CN116004822B - 一种用于乳腺癌诊断的pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于乳腺癌诊断的PCR试剂盒，属于乳腺癌诊断和治疗技术领域。本发明所提供的乳腺癌试剂盒中含有检测lnc‑AP001046.1基因的表达产物的PCR引物，lnc‑AP001046.1的转录本序列如SEQ ID NO.1所示，PCR引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。通过实验检测发现lnc‑AP001046.1在乳腺癌标本中高表达，且对差异表达进行检测具有高灵敏度和高特异性。

Description

一种用于乳腺癌诊断的PCR试剂盒

技术领域

本发明属于乳腺癌诊断和治疗技术领域，尤其涉及一种用于乳腺癌诊断的PCR试剂盒。

背景技术

乳腺癌是女性中常见的恶性肿瘤，其发病率逐年上升，且呈现出年轻化的趋势，严重危害着女性的健康。在中国，乳腺癌的发病率在女性恶性肿瘤中是最高的。随着社会的发展和进步，尽管生存环境和医疗条件发生了明显的改善，但是统计数据显示，目前乳腺癌的发病率越来越高，患者的发病年龄也趋于年轻化，发病率和死亡率也没有得到有效的改善，因此依然严重威胁着女性的健康和生命。因此，对于乳腺癌的诊断和治疗越来越值得关注和重视。

长链非编码RNA是真核细胞中转录本长度大于200核苷酸的非编码RNA。其实由RNA聚合酶Ⅱ转录的RNA，剪切后具有polyA尾，同时具有类似mRNA的结构。LncRNA的功能主要包括基因转录干扰、转录激活、核内运输、基因组印迹、X染色体沉默和染色质修饰等多种重要的调控过程。

现有的研究表明，lncRNA贯穿肿瘤的发生和发展的过程中，因此研究lncRNA在乳腺癌中的应用，有助于实现乳腺癌的早诊断和早治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于乳腺癌诊断的PCR试剂盒，并提供一种用于治疗乳腺癌的siRNA。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了lnc-AP001046.1基因的表达产物作为检测乳腺癌的分子标志物在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应用，所述lnc-AP001046.1基因的转录本序列如SEQID NO.1所示。

优选地，所述试剂盒中包括检测lnc-AP001046.1基因的表达产物的PCR引物；所述PCR引物的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述PCR引物的反向引物序列如SEQ ID NO.3所示。

第二方面，本发明提供了一种用于乳腺癌诊断的PCR试剂盒，所述试剂盒中包括检测lnc-AP001046.1基因的表达产物的PCR引物；所述PCR引物的正向引物序列如SEQ IDNO.2所示，所述PCR引物的反向引物序列如SEQ ID NO.3所示；

所述lnc-AP001046.1基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示。

第三方面，本发明提供了检测lnc-AP001046.1基因表达量的PCR引物在制备检测乳腺癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述lnc-AP001046.1基因的转录本序列如SEQID NO.1所示。

优选地，所述PCR引物的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述PCR引物的反向引物序列如SEQ ID NO.3所示。

第四方面，本发明提供了lnc-AP001046.1基因的siRNA在制备乳腺癌治疗药物中的应用，所述lnc-AP001046.1基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述乳腺癌治疗药物至少具有以下功用之一：抑制乳腺癌细胞增殖，抑制乳腺癌细胞侵袭，抑制乳腺癌细胞内N-cadherin蛋白水平，促进乳腺癌细胞内E-cadherin蛋白水平。

优选地，所述siRNA的正义链如SEQ ID NO.4所示，所述siRNA的反义链如SEQ IDNO.5所示。

第五方面，本发明提供了lnc-AP001046.1基因的siRNA制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物中的应用，所述lnc-AP001046.1基因的转录本序列如SEQ IDNO.1所示；所述siRNA的正义链如SEQ ID NO.4所示，所述siRNA的反义链如SEQ ID NO.5所示。

第六方面，本发明提供了lnc-AP001046.1基因的siRNA制备抑制乳腺癌细胞侵袭的药物中的应用，所述lnc-AP001046.1基因的转录本序列如SEQ IDNO.1所示；所述siRNA的正义链如SEQ ID NO.4所示，所述siRNA的反义链如SEQ ID NO.5所示。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供了一种在乳腺癌组织和癌旁组织中差异表达的lnc-AP001046.1，而且检测lnc-AP001046.1的表达量差异具有优异的灵敏度和特异性，从而可以将检测lnc-AP001046.1的表达量的试剂盒用于诊断乳腺癌。

2.本发明提供了lnc-AP001046.1的siRNA，将siRNA转染siRNA后可以有效的抑制乳腺癌细胞的集落形成和侵袭能力，因此可以将该siRNA制备用药物来治疗乳腺癌。

附图说明

图1为lnc-AP001046.1在乳腺癌组织和癌旁组织中的差异表达情况(A)和ROC曲线(B)；

图2为lnc-AP001046.1在乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7；

图3为si-lnc-AP001046.1的抑制效果(A)以及抑制si-lnc-AP001046.1对于乳腺癌细胞集落形成的影响(B和C)；

图4为抑制si-lnc-AP001046.1对于乳腺癌细胞侵袭的影响(A和B)；

图5为抑制si-lnc-AP001046.1对于乳腺癌细胞中EMT相关蛋白E-cadherin和N-cadherin的影响。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

提取乳腺癌组织和癌变组织的RNA

(1)取50mg不同样品的乳腺癌组织和癌旁组织(每组包含30个组织)放入到研钵中，加入少量的液氮后，快速对组织进行研磨，研磨结束后加入1mL Trizol，吹打混匀后，转移到离心管中；

(2)调整离心机参数为12000r，离心时间5min，放入离心管进行离心，离心结束后将上清转移到新的离心管中；

(3)加入200μL氯仿震荡混匀，室温放置5min之后，调整离心机参数为12000r，4℃，15min，离心后收集上清至新的离心管中；

(4)加入500μL预冷的异丙醇混匀，混匀后冰上静置10min之后，调整离心机参数为12000r,4℃，10min，离心后去除上清保留沉淀；

(5)加入浓度75％乙醇(使用DEPC水配置)，温和震荡悬浮沉淀后，调整离心机参数为8000r，4℃，5min，离心后小心去除上清；

(6)室温下静置10min，待RNA干燥之后，加入35μL DEPC水震荡溶解RNA后，使用微量紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度。

实施例2

检测lnc-AP001046.1在乳腺癌组织样本和癌旁组织样本中的表达差异

(1)去除实施例1中RNA样品的基因组DNA，按照如下的反应体系配制反应试剂：

(2)设置反应条件为42℃2分钟，4℃保持进行反应；

(3)按照如下的反应体系配制逆转录反应试剂：

(4)设置反应条件为37℃15分钟，85℃5秒，4℃保持进行反应；

(5)按照如下的反应体系配制荧光定量PCR反应试剂：

其中，lnc-AP001046.1(转录本序列为SEQ ID NO.1)的正向引物为：ACATCAGGTGGCTGCATTCA(SEQ ID NO.2)，lnc-AP001046.1的反向引物为：ATTCAGGAGCAGGAAAGGCC(SEQ ID NO.3)；

(6)设置反应条件为95℃10min；95℃15s，60℃45s 40个循环；

(7)根据2^-△△Ct方法处理实时定量PCR数据，得到的结果被展示在图1A中。

从图1A中，我们可以看出乳腺癌组织中lnc-AP001046.1的相对表达量(2.59±0.71)明显高于癌旁组织中lnc-AP001046.1的相对表达量，且差异具有统计学差异(P<0.0001)；

同时，本发明绘制了乳腺癌组织和癌旁组织差异的ROC曲线，如图1B，从图1B中可以看出，ROC曲线的AUC值为0.976。除此之外，ROC曲线的cut-off值为1.643，灵敏度为0.933，特异度为0.900；上述结果说明将lnc-AP001046.1作为乳腺癌的诊断标志物时，具有优异的诊断价值。

实施例3

比较lnc-AP001046.1在人乳腺上皮细胞MCF-10A和人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7中的表达差异。

(1)将MCF-10A，MDA-MB-231，MCF-7接种于6孔细胞培养板中，加入培养基进行培养；

(2)待细胞的密度达到90％上时，去除培养基，使用PBS清洗细胞，加入1ml Trizol吹打裂解细胞，吹打混匀后，转移至离心管中；

(3)后续RNA提取步骤同实施例1，逆转录和荧光定量PCR反应步骤同实施例2；

(4)得到的结果被展示在图2中。

从图2中可以看出，相较于人乳腺上皮细胞MCF-10A，人乳腺癌细胞MDA-MB-231(2.13±0.36)和MCF-7(3.05±0.38)中lnc-AP001046.1的表达量均发生明显的升高，与组织标本中得到的结果相一致。

实施例4

通过克隆形成实验检测抑制lnc-AP001046.1对于乳腺癌细胞增殖的调控

1)设计抑制lnc-AP001046.1的siRNA

(1)根据lnc-AP001046.1的转录本序列设计的siRNA如下：

正义链：ACACUAAUAGGAAACUCACCA；SEQ ID NO.4；

反义链：GUGAGUUUCCUAUUAGUGUGG；SEQ ID NO.5；

(2)将MCF-7细胞消化制成单细胞悬液，之后将细胞按照适量密度接种于6孔板中，过夜贴壁；

(3)第二天，待细胞密度达到70-80％的时候进行细胞转染，在2个无酶EP管中分别加入10μL si-NC，si-lnc-AP001046.1，之后加入Opti-MEM补齐到500μL；

(4)在另外2个无酶EP管中分别加入5μL Lipo2000，之后加入Opti-MEM补齐到500μL；

(5)将含有lipo2000的Opti-MEM与含有si-NC，si-lnc-AP001046.1的Opti-MEM混合添加到6孔板中，并加入1ml培养基；

(6)转染48h后，提取RNA检测si-lnc-AP001046.1的抑制效果，得到的结果如图3A所示。

2)克隆形成实验

(1)将转染si-NC和si-lnc-AP001046.1细胞消化计数后，每个小皿中加入1000个细胞，加入培养基进行培养；

(2)每2,3天进行一次换液，10天后去除培养基，使用PBS洗去残留的培养基；

(3)使用多聚甲醛固定贴壁细胞20min，之后使用结晶紫染色20min后，去除染色液，PBS清洗后，进行拍照和技术，得到的结果如图3B和C所示。

从图3A可以看出，本发明所提供的si-lnc-AP001046.1可以有效的抑制AP001046.1的mRNA表达(0.20±0.04)；

从图3B和图3C可以看出，在MCF-7细胞中转染si-lnc-AP001046.1之后，细胞克隆形成的数量显著减少，说明抑制乳腺癌细胞中lnc-AP001046.1表达可以有效的抑制乳腺癌细胞的增殖。

实施例5

检测lnc-AP001046.1对于乳腺癌侵袭的影响

1.使用Transwell小室检测抑制lnc-AP001046.1对于乳腺癌细胞侵袭的影响

(1)吸取1000μL无血清培养基与离心管中，加入200μL过夜融化的Matrigel胶，混匀后吸取100μL加入Transwell小室(置于24孔板中)中，之后将小室放入培养箱找那个孵育至完全凝固；

(2)将转染si-NC和si-lnc-AP001046.1细胞制成细胞悬液并计数，将5×10⁴个细胞的500μL无血清培养基加入小室内，将500μL含有10％FBS的培养基加入到24孔板中，每组设置3个重复；

(3)培养24h后，去除小室中的液体，将小室置于甲醇进行固定；

(4)之后，使用结晶紫染色20min，然后使用清水浸泡小室3次，擦去上室中的细胞，置于显微镜下进行拍照和计数，得到的结果如图4A和B所示。

从图4A和4B中可以看出，转染了si-lnc-AP001046.1的细胞穿过Transwell小室的数量明显减少，说明通过抑制乳腺癌细胞中lnc-AP001046.1的表达可以有效的抑制乳腺癌细胞的侵袭。

实施例6

(1)在转染了si-NC和si-lnc-AP001046.1的6孔板中的MCF-7细胞中加入100μL细胞裂解液，置于冰上裂解30min；

(2)使用蛋白刮子将细胞及裂解液刮下，使用200μL移液枪将裂解液和细胞收集到EP管中；

(3)使用BCA法测定蛋白浓度，加入蛋白loading buffer，使用95℃恒温水浴锅加热10min，使蛋白充分变性；

(4)清洗玻璃板，安装配胶支架，配置电泳胶，配置完成后将玻璃板固定在电泳支架上，垂直拔出梳子；

(5)在2测加入蛋白Marker，在中央的样品孔中加入蛋白样品，上样完成后，安装电泳槽加入新的电泳缓冲液，接好电泳；

(6)首先使用80V跑大约30min，待蛋白Marker跑开后，调整至120V至结束；

(7)将合适大小的PVDF膜置于甲醇中激活，之后放入电转缓冲液中备用，转膜夹的黑色端铺上一层海绵，然后放置3层滤纸，将凝胶铺在滤纸上，之后按照顺序放置PVDF膜，3层滤纸，1层海绵，卡紧电转夹；

(8)安装好电转仪，放入冰盒，加入电转液，开始电转；

(9)电转结束后，使用清水冲洗一下PVDF膜后，放入到脱脂奶粉中进行封闭，使用60rpm的摇床摇晃1.5h；

(10)根据E-cadherin，N-cadherin，β-actin的大小裁剪PVDF膜；

(11)将适宜浓度的相应一抗加入到PVDF膜上，4℃放置过夜；

(12)使用TBST在摇床上洗3次，每次10min，使用1％脱脂奶粉配置的二抗孵育1h，TBST摇床上洗膜3次，每次10min；

(13)将PVDF膜放入塑料盒中，正面朝上放好后，加入A+B发光工作液；

(14)将PVDF膜置于显影盒中的保鲜膜上，关闭暗盒；

(15)曝光完成后，把胶片放入到显影液中，等待1-3分钟后进行显影；

(16)将显影后的胶片放入到蒸馏水中片刻后，马上放入到定影液中，等待定影完成，之后扫描胶片进行保存,实验得到的结果如图5所示。

从图5中可以看出，转染si-lnc-AP001046.1的细胞中EMT促进蛋白E-cadherin的表达量升高，而EMT抑制蛋白N-cadherin的表达量降低，该结果进一步证明通过抑制lnc-AP001046.1在乳腺癌中的表达可以EMT相关蛋白来降低乳腺癌的侵袭能力。

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Claims (10)

1.lnc-AP001046.1基因的表达产物作为检测乳腺癌的分子标志物在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述lnc-AP001046.1基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的lnc-AP001046.1基因的表达产物作为检测乳腺癌的分子标志物在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒中包括检测lnc-AP001046.1基因的表达产物的PCR引物；所述PCR引物的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述PCR引物的反向引物序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种用于乳腺癌诊断的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括检测lnc-AP001046.1基因的表达产物的PCR引物；所述PCR引物的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述PCR引物的反向引物序列如SEQ ID NO.3所示；

所述lnc-AP001046.1基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示。

4.检测lnc-AP001046.1基因表达量的PCR引物在制备检测乳腺癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述lnc-AP001046.1基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的检测lnc-AP001046.1基因表达量的PCR引物在制备检测乳腺癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述PCR引物的正向引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述PCR引物的反向引物序列如SEQ ID NO.3所示。

6.lnc-AP001046.1基因的siRNA在制备乳腺癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述lnc-AP001046.1基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求6所述的lnc-AP001046.1基因的siRNA在制备乳腺癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述乳腺癌治疗药物至少具有以下功用之一：抑制乳腺癌细胞增殖，抑制乳腺癌细胞侵袭，抑制乳腺癌细胞内N-cadherin蛋白水平，促进乳腺癌细胞内E-cadherin蛋白水平。

8.根据权利要求6所述的lnc-AP001046.1基因的siRNA在制备乳腺癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述siRNA的正义链如SEQ ID NO.4所示，所述siRNA的反义链如SEQ IDNO.5所示。

9.lnc-AP001046.1基因的siRNA制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物中的应用，其特征在于，所述lnc-AP001046.1基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示；所述siRNA的正义链如SEQID NO.4所示，所述siRNA的反义链如SEQ ID NO.5所示。

10.lnc-AP001046.1基因的siRNA制备抑制乳腺癌细胞侵袭的药物中的应用，其特征在于，所述lnc-AP001046.1基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示；所述siRNA的正义链如SEQID NO.4所示，所述siRNA的反义链如SEQ ID NO.5所示。