR对顺铂药物耐药，而MDA-MB-468 parental不耐药。
2、荧光定量PCR(qPCR)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中LINC01778 V2的表达
其中，荧光定量PCR检测顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-468 CisR中LINC01778 V2的表达的步骤如下所示：
(1)利用NCBI数据库的primer blast功能，基于如SEQ ID NO.1所示序列设计LINC01778 V2的引物。引物序列如下：
LINC01778-Forward：5’-GTCAGAAGCCTGGAAAGCCC-3’
LINC01778-Reverse：5’-CACGACATGGGTGGGGTAAAT-3’
(2)提取顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-468 CisR的总RNA；
(3)样品cDNA的制备：采用TAKARA公司的PrimeScript RT逆转录酶，并按说明书操作：①RT-PCR体系：提取的总RNA 500ng、PrimeScript RT逆转录酶2ul，利用无RNA酶的ddH 2O补到10μl；②置于PCR仪中37℃孵育15min，85℃孵育5s以灭活逆转录酶，获得cDNA。
(4)荧光定量PCR
①采用TAKARA公司的TB Green Premix Ex Taq II试剂盒进行，反应体系如下：TB Green  5ul、LINC01778 V2正向引物0.4μL、LINC01778 V2反向引物0.4μL、cDNA 1μL、ddH2O 3.2μL，总体积10μL。
②基于①反应体系在罗氏PCR系统LightCycler480 system中进行反应并分析数据。
荧光定量PCR检测顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-468 parental中LINC01778 V2的表达的步骤与上述荧光定量PCR检测顺铂耐药三阴性乳腺癌细胞株中LINC01778 V2的表达步骤相同；最后，荧光定量PCR(qPCR)检测顺铂耐药/顺铂敏感三阴性乳腺癌细胞中LINC01778 V2的结果如图6(右)所示。
通过对基于不同的三阴性乳腺癌细胞系检测，进一步验证了实施例2的结论，且通过不同细胞系能证明LINC01778 V2作为标志物或靶点是具有三阴性乳腺癌广谱性的，能够适用不同三阴性乳腺癌患者。
实施例4
在获得LINC01778 V2对应的全长序列后，除了上述对多种细胞系的检测外，本发明人同时还对顺铂化疗敏感患者乳腺癌组织及对顺铂化疗不敏感患者乳腺癌组织进行LINC01778 V2基因表达的检测。
1、原位杂交检测FFPE样本中的LINC01778 V2表达。
本实施例中采用的原位杂交检测方法为常规检测方法，主要包括步骤：脱蜡和补液，然后使用20μg/ml罗氏蛋白酶K进行消化，消化过程完成后通过4％多聚甲醛进行固定，再基于Exiqon公司的双(5’和3’)digoxin-labeled(DIG-labeled)LNA-modified CREILA探针实现杂化作用，并于52℃下孵育过夜；随后在4℃下与anti-DIG单克隆抗体结合，基于碱性磷酸酶(罗氏，目录11093274910)、硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(Roche)实现染色显示，最后将切片裱起来观察。ISH中使用的探针序列为5’-AGATTCTATCAGGCACGTCACT-3’。强度记录为0(无染色)，1(浅紫色)，2(紫蓝色)和3(深紫色)。且本实施例中乳腺癌组织为三阴性乳腺癌组织。
如图7所示，检测发现在顺铂化疗不敏感患者乳腺癌组织表达量较顺铂化疗敏感患者乳腺癌组织中高，见图7(右)，所以LINC01778 V2可以作为一种对顺铂化疗不敏感乳腺癌患者的标志物。
实施例5
在LINC01778 V2基础上，本发明人进一步设计相应的siRNA以研究LINC01778 V2作为治疗靶点的可行性。
发明人基于LINC01778 V2序列设计了多条靶向LINC01778 V2的siRNA，采用脂质体介导的方法转染癌细胞后，通过荧光定量PCR的方法检测siRNA沉默LINC01778 V2的效率，以及siRNA结合顺铂对乳腺癌细胞的杀伤效果。所述siRNA即为SEQ ID NO.2～NO.5所示序列。以下及以下实施例以si1/sh1标识包含SEQ ID NO.2～NO.3所示序列的siRNA，以si2/sh2标识包含SEQ ID NO.4～NO.5所示序列的siRNA，其中sh1代表经载体导入细胞株的si1，sh2代表经载体导入细胞株的si2。
本发明人通过siRNA敲低LINC01778 V2在MDA-MB-231 CisR细胞株中的表达，以下实施例中以231 CisR表示MDA-MB-231 CisR耐药细胞株，231标识MDA-MB-231非耐药细胞株，结果如图8A所示，NC为不加入siRNA的对照组，而si1为加入包括SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的siRNA的实验组，结果显示，通过siRNA能够有效降低LINC01778 V2的表达。进一步地，本发明人还结合siRNA和顺铂研究siRNA下调LINC01778 V2表达后对三阴性乳腺癌细胞活性以及三阴性乳腺癌细胞对顺铂耐药性的影响，结果如图8B所示，其中w/o代表不加入顺铂，with cisplatin代表加入顺铂，从图中可以看出，不加顺铂时，通过siRNA下调LINC01778 V2表达后，细胞活性显著地受到抑制。而相比于不加顺铂，结合siRNA下调LINC01778 V2表达并加入顺铂的实验组在细胞活性受到更为显著的抑制，基于NC对照组中加入顺铂与不加入顺铂的活性差异不显著的表现以及单独siRNA实验组的表现，可知siRNA下调LINC01778 V2表达还会逆转三阴性乳腺癌细胞对顺铂的耐药性。
同时，本发明还进一步的基于细胞计数、平板克隆检测了NC阴性对照组、sh1组、sh1+顺铂组下231 CisR细胞的增殖情况，其中sh1组即代表使用si1下调LINC01778 V2表达的组别；sh1+cisplatin即为sh1+顺铂，代表同时使用si1和顺铂的实验组，结果如图8C所示，可以明显的看出抑制LINC01778 V2表达能够直接抑制乳腺癌细胞的增殖，且当LINC01778 V2表达抑制剂结合顺铂药物时，乳腺癌细胞增殖抑制更为显著。本发明人还通过Annexin-V/PI染色流式分析进行231原始细胞株、231 CisR细胞株、231 CisR细胞株+si1实验组中加入和不加入顺铂时的凋亡研究，其中w/o Cis代表不含顺铂、with Cis代表包含顺铂，结果如图8D所示。从图中也可以看出，231 CisR细胞株+si1组别、231 CisR细胞株+si1+Cis组别细胞凋亡明显，表明siRNA能够直接促进乳腺癌细胞的凋亡，且231 CisR细胞株+si1+Cis组别细胞凋亡较231 CisR细胞株+si1组别细胞凋亡更加显著，表明si1能逆转顺铂耐药，且si1联合顺铂能够起到最佳的治疗效果。
实施例6
本发明还比较了下调LINC01778表达后231 CisR细胞株的mRNA表达谱，结果如图9A所示，相应的HSPB1表达下调，证明LINC01778的下调直接影响HSPB1的表达。为了进一步验证该结果，本发明人通过QRT-PCR验证HSPB1在稳定敲低LINC01778的耐药株中的表达下调，结果如图9B所示。其中NC为阴性对照，sh1、sh2分别为加入si1、si2的实验组。进一步地，本发明人还研究HSPB1与乳腺癌患者及接受化学治疗的乳腺癌患者群体的不良预后关系，结果如图9C、9D所示，结果显示，乳腺癌患者以及经化学治疗的乳腺癌患者中HSPB1与不良预后密切相关。
实施例7
本发明人还比较了三阴性乳腺癌非耐药细胞株231和耐药细胞株231 CisR中HSPB1 mRNA的表达情况，如图10A所示，表明耐药三阴性乳腺癌细胞株中HSPB1呈现特异性高表达。同时，也比较了Hsp27、AKT、pAKT蛋白的表达情况，结果如图10B所示。结果显示，HSPB1 mRNA在耐药细胞株较非耐药株表达较高。同时，对应的Hsp27蛋白也表达较高，且AKT、pAKT蛋白也较高。表明LINC01778 V2可能是通过影响HSPB1表达，从而促进Hsp27的产生，以引发三阴性乳腺癌的耐药机制。为此，本发明人进一步的研究了Hsp27与顺铂耐药三阴性乳腺癌之间的关联，下调Hsp27后发现能够直接对231 CisR细胞株产生抑制，并逆转其对顺铂的耐药性，使CisR恢复对顺铂的敏感性，结果如图10C所示。本发明人为进一步研究LINC01778 V2的作用机制，研究了下调LINC01778表达的同时过表达Hsp27蛋白对231 CisR细胞的影响，其中Hsp27过表达是通过构建过表达载体并转入细胞株实现的，结果如图10D所示，单独的下调LINC01778 V2均能实现对癌细胞的杀伤作用，而当同时过表达Hsp27时，下调LINC01778的效果则有所减弱，且顺铂耐药的逆转也不明显，由此，也表明了LINC01778是通过影响HSPB1基因表达以及Hsp27蛋白的产生而达到肿瘤细胞杀伤、顺铂耐药逆转效果的。从而进一步的获得了LINC01778 V2的作用机制研究基础，也为乳腺癌的治疗提供新的靶点和研究方向。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

  1. 一种长链非编码RNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
  2. 权利要求1所述长链非编码RNA在制备诊断、治疗乳腺癌产品中的应用。
  3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，乳腺癌为顺铂耐药三阴性乳腺癌。
  4. 权利要求1所述长链非编码RNA的检测试剂在制备用于三阴性乳腺癌顺铂耐药诊断的试剂中的应用。
  5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述用于三阴性乳腺癌顺铂耐药诊断的试剂包括用于检测所述长链非编码RNA的特异性探针，和/或，基于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计的用于检测所述长链非编码RNA的特异性引物；所述特异性引物包括如下所述引物：LINC01778-Forward，其核苷酸序列为5’-GTCAGAAGCCTGGAAAGCCC-3’；LINC01778-Reverse，其核苷酸序列为5’-CACGACATGGGTGGGGTAAAT-3’。
  6. 权利要求1所述长链非编码RNA的抑制剂在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用。
  7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，预防或治疗乳腺癌的药物包括逆转三阴性乳腺癌顺铂耐药的药物。
  8. 根据权利要求6～7任一项所述的应用，其特征在于，抑制剂为siRNA分子；所述siRNA为si1，si1的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述si1的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或，所述siRNA为si2，所述si2的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述siRNA-2的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；或，所述siRNA分子为被修饰的si1或si2分子，所述被修饰的si1或si2分子沉默所述长链非编码RNA基因的表达；或，所述si1或si2分子的核苷酸被部分替换和/或增减，核苷酸被部分替换和/或增减后的siRNA分子沉默所述长链非编码RNA基因的表达。
  9. 一种抑制剂在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用，所述抑制剂抑制HSPB1基因表达和/或抑制Hsp27蛋白产生。
  10. 一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述长链非编码RNA的抑制剂和顺铂药物。
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