CN114645043B - 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用 - Google Patents

用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114645043B
CN114645043B CN202111539702.3A CN202111539702A CN114645043B CN 114645043 B CN114645043 B CN 114645043B CN 202111539702 A CN202111539702 A CN 202111539702A CN 114645043 B CN114645043 B CN 114645043B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
primers
probe
probes
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111539702.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114645043A (zh
Inventor
刘丹
叶竹佳
杨昊
陈思宇
李镭
李为民
陈志伟
范建兵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AnchorDx Medical Co Ltd
Original Assignee
AnchorDx Medical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AnchorDx Medical Co Ltd filed Critical AnchorDx Medical Co Ltd
Publication of CN114645043A publication Critical patent/CN114645043A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114645043B publication Critical patent/CN114645043B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，所述DNA甲基化分子标记物组合为所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示序列或其完全互补序列中的任意两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示序列或其完全互补序列的全长的至少55％的连续片段中的任意两种以上的组合。本发明还提供了上述DNA甲基化分子标记物组合的检测试剂盒和检测方法。所述DNA甲基化分子标记物组合与肺癌高度相关，对肺结节良恶性的检测具有高度灵敏度和特异性，能提高恶性肺结节的检出率，降低检出的假阳性率。所述试剂盒中的引物和探针克服了多个引物和探针在进行多重PCR扩增和检测时存在相互干扰的缺点，定量性能与单个区域定量等同。

Description

用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用
本发明要求2020年12月17日提交的名称为《检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物及其组合和应用》的中国专利申请CN2020114961847的优先权，该发明的内容通过援引合并于此；本发明还要求2021年04月13日提交的名称为《检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物及其组合和应用》的PCT/CN2021/086902的PCT申请的优先权，该发明的部分内容通过援引合并于此。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用，所述应用包括检测试剂盒及检测方法。
背景技术
肺结节，即孤立性肺结节(solitary pulmonary nodule)是指影像为类圆形阴影、单一的、边界清楚的、直径小于或等于3cm、周围为含气肺组织所包绕的高低密度的实性或者亚实性病变，不伴肺不张、肺门肿大或胸腔积液。其常侵犯肺、双侧肺门淋巴结、眼、皮肤等器官，其胸部受侵率高达80％～90％。相当多的肺结节不能排除早期恶性肿瘤的可能性。
肺结节通常分为良性和恶性两类，但不管是良性还是恶性都常无明显症状，良性结节需要针对病因治疗，恶性需要早期手术。良性肺结节的病因常与自身性免疫疾病或各种感染相关，恶性肺结节的病因常与肺癌相关。
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。然而，在肺癌发生早期对病人进行治疗，是能够有效的提高其五年生存率。统计研究数据发现，I期肺癌患者在接受有效的治疗后，其五年生存率可达到60％～90％以上，而晚期肺癌患者的五年生存率却不足20％。因此，对早期癌症患者的诊断和治疗，显得尤为重要。目前，临床上使用的肺癌检测方法有：影像学检测、细胞学检测和分子标记物检测。
其中，肺癌分子标记物检测的检测样本主要来源于组织活检和液体活检。组织样本主要通过外科手术或纤维支气管镜刷片直接从肿瘤部位取得，因此其检测的准确性更高，然而因组织活检具有一定的侵入性，肿瘤异质性的存在及由于种种原因而无法取得组织标本或者组织标本量不足以完成分子检测，使得组织活检在肺癌的早期诊断、预测转移以及预后等方面的作用存在一定的局限性。相对于组织活检，液体活检具有操作简便、非侵入性、重复性强和利于疾病的动态监测等优势。肺癌液体活检以患者的血液、痰液和肺泡灌洗液等为标本，对其中的肿瘤细胞DNA及其修饰水平，如DNA甲基化等，进行检测和分析。对于癌症患者，因其血液中的ctDNA含量很低且个体差异较大，提高灵敏性是该检测方法面临的一个巨大挑战。而痰液和肺泡灌洗液采集，临床可以通过雾化诱导咳痰收集痰液，以及纤维支气管镜获得肺泡灌洗液，因样本直接来源于肺部，在信号检测的灵敏度上会较血液样本更有优势。在样本采集方式上，痰液的收集为无创操作，更为安全；纤维支气管镜收集肺泡灌洗术(bronohoalveolarlavage,BAL)是利用支气管镜向支气管肺泡内注人生理盐水并随即吸出，收集肺泡表面有效液体，检查其细胞成分和可溶性物质的一种方法。相对于经皮肺穿刺和外科手术活检是一类安全性较高的微创活检方法。
DNA甲基化与癌症的发生密切相关，尤其是CpG岛区的启动子超甲基化可能会导致抑癌基因转录沉默，从而影响肿瘤发生的进程，由于DNA甲基化几乎在所有癌症中均有发现，并且发生在癌前或者癌症早期阶段，因而是癌症诊断的理想标志物或者其组合。
通过寻找基于肺癌呼吸道样本特异性DNA甲基化生物分子标记物，联合检测多个与肺癌相关的分子标记物的组合，可增强肺癌的检出率，这对检测肺结节良恶性起到了关键作用。
本发明的发明人，一直致力于寻找能很好实现检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，在逐步加深的研究中，进一步寻找一些能很好地适用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或者其组合，以期能实现能能高灵敏度和特异性对肺结节良恶性的检测，特别是还能针对呼吸道液体样本实现加高灵敏度检测，从而为肺癌特别是早期肺癌的无创诊断提供技术支持。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一种用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，所述DNA甲基化分子标记物组合对肺结节良恶性的检测具有非常好的灵敏度和特异性，能有效提高恶性肺结节的检出率。
实现上述目的的技术方案包括以下。
本发明的第一方面，提供了一种可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示序列或其完全互补序列中的任意两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示序列或其完全互补序列的全长的至少55％的连续片段中的任意两种以上的组合。
在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合包括SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.5所示序列或其完全互补序列的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示序列或其完全互补序列的全长的至少55％的连续片段中的组合。
以上所示序列全长的至少55％的连续片段，可以是序列全长至少55％的，也可以至少是58％、至少是60％、至少是65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％等的连续片段。
在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.5所示序列全长的至少55％的连续片段分别为：
以引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.1中所对应的序列；
和/或，以引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.2中所对应的序列；
和/或，以引物为SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.3中所对应的序列；
和/或，以引物为SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.4中所对应的序列；
和/或，以引物为SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.5中所对应的序列。
在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.5所示序列全长的至少55％的连续片段分别为：
以引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所扩增的片段在SEQ ID NO.1中所对应的序列；
和/或，以引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所扩增的片段在SEQ ID NO.2中所对应的序列；
和/或，以引物为SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所扩增的片段在SEQ ID NO.3中所对应的序列；
和/或，以引物为SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所扩增的片段在SEQ ID NO.4中所对应的序列；
和/或，以引物为SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所扩增的片段在SEQ ID NO.5中所对应的序列。
在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合为针对呼吸道样本的分子标记物。
在其中一些实施例中，所述呼吸道样本为肺部组织样本或呼吸道液体样本。
本发明的第二方面，提供了SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示序列中的任意两种以上的组合作为肺癌相关甲基化分子标记物在检测肺结节良恶性、和/或早期肺癌中的应用；或检测上述甲基化分子标记物组合的甲基化水平的试剂在制备检测肺结节良恶性、早期肺癌的试剂盒中应用。
本发明的第三方面，提供了一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测上述DNA甲基化分子标记物组合的甲基化水平的试剂。
在其中一些实施例中，所述试剂盒可以用于以下检测平台：包括采用PCR扩增法、荧光定量PCR法、数字PCR法、液相芯片法、代测序法、三代测序法二代测序法、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、简化亚硫酸氢盐测序技术或它们的组合所使用的试剂。在一些优选的实施例中，所述检测方法为PCR扩增检测、荧光定量PCR检测、数字PCR检测、芯片检测。
在其中一些实施例中，所述试剂盒中检测上述DNA甲基化分子标记物组合的甲基化水平的试剂包括针对DNA甲基化分子标记物的荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物和探针为：
SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示引物，以及SEQ ID NO.8所示探针；SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示引物，以及SEQ ID NO.11所示探针；SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示引物，以及SEQ ID NO.14所示探针；
和/或，针对SEQ ID NO.2的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.15和SEQID NO.16所示引物，以及SEQ ID NO.17所示探针；SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示引物，以及SEQ ID NO.20所示探针；SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示引物，以及SEQ ID NO.23所示探针；
和/或，针对SEQ ID NO.3的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.24和SEQID NO.25所示引物，以及SEQ ID NO.26所示探针；SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示引物，以及SEQ ID NO.29所示探针；SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示引物，以及SEQ ID NO.32所示探针；
和/或，针对SEQ ID NO.4的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.33和SEQID NO.34所示引物，以及SEQ ID NO.35所示探针；SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37所示引物，以及SEQ ID NO.38所示探针；SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示引物，以及SEQ ID NO.41所示探针；
和/或，针对SEQ ID NO.5的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.42和SEQID NO.43所示引物，以及SEQ ID NO.44所示探针；SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示引物，以及SEQ ID NO.47所示探针；SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49所示引物，以及SEQ ID NO.50所示探针；
或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
其中一些优选的实施例中，所述引物和探针为：
以引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所扩增的片段在SEQ ID NO.1中所对应的序列；
和/或，以引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所扩增的片段在SEQ ID NO.2中所对应的序列；
和/或，以引物为SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所扩增的片段在SEQ ID NO.3中所对应的序列；
和/或，以引物为SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所扩增的片段在SEQ ID NO.4中所对应的序列；
和/或，以引物为SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所扩增的片段在SEQ ID NO.5中所对应的序列；
或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包含针对内参基因ACTB的荧光定量PCR检测的引物和探针，优选地，所述引物和探针为：SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示引物，以及SEQ ID NO.53所示探针。
在其中一些实施例中，所述试剂盒的检测样本为呼吸道样本。
在其中一些实施例中，所述呼吸道样本为肺部组织样本或呼吸道液体样本。
本发明的第四方面，提供了上述DNA甲基化分子标记物组合的甲基化水平检测方法，包括以下步骤：
(1)从待测样本中提取基因组DNA；
(2)对提取获得的基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，得到转化后的DNA；
(3)用针对上述DNA甲基化分子标记物的扩增引物对转化后的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；
(4)步骤(3)获得的多重PCR产物用针对上述DNA甲基化分子标记物的探针进行多重荧光定量PCR检测。
本发明的第五方面，还提供了一种检测肺结节良恶性的方法，包括以下步骤：
(1)利用上述检测方法对上述DNA甲基化分子标记物的甲基化水平进行检测；
(2)通过内参基因CT值判断样本是否有效，然后用内参基因CT值对有效样本中检测的每个分子标记物的CT值进行校正；
(3)将校正后的数据进行模型分析，最后进行肺结节良恶性的判断。
本发明找到了与肺癌高度相关的DNA甲基化特异性的分子标记物的组合，通过检测该组合的甲基化水平可以检测肺结节良恶性，具有高度的灵敏度和特异性，提高对肺结节良恶性的检测的灵敏度和特异性，能有效提高早期恶性肺结节的检出率，及早进行治疗和干预，提高患者生存率；同时降低检出的假阳性率，避免良性肺结节的过度诊疗。本发明提供的DNA甲基化分子标记物尤其适用于呼吸道样本，特别是通过微创或无创手段获取的呼吸道液体样本，可以实现肺结节无创检测。
本发明设计了所述DNA甲基化分子标记物的荧光定量PCR检测引物和探针，通过引物对经过亚硫酸氢盐处理的DNA进行多重PCR时，每个DNA甲基化分子标记物均能得到有效扩增和富集；后续对多重PCR产物进行多重荧光定量PCR检测时，相应DNA甲基化分子标记物在多重荧光定量PCR检测中获得的CT值与该DNA甲基化分子标记物单独进行荧光定量PCR反应的CT值没有显著差异，定量性能与单个区域定量等同，克服了多个引物和探针在进行多重PCR扩增和检测时存在相互干扰的缺点。所述试剂盒经过优化，针对不同DNA甲基化分子标记物的引物和探针相互之间没有干扰，可成功实现多重PCR扩增和多重荧光定量PCR检测，有效提高检测效率。
附图说明
图1是实施例4中本发明所述5个甲基化分子标记物组合的ROC曲线图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明提供的用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物为针对5个检测基因GHSR、HOXA11、HOXB4、LHX9、和PTGER4中的5个甲基化区域的组合，所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示序列或其完全互补序列中的任意两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示序列全长或其完全互补序列的至少55％的连续片段中的任意两种以上的组合。
在以下实施例中，SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所述DNA甲基化分子标记物相应记载的Marker，以及相应引物扩增的对应的Marker。
本发明的一个实施方式中，包括适用于呼吸道样本检测肺结节良恶性的5个DNA甲基化分子标记物的甲基化检测区域的任意者两种以上的组合。
本发明的一个实施方式中，涉及了对上述DNA甲基化分子标记物组合的检测试剂在制备检测肺结节良恶性的试剂盒中的用途。
本发明的一个实施方式中，涉及了一种检测肺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测上述DNA甲基化分子标记物组合的甲基化水平的试剂。所述试剂盒可以适用于PCR扩增、荧光定量PCR诊断、数字PCR(digital PCR)或者检测芯片等检测平台，最好是能实现高通量检测的平台。
本发明针对上述特定甲基化区域的DNA甲基化分子标记物组合的每个标记物进行了引物与探针设计，利用所述的DNA甲基化分子标记物组合的扩增引物，对从呼吸道样本中提取的并经过亚硫酸氢盐处理后的基因组DNA(gDNA)进行多重PCR扩增；再利用该DNA甲基化分子标记物的特异性探针对此检测区域的甲基化信号进行荧光定量PCR检测，然后采用朴素贝叶斯算法建立良恶性预测模型，最后通过建立的模型对肺结节的良恶性进行诊断。
本发明提供的针对所述DNA甲基化分子标记物的检测方法通过引入多重PCR扩增，能有效对目标分子进行富集，在放大检测信号的同时也能进行多个分子标记物的联合检测，提高检测灵敏度和检测效率，能增强对肺癌的检出率以及肺结节良恶性检测的准确率。
本发明的一些实施例中，还提供了上述DNA甲基化分子标记物组合的甲基化水平检测方法，包括以下步骤：
(1)从待测样本中提取基因组DNA；
(2)对提取获得的基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，得到转化后的DNA；
(3)用针对上述DNA甲基化分子标记物的扩增引物对转化后的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；
(4)步骤(3)获得的多重PCR产物用针对上述DNA甲基化分子标记物的探针进行多重荧光定量PCR检测。
在其中一些实施例中，所述多重PCR反应条件如下：98℃30s；15-35个循环：98℃15s，58℃～66℃15～30s；72℃15～30s；72℃5min；和/或，所述荧光定量PCR反应条件如下：95℃30s；35～50个循环：95℃10s；60℃～64℃30s。
在其中一些实施例中，所述步骤(2)中若内参基因的CT值在10-25之间，则该样本判断为有效样本；反之，则为无效样本；然后用内参基因CT值对有效样本中的每个DNA甲基化分子标记物的CT值进行校正；若目标DNA甲基化分子标物CT值<40判断该DNA甲基化分子标记物被检出，得到该目标DNA甲基化分子标记物的相对循环数ΔCT：ΔCT＝目标DNA甲基化分子标记物CT值-内参基因CT值；若目标DNA甲基化分子标物CT值为“Undertermined”则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出，则赋予其ΔCT＝30。
在其中一些实施例中，所述步骤(3)中根据校正后的ΔCT值进行数据分析后，采用逻辑回归(Logistic Regression)算法建立肺结节良恶性预测模型。在模型构建过程中，使用交叉验证方法(Cross-validation)，将数据集随机分成3等份，并取其中任意2份合并作为训练集，剩余的1份作为测试集，则对于任意一个3等分的划分，根据组合原理可以得到3个不同的训练-测试集组合，然后针对训练集里含有不同DNA甲基化分子标记物的组合采用逻辑回归算法建立良恶性预测模型，并在含有特定的DNA甲基化分子标记物组合的测试集中评估模型的分类能力。按照上述步骤进行100次随机且相互独立的试验，最终含有特定DNA甲基化分子标记物的模型的分类能力，由100个模型的平均分类能力决定。
以下通过具体实施例，对本发明进行进一步的阐述，但不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
一个用于呼吸道样本检测肺结节良恶性的试剂盒，包含了5个检测基因GHSR、HOXA11、HOXB4、LHX9、和PTGER4中的5个甲基化区域的DNA甲基化分子标记物Marker1至Marker5的检测引物和探针，各DNA甲基化分子标记物的检测区域序列及序列编号具体如表1所示(其中每个区域下划线部分为本发明以下实施例中优选所用引物扩增的片段的对应序列的Marker)：
表1分子标记物检测区域序列
Figure BDA0003413614010000071
所述试剂盒针对5个用于呼吸道样本检测肺结节良恶性的分子标记物Marker1至Marker5中的特异性甲基化位点各设计了三对引物和三条探针(探针荧光标记可采用FAM、VIC及NED等荧光基团标记)，并分别标记为组合1、2、3。其中，每个分子标记物中被选择的引物和探针组合，可任意选择与其他分子标记物中的引物和探针的组合1、2、3进行组合并在同一平台进行检测。具体的各分子标记物对应的引物和探针序列如表2所示：
表2.相关分子标记物的引物和探针序列
Figure BDA0003413614010000072
Figure BDA0003413614010000081
本实施例和以下实施例中，优选所用的引物和探针组合都为如下所示：Marker1的引物和探针组合1，Marker2的引物和探针组合3，Marker3的引物和探针组合1，Marker4的引物和探针组合1，Marker5的引物和探针组合2。
所述试剂盒还包含内参基因ACTB的引物和探针，其序列具体如表3所示：
表3.内参基因ACTB引物和探针
Figure BDA0003413614010000091
实施例2
本实施例利用实施例1所述试剂盒对呼吸道样本中Marker1至Marker5的甲基化水平进行检测。
一种DNA甲基化分子标记物的甲基化水平检测方法，包括以下步骤：
1、呼吸道样本中gDNA的提取：
1)对呼吸道液体样本gDNA提取：先将呼吸道液体样本进行低速离心处理，4℃，5000g，5min；去上清，收集沉淀；然后按照Qiagen公司的
Figure BDA0003413614010000092
Blood&Tissue Kit说明书进行操作提取gDNA；
2)如果是肺组织石蜡切片样本的gDNA提取，可按照以下方法：石蜡组织gDNA提取具体操作步骤按照Qiagen公司的ALLPrep DNA/RNA FFPE Kit说明书进行。
2、对提取的gDNA进行亚硫酸盐转化
将提取的gDNA进行亚硫酸氢盐转化，投入50-100ng gDNA，本实施例优选在75ng,按照Zymo DNA Methylation-Direct MagPrep说明书进行操作,使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。经过亚硫酸氢盐转化后的DNA产物全部用于进行多重PCR扩增。
3、对转化后的DNA进行多重PCR扩增
转化后的DNA产物全部进行多重PCR扩增，其中的反应组分为：将分子标记物组合及1个内参基因的引物混合液，其中每条引物浓度在200nM-300nM，本实施例优选300nM；镁离子的浓度在1-3mM，本实施例优选在1.5mM；dNTP混合液浓度在200-600uM，本实施例优选在400uM；反应酶为
Figure BDA0003413614010000093
Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase(NEB,Cat#
M0515)，一个反应的单位数为1-3U，本实施例优选2U。多重PCR反应体系配制如表4：
表4.多重PCR反应体系
Figure BDA0003413614010000094
Figure BDA0003413614010000101
具体反应条件为：预变性，98℃，30s；5-10个循环反应1，本实施例优选5个循环：变性，98℃，15s；退火，58-66℃，15-30s，本实施例优选58℃，15s；延伸68℃，15-30s，本实施例优选15s。10-15个循环反应2，本实施例优选13个循环：变性，98℃，15s；退火，58-66℃，15-30s，本实施例优选62℃，15s；延伸68℃，15-30s，本实施例优选15s。
4、对多重PCR扩增产物进行荧光定量PCR测定
对多重PCR产物进行1-5倍稀释，本实施例优选5倍稀释。荧光定量PCR反应组分为：引物探针混合液，其中各引物浓度在200-900nM，本实施例优选400nM；探针浓度在100-200nM，本实施例优选200nM。采用的反应酶混合液为1倍的
Figure BDA0003413614010000102
Universal qPCR MasterMix(NEB,Cat#M3003)，一个反应为10ul体系。
具体反应条件为：预变性，95℃，5min；40-50个循环，本实施例优选40个循环：变性，95℃ 15s；退火，60-64℃，本实施例优选62℃，30s，信号收集。qPCR荧光定量反应体系配制如表5：
表5.qPCR荧光定量反应体系
Figure BDA0003413614010000103
本实施例进一步提供一种检测肺结节良恶性的方法，还包括以下步骤：
5、根据荧光定量PCR反应测定的内参基因在样本中的CT值判断该检测样本是否为有效样品，若检测样本内参基因的CT值在10-25之间，则该样本判断为有效样品；若检测样本内参基因的CT值<10，则样本初始投入量过剩；若检测样本内参基因的CT值>25,则初始样本投入量不足。对于初始投入量过剩或不足的样本，均判定为无效样本，不纳入检测和分析。
6、在样品判断为有效样品的前提下，若目标DNA甲基化分子标物CT值<40判断该DNA甲基化分子标记物被检出，得到该目标DNA甲基化分子标记物的相对循环数ΔCT：ΔCT＝目标DNA甲基化分子标记物CT值-内参基因CT值；若目标DNA甲基化分子标物CT值为“Undetermined”则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出，则赋予其ΔCT＝30。
7、根据校正后的ΔCT值进行数据分析，采用逻辑回归(Logistic Regression)算法建立肺结节良恶性预测模型。在模型构建过程中，使用交叉验证方法(Cross-validation)，将数据集随机分成3等份，并取其中任意2份合并作为训练集，剩余的1份作为测试集，则对于任意一个3等分的划分，根据组合原理可以得到3个不同的训练-测试集组合，然后针对训练集里含有不同DNA甲基化分子标记物的组合采用逻辑回归算法建立良恶性预测模型，并在含有特定的DNA甲基化分子标记物组合的测试集中评估模型的分类能力。按照上述步骤进行100次随机且相互独立的试验，最终含有特定DNA甲基化分子标记物的模型的分类能力，由100个模型的平均分类能力决定。
实施例3
本实施例提供分子标记物在标准品中的检测方法，其检测步骤如下：
1、标准品制备
1)0％甲基化标准品制备：
利用
Figure BDA0003413614010000111
Single Cell Kit(Qiagen,Cat#150343)和Mung Bean Nuclease(NEB,Cat#M0250L)处理NA12878 DNA以制备0％甲基化标准品；
2)100％甲基化标准品制备：
利用CpG Methyltransferase(M.SssI)处理所制备的0％的甲基化标准品，得到100％的甲基化标准品。
2、不同甲基化比例的标准品制备：
按照所需的甲基化比例梯度混合0％与100％甲基化标准品，得到0.2％，0.4％，1％甲基化比例的标准品。
3、对不同甲基化比例的标准品DNA进行亚硫酸氢盐转化：步骤如实施例2，转化投入量为50-100ng，优选75ng。
4、对转化后的标准品DNA进行多重PCR扩增，步骤如实施例2，多重PCR引物混合液为21个分子标记物以及内参基因的引物。
5、对上述多重PCR扩增产物进行荧光定量PCR测定，步骤如实施例2。
6、根据荧光定量PCR反应测定的内参基因ACTB在样本中的CT值判断该检测样本是否为有效样品，若检测样本内参基因的CT值在10-25之间，则该样本判断为有效样品；
7、在样品判断为有效样品的前提下，若目标DNA甲基化分子标物CT值<40判断该DNA甲基化分子标记物被检出，若目标DNA甲基化分子标物CT值为“Undetermined”则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出。
本实施例及以下实施例中，各分子标记物的引物探针组合如实施例1中优选的组合。
本实施例及以下实施例中，每一次试验都会设置阴性对照，该阴性对照以水作为模板进行多重PCR，得到的阴性对照多重PCR产物再进行各特定分子标记物的荧光定量PCR测定。如阴性对照无检测信号，则判定整个实验操作无外源污染。
本实施例进行了3次完全独立重复试验，5个分子标记物在100％甲基化标准品中均有检测信号，而阴性对照和非甲基化检测标准品中都无检测信号。在甲基化比例≥0.2％的各标准品中，Marker2，Marker4三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物对甲基化比例≥0.2％的样品检出率达到了100％；5个分子标记物在甲基化比例为1％的标准品中，三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物都能检出甲基化比例为1％的信号，以上所述如表6：
表6.分子标记物在各甲基化比例标准品中的测试结果
Figure BDA0003413614010000121
实施例4分子标记物及组合对呼吸道液体样本进行肺结节良恶性检测的表现
本实施例对181例呼吸道液体样本中的5个分子标记物的组合进行检测。其中，样本中手术活检鉴定为良性样本有95例，恶性样本86例，其中恶性样本包含52例I期样本，3例II期样本，6例III期样本，13例IV样本和12例未知分期样本。具体的检测试剂盒和试验方法以及数据判断处理如实施例2所述，引物和探针组合如实施例1所优选的组合。
选取用分子标记物组合marker1至marker5的组合对呼吸道液体样本建模分析，其平均AUC为0.820(特异性：80％；灵敏性：69％)，其对I期恶性样本的灵敏性为60％，II期灵敏性为100％，III期灵敏性为83％，IV期样本灵敏性为92％，ROC如图1所示。
实施例还对呼吸道液体样本中的Marker1，Marker2，Marker3，Marke4，Marker5进行了单分子标记物的检测。如实施例4所述，该5个分子标记物与肺癌有高度的相关性，其在呼吸道液体样本中的单个检测表现具体如表7所示，其中，每个Marker单独的AUC范围在0.64-0.78(<0.8)，且单marker的特异性都相对较低(<0.8)，总体表现弱于多marker联合使用。如本实施例所述的分子标记物组合，其AUC都比单独marker使用时的高。综合比较，将特定合适的分子标记物进行联合使用的检测能力，优于单个分子标记物单独检测时的表现。
表7
Figure BDA0003413614010000122
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市基准医疗有限责任公司
四川大学华西医院
<120> 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用
<150> 2020114961847
<151> 2020-12-17
<150> PCT/CN2021/086902
<151> 2021-04-13
<160> 53
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgggggaag catcccagtc caggtcggcc agtgtgaggt tgaaccccgg ctcttcgctg 60
ggcgtcgcgt tccacatgct gccggctcag ctgaacaggc tctgggacgt gactgcgc 118
<210> 2
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctcaattgc agggtcctcg ttctcgagtg tgcagagggc ggtgagagct caactctcgt 60
ccccacctcc cacccgcagc tccccgggtg ggtgagggat gccctg 106
<210> 3
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctgtttccg aaagccctcc tacttactgt caagtgaaca aagttaggcg cccacgtgat 60
cctccgagcc aatggccgcc ccgcctgcga ttcccggata aggaaatctg ctcacccgga 120
ccccactcca gccaaagagg tttatttccc c 151
<210> 4
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccttgcggtg tgctttcttt gcagggcatg cccccgctca gcccggagaa gcccgccctg 60
tgcgccggct gcgggggcaa gatctcggac aggtactatc tgctggctgt ggacaaacag 120
tggcatct 128
<210> 5
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttgcctcc cggggccacc ccgctgcctc cccagccttg ccgcgcctca gcgactttcg 60
gcgccgccgg agcttccgcc gcatcgcggg cgccgagatc cagatggtca tcttactcat 120
tgccacctcc ctggtggtgc tca 143
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtttaggtc ggttagtgtg aggttg 26
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgtcccaaa acctattcaa cta 23
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acaacatata aaacgcgacg cccaacgaa 29
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttagtttagg tcggttagtg tgagg 25
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atcacgtccc aaaacctatt caac 24
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caacatataa aacgcgacgc ccaacgaaaa 30
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tttagtttag gtcggttagt gtgag 25
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cacgtcccaa aacctattca acta 24
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgacaacata taaaacgcga cgcccaacg 29
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaaatcctcg ttctcgaata taca 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tatttattcg gggagttgcg 20
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaactcaact ctcgtcccca cctcc 25
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cctcgttctc gaatatacaa aa 22
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttattcgggg agttgcg 17
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaactcaact ctcgtcccca cctcc 25
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaaatcctcg ttctcgaata tacaaaa 27
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttttatttat tcggggagtt gcg 23
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aaactcaact ctcgtcccca cctccca 27
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttaagtgaat aaagttaggc gtttacg 27
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atccgaataa acaaatttcc ttatccg 27
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aatcgcaaac gaaacgacca ttaactcgaa 30
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aagtgaataa agttaggcgt ttacg 25
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atccgaataa acaaatttcc ttatccg 27
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aatcgcaaac gaaacgacca ttaactcgaa 30
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gaataaagtt aggcgtttac gtgatt 26
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atccgaataa acaaatttcc ttatccg 27
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aatcgcaaac gaaacgacca ttaactcgaa 30
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtagggtatg ttttcgttta gttcgg 26
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cacaaccaac aaataatacc tatccg 26
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cccgcaaccg acgcacaaaa cg 22
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agggtatgtt ttcgtttagt tcgg 24
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cacaaccaac aaataatacc tatccg 26
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ccccgcaacc gacgcacaaa acga 24
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gtagggtatg ttttcgttta gttcg 25
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
caaccaacaa ataataccta tccgaa 26
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ccccgcaacc gacgcacaaa acga 24
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ttagttttgt cgcgttttag cg 22
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ataaataaaa taaccatcta aatctcgacg 30
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cgatacgacg aaaactccga cgacgc 26
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ttttagtttt gtcgcgtttt agc 23
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aaataaccat ctaaatctcg acgc 24
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
acgaaaactc cgacgacgcc gaa 23
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
attacctccc gaaaccaccc 20
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gtaatgagta agatgattat ttggatttcg 30
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ccaaccttac cgcgcctcaa cgact 25
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gtgatggagg aggtttagta agtt 24
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims (9)

1.检测DNA甲基化分子标记物组合的甲基化水平的试剂在制备检测肺结节良恶性、和/或肺癌的试剂盒中的应用，所述DNA甲基化分子标记物组合为SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.5所示序列或其完全互补序列的组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述肺癌为早期肺癌。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，检测的样本为呼吸道样本。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，检测的样本为肺部组织样本，或呼吸道液体样本。
5.一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测DNA甲基化分子标记物组合的甲基化水平的试剂，所述DNA甲基化分子标记物组合为SEQ ID NO.1~SEQID NO.5所示序列或其完全互补序列的组合；
所述试剂包括针对DNA甲基化分子标记物的荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物和探针为：
针对SEQ ID NO.1的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示引物，以及SEQ ID NO.8所示探针；SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示引物，以及SEQ IDNO.11所示探针；SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示引物，以及SEQ ID NO.14所示探针；
针对SEQ ID NO.2的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示引物，以及SEQ ID NO.17所示探针；SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示引物，以及SEQ IDNO.20所示探针；SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示引物，以及SEQ ID NO.23所示探针；
针对SEQ ID NO.3的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示引物，以及SEQ ID NO.26所示探针；SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示引物，以及SEQ IDNO.29所示探针；SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示引物，以及SEQ ID NO.32所示探针；
针对SEQ ID NO.4的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示引物，以及SEQ ID NO.35所示探针；SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37所示引物，以及SEQ IDNO.38所示探针；SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示引物，以及SEQ ID NO.41所示探针；
针对SEQ ID NO.5的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43所示引物，以及SEQ ID NO.44所示探针；SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示引物，以及SEQ IDNO.47所示探针；SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49所示引物，以及SEQ ID NO.50所示探针。
6.根据权利要求5所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括采用 PCR扩增法、荧光定量PCR法、数字PCR法、液相芯片法、代测序法、三代测序法 二代测序法、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、简化亚硫酸氢盐测序技术或它们的组合所使用的试剂。
7.根据权利要求5所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针为：
针对SEQ ID NO.1的引物和探针为：SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示引物，以及SEQ IDNO.8所示探针；
针对SEQ ID NO.2的引物和探针为：SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示引物，以及SEQID NO.23所示探针；
针对SEQ ID NO.3的引物和探针为：SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示引物，以及SEQID NO.26所示探针；
针对SEQ ID NO.4的引物和探针为：SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示引物，以及SEQID NO.35所示探针；
针对SEQ ID NO.5的引物和探针为：SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示引物，以及SEQID NO.47所示探针。
8.根据权利要求5所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含针对内参基因ACTB的荧光定量PCR检测的引物和探针。
9.根据权利要求8所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述针对内参基因ACTB所述引物和探针为：SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示引物，以及SEQ ID NO.53所示探针。
CN202111539702.3A 2020-12-17 2021-12-15 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用 Active CN114645043B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011496184 2020-12-17
CN2020114961847 2020-12-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114645043A CN114645043A (zh) 2022-06-21
CN114645043B true CN114645043B (zh) 2022-12-09

Family

ID=81992188

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111539702.3A Active CN114645043B (zh) 2020-12-17 2021-12-15 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114645043B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012023648A1 (ko) * 2010-08-20 2012-02-23 국립암센터 Ｈｏｘａ１１ 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비소세포폐암 진단용 조성물 및 이를 이용한 비소세포폐암 진단방법
CN106232833A (zh) * 2014-01-30 2016-12-14 加利福尼亚大学董事会 用于非侵入性诊断的甲基化单体型分析(monod)
WO2018069450A1 (en) * 2016-10-14 2018-04-19 Aarhus Universitet Methylation biomarkers for lung cancer
CN109022567A (zh) * 2018-08-06 2018-12-18 北京艾克伦医疗科技有限公司 用于鉴定肺结节和/或肺癌状态的试剂盒及其应用
CN110229908A (zh) * 2019-07-03 2019-09-13 四川沃文特生物技术有限公司 用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针及试剂盒
CN110387421A (zh) * 2019-08-28 2019-10-29 深圳市新合生物医疗科技有限公司 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法
CN110872631A (zh) * 2019-12-26 2020-03-10 广州市基准医疗有限责任公司 Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012023648A1 (ko) * 2010-08-20 2012-02-23 국립암센터 Ｈｏｘａ１１ 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비소세포폐암 진단용 조성물 및 이를 이용한 비소세포폐암 진단방법
CN106232833A (zh) * 2014-01-30 2016-12-14 加利福尼亚大学董事会 用于非侵入性诊断的甲基化单体型分析(monod)
WO2018069450A1 (en) * 2016-10-14 2018-04-19 Aarhus Universitet Methylation biomarkers for lung cancer
CN109022567A (zh) * 2018-08-06 2018-12-18 北京艾克伦医疗科技有限公司 用于鉴定肺结节和/或肺癌状态的试剂盒及其应用
CN110229908A (zh) * 2019-07-03 2019-09-13 四川沃文特生物技术有限公司 用于早期检测肺癌基因甲基化的引物、探针及试剂盒
CN110387421A (zh) * 2019-08-28 2019-10-29 深圳市新合生物医疗科技有限公司 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法
CN110872631A (zh) * 2019-12-26 2020-03-10 广州市基准医疗有限责任公司 Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Diagnosis of pulmonary nodules by DNA methylation analysis in bronchoalveolar lavage fluids. Clin Epigenetics;Li Lei 等;《Clin Epigenetics》;20211007;第13卷(第1期);1-13页 *
血浆无细胞DNA中SHOX2和PTGER4基因甲基化检测有助于肺结节患者的鉴别诊断;初霞 等;《细胞与分子免疫学杂志》;20190418;第35卷(第4期);357-361页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114645043A (zh) 2022-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108977543B (zh) 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂
CN113755603B (zh) 子宫内膜癌早期筛查诊断用标志物、引物探针及试剂盒
WO2023071890A1 (zh) 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒
CN114317738B (zh) 用于检测胃癌淋巴结节转移相关的甲基化生物标记物或其组合及应用
CN113249487B (zh) 用于肝癌早期筛查的生物标志物组合、检测方法和试剂盒
WO2022143396A1 (zh) 乳腺肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒
CN110592224B (zh) 人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组及试剂以及试剂盒及其应用
CN113637745B (zh) 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用
CN113637746B (zh) 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用
WO2020063901A1 (zh) Hoxa7和hoxa9甲基化检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途
CN114645087B (zh) 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用
US20240084393A1 (en) Dna methelation molecular markers for identifying benignity or malignancy of lung nodule and applications of the same
WO2020063898A1 (zh) Hoxa7甲基化检测试剂在制备肺癌诊断试剂中的用途
CN114645043B (zh) 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用
CN113337608B (zh) 用于肝癌早期诊断的组合标志物及其应用
CN108998528B (zh) 肺癌诊断分子标记物lncRNA LINC00516和试剂盒及其应用
CN112553343A (zh) 肝细胞癌辅助诊断的血液分子标志物及其引物和应用
WO2021218616A1 (zh) 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用
WO2024001668A1 (zh) 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物及其应用
CN115948561B (zh) 一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用
CN116083586A (zh) 诊断食管癌的核酸产品、试剂盒及用途
CN115725733A (zh) 一种znf135基因甲基化检测试剂及其应用
CN117778582A (zh) 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用
CN116479129A (zh) 一种肝癌检测的核酸组合、试剂盒及应用
CN117587125A (zh) 检测甲基化的试剂在制备诊断胰腺癌的产品中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220725

Address after: 510000 unit 502, No. 8, helix 3 Road, International Biological Island, Guangzhou, Guangdong Province

Applicant after: ANCHORDX MEDICAL Co.,Ltd.

Address before: 510000 unit 502, No. 8, helix 3 Road, International Biological Island, Guangzhou, Guangdong Province

Applicant before: ANCHORDX MEDICAL Co.,Ltd.

Applicant before: WEST CHINA HOSPITAL OF SICHUAN University

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant