CN112553343A - 肝细胞癌辅助诊断的血液分子标志物及其引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅助诊断肝细胞癌的血液分子标志物及其引物和应用，属于生物医学检测领域。本发明将LINC00221作为一种有效的肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物，其血浆表达水平对于肝细胞癌患者具有较高的诊断价值，且其与血浆AFP的联合使用可提高肝细胞癌患者的检出率。同时利用检测此肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物表达水平的引物可制备肝细胞癌辅助诊断的试剂盒，检测此肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物的表达水平，从而使肝细胞癌的诊断更加方便易行。使用本发明的血液分子标志物辅助诊断肝细胞癌，其灵敏度、特异度均达到80％以上。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种肝细胞癌辅助诊断的血液分子标志物及其引物和应用。
背景技术
原发性肝癌是世界范围内常见的恶性疾病，其发病率居恶性肿瘤第六位，死亡率居癌症相关死亡率的第二位。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌的主要病理类型。由于早期诊断率低，HCC往往在晚期才被发现，对人类生命构成极大威胁。北美HCC患者的5年生存率约为19％，在中国HCC患者的5年生存率为12％，目前迫切需要一种可靠的HCC早期诊断方法。近年研究表明，广泛用于HCC诊断的生物标志物-甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)在预测早期肝癌方面存在一定不足。因此，识别新型的生物标志物对于肝癌的及时、早期诊断非常重要。
随着基因组学的发展，越来越多的非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)，尤其是长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)，已被证实参与肿瘤发生发展的各种生物学过程，在辅助HCC的早期诊断中有广泛的应用前景，可作为非侵入性的血液分子标志物。
本发明发现HCC患者的血浆lncRNA LINC00221表达水平显著高于癌前病变患者和正常对照者，且血浆LINC00221具有较高的诊断价值，可作为HCC辅助诊断的新型血液分子标志物。
发明内容
针对目前肝细胞癌诊断的现状，本发明的目的是提供一种肝细胞癌辅助诊断的血液分子标志物及其引物和应用，即是血浆分子标志物LINC00221在肝细胞癌患者诊断中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了一种新型肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物，所述标志物为LINC00221。
本发明的第二方面，提供了一种上述新型肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物在制备用于肝细胞癌辅助诊断的试剂盒中的应用。所述标志物LINC00221的表达水平升高，提示患者患有肝细胞癌。
本发明的第三方面，提供了上述新型肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物与AFP联用在制备用于肝细胞癌辅助诊断的试剂盒中的应用。
本发明的第四方面，提供了一种检测上述新型肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物表达水平的引物。进一步地，所述的引物序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示。SEQ NO.1为GCAGTAACTGTTGGTTGGGATG，SEQ NO.2为CAGGCTTACAAGTGTCTTAGTCCAG。
本发明的第五方面，提供了一种上述检测新型肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物表达水平的引物在制备用于肝细胞癌辅助诊断的试剂盒中的应用。
进一步地，所述用于肝细胞癌辅助诊断的试剂盒，用于检测所述新型肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物的表达水平。更进一步地，利用所述序列如SEQ NO:1和SEQ NO:2所示的引物制备用于HCC辅助诊断的试剂盒，检测LINC00221在HCC患者中的表达水平。
更进一步地，所述用于肝细胞癌辅助诊断的试剂盒包含：检测上述新型肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物表达水平的引物；还可以包含以下成分中的一种或多种：
(1)血浆标本RNA提取所需的试剂；
(2)逆转录反应所需的试剂；
(3)实时荧光定量PCR所需的试剂。
其中，上述血浆标本RNA提取所需的试剂来自血浆RNA提取试剂盒；上述逆转录反应所需的试剂来自逆转录试剂盒；上述实时荧光定量PCR所需的试剂包含内参GAPDH上游引物和下游引物、SYBR染料和无酶水等。
更进一步地，所述用于肝细胞癌辅助诊断的试剂盒，还可以包含检测AFP表达水平的试剂。
与目前肝细胞癌诊断技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过开展实验首次发现血浆LINC00221的表达与HCC的发生密切相关。研究结果表明，从健康者到癌前病变患者(包括乙肝患者和肝硬化患者)到进一步发展为HCC患者，血浆LINC00221的表达水平逐渐升高，血浆LINC00221的表达水平可用于区分HCC患者与健康对照者，具有较高的诊断价值，且血浆LINC00221与血浆AFP的联合使用可提高HCC患者的检出率，进一步证明了LINC00221可作为一种有效的HCC辅助诊断血液分子标志物。同时本发明将该HCC辅助诊断血液分子标志物的引物用于制备HCC辅助诊断的试剂盒中，检测HCC辅助诊断血液分子标志物—LINC00221的表达水平，从而使HCC的诊断更加方便易行。具体如下：
1、本发明将LINC00221作为一种有效的肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物，其血浆表达水平与HCC的发生发展密切相关；
2、本发明将血浆LINC00221的表达水平用于辅助诊断肝细胞癌患者，其与血浆AFP的联合使用可提高肝细胞癌患者的检出率。
3、本发明提供检测肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物LINC00221表达水平的引物，利用所述引物可检测患者血浆中LINC00221的表达水平，从而使肝细胞癌的诊断更加方便易行。
4、本发明提供检测肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物LINC00221表达水平的引物的应用，利用所述引物可制备肝细胞癌辅助诊断的试剂盒，从而快速方便的检测LINC00221在患者血浆中的表达水平。
单独检测血浆LINC00221的表达水平区分肝细胞癌患者和正常对照者，灵敏度、特异度均达到80％以上；联合检测血浆LINC00221的表达水平和AFP的水平区分肝细胞癌患者和正常对照者，灵敏度达到90％以上，特异度接近90％。
附图说明
图1为本发明实施例中健康对照者、癌前病变患者(包括乙肝患者和肝硬化患者)及肝细胞癌患者血浆LINC00221的表达水平比较。
图2为本发明实施例中血浆LINC00221及血浆AFP单独及联合使用在鉴别健康对照者与肝细胞癌患者时的ROC曲线；
图3为本发明实施例中血浆LINC00221及血浆AFP单独及联合使用在鉴别癌前病变患者(包括乙肝患者和肝硬化患者)与肝细胞癌患者时的ROC曲线。
图4为本发明实施例中血浆LINC00221及血浆AFP单独及联合使用在鉴别健康对照者与癌前病变患者(包括乙肝患者和肝硬化患者)时的ROC曲线。
具体实施方式
通过以下实施例的详细说明并结合附图可以帮助深入理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法或常规条件，或按照制造商所建议的条件。
【实施例】肝细胞癌患者血浆LINC00221表达水平异常升高
一、实验对象
收集了2018年9月至2019年10月就诊于武汉大学中南医院的83例肝细胞癌患者、70例癌前病变患者(包括乙肝患者和肝硬化患者)和77例健康对照者的EDTA抗凝血标本及临床信息。收集的血液标本于4℃离心机中12000rpm离心15min后分离血浆，置于-80℃保存。所纳入的患者均依据其病理报告诊断，肿瘤分期的判断参考美国癌症联合委员会(AJCC)第七版癌症分期手册。
所有实验设计及流程均获得武汉大学中南医院伦理委员会批准。
二、实验方法
1.血浆标本RNA提取及检测
使用Bioteke的血浆RNA提取试剂盒提取血浆标本RNA，具体步骤如下：
(1)收集约2mL EDTA抗凝的全血于2mL无酶Ep管中，于4℃离心机中12000rpm离心15min，此时标本分三层。
(2)吸取300μL上层血浆至一新的2mL无酶Ep管中，以1:3的比例加入900μL裂解液RLS，充分吹打混匀后涡旋震荡，此时可继续进行下一步或置于-20℃保存。避免反复冻融。
(3)每1mL的裂解液RLS中加入200μL的氯仿，用力剧烈震荡15s后再涡旋振荡，随后室温放置3min。
(4)于4℃离心机中12000rpm离心10min，样品分三层：上层、中间层和下层。RNA存在于上层水相中。吸取上层水相至一新的2mL无酶Ep管中。
(5)加入等量的70％乙醇，轻轻颠倒混匀后将液体全部加入吸附柱RA中(吸附柱置于收集管中)。
(6)于4℃离心机中10000rpm离心45s，弃掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
(7)加入500μL漂洗液RW，于4℃离心机中12000rpm离心1min，弃掉废液，吸附柱重新放入收集管中，于4℃离心机中12000rpm空离2min。
(8)加入500μL去蛋白液RE，室温放置2min后，12000rpm离心45s，弃掉废液，吸附柱重新放入收集管中。
(9)加入500μL漂洗液RW，于4℃离心机中12000rpm离心1min，弃掉废液，吸附柱重新放入收集管中。
(10)于4℃离心机中12000rpm空离2min。
(11)剪掉吸附柱盖子，将吸附柱放入新的2mL无酶Ep管中，根据样本所含RNA含量的高低在吸附膜的正中央选择加入不同含量(30-80μL)的DEPC水(DEPC水需事先于水浴锅中加热至65℃-70℃左右)，室温静置2min，12000rpm离心1min。为使得RNA浓度提高，离心后可将Ep管中的液体吸出，再次垂直加入到吸附膜的正中央位置，室温静置2min，12000rpm离心1min。
(12)采用NanoDrop 2000对提取的RNA浓度进行检测，使用1μL DEPC将检测孔清洗3次后，加入1μL DEPC水调零，随后加入1μL待检测的RNA样本，观察RNA浓度及纯度，良好的RNA样本其OD260/OD280在1.8-2.1之间，曲线无双峰。
(13)提取的RNA可直接进行逆转录或置于-80℃保存。
2.逆转录
使用Takara的PrimeScriptTM RT试剂盒进行逆转录，步骤如下：
(1)RNA的变性：取6μL上述提取的RNA至一新的200μL Ep管中(冰上操作)，离心10-15s后，在普通PCR仪上运行如下程序65℃5min，4℃∞，运行完成后立即置于冰上冷却。
(2)去除基因组DNA：为避免上述提取的RNA中混杂有DNA，需去除基因组DNA。向上述含有6μL RNA的Ep管中加入2μL已添加gDNA Remover的4×DN Master Mix(冰上操作)，混匀后离心10-15s，在普通PCR仪上运行如下程序37℃5min，4℃∞，运行完成后立即置于冰上冷却。
(3)逆转录反应：向上述反应液中加入2μL 5×的RT Master Mix II(冰上操作)，混匀后点离10-15s，在普通PCR仪上运行如下程序37℃15min，50℃5min，98℃5min，4℃∞，运行完成后立即置于冰上冷却；此时RNA已逆转为cDNA，可直接使用或置于-20℃保存。
3.实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)：
(1)引物序列：LINC00221和GAPDH的引物序列如下表1：
表1
| LINC00221上游引物 | 5'-GCAGTAACTGTTGGTTGGGATG-3'(SEQ NO.1) |
| LINC00221下游引物 | 5'-CAGGCTTACAAGTGTCTTAGTCCAG-3'(SEQ NO.2) |
| GAPDH上游引物 | 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'(SEQ NO.3) |
| GAPDH下游引物 | 5'-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3'(SEQ NO.4) |
(2)反应体系：qPCR所用试剂盒为CWBIO公司的SYBR-Green I Premix Ex Taq，反应体系按照9：1的比例进行加样(即试剂加18μL，cDNA模板加2μL)。对于每个样本，内参GAPDH和目的lncRNA LINC00221同时检测，且均做2个复孔。实验所用的仪器为Bio-Rad CFX96，具体反应体系如下表2：
表2
| 成分 | 用量 |
| SYBR-Green I Premix Ex Taq | 10μL |
| Forward primer(2μM) | 0.8μL |
| Reverse primer(2μM) | 0.8μL |
| RNase-free water | 6.4μL |
| cDNA | 2μL |
(3)Real-time qPCR：注意全程在冰上操作，且避免外源DNA的污染。加样完成后离心10-15s，在qPCR仪上运行如下程序95℃5min，95℃30sec、60.7℃30sec、72℃30sec，除第一步外，其余共计40个循环。运行完成后，通过观察溶解曲线，判断是否有引物二聚体形成以及非特异性扩增。Ct值是指反应管中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，反映了样本所含的起始拷贝数。起始拷贝数越少，Ct越大，反之则越小。对于每个样品来说，LINC00221的实际Ct值为其两个复孔Ct的平均值，GAPDH的实际Ct值为其两个复孔Ct的平均值，通过计算Ct LINC00221-Ct GAPDH，得出ΔCt。qPCR运行完成后的8联管可置于4℃保存。
4.统计分析：
运用受试者工作特征曲线(Receiver-operator characteristic,ROC)评估了血浆LINC00221在肝细胞癌中的诊断价值。所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.0和IBMSPSS Statistics26.0进行。以P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
如图1所示，肝细胞癌患者的血浆LINC00221表达水平显著高于癌前病变患者和正常对照者(P<0.0001)。
如图2所示，ROC曲线分析结果表明，血浆LINC00221的水平可用于区分肝细胞癌患者和正常对照者(AUC＝0.8771，P<0.0001)，灵敏度为82.19％，特异度为84.62％。血浆AFP的水平可用于区分肝细胞癌患者和正常对照者(AUC＝0.7731，P<0.0001)，灵敏度为64.38％，特异度为100％。且血浆AFP和LINC00221的联合使用提高了肝细胞癌患者的检出率(AUC＝0.9368，P<0.0001)，灵敏度为93.15％，特异度为88.46％。
如图3所示，ROC曲线分析结果表明，血浆LINC00221的水平可用于区分肝细胞癌患者和癌前病变患者(AUC＝0.7732，P<0.0001)，灵敏度为54.79％，特异度为92.31％。血浆AFP的水平可用于区分肝细胞癌患者和癌前病变患者(AUC＝0.6679，P＝0.0014)，灵敏度为53.42％，特异度为78.85％。且血浆AFP和LINC00221的联合使用提高了肝细胞癌患者的检出率(AUC＝0.7777，P<0.0001)，灵敏度为54.79％，特异度为92.31％。
如图4所示，ROC曲线分析结果表明，血浆LINC00221的水平可用于区分癌前病变患者和正常对照者(AUC＝0.6679，P＝0.0032)，灵敏度为53.85％，特异度为78.85％。血浆AFP的水平可用于区分癌前病变患者和正常对照者(AUC＝0.6024，P＝0.0717)，灵敏度为46.15％，特异度为100％。且血浆AFP和LINC00221的联合使用提高了癌前病变患者的检出率(AUC＝0.7385，P<0.0001)，灵敏度为65.38％，特异度为84.62％。
综上所述，本发明通过开展实验首次发现血浆LINC00221的表达与HCC的发生密切相关。研究结果表明，从健康者到癌前病变患者(包括乙肝患者和肝硬化患者)到进一步发展为HCC患者，血浆LINC00221的表达水平逐渐升高，血浆LINC00221的表达水平可用于区分HCC患者与健康对照者，具有较高的诊断价值，且血浆LINC00221与血浆AFP的联合使用可提高HCC患者的检出率，进一步证明了LINC00221可作为一种有效的HCC辅助诊断血液分子标志物。同时本发明将该HCC辅助诊断血液分子标志物的引物用于制备HCC辅助诊断的试剂盒中，检测HCC辅助诊断血液分子标志物—LINC00221的表达水平，从而使HCC的诊断更加方便易行。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 肝细胞癌辅助诊断的血液分子标志物及其引物和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagtaactg ttggttggga tg 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggcttaca agtgtcttag tccag 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtctcctct gacttcaaca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgagggtct ctctcttcct 20
Claims (10)
1.一种肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物，其特征在于：所述的标志物为LINC00221。
2.权利要求1所述的肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物在制备用于肝细胞癌辅助诊断的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物在肝细胞癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于：与健康对照者相比，所述标志物LINC00221的表达水平升高，提示患者患有肝细胞癌。
4.权利要求1所述的肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物与AFP联用在制备用于肝细胞癌辅助诊断的试剂盒中的应用。
5.一种引物，其特征在于：所述的引物用于检测权利要求1所述的肝细胞癌辅助诊断血液分子标志物的表达水平。
6.根据权利要求5所述的引物，其特征在于：所述的引物的序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示。
7.权利要求5或6所述的引物在制备用于肝细胞癌辅助诊断的试剂盒中的应用。
8.一种用于肝细胞癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于：包含权利要求5或6所述的引物。
9.根据权利要求8所述的用于肝细胞癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于：包含以下成分中的一种或多种：
(1)血浆RNA提取所需的试剂；
(2)逆转录反应所需的试剂；
(3)实时荧光定量PCR所需的试剂。
10.根据权利要求8或9所述的用于肝细胞癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于：包含检测AFP的试剂。
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-
2021
- 2021-01-05 CN CN202110009260.5A patent/CN112553343A/zh active Pending
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