CN113322318A - Linc00485作为分子标志物在制备用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了LINC00485作为分子标志物在制备用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品中的应用，所述用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品包括LINC00485分子标志物的检测试剂和/或检测引物和/或检测试剂盒；所述检测试剂包括血浆标本RNA提取试剂、逆转录反应试剂、实时荧光定量PCR试剂中的至少一种；所述检测引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示；所述检测试剂盒，包括所述的检测引物。可检测患者血浆中LINC00485的表达水平，从而快速方便的检测血浆LINC00485肝细胞癌患者和正常对照者的表达水平，灵敏度达到85％以上，特异度达到70％以上。

Description

LINC00485作为分子标志物在制备用于诊断和/或预后肝细胞 癌的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学检测技术领域，特别涉及LINC00485作为分子标志物在制备用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品中的应用。

背景技术

原发性肝癌是世界范围内常见的恶性疾病，其发病率居恶性肿瘤第六位，死亡率居癌症相关死亡率的第二位。肝细胞癌(HepatocellμLar carcinoma,HCC)是原发性肝癌的主要病理类型。由于早期诊断率低，HCC往往在晚期才被发现，对人类生命构成极大威胁。北美HCC患者的5年生存率约为19％，在中国HCC患者的5年生存率为12％，目前迫切需要一种可靠的HCC早期诊断方法。

近年研究表明，广泛用于HCC诊断的生物标志物-甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)在预测早期肝癌方面存在一定不足，存在灵敏度、特异度不高的缺点；因此，识别新型的生物标志物对于肝癌的及时、早期诊断非常重要，有必要开发一种新的灵敏度、特异度高的标志物。

发明内容

本发明目的是提供LINC00485作为分子标志物在制备用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品中的应用，利用用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品可检测患者血浆中LINC00485的表达水平，从而快速方便的检测LINC00485在患者血浆中的表达水平。单独检测血浆LINC00485的表达水平区分肝细胞癌患者和正常对照者，灵敏度达到85％以上，特异度达到70％以上。

在本发明的第一方面，提供了LINC00485作为分子标志物在制备用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品中的应用。

进一步地，所述用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品包括LINC00485分子标志物的检测试剂和/或检测引物和/或检测试剂盒。

在本发明的第二方面，提供了一种LINC00485分子标志物的检测试剂，所述检测试剂包括试剂A、试剂B和试剂C中的至少一种：

试剂A、血浆标本RNA提取试剂；

试剂B、逆转录反应试剂；

试剂C、实时荧光定量PCR试剂。

在本发明的第三方面，提供了一种LINC00485分子标志物的检测引物，所述的引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

在本发明的第四方面，提供了一种LINC00485分子标志物的实时荧光定量PCR试剂盒，包括所述的检测引物。

进一步地，所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括：用于均一化的内参引物、阳性对照模板、阴性对照模板和qPCR反应常规试剂。

进一步地，所述用于均一化的内参引物为以GAPDH为内参的引物，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

进一步地，述阳性对照模板为经测序验证过的LINC00485 PCR扩增产物；所述阴性对照模板为去离子水；所述qPCR反应常规试剂包括SYBR-Green I Premix Ex Taq。

在本发明的第五方面，提供了一种用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品，包括：

所述的LINC00485分子标志物的检测试剂；

和/或所述的LINC00485分子标志物的检测引物；

和/或所述的LINC00485分子标志物的实时荧光定量PCR试剂盒。

进一步地，所述用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品还包括：AFP检测试剂。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1、本发明提供的LINC00485作为分子标志物在制备用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品中的应用，将LINC00485作为一种有效的肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物，其血浆表达水平与HCC的发生发展密切相关；与健康对照者相比，所述标志物LINC00485的表达水平升高，提示患者患有肝细胞癌；

2、本发明提供了检测肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物LINC00485表达水平的引物，利用所述引物可检测患者血浆中LINC00485的表达水平，从而使肝细胞癌的诊断更加方便易行；

3、本发明利用所述引物可制备肝细胞癌辅助诊断的试剂盒，从而快速方便的检测LINC00485在患者血浆中的表达水平；

4、本发明将血浆LINC00485的表达水平用于辅助诊断肝细胞癌患者，其与血浆AFP的联合使用可提高肝细胞癌患者的检出率，单独检测血浆LINC00485的表达水平区分肝细胞癌患者和正常对照者，灵敏度达到85％以上，特异度达到70％以上；联合检测血浆LINC00485的表达水平和AFP的水平区分肝细胞癌患者和正常对照者，灵敏度、特异度均达到80％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例中健康对照者，癌前病变患者(包括乙肝患者和肝硬化患者)及肝细胞癌患者血浆LINC00485的表达水平比较；

图2为本发明实施例中血浆LINC00485及血浆AFP单独及联合使用在鉴别健康对照者与肝细胞癌患者时的ROC曲线；

图3为本发明实施例中血浆LINC00485及血浆AFP单独及联合使用在鉴别癌前病变患者(包括乙肝患者和肝硬化患者)与肝细胞癌患者时的ROC曲线；

图4为本发明实施例中血浆LINC00485及血浆AFP单独及联合使用在鉴别健康对照者与癌前病变患者(包括乙肝患者和肝硬化患者)时的ROC曲线。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

通过开展实验首次发现血浆LINC00485的表达与HCC的发生密切相关。研究结果表明，从健康者到癌前病变患者(包括乙肝患者和肝硬化患者)到进一步发展为HCC患者，血浆LINC00485的表达水平逐渐升高，血浆LINC00485的表达水平可用于区分HCC患者与健康对照者，具有较高的诊断价值。

且血浆LINC00485与血浆AFP的联合使用可提高HCC患者的检出率，进一步证明了LINC00485可作为一种有效的HCC辅助诊断血液分子标志物。

本发明将HCC辅助诊断血液分子标志物的引物(所述的引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示)用于制备HCC辅助诊断的试剂盒中，检测HCC辅助诊断血液分子标志物—LINC00485的表达水平，从而使HCC的诊断更加方便易行。

所述试剂盒为实时荧光定量PCR试剂盒，包括所述的检测引物，还包括：用于均一化的内参引物、阳性对照模板、阴性对照模板和qPCR反应常规试剂。

采用实时荧光定量PCR试剂盒用于检测上述分子标记物的方法，包括以下步骤：

以逆转录获得的cDNA为模板，采用所述实时荧光定量PCR试剂盒配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线；所述扩增反应体系包括：SYBR-Green I Premix ExTaq 10μL、如SEQ ID NO：1所示的引物(2μM)0.8μL、如SEQ ID NO：2所示的引物(2μM)0.8μL、RNase-free water 6.4μL、cDNA2μL。所述扩增程序为：95℃5min，95℃30sec,61.6℃30sec,72℃30sec，除第一步外，其余共计40个循环，获得Ct LINC00485；

同时用GAPDH作为均一化参照引物对逆转录合成待检测样本cDNA进行qPCR扩增，获得Ct GAPDH；

Ct值是指反应管中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，反映了样本所含的起始拷贝数。起始拷贝数越少，Ct越大，反之则越小。通过计算Ct LINC00485-CtGAPDH，得出ΔCt。

对ΔCt进行分析判断原则为：

将待测样本的ΔCt值与健康对照者样本的ΔCt值进行比较，并进行统计学分析获得P值，以P<0.05为差异有统计学意义。

若P<0.05，待测样本诊断为肝细胞癌；

若P≥0.05，待测样本不诊断为肝细胞癌；

下面将结合实施例及实验数据对本申请的LINC00485作为分子标志物在制备用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品中的应用进行详细说明。

实施例1肝细胞癌患者血浆LINC00485表达水平异常升高

一、实验对象

收集了2019年10月至2020年9月就诊于武汉大学中南医院的70例肝细胞癌患者、70例癌前病变患者(包括乙肝患者和肝硬化患者)和70例健康对照者的EDTA抗凝血标本及临床信息。收集的血液标本于4℃离心机中12000rpm离心15min后分离血浆，置于-80℃保存。所纳入的患者均依据其病理报告诊断，肿瘤分期的判断参考美国癌症联合委员会(AJCC)第七版癌症分期手册。

所有实验设计及流程均获得武汉大学中南医院伦理委员会批准。

二、实验方法

1.血浆标本RNA提取及检测(血浆RNA提取试剂盒—Bioteke)

(1)收集约2ml EDTA抗凝的全血于2ml无酶Ep管中，于4℃离心机中12000rpm离心15min，此时标本分三层。

(2)吸取300μL上层血浆至一新的2ml无酶Ep管中，以1:3的比例加入900μL裂解液RLS，充分吹打混匀后涡旋震荡，此时可继续进行下一步或置于-20℃保存。避免反复冻融。

(3)每1ml的裂解液RLS中加入200μL的氯仿，用力剧烈震荡15s后再涡旋振荡，随后室温放置3min。

(4)于4℃离心机中12000rpm离心10min，样品分三层：上层、中间层和下层。RNA存在于上层水相中。吸取上层水相至一新的2ml无酶Ep管中。

(5)加入等量的70％乙醇，轻轻颠倒混匀后将液体全部加入吸附柱RA中(吸附柱置于收集管中)。

(6)于4℃离心机中10000rpm离心45s，弃掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(7)加入500μL漂洗液RW，于4℃离心机中12000rpm离心1min，弃掉废液，吸附柱重新放入收集管中，于4℃离心机中12000rpm空离2min。

(8)加入500μL去蛋白液RE，室温放置2min后，12000rpm离心45s，弃掉废液，吸附柱重新放入收集管中。

(9)加入500μL漂洗液RW，于4℃离心机中12000rpm离心1min，弃掉废液，吸附柱重新放入收集管中。

(10)于4℃离心机中12000rpm空离2min。

(11)剪掉吸附柱盖子，将吸附柱放入新的2ml无酶Ep管中，根据样本所含RNA含量的高低在吸附膜的正中央选择加入不同含量(30-80μL)的DEPC水(DEPC水需事先于水浴锅中加热至65℃-70℃左右)，室温静置2min，12000rpm离心1min。为使得RNA浓度提高，离心后可将Ep管中的液体吸出，再次垂直加入到吸附膜的正中央位置，室温静置2min，12000rpm离心1min。

(12)采用NanoDrop 2000对提取的RNA浓度进行检测，使用1μL DEPC将检测孔清洗3次后，加入1μL DEPC水调零，随后加入1μL待检测的RNA样本，观察RNA浓度及纯度，良好的RNA样本其OD260/OD280在1.8-2.1之间，曲线无双峰。

(13)提取的RNA可直接进行逆转录或置于-80℃保存。

2.逆转录(PrimeScript^TMRT试剂盒—Takara)

(1)RNA的变性：取6μL上述提取的RNA至一新的200μL Ep管中(冰上操作)，离心10-15s后，在普通PCR仪上运行如下程序65℃5min，4℃∞，运行完成后立即置于冰上冷却。

(2)去除基因组DNA：为避免上述提取的RNA中混杂有DNA，需去除基因组DNA。向上述含有6μL RNA的Ep管中加入2μL已添加gDNA Remover的4×DN Master Mix(冰上操作)，混匀后离心10-15s，在普通PCR仪上运行如下程序37℃5min，4℃∞，运行完成后立即置于冰上冷却。

(3)逆转录反应：向上述反应液中加入2μL 5×的RT Master Mix II(冰上操作)，混匀后点离10-15s，在普通PCR仪上运行如下程序37℃15min，50℃5min,98℃5min,4℃∞，运行完成后立即置于冰上冷却；此时RNA已逆转为cDNA，可直接使用或置于-20℃保存。

3.实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)：

(1)引物序列：LINC00485和GAPDH的引物序列如下表1：

表1

LINC00221上游引物	5'-TCTCCATCACCCCCTGTTCT-3'(SEQ NO:1)
		LINC00221下游引物	5'-TGAGCCGTTTTGTGGACTGT-3'(SEQ NO:2)
GAPDH上游引物	5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'(SEQ NO:3)
		GAPDH下游引物	5'-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3'(SEQ NO:4)

(2)反应体系：qPCR所用试剂盒为CWBIO公司的SYBR-Green I Premix Ex Taq，反应体系按照9：1的比例进行加样(即试剂加18μL，cDNA模板加2μl)。对于每个样本，内参GAPDH和目的lncRNA LINC00485同时检测，且均做2个复孔。实验所用的仪器为Bio-Rad CFX96，具体反应体系如下表2：

表2

成分	用量
		SYBR-Green I Premix Ex Taq	10μL
Forward primer(2μM)	0.8μL
		Reverse primer(2μM)	0.8μL
RNase-free water	6.4μL
		cDNA	2μL

(3)Real-time qPCR：注意全程在冰上操作，且避免外源DNA的污染。加样完成后离心10-15s，在qPCR仪上运行如下程序95℃5min，95℃30sec,61.6℃30sec,72℃30sec，除第一步外，其余共计40个循环。运行完成后，通过观察溶解曲线，判断是否有引物二聚体形成以及非特异性扩增。Ct值是指反应管中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，反映了样本所含的起始拷贝数。起始拷贝数越少，Ct越大，反之则越小。对于每个样品来说，LINC00485的实际Ct值为其两个复孔Ct的平均值，GAPDH的实际Ct值为其两个复孔Ct的平均值，通过计算Ct LINC00485-Ct GAPDH，得出ΔCt。qPCR运行完成后的8联管可置于4℃保存。

4.统计分析：

运用受试者工作特征曲线(Receiver-operator characteristic,ROC)评估了血浆LINC00485在肝细胞癌中的诊断价值。所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.0和IBMSPSS Statistics 26.0进行。以P<0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

如图1所示，肝细胞癌患者的血浆LINC00485表达水平显著高于癌前病变患者和正常对照者(P<0.0001)。

如图2所示，ROC曲线分析结果表明，血浆LINC00485的水平可用于区分肝细胞癌患者和正常对照者(AUC＝0.8336，P<0.0001)，灵敏度为85.71％，特异度为71.42％。血浆AFP的水平可用于区分肝细胞癌患者和正常对照者(AUC＝0.7360，P<0.0001)，灵敏度为51.43％，特异度为100％。且血浆AFP和LINC00485的联合使用提高了肝细胞癌患者的检出率(AUC＝0.9098，P<0.0001)，灵敏度为84.29％，特异度为84.29％。

如图3所示，ROC曲线分析结果表明，血浆LINC00485的水平可用于区分肝细胞癌患者和癌前病变患者(AUC＝0.8039，P<0.0001)，灵敏度为75.71％，特异度为71.43％。血浆AFP的水平可用于区分肝细胞癌患者和癌前病变患者(AUC＝0.6968，P＝0.0014)，灵敏度为62.86％，特异度为70％。且血浆AFP和LINC00485的联合使用提高了肝细胞癌患者的检出率(AUC＝0.8571，P<0.0001)，灵敏度为92.86％，特异度为64.29％。

如图4所示，ROC曲线分析结果表明，血浆LINC00485的水平可用于区分癌前病变患者和正常对照者(AUC＝0.6551，P＝0.0015)，灵敏度为54.29％，特异度为72.86％。

AFP检测试剂具体可采用现有中常用的检测试剂盒；血浆AFP的水平可用于区分癌前病变患者和正常对照者(AUC＝0.5844，P＝0.0848)，灵敏度为31.43％，特异度为98.57％。

且血浆AFP和LINC00485的联合使用提高了癌前病变患者的检出率(AUC＝0.6749，P＝0.0004)，灵敏度为42.86％，特异度为92.86％。

综上所述，本发明通过开展实验首次发现血浆LINC00485的表达与HCC的发生密切相关。研究结果表明，从健康者到癌前病变患者(包括乙肝患者和肝硬化患者)到进一步发展为HCC患者，血浆LINC00485的表达水平逐渐升高，血浆LINC00485的表达水平可用于区分HCC患者与健康对照者，具有较高的诊断价值，且血浆LINC00485与血浆AFP的联合使用可提高HCC患者的检出率，进一步证明了LINC00485可作为一种有效的HCC辅助诊断血液分子标志物。同时本发明将该HCC辅助诊断血液分子标志物的引物用于制备HCC辅助诊断的试剂盒中，检测HCC辅助诊断血液分子标志物—LINC00485的表达水平，从而使HCC的诊断更加方便易行。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 武汉大学中南医院

<120> LINC00485作为分子标志物在制备用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctccatcac cccctgttct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgagccgttt tgtggactgt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtctcctct gacttcaaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgagggtct ctctcttcct 20

Claims (10)

1.LINC00485作为分子标志物在制备用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品包括LINC00485分子标志物的检测试剂和/或检测引物和/或检测试剂盒。

3.一种LINC00485分子标志物的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括试剂A、试剂B和试剂C中的至少一种：

试剂A、血浆标本RNA提取试剂；

试剂B、逆转录反应试剂；

试剂C、实时荧光定量PCR试剂。

4.一种LINC00485分子标志物的检测引物，其特征在于，所述的引物的序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。

5.一种LINC00485分子标志物的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述的检测引物。

6.根据权利要求5所述的一种LINC00485分子标志物的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括：用于均一化的内参引物、阳性对照模板、阴性对照模板和qPCR反应常规试剂。

7.根据权利要求6所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述用于均一化的内参引物为以GAPDH为内参的引物，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。

8.根据权利要求6所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照模板为经测序验证过的LINC00485 PCR扩增产物；所述阴性对照模板为去离子水；所述qPCR反应常规试剂包括SYBR-Green I Premix Ex Taq。

9.一种用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品，其特征在于，包括：

权利要求3所述的LINC00485分子标志物的检测试剂；

和/或权利要求4所述的LINC00485分子标志物的检测引物；

和/或权利要求4所述的LINC00485分子标志物的实时荧光定量PCR试剂盒。

10.根据权利要求9所述的用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品，其特征在于，所述用于诊断和/或预后肝细胞癌的产品还包括：AFP检测试剂。

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