CN113637745B

CN113637745B - 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用

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Publication number: CN113637745B
Application number: CN202010345338.6A
Authority: CN
Inventors: 叶竹佳; 陶锦胜; 陈志伟; 范建兵
Original assignee: AnchorDx Medical Co Ltd
Current assignee: AnchorDx Medical Co Ltd
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2020-04-27
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2040-04-27
Also published as: CN113637745A

Abstract

本发明提供了用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列或其全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列的完全互补序列或其全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合。其中特别是其中的SEQ ID NO.8具有对肺结节良恶性检测的较高特异性。本发明还提供了上述DNA甲基化分子标记物的检测试剂盒和检测方法。所述DNA甲基化分子标记物与肺癌高度相关，尤其是组合使用，可以进一步提高对肺结节良恶性的检测的灵敏度和特异性，提高恶性肺结节的检出率，降低检出的假阳性率。所述试剂盒中的引物和探针克服了多个引物和探针在进行多重PCR扩增和检测时存在相互干扰的缺点，定量性能与单个区域定量等同。

Description

用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物及其组合和应用，所述应用包括检测试剂盒及检测方法。

背景技术

肺结节，即孤立性肺结节(solitary pulmonary nodule)是指影像为类圆形阴影、单一的、边界清楚的、直径小于或等于3cm、周围为含气肺组织所包绕的高低密度的实性或者亚实性病变，不伴肺不张、肺门肿大或胸腔积液。

肺结节分为良恶性两类，常无明显症状，良性结节需要针对病因治疗，恶性需要早期手术。良性的病因常与自身性免疫疾病或各种感染相关，恶性的病因常与肺癌相关。

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。然而，在肺癌发生早期对病人进行治疗，是能够有效的提高其五年生存率。统计研究数据发现，I期肺癌患者在接受有效的治疗后，其五年生存率可达到60％～90％以上，而晚期肺癌患者的五年生存率却不足20％。因此，对早期癌症患者的诊断和治疗，显得尤为重要。目前，临床上使用的肺癌检测方法有：影像学检测、细胞学检测和分子标记物检测。

LDCT(低剂量螺旋CT)影像检测是常用的比较有效的早期肺癌筛查方法。该方法在不降低结节灶的发现率的前提下，将曝光剂量降至常规CT的10％～25％，对结节发现率的敏感性高。而LDCT并不能确定结节性质，导致4％～55％良性病灶过度治疗，假阳性率增高。在NLST试验中LDCT的阳性结果中有96.4％为假阳性。

临床上，肺癌早期诊断另一主要手段为常规痰脱落细胞学检查。肺癌表面脱落的癌细胞可随痰咯出，痰细胞学检查找到癌细胞可明确诊断，准确率可达80％以上，而痰细胞学早期肺癌的敏感性仅为20％～30％。因其敏感性受到肿瘤的位置、组织类型和痰标本留取正确与否的影响，同时也受病理科医生技术水平的影响，总体的检出阳性率偏低。

肺癌分子标记物检测的检测样本主要来源于组织活检和液体活检。组织样本主要通过外科手术或纤维支气管镜刷片直接从肿瘤部位取得，因此其检测的准确性更高，然而因组织活检具有一定的侵入性，肿瘤异质性的存在及由于种种原因而无法取得组织标本或者组织标本量不足以完成分子检测，使得组织活检在肺癌的早期诊断、预测转移以及预后等方面的作用存在一定的局限性。相对于组织活检，液体活检具有操作简便、非侵入性、重复性强和利于疾病的动态监测等优势。肺癌液体活检以患者的血液、痰液和肺泡灌洗液等为标本，对其中的肿瘤细胞DNA及其修饰水平，如DNA甲基化等，进行检测和分析。对于癌症患者，因其血液中的ctDNA含量很低且个体差异较大，提高灵敏性是该检测方法面临的一个巨大挑战。而痰液和肺泡灌洗液采集，临床可以通过雾化诱导咳痰收集痰液，以及纤维支气管镜获得肺泡灌洗液，因样本直接来源于肺部，在信号检测的灵敏度上会较血液样本更有优势。在样本采集方式上，痰液的收集为无创操作，更为安全；纤维支气管镜收集肺泡灌洗术(bronohoalveolarlavage,BAL)是利用支气管镜向支气管肺泡内注人生理盐水并随即吸出，收集肺泡表面有效液体，检查其细胞成分和可溶性物质的一种方法。相对于经皮肺穿刺和外科手术活检是一类安全性较高的微创活检方法。

随着多层螺旋CT及高分辨CT的普及，以及人们健康意识的提高，越来越多的肺结节被检查出来，这对患者来说是好事，可以发现早期肺癌，但是对于患者也会造成很多困扰，甚至很多患者发现肺结节后会寝室难安，因此及时区分肺结节的良性或恶性及为重要。

目前可以确诊肺结节良恶性的主要是病理活检，但是病理活检是一种有创的操作，而且较小的结节不易通过穿刺活检取得标本，所以大部分的肺结节是通过结节大小、形态、密度，等来确定结节的良恶性。良性结节与恶性结节常常有不同的影像学表现，医生就是根据影像学的特点来判断肺结节的良恶性的，从而确定结节是否需要手术切除、或者进一步检查、或者是定期随访。

DNA甲基化与癌症的发生密切相关，尤其是CpG岛区的启动子超甲基化可能会导致抑癌基因转录沉默，从而影响肿瘤发生的进程，由于DNA甲基化几乎在所有癌症中均有发现，并且发生在癌前或者癌症早期阶段，因而是癌症诊断的理想标志物。

通过寻找基于肺癌呼吸道样本特异性DNA甲基化生物分子标记物，联合检测多个与肺癌相关的分子标记物，可增强肺癌的检出率，这对检测肺结节良恶性起到了关键作用。

发明内容

基于此，本发明提供一种用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物、检测试剂盒及方法，所述DNA甲基化分子标记物与肺癌高度相关，尤其是其组合使用，对肺结节良恶性的检测具有很好的灵敏度和特异性，能有效提高恶性肺结节的检出率。

实现上述目的的技术方案包括以下。

一种可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物或其组合，所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物或其组合包括SEQ ID NO.8所示序列，或包括SEQ ID NO.8的完全互补序列，或包括SEQ ID NO.8所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQ ID NO.8所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物或其组合包括SEQ ID NO.8所示序列或其完全互补序列，或SEQ ID NO.8所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括SEQID NO.8所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列；和

SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.21所示序列或其互补序列中的至少一种，或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段中至少一种，或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7以及SEQ IDNO.9～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中至少一种。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合为包括SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9的序列；或为包括SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9的完全互补序列；或为包括SEQID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列全长的至少55％的连续片段，或为包括选自SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合还包括选自SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或包括选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或包括选自SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合还包括选自SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.21所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或还包括选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.21所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或包括选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.10、SEQID NO.14、SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或包括选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合还包括SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列或其互补序列，或还包括SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段中，或包括SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合为包括SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列；或为包括SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列的完全互补序列；或为包括SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段，或为包括选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合为包括SEQ ID NO.6、SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的序列；或为包括SEQID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的完全互补序列；或为包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段，或为包括选自SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合还包括选自SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或还包括选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或为还包括选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示序列全长的至少55％的连续片段，或为还包括选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物的组合为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.21所示序列；或为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列的完全互补序列；或为所述DNA甲基化分子标记物为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段；或为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。

以上所示序列全长的至少55％的连续片段，可以是序列全长至少55％的，也可以至少是58％、至少是60％、至少是65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％等的连续片段。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段分别为：

以引物为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28和SEQ ID NO.29中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.1中所对应的序列；

和/或，引物为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35、SEQID NO.37和SEQ ID NO.38中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.2中所对应的序列；

和/或，针对SEQ ID NO.3的以引物为SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41、SEQ IDNO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47中的任一组所扩增的片段在SEQ IDNO.3中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.4中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59、EQ ID NO.61和SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64和SEQ ID NO.65中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.5中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、SEQ ID NO.70和SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.6中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.76和SEQ ID NO.77、SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80、SEQ ID NO.82和SEQ ID NO.83中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.7中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.89、SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.92中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.8中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.94和SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97和SEQ ID NO.98、SEQ ID NO.100和SEQ ID NO.101中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.9中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.106和SEQ IDNO.107、SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.110中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.10中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.112和SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115和SEQ IDNO.116、SEQ ID NO.118和SEQ ID NO.119中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.11中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.122、SEQ ID NO.124和SEQ IDNO.125、SEQ ID NO.127和SEQ ID NO.128中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.12中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.130和SEQ ID NO.131、SEQ ID NO.133和SEQ IDNO.134、SEQ ID NO.136和SEQ ID NO.137中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.13中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.139和SEQ ID NO.140、SEQ ID NO.142和SEQ IDNO.143、SEQ ID NO.145和SEQ ID NO.146中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.14中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.148和SEQ ID NO.149、SEQ ID NO.151和SEQ IDNO.152、SEQ ID NO.154和SEQ ID NO.155中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.15中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.157和SEQ ID NO.158、SEQ ID NO.160和SEQ IDNO.161、SEQ ID NO.163和SEQ ID NO.164中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.16中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.166和SEQ ID NO.167、SEQ ID NO.169和SEQ IDNO.170、SEQ ID NO.172和SEQ ID NO.173中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.17中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.175和SEQ ID NO.176、SEQ ID NO.178和SEQ IDNO.179、SEQ ID NO.181和SEQ ID NO.182中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.18中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.184和SEQ ID NO.185、SEQ ID NO.187和SEQ IDNO.188、SEQ ID NO.190和SEQ ID NO.191中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.19中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.193和SEQ ID NO.194、SEQ ID NO.196和SEQ IDNO.197、SEQ ID NO.199和SEQ ID NO.200中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.20中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.202和SEQ ID NO.203、SEQ ID NO.205和SEQ IDNO.206、SEQ ID NO.208和SEQ ID NO.209中的任一组所扩增的片段在SEQ ID NO.21中所对应的序列。

以引物为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所扩增的片段在SEQ ID NO.1中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所扩增的片段在SEQ ID NO.2中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所扩增的片段在SEQ ID NO.3中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所扩增的片段在SEQ ID NO.4中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59所扩增的片段在SEQ ID NO.5中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68所所扩增的片段在SEQ ID NO.6中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.76和SEQ ID NO.77所扩增的片段在SEQ ID NO.7中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.89所扩增的片段在SEQ ID NO.8中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.100和SEQ ID NO.101所扩增的片段在SEQ ID NO.9中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.110所扩增的片段在SEQ ID NO.10中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.112和SEQ ID NO.113所扩增的片段在SEQ ID NO.11中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.122所扩增的片段在SEQ ID NO.12中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.130和SEQ ID NO.131所扩增的片段在SEQ ID NO.13中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.142和SEQ ID NO.143所扩增的片段在SEQ ID NO.14中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.151和SEQ ID NO.152所扩增的片段在SEQ ID NO.15中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.160和SEQ ID NO.161所扩增的片段在SEQ ID NO.16中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.166和SEQ ID NO.167所扩增的片段在SEQ ID NO.17中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.175和SEQ ID NO.176所扩增的片段在SEQ ID NO.18中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.184和SEQ ID NO.185所扩增的片段在SEQ ID NO.19中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.199和SEQ ID NO.200所扩增的片段在SEQ ID NO.20中所对应的序列；

和/或，以引物为SEQ ID NO.208和SEQ ID NO.209所扩增的片段在SEQ ID NO.21中所对应的序列。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物为针对呼吸道样本的分子标记物。

在其中一些实施例中，所述呼吸道样本为肺部组织样本或呼吸道液体样本。

本发明的另一个方面，还提供了SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列中的任意一种或两种以上的组合作为肺癌相关甲基化分子标记物在检测肺结节良恶性、和/或早期肺癌中的应用。

本发明还提供了一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测上述DNA甲基化分子标记物的甲基化水平的试剂。

在其中一些实施例中，所述试剂盒可以用于以下检测平台：包括采用PCR扩增法、荧光定量PCR法、数字PCR法、液相芯片法、代测序法、三代测序法二代测序法、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、简化亚硫酸氢盐测序技术或它们的组合所使用的试剂。在一些优选的实施例中，所述检测方法为PCR扩增检测、荧光定量PCR检测、数字PCR检测、芯片检测。

在其中一些实施例中，所述试剂盒中检测上述DNA甲基化分子标记物的甲基化水平的试剂包括针对DNA甲基化分子标记物的荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物和探针为：

针对SEQ ID NO.1的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.22和SEQ IDNO.23所示引物，以及SEQ ID NO.24所示探针；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示引物，以及SEQ ID NO.27所示探针；SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示引物，以及SEQ ID NO.30所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.2的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.31和SEQID NO.32所示引物，以及SEQ ID NO.33所示探针；SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示引物，以及SEQ ID NO.36所示探针；SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示引物，以及SEQ ID NO.39所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.3的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.40和SEQID NO.41所示引物，以及SEQ ID NO.42所示探针；SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示引物，以及SEQ ID NO.45所示探针；SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示引物，以及SEQ ID NO.48所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.4的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.49和SEQID NO.50所示引物，以及SEQ ID NO.51所示探针；SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53所示引物，以及SEQ ID NO.54所示探针；SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示引物，以及SEQ ID NO.57所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.5的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.58和SEQID NO.59所示引物，以及SEQ ID NO.60所示探针；SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62所示引物，以及SEQ ID NO.63所示探针；SEQ ID NO.64和SEQ ID NO.65所示引物，以及SEQ ID NO.66所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.6的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.67和SEQID NO.68所示引物，以及SEQ ID NO.69所示探针；SEQ ID NO.70和SEQ ID NO.71所示引物，以及SEQ ID NO.72所示探针；SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74所示引物，以及SEQ ID NO.75所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.7的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.76和SEQID NO.77所示引物，以及SEQ ID NO.78所示探针；SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80所示引物，以及SEQ ID NO.81所示探针；SEQ ID NO.82和SEQ ID NO.83所示引物，以及SEQ ID NO.84所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.8的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.85和SEQID NO.86所示引物，以及SEQ ID NO.87所示探针；SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.89所示引物，以及SEQ ID NO.90所示探针；SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.92所示引物，以及SEQ ID NO.93所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.9的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.94和SEQID NO.95所示引物，以及SEQ ID NO.96所示探针；SEQ ID NO.97和SEQ ID NO.98所示引物，以及SEQ ID NO.99所示探针；SEQ ID NO.100和SEQ ID NO.101所示引物，以及SEQIDNO.102所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.10的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.103和SEQID NO.104所示引物，以及SEQ ID NO.105所示探针；SEQ ID NO.106和SEQ ID NO.107所示引物，以及SEQ ID NO.108所示探针；SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.110所示引物，以及SEQID NO.111所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.11的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.112和SEQID NO.113所示引物，以及SEQ ID NO.114所示探针；SEQ ID NO.115和SEQ ID NO.116所示引物，以及SEQ ID NO.117所示探针；SEQ ID NO.118和SEQ ID NO.119所示引物，以及SEQID NO.120所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.12的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.121和SEQID NO.122所示引物，以及SEQ ID NO.123所示探针；SEQ ID NO.124和SEQ ID NO.125所示引物，以及SEQ ID NO.126所示探针；SEQ ID NO.127和SEQ ID NO.128所示引物，以及SEQID NO.129所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.13的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.130和SEQID NO.131所示引物，以及SEQ ID NO.132所示探针；SEQ ID NO.133和SEQ ID NO.134所示引物，以及SEQ ID NO.135所示探针；SEQ ID NO.136和SEQ ID NO.137所示引物，以及SEQID NO.138所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.14的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.139和SEQID NO.140所示引物，以及SEQ ID NO.141所示探针；SEQ ID NO.142和SEQ ID NO.143所示引物，以及SEQ ID NO.144所示探针；SEQ ID NO.145和SEQ ID NO.146所示引物，以及SEQID NO.147所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.15的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.148和SEQID NO.149所示引物，以及SEQ IDNO.150所示探针；SEQ ID NO.151和SEQ ID NO.152所示引物，以及SEQ ID NO.153所示探针；SEQ ID NO.154和SEQ ID NO.155所示引物，以及SEQ IDNO.156所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.16的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.157和SEQID NO.158所示引物，以及SEQ ID NO.159所示探针；SEQ ID NO.160和SEQ ID NO.161所示引物，以及SEQ ID NO.162所示探针；SEQ ID NO.163和SEQ ID NO.164所示引物，以及SEQID NO.165所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.17的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.166和SEQID NO.167所示引物，以及SEQ ID NO.168所示探针；SEQ ID NO.169和SEQ ID NO.170所示引物，以及SEQ ID NO.171所示探针；SEQ ID NO.172和SEQ ID NO.173所示引物，以及SEQID NO.174所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.18的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.175和SEQID NO.176所示引物，以及SEQ ID NO.177所示探针；SEQ ID NO.178和SEQ ID NO.179所示引物，以及SEQ ID NO.180所示探针；SEQ ID NO.181和SEQ ID NO.182所示引物，以及SEQID NO.183所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.19的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.184和SEQID NO.185所示引物，以及SEQ ID NO.186所示探针；SEQ ID NO.187和SEQ ID NO.188所示引物，以及SEQ ID NO.189所示探针；SEQ ID NO.190和SEQ ID NO.191所示引物，以及SEQID NO.192所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.20的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.193和SEQID NO.194所示引物，以及SEQ ID NO.195所示探针；SEQ ID NO.196和SEQ ID NO.197所示引物，以及SEQ ID NO.198所示探针；SEQ ID NO.199和SEQ ID NO.200所示引物，以及SEQID NO.201所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.21的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.202和SEQID NO.203所示引物，以及SEQ ID NO.204所示探针；SEQ ID NO.205和SEQ ID NO.206所示引物，以及SEQ ID NO.207所示探针；SEQ ID NO.208和SEQ ID NO.209所示引物，以及SEQID NO.210所示探针；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。

其中一些实施例中，所述引物和探针为：

针对SEQ ID NO.1的引物和探针为：SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示引物，以及SEQ ID NO.24所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.2的引物和探针为：SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示引物，以及SEQ ID NO.36所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.3的引物和探针为：SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示引物，以及SEQ ID NO.42所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.4的引物和探针为：SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示引物，以及SEQ ID NO.57所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.5的引物和探针为：SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59所示引物，以及SEQ ID NO.60所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.6的引物和探针为：SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68所示引物，以及SEQ ID NO.69所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.7的引物和探针为：SEQ ID NO.76和SEQ ID NO.77所示引物，以及SEQ ID NO.78所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.8的引物和探针为：SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.89所示引物，以及SEQ ID NO.90所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.9的引物和探针为：SEQ ID NO.100和SEQ ID NO.101所示引物，以及SEQ ID NO.102所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.10的引物和探针为：SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.110所示引物，以及SEQ ID NO.111所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.11的引物和探针为：SEQ ID NO.112和SEQ ID NO.113所示引物，以及SEQ ID NO.114所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.12的引物和探针为：SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.122所示引物，以及SEQ ID NO.123所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.13的引物和探针为：SEQ ID NO.130和SEQ ID NO.131所示引物，以及SEQ ID NO.132所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.14的引物和探针为：SEQ ID NO.142和SEQ ID NO.143所示引物，以及SEQ ID NO.144所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.15的引物和探针为：SEQ ID NO.151和SEQ ID NO.152所示引物，以及SEQ ID NO.153所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.16的引物和探针为：SEQ ID NO.160和SEQ ID NO.161所示引物，以及SEQ ID NO.162所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.17的引物和探针为：SEQ ID NO.166和SEQ ID NO.167所示引物，以及SEQ ID NO.168所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.18的引物和探针为：SEQ ID NO.175和SEQ ID NO.176所示引物，以及SEQ ID NO.177所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.19的引物和探针为：SEQ ID NO.184和SEQ ID NO.185所示引物，以及SEQ ID NO.186所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.20的引物和探针为：SEQ ID NO.199和SEQ ID NO.200所示引物，以及SEQ ID NO.201所示探针；

和/或，针对SEQ ID NO.21的引物和探针为：SEQ ID NO.208和SEQ ID NO.209所示引物，以及SEQ ID NO.210所示探针；

或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包含针对内参基因ACTB的荧光定量PCR检测的引物和探针，优选地，所述引物和探针为：SEQ ID NO.211和SEQ ID NO.212所示引物，以及SEQ ID NO.213所示探针。

在其中一些实施例中，所述试剂盒的检测样本为呼吸道样本。

本发明还提供了上述DNA甲基化分子标记物或其组合的甲基化水平检测方法，包括以下步骤：

(1)从待测样本中提取基因组DNA；

(2)对提取获得的基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，得到转化后的DNA；

(3)用针对上述DNA甲基化分子标记物的扩增引物对转化后的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；

(4)步骤(3)获得的多重PCR产物用针对上述DNA甲基化分子标记物的探针进行多重荧光定量PCR检测。

在其中一些实施例中，所述多重PCR反应条件如下：98℃30s；15-35个循环：98℃15s，58℃～66℃15～30s；72℃15～30s；72℃5min；和/或，所述多重荧光定量PCR反应条件如下：95℃30s；35～50个循环：95℃10s；60℃～64℃30s。

在其中一些实施例中，利用上述试剂盒中的引物和探针进行检测。

本发明还提供了一种检测肺结节良恶性的方法，包括以下步骤：

(1)利用上述检测方法对上述DNA甲基化分子标记物的甲基化水平进行检测；

(2)通过内参基因C_T值判断样本是否有效，然后用内参基因C_T值对有效样本中检测的每个分子标记物的C_T值进行校正；

(3)将校正后的数据进行模型分析，最后进行肺结节良恶性的判断。

在其中一些实施例中，所述步骤(2)中若内参基因的C_T值在8-18之间，则该样本判断为有效样本；反之，则为无效样本；然后用内参基因C_T值对有效样本中的每个DNA甲基化分子标记物的C_T值进行校正；若目标DNA甲基化分子标物C_T值<35判断该DNA甲基化分子标记物被检出，得到该目标DNA甲基化分子标记物的相对循环数ΔC_T：ΔC_T＝目标DNA甲基化分子标记物C_T值-内参基因C_T值；若目标DNA甲基化分子标物C_T值≥35则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出，则赋予其ΔC_T＝27。

在其中一些实施例中，所述步骤(3)中根据校正后的ΔC_T值进行数据分析，采用朴素贝叶斯算法建立肺结节良恶性预测模型。根据校正后的ΔC_T值进行数据分析，将数据集按照6:4随机切分为训练集和测试集，然后针对训练集里含有不同DNA甲基化分子标记物的组合采用朴素贝叶斯算法建立良恶性预测模型，最后在对应的含有特定的DNA甲基化分子标记物组合的测试集中评估模型的分类能力。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明找到了与肺癌高度相关的DNA甲基化特异性的分子标记物，通过检测这些DNA甲基化分子标记物的甲基化水平可以检测肺结节良恶性，具有很好的灵敏度和特异性。其中单独的分子标记物SEQ ID NO.8在肺部组织样本或呼吸道液体样本中都具有较高的特异性，其与SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ IDNO.10，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16分子标记物的任意组合具有较高的灵敏度和特异性，特别是SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9对应Marker的组合，或者是包括其他marker的进一步组合，可以很好地提高对肺结节良恶性的检测的灵敏度和特异性，有效提高早期恶性肺结节的检出率，及早进行治疗和干预，提高患者生存率；同时降低检出的假阳性率，避免良性肺结节的过度诊疗。

本发明提供的DNA甲基化分子标记物尤其适用于呼吸道样本，包括通过外科手术获取的肺部组织样本，以及通过微创或无创手段获取的呼吸道液体样本等。

本发明试剂盒提供的针对所述DNA甲基化分子标记物的荧光定量PCR检测引物和探针克服了多个引物和探针在进行多重PCR扩增和检测时存在相互干扰的缺点，利用所述引物对经过亚硫酸氢盐处理的DNA进行多重PCR时，每个DNA甲基化分子标记物均能得到有效扩增和富集；后续对多重PCR产物进行多重荧光定量PCR检测时，相应DNA甲基化分子标记物在多重荧光定量PCR检测中获得的C_T值与该DNA甲基化分子标记物单独进行荧光定量PCR反应的C_T值没有显著差异，定量性能与单个区域定量等同。所述试剂盒经过优化，针对不同DNA甲基化分子标记物的引物和探针相互之间没有干扰，可成功实现多重PCR扩增和多重荧光定量PCR检测，有效提高检测效率。

本发明提供的针对所述DNA甲基化分子标记物的检测方法通过引入多重PCR扩增，能有效对目标分子进行富集，克服了检测样本获取量低的限制，在放大检测信号的同时也能进行多个分子标记物的联合检测，提高检测灵敏度和检测效率，能增强对肺癌的检出率以及肺结节良恶性检测的准确率。

附图说明

图1是实施例3中其中一个分子标记物(Marker8)荧光定量PCR反应检测扩增曲线。

图2是实施例5中各分子标记物组合的ROC曲线图。

图3是实施例6中各分子标记物组合的ROC曲线图。

图4是呼吸道组织样本和呼吸道液体样本中甲基化信号比较的PCA图。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本发明提供的用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物为针对13个检测基因B3GNTL1、DLX4、HOAX1、HOXA9、HOXB4、MSC-AS1、OTX2、PREX1、PTGER4、RASSF1、SHOX2、TWIST1和ZNF781中的21个甲基化区域，所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.21所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。

在以下实施例中，SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.21所述DNA甲基化分子标记物相应记载的Marker，以及相应引物扩增的对应的Marker。

本发明的一个实施方式中，涉及了适用于呼吸道样本检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，其中，包括21个甲基化检测区域的任意一种或者两种以上的组合。在其中一些实施例中，这些DNA甲基化分子标记物可以任意组合，以实现对检测样本进行肺结节良恶性的检测。

本发明的一个实施方式中，涉及了上述DNA甲基化分子标记物在制备检测肺结节良恶性的试剂盒中的用途。

本发明的一个实施方式中，涉及了一种检测肺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包含检测上述DNA甲基化分子标记物的甲基化水平的试剂。所述试剂盒可以适用于PCR扩增、荧光定量PCR诊断、数字PCR(digital PCR)或者检测芯片等检测平台，最好是能实现高通量检测的平台。

本发明针对上述特定甲基化区域的DNA甲基化分子标记物进行了引物与探针设计，利用所述的DNA甲基化分子标记物组合的扩增引物，对从呼吸道样本中提取的并经过亚硫酸氢盐处理后的基因组DNA(gDNA)进行多重PCR扩增；再利用该DNA甲基化分子标记物的特异性探针对此检测区域的甲基化信号进行荧光定量PCR检测，然后采用朴素贝叶斯算法建立良恶性预测模型，最后通过建立的模型对肺结节的良恶性进行诊断。

实施例1

一个用于呼吸道样本检测肺结节良恶性的试剂盒，包含了13个检测基因B3GNTL1、DLX4、HOXA1、HOXA9、HOXB4、MSC-AS1、OTX2、PREX1、PTGER4、RASSF1、SHOX2、TWIST1和ZNF781中的21个甲基化区域的DNA甲基化分子标记物Marker1至Marker21的检测引物和探针，各DNA甲基化分子标记物的检测区域序列及序列编号具体如表1所示(其中每个区域下划线部分为实施例中优选所用引物扩增的片段的对应序列的Marker)：

表1.分子标记物检测区域序列

所述试剂盒针对21个用于呼吸道样本检测肺结节良恶性的分子标记物Marker1至Marker21中的特异性甲基化位点各设计了三对引物和三条探针(探针荧光标记可采用FAM、VIC及NED等荧光基团标记)，并分别标记为组合1、2、3。其中，每个分子标记物中被选择的引物和探针组合，可任意选择与其他分子标记物中的引物和探针的组合1、2、3进行组合并在同一平台进行检测。具体的各分子标记物对应的引物和探针序列如表2所示：

表2相关分子标记物的引物和探针序列

本实施例和以下实施例中，优选所用的引物和探针组合为：

Marker1的引物和探针组合1，Marker2的引物和探针组合2，Marker3的引物和探针组合1，Marker4的引物和探针组合3，Marker5的引物和探针组合1，Marker6的引物和探针组合1，Marker7的引物和探针组合1，Marker8的引物和探针组合2，Marker9的引物和探针组合3，Marker10的引物和探针组合3，Marker11的引物和探针组合1，Marker12的引物和探针组合1，Marker13的引物和探针组合1，Marker14的引物和探针组合2，Marker15的引物和探针组合2，Marker16的引物和探针组合2，Marker17的引物和探针组合1，Marker18的引物和探针组合1，Marker19的引物和探针组合1，Marker20的引物和探针组合3，Marker21的引物和探针组合3。在其他实际应用中，将根据甲基化分子标记物的不同组合进行选择相应的引物和探针。

所述试剂盒还包含内参基因ACTB的引物和探针，其序列具体如表3所示：

表3.内参基因ACTB引物和探针

实施例2

本实施例利用实施例1所述试剂盒对呼吸道样本中Marker1至Marker21的甲基化水平进行检测。

一种DNA甲基化分子标记物的甲基化水平检测方法，包括以下步骤：

1、呼吸道样本中gDNA的提取：

1)对肺组织石蜡切片样本gDNA提取：石蜡组织gDNA提取具体操作步骤按照Qiagen公司的ALLPrep DNA/RNA FFPE Kit说明书进行；

2)对呼吸道液体样本gDNA提取：先将呼吸道液体样本进行低速离心处理，4℃，5000g，5min；去上清，收集沉淀；然后按照Qiagen公司的

Blood&Tissue Kit说明书进行操作提取gDNA。

2、对提取的gDNA进行亚硫酸盐转化

将提取的gDNA进行亚硫酸氢盐转化，投入20-50ng gDNA，本实施例优选在50ng,按照Zymo DNA Methylation-Direct MagPrep说明书进行操作,使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。经过亚硫酸氢盐转化后的DNA产物全部用于进行多重PCR扩增。

3、对转化后的DNA进行多重PCR扩增

转化后的DNA产物全部进行多重PCR扩增，其中的反应组分为：特定组合的分子标记物及1个内参基因的引物混合液，其中每条引物浓度在200nM-300nM，本实施例优选300nM；镁离子的浓度在1-3mM，本实施例优选在1.5mM；dNTP混合液浓度在200-600uM，本实施例优选在400uM；反应酶为Phusion U(Thermo Fisher,Cat#F555L)，一个反应的单位数为1-3U，本实施例优选1.5U。多重PCR反应体系配制如表4：

表4.多重PCR反应体系

组分	体积(ul)	终浓度
			5X GC buffer	10	1X
dNTP mix(10mM/dNTP)	2	400uM/dNTP
			引物混合液(75uM/引物)	8.4	300nM/引物
MgCl<sub>2</sub>(25mM)	3	1.5mM
			Phusion U(2U/ul)	0.75	1.5U
DNA模板	18-22
			DEPC H<sub>2</sub>O	up to 50

具体反应条件为：预变性，98℃，30s；15-35个循环反应，本实施例优选22个循环：变性，98℃，15s；退火，58-66℃，15-30s，本实施例优选63℃，15s；延伸72℃，15-30s，本实施例优选15s。

4、对多重PCR扩增产物进行多重荧光定量PCR测定

对多重PCR产物进行1-5倍稀释，本实施例优选2倍稀释。多重荧光定量PCR反应组分为：引物探针混合液，其中各引物浓度在200-900nM，本实施例优选900nM；探针浓度在100-200nM，本实施例优选200nM。采用的反应酶混合液为1倍的ChamQ Geno-SNP probeMaster Mix(Vazyme,Cat#Q811-02)，一个反应为10ul体系。

该体系中的引物探针混合液包含了2-3个分子标记物的引物和不同荧光基团标记的探针，表5中列举了其中一些2-3个分子标记物的引物和探针进行混合的混合液方案：

表5.多重荧光定量PCR反应体系中的引物探针混合液组合方案

具体反应条件为：预变性，95℃，5min；40-50个循环，本实施例优选45个循环：变性，95℃15s；退火，60-64℃，本实施例优选62℃，1min，信号收集。qPCR荧光定量反应体系配制如表6：

表6. qPCR荧光定量反应体系

用完全甲基化(阳性对照)及非甲基化(阴性对照)标准品对21个分子标记物按照表格5所示的混合液组合(混合液A-O)进行多重荧光定量PCR测定的C_T值，与对其进行单独荧光定量PCR反应的C_T值比较，其中阴性对照在所有组合及单个定量中均无检出，阳性对照的C_T值如表7(包括表7.1和表7.2)所示，结果显示各分子标记物在按照表5所示的混合液组合方案进行的荧光定量PCR反应的C_T值与其单独进行荧光定量PCR反应的C_T值相近，没有显著差异，由此判断多重荧光定量的引物探针混合液组合方案中各分子标记物的扩增效率没有相互干扰，定量性能与单个区域定量等同，可实现2-3个分子标记物的同时定量检测。

表7.1.各分子标记物在多重和单独荧光定量PCR反应下的C_T值

表7.2.各分子标记物在多重和单独荧光定量PCR反应下的C_T值

本实施例进一步提供一种检测肺结节良恶性的方法，还包括以下步骤：

5、根据荧光定量PCR反应测定的内参基因在样本中的C_T值判断该检测样本是否为有效样品，若检测样本内参基因的C_T值在8-18之间，则该样本判断为有效样品；若检测样本内参基因的C_T值<8，则样本初始投入量过剩；若检测样本内参基因的C_T值>18,则初始样本投入量不足。对于初始投入量过剩或不足的样本，均判定为无效样本，不纳入检测和分析。

6、在样品判断为有效样品的前提下，若目标DNA甲基化分子标物C_T值<35判断该DNA甲基化分子标记物被检出，得到该目标DNA甲基化分子标记物的相对循环数ΔC_T：ΔC_T＝目标DNA甲基化分子标记物C_T值-内参基因C_T值；若目标DNA甲基化分子标物C_T值≥35则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出，则赋予其ΔC_T＝27。

7、根据各样本中的目标分子标记物校正后的ΔC_T进行数据分析，将数据集按照6:4分为训练集和测试集，并进行100次随机切分为，然后针对训练集以含有不同分子标记物的组合采用朴素贝叶斯算法建立良恶性预测模型，最后在对应的含有特定的分子标记物组合的测试集中评估模型的分类能力。

实施例3

本实施例提供分子标记物在标准品中的检测方法，其检测步骤如下：

1、标准品制备

1)0％甲基化标准品制备：

利用

Single Cell Kit(Qiagen,Cat#150343)和Mung Bean Nuclease(NEB,Cat#M0250L)处理NA12878 DNA以制备0％甲基化标准品；

2)100％甲基化标准品制备：

利用CpG Methyltransferase(M.SssI)处理所制备的0％的甲基化标准品，得到100％的甲基化标准品。

2、不同甲基化比例的标准品制备：

按照所需的甲基化比例梯度混合0％与100％甲基化标准品，得到0.2％，0.4％，1％甲基化比例的标准品。

3、对不同甲基化比例的标准品DNA进行亚硫酸氢盐转化：步骤如实施例2，转化投入量为10-50ng，优选50ng。

4、对转化后的标准品DNA进行多重PCR扩增，步骤如实施例2，多重PCR引物混合液为21个分子标记物以及内参基因的引物。

5、对上述多重PCR扩增产物进行荧光定量PCR测定，步骤如实施例2。

6、根据荧光定量PCR反应测定的内参基因ACTB在样本中的C_T值判断该检测样本是否为有效样品，若检测样本内参基因的C_T值在8-18之间，则该样本判断为有效样品；

7、在样品判断为有效样品的前提下，若目标DNA甲基化分子标物C_T值<35判断该DNA甲基化分子标记物被检出，若目标DNA甲基化分子标物C_T值≥35则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出。

本实施例及以下实施例中，各分子标记物的引物探针组合如实施例1中优选的组合。

本实施例及以下实施例中，每一次试验都会设置阴性对照，该阴性对照以水作为模板进行多重PCR，得到的阴性对照多重PCR产物再进行各特定分子标记物的荧光定量PCR测定。如阴性对照无检测信号，则判定整个实验操作无外源污染。

本实施例进行了3次完全独立重复试验，21个分子标记物在100％甲基化标准品中均有检测信号，而阴性对照和非甲基化检测标准品中都无检测信号，以其中一个分子标记物(Marker10)扩增曲线为例，如图1所示。在甲基化比例≥0.2％的各标准品中，Marker1，Marker2，Marker4，Marker5，Marker10，Marker11和Marker21三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物对甲基化比例≥0.2％的样品检出率达到了100％；在甲基化比例≥0.4％的各标准品中，Marker3，Marker12，Marker14，Marker15，Marker18，Marker20三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物对甲基化比例≥0.4％的样品的检出率达到了100％；21个分子标记物在甲基化比例为1％的标准品中，三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物都能检出甲基化比例为1％的信号，以上所述如表8：

表8.分子标记物在各甲基化比例标准品中的测试结果

实施例4分子标记物与肺癌的相关性

本实施例研究本发明提供的分子标记物与肺癌的相关性，具体方法如下：

1、对肺部组织石蜡切片样本进行DNA提取，如实施例2所述。

2、对提取的DNA进行亚硫酸盐转化，投入量为10ng-50ng，本实施例优选50ng，如实施2所述。

3、对转化后的DNA通过用包含有特定分子标记物的扩增引物进行多重PCR扩增，如实施例2所述。

4、对多重PCR扩增产物进行荧光定量PCR测定，如实施例2所述。

5、根据荧光测定的结果，判断样本是否为有效样品，如实施例2所述。

6、对所检测的样本中的目标分子标记物C_T值进行校正，如实施例2所述。

7、根据对样本中校正后的目标分子标记物的ΔC_T进行数据分析，如实施例2所述。

本实施例对109例肺结节组织样本中(手术活检鉴定为良性样本有46例，恶性样本63例包含恶性结节样本包含4例AIS样本，11例MIA样本，38例IA样本和10其他亚型的恶性样本，其中样本中有84％的恶性样本为肺癌早期样本)的分子标记物Marker1，Marker6，Marker7，Marker8，Marker9，Marker10，Marker14,Marker15，Marker16进行了单分子标记物的检测。前述各分子标记物的平均AUC范围为0.80-0.89，在95％CI下，最低AUC范围在0.71-0.82，最高AUC范围达到0.88-0.95。在约登指数(YouDen Index)为最大的前提下进行切分后的灵敏性(Sensitivity)范围为65％-79％，特异性(Specificity)范围为80％-98％，这表明了这些分子标记物甲基化水平与肺癌的癌变高度相关。具体如表9所示：

表9.分子标记物与肺癌的相关性

实施例5不同分子标记物组合对肺组织样本进行肺结节良恶性检测的表现

本实施例利用21个分子标记物包含Marker1至Marker21，通过实施例2的实验方法，对实施例4中的109例肺结节组织样本进行检测分析，具体的检测试剂盒、试验方法以及数据判断处理如实施例2所述，引物和探针组合如实施例1所优选的组合。

本实施例及以下实施例选取包含了不同特定分子标记物的组合，具体分子标记物组合如表10所示，利用逻辑回归模型进行建模分析，将数据集按照6:4随机切分为训练集和测试集，采用朴素贝叶斯算法建立良恶性预测模型。

表10.不同分子标记物组合

选取表10中分子标记物组合A进行建模分析，其在测试集中AUC为0.95(特异性：94％；灵敏性：86％)，ROC如图2所示。可见所述所选分子标记的组合灵敏性和特异性都非常好。由于样本中有84％的恶性样本为肺癌早期样本，因此该分子标记物的组合对早期肺癌检测及肺结节良恶性检测也有较高的灵敏性和特异性。

选取表10中分子标记物组合E进行建模分析，其在测试集中AUC为0.91(特异性：95％；灵敏性：85％)，ROC如图2所示。可见所述所选分子标记的组合具有较好的灵敏性和特异性。由于样本中有84％的恶性样本为肺癌早期样本，因此该分子标记物的组合对早期肺癌检测及肺结节良恶性检测也有较高的灵敏性和特异性。可见，Marker8和Marker9的组合，在组织样本中的特异性和灵敏性都较高。

选取表10中分子标记物组合J进行建模分析，其在测试集中AUC为0.91(特异性：84％；灵敏性：85％)，ROC如图2所示。可见所述所选分子标记的组合具有较好的灵敏性和特异性。由于样本中有84％的恶性样本为肺癌早期样本，因此该分子标记物的组合对早期肺癌检测及肺结节良恶性检测也有较高的灵敏性和特异性。

选取表10中分子标记物组合I进行建模分析，其在测试集中AUC为0.86(特异性：84％；灵敏性：85％)，ROC如图2所示。可见所述所选分子标记的组合具有较好的灵敏性和特异性。由于样本中有84％的恶性样本为肺癌早期样本，因此该分子标记物的组合对早期肺癌检测及肺结节良恶性检测也有较高的灵敏性和特异性。

选取表10中分子标记物组合B，D，F，G，H和K进行建模分析，其在测试集中的表现分别为：组合B，AUC为0.88(特异性：95％；灵敏性：76％)；组合D，AUC为0.90(特异性：100％；灵敏性：77％)；组合F，AUC为0.90(特异性：100％；灵敏性：77％)；组合G，0.81(特异性：95％；灵敏性：73％)；组合H，AUC为0.87(特异性：90％；灵敏性：73％)；组合K，AUC为0.90(特异性：95％；灵敏性：70％)；ROC如图2所示。可见所述所选分子标记的组合虽然灵敏性稍弱于前述几个组合(组合A,E,J和I)，但都具有较高的特异性。较高的检测特异性，能够更好的降低肺结节良恶性诊断的假阳性率，因此该分子标记物的组合对早期肺癌检测及肺结节良恶性诊断也具有较好的检测能力。

实施例6不同分子标记物及组合对呼吸道液体样本进行肺结节良恶性检测的表现

本实施例对86例呼吸道液体样本中的21个分子标记物包含实施例1中提及的Marker1至Marker21进行检测。其中，样本中手术活检鉴定为良性样本有42例，恶性样本44例，其中恶性样本包含25例I期样本，1例II期样本，6例III期样本，和12例IV样本。具体的检测试剂盒和试验方法以及数据判断处理如实施例2所述，引物和探针组合如实施例1所优选的组合。

选取用实施例5表10中的分子标记物组合A对呼吸道液体样本建模分析，其平均AUC为0.84(特异性：88％；灵敏性：83％)，其对I期恶性样本的灵敏性为77％，对III期和IV期样本灵敏性均达到100％，ROC如图3所示。故通过该方法对呼吸道液体样本进行肺结节良恶性检测有较高的灵敏性和特异性。

选取用实施例5表10中的分子标记物组合C对呼吸道液体样本建模分析，其平均AUC为0.87(特异性：81％；灵敏性：85％)，其对I期恶性样本的灵敏性为77％，对III期和IV期样本灵敏性均达到100％，ROC如图3所示。故通过该方法对呼吸道液体样本进行肺结节良恶性检测有较高的灵敏性和特异性。

选取用实施例5表10中的分子标记物组合D对呼吸道液体样本建模分析，其平均AUC为0.82(特异性：81％；灵敏性：79％)，其对I期恶性样本的灵敏性为73％，对III期和IV期样本灵敏性均达到100％，ROC如图3所示。故通过该方法对呼吸道液体样本进行肺结节良恶性检测有较高的灵敏性和特异性。

选取用实施例5表10中的分子标记物组合E，G，I和K对呼吸道液体样本建模分析，其表现分别为：组合E，平均AUC为0.81(特异性：100％；灵敏性：50％)；组合G，AUC为0.80(特异性：88％；灵敏性：61％)；组合I，平均AUC为0.81(特异性：88％；灵敏性：72％)；组合K，平均AUC为0.85(特异性：88％；灵敏性：78％)。ROC如图3所示。所述该几个分子标记物组合在呼吸道液体样本中都具有较好的特异性,但灵敏性较弱于其他组合(A、C、D)的检测效果，故前述三个分子标记物组合(A、C、D)更适用于对呼吸道液体样本进行肺结节良恶性检测。

选取用实施例5表10中的分子标记物组合F，H和J对呼吸道液体样本建模分析，其表现分别为：组合F，平均AUC为0.84(特异性：77％；灵敏性：83％)；组合H，AUC为0.86(特异性：71％；灵敏性：94％)；组合J，平均AUC为0.87(特异性：71％；灵敏性：100％)。ROC如图3所示。该几个分子标记物组合在呼吸道液体样本中都具有较好的灵敏性,但特异性较弱于其他组合(A、C、D)，以及在肺组织样本中的检测效果，故前述三个分子标记物组合(A、C、D)更适用于对呼吸道液体样本进行肺结节良恶性检测。

由于组织样本直接来源于肿瘤处，而呼吸道液体样本是间接来自于肿瘤处的一些表皮脱落细胞，其获得的肿瘤相关的甲基化信号与直接来源于肿瘤组织的甲基化信号有一定差异，如图4所示。故在针对两种类型样本的检测，最适用的marker组合会有所差异,且相同的marker组合在不同类型呼吸道样本中的表现也不一定相同。

如实施例4所示，marker8分子标记物具有很好的特异性。在实施例5中，对于呼吸道组织样本，只有marker8和marker 9两个分子标记物的组合，已能达到较高的灵敏度和特异性；但是相对于呼吸道组织样本，在呼吸道液体样本中，则需要在此基础上添加一定的合适的marker进行组合，从而达到更好的检测能力。其中组合A和组合C，在marker8和marker9基础上，增添一定合适的marker后，在呼吸道液体样本中都表现出了很好的特异性和灵敏性。

在呼吸道液体样本中，相较于由更多marker进行组合的组合A和组合C而言，只有marker15和marker 16两个分子标物的组合，也表现出较好的检测能力，并且接近组合A和组合C的检测特异性和灵敏性。

本实施例也对呼吸道液体样本中的这些分子标记物Marker6，Marker7，Marker8，Marker9，Marker15，Marker16进行了单分子标记物的检测。如实施例4所述，该6个分子标记物与肺癌有高度的相关性，其在呼吸道液体样本中的单个检测表现具体如表11所示，其中，Marker8具有较高的特异性，但灵敏性低于多marker联合使用下的表现。如本实施例所述的组合A，C和D在保持较高的特异性(>80％)前提下，其灵敏性都比marker8单独使用时的高。综合比较，将特定合适的分子标记物进行联合使用的检测能力，优于单个分子标记物独立检测时的表现。

表11

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市基准医疗有限责任公司

<120> 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用

<160> 213

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagcccgac cccgtggcca cagagcagcc tctgttcctt ggtaatcgtc aacatctggc 60

aggcacctcc acgcccctcc gcccccacca tacgctgctg gctggaggct cccgtgcaat 120

gccaggtgtg ttgggagagg acaggcta 148

<210> 2

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agggggtctg ctgggagagt tggggcgcgg agggctatgc gaattcagca accgggtcgg 60

cctcagagac tctgcgtccc cgctcgaatt gcgcagtcca cgcagccaga gaggcgcggg 120

tgggctctgg gctgccagcc cagag 145

<210> 3

<211> 181

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctgagc ctcctgcaaa agtttgccgg cttccgcagt gatggatcac cgttttagtg 60

gcatttaaat ccccggcgct ccgccgtcta ggtgacgcgc agtcgccccc ccaggcagcc 120

taggcggcgg cagctgctgc ggcgactgca aaggccgatt tggagtgctg gagcgaagaa 180

g 181

<210> 4

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagagcgcac cgggcgtggg ctccagccag gagcgcatgt acctgccgtc cggcgccgcc 60

gccgccacgg gcgcctgggg gtgcacgtag gggtggtggt gatggtggtg gtacaccgca 120

gcgggtacag cgttggcgcc cgccgcgtgc actgggttcc acgaggcgcc aaacaccgtc 180

gccttggac 189

<210> 5

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctcggccag cgtcgccgcc tgccggggag gctggcccag ggtccccggc gcatagcggc 60

caacgctcag ctcatccgcg gcgtcggcgc ccagcaggaa cgagtccacg tagtagttgc 120

ccagggcccc agtggtggcc atcaccgtgc cca 153

<210> 6

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttctgggcg cagggaggcg gcggggggct gctgctgacc gcctcgcagc gctggccggg 60

ctccgggagg agggccccgg cgggtggcgg cgcaggagcc cgaggggaca gaccgggcgg 120

tggcgggggc ggcgggggtg gtggc 145

<210> 7

<211> 182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcgggggccc agggtcccgg caggccgcgt agcgctgcac ggtgcacgcc gcgcgccgcc 60

cgaagcccgc ctccggctgg aagctgctct ctcgcctctg gccgccggcg tagtacccgg 120

gcgagtggtc gctgggtagg taatcgctct gtgaatattc ctcgcatgga gggaacttgg 180

gg 182

<210> 8

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctgtttccg aaagccctcc tacttactgt caagtgaaca aagttaggcg cccacgtgat 60

cctccgagcc aatggccgcc ccgcctgcga ttcccggata aggaaatctg ctcacccgga 120

ccccactcca gccaaagagg tttatttccc c 151

<210> 9

<211> 178

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctccccacc cacccaccca acaccaggat ttacataggg ctcctgcggg gcgaccccct 60

ccttgcctcg ctctctccgg gatcagagag agagcgagag agagagcgcg cgcaggttgc 120

gactggaggg cctgttgggg cgctaggcag agcgcaaacc ctagatccct taagaagt 178

<210> 10

<211> 139

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccagggcagg ctggtcttga gcctggagaa ggctttgctc agcacgcgca tccgggcacg 60

ctcacgggcg ttggccgcgt tccgctgcga ctgcttgcac tctgcggctg agcccttggc 120

cgggaggggc ttcttgcca 139

<210> 11

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccttgcccac acgcgtcctc tttcctcccc cctggccagt ctcgctgtct ccgccttccg 60

ctccctggcg gaggcggagg ccagagagcg ctccaaggaa gactaaaaac ccaggccggg 120

aagcgcgggg tgagaaagcg aggtgggtgg c 151

<210> 12

<211> 166

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcctgacccc gaagctctag gatggagggg agaatttcta ggagcgactt ccccgtcccc 60

tccccaagca atccaccacc gcagggtcgg cgccgctcgg ccttcgctcc ccgcgcacca 120

gttctatctg tgaaggaagc aaaagccaac tcggtggaat cctgac 166

<210> 13

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggcccctggg gacgcggcgc ggcgctcggc gcctccgtcg gaagctcggg ggtcgggcgg 60

gagcctccgg aagggccccg cggagccggg agtccgaggc cgcgcgcacg ccgaaccgag 120

cgtaccaact ccgcgcccgg acgcgtggcg cccccccaac cc 162

<210> 14

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agtcaccgcg ggctacgcca ctcccacccg gcacacgcga cacccgccgc gcgcaggctc 60

ctgcttgcag gtccggccgc tgctcgggcc aagtaaacac cgggctggga aagctcgctg 120

cggagccgct cgggggcaag ccagcccc 148

<210> 15

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gctcgcggct gcagtaccca gacacctggt gcttcatcga ctggaccacc aacgtgacgg 60

cgcacgccgc ctactcctac atgtacgcgg gcttcagctc cttcctcatt ctcgccaccg 120

tcctctgcaa cgtgcttgtg tgcggcgcgc tgctccgcat gcaccgccag ttca 174

<210> 16

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggttgcctcc cggggccacc ccgctgcctc cccagccttg ccgcgcctca gcgactttcg 60

gcgccgccgg agcttccgcc gcatcgcggg cgccgagatc cagatggtca tcttactcat 120

tgccacctcc ctggtggtgc tca 143

<210> 17

<211> 147

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctcgtaggcg cgcggggcca ctactcacgc gcgcactgca ggcctttgcg cacgacgccc 60

cagatgaagt cgccacagag gtcgcaccac gtgtgcgtgg cgggccccgc gggctggaag 120

cggtggccac ggccagggac cagctgc 147

<210> 18

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctccagccgg gtgcggccct tcccagcgcg cccagcgggt gccagctccc gcagctcaat 60

gagctcaggc tcccccgaca tggcccggtt gggcccgtgc ttcgctggct ttgggcgcta 120

gcaagcgcgg gccgggcggg gccacagggc gggc 154

<210> 19

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcctgcccga ccggggtcgc acgagcacag gcgcccacgc catgttggct gcccaaaggg 60

ctcgccgccc aagccgggcc agaaggcagg aggcggaaaa ccagcctccg gtggcgggcg 120

aaagcaaccg ctctttctgt tctctcttcg ccctccctcg tggaaacgca gactcga 177

<210> 20

<211> 157

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tggatggccc cgaggtccaa aaagaaagcg cccaacggct ggacgcacac cccgccaggc 60

ctcctggaaa cggtgccggt gctgcagagc ccgcgaggtg tctgggagtt gggcgagagc 120

tgcagacttg gaggctctta tacctccgtg caggcgg 157

<210> 21

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cagcttgtgc cagcgactac taggtcaggg ggcgcagctg agagaattca agcaacctcc 60

ccgcaaccgg ttccgccgcg tttgtgggct ggtagcccgg aatacatttc ccagaggcct 120

tcgcggccga cgtgcttcgc gcaggaacgc agccgcctc 159

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctctattcct taataatcgt caacatctaa c 31

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgtacgggag tttttagtta gtagcg 26

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aacacctcca cgcccctccg c 21

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caaaacaacc tctattcctt aataatcg 28

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ttttagttag tagcgtatgg tggg 24

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

caacatctaa caaacacctc cacgccc 27

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

acaaaacaac ctctattcct taataatcg 29

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tttaatatat ttggtattgt acgggagttt 30

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

caacatctaa caaacacctc cacgccc 27

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cggagggtta tgcgaattta gtaa 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gcctctctaa ctacgtaaac tacg 24

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cgaaaacgca aaatctctaa aaccgacccg 30

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gagggttatg cgaatttagt aatcg 25

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gcctctctaa ctacgtaaac tacgc 25

<210> 36

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cgaacgaaaa cgcaaaatct ctaaaaccga c 31

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

tcaacaaccg aatcgacctc aaaa 24

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tgggttggta gtttagagtt tattcg 26

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

cccgctcgaa ttacgcaatc cacgc 25

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

acttccgcaa taataaatca ccgtt 25

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ttgtagtcgt cgtagtagtt gtcgtc 26

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

acatttaaat ccccgacgct ccgcc 25

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

agtgatggat tatcgtttta gtggtat 27

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

actccaaatc gacctttaca atcg 24

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

cgcaacaact accgccgcct aaact 25

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

cgcgcataac taaacctcct ac 22

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

tgtagtcgtc gtagtagttg tcg 23

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

accgacttcc gcaataataa atcaccgttt 30

<210> 49

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

ttagttagga gcgtatgtat ttgtcg 26

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gcctcgtaaa acccaataca cg 22

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

acgaacgcca acgctatacc cgcta 25

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

ccgaacgtaa actccaacca aa 22

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

cgttgtattc gttgcggtgt a 21

<210> 54

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

catataccta ccgtccgacg ccgcc 25

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

ggagcgtatg tatttgtcgt tcg 23

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

aaacccaata cacgcgacga a 21

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cgctataccc gctacgatat accaccacca 30

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

aactaaccca aaatccccga cg 22

<210> 59

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

tgggtaatta ttacgtggat tcgtttt 27

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

ataacgacca acgctcaact catccgc 27

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

gttcggttag cgtcgtcgtt 20

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

acgccgcgaa taaactaaac g 21

<210> 63

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

aaccgctata cgccgaaaac cctaaacc 28

<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

actaacccaa aatccccgac g 21

<210> 65

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

gggtacggtg atggttatta ttgg 24

<210> 66

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

ataacgacca acgctcaact catccgc 27

<210> 67

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

tgttgttgat cgtttcgtag cg 22

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

cgatctatcc cctcgaactc cta 23

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

ccgccacccg ccgaaaccc 19

<210> 70

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

gttgttgttg atcgtttcgt agcg 24

<210> 71

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

gatctatccc ctcgaactcc tacg 24

<210> 72

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

ccgaaaccct cctcccgaaa cccg 24

<210> 73

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

gggttgttgt tgatcgtttc gtag 24

<210> 74

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

gatctatccc ctcgaactcc tacg 24

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

cgccgaaacc ctcctcccga aaccc 25

<210> 76

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

tagcgttgta cggtgtacgt cg 22

<210> 77

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

acaaaacgat tacctaccca acg 23

<210> 78

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

cccgaatact acgccgacga ccaaa 25

<210> 79

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

aagttcgttt tcggttggaa gttg 24

<210> 80

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

aaacgattac ctacccaacg acca 24

<210> 81

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

cgcccgaata ctacgccgac gacca 25

<210> 82

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

aagttcgttt tcggttggaa gttg 24

<210> 83

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

aaacgattac ctacccaacg acca 24

<210> 84

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

cgcccgaata ctacgccgac gacca 25

<210> 85

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

aagtgaataa agttaggcgt ttacg 25

<210> 86

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

atccgaataa acaaatttcc ttatccg 27

<210> 87

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

aatcgcaaac gaaacgacca ttaactcgaa 30

<210> 88

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

ttaagtgaat aaagttaggc gtttacg 27

<210> 89

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

atccgaataa acaaatttcc ttatccg 27

<210> 90

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

aatcgcaaac gaaacgacca ttaactcgaa 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

gaataaagtt aggcgtttac gtgatt 26

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

atccgaataa acaaatttcc ttatccg 27

<210> 93

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

aatcgcaaac gaaacgacca ttaactcgaa 30

<210> 94

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

aatttacata aaactcctac gaaacga 27

<210> 95

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

cgttttgttt agcgttttaa taggttt 27

<210> 96

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

ccctccttac ctcgctctct ccgaaat 27

<210> 97

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

aaaatttaca taaaactcct acgaaacg 28

<210> 98

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

gcgttttgtt tagcgtttta atagg 25

<210> 99

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

ccctccttac ctcgctctct ccgaaat 27

<210> 100

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

tttacataaa actcctacga aacgacc 27

<210> 101

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

gtttagcgtt ttaataggtt ttttagtcg 29

<210> 102

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

cctccttacc tcgctctctc cgaaatcaa 29

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

gcggtttagg gtaggttggt 20

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

gcaaaataca aacaatcgca acg 23

<210> 105

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

cgaccaacgc ccgtaaacgt accc 24

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

gtttggagaa ggttttgttt agtacg 26

<210> 107

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 107

tcaaccgcaa aatacaaaca atcg 24

<210> 108

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 108

cgaccaacgc ccgtaaacgt ac 22

<210> 109

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

aaactttact caacacgcgc atc 23

<210> 110

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 110

agtcgtagag tgtaagtagt cgtagcg 27

<210> 111

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 111

aacacgctca cgaacgttaa ccgcg 25

<210> 112

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 112

ttttggttag tttcgttgtt ttcgtt 26

<210> 113

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 113

tcccgaccta aatttttaat cttcctta 28

<210> 114

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 114

ctctctaacc tccgcctccg ccaaa 25

<210> 115

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 115

ttttggttag tttcgttgtt ttcgt 25

<210> 116

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 116

cgcgcttccc gacctaaa 18

<210> 117

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 117

atcttcctta aaacgctctc taacctccgc 30

<210> 118

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 118

ggttagtttc gttgttttcg tttt 24

<210> 119

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 119

cgcgcttccc gacctaaa 18

<210> 120

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 120

atcttcctta aaacgctctc taacctccgc 30

<210> 121

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 121

gagaattttt aggagcgatt ttttcg 26

<210> 122

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 122

ccttcacaaa taaaactaat acgcgaaa 28

<210> 123

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 123

aaaccgaacg acgccgaccc tacg 24

<210> 124

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 124

tcgaagtttt aggatggagg ggag 24

<210> 125

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 125

tacttccttc acaaataaaa ctaatacgcg a 31

<210> 126

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 126

accgaacgac gccgacccta cgata 25

<210> 127

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 127

ttgagtagga gaaattttga tttcg 25

<210> 128

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 128

aactaatacg cgaaaaacga aaaccg 26

<210> 129

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 129

aacgcacgcc gaccctacga taataa 26

<210> 130

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 130

cgttttcgtc ggaagttcg 19

<210> 131

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 131

gaaattaata cgctcgattc gacgt 25

<210> 132

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 132

cctcgaactc ccgactccgc gaaac 25

<210> 133

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 133

ttcggcgttt tcgtcggaag tc 22

<210> 134

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 134

attaatacgc tcgattcgac gtacg 25

<210> 135

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 135

tacgcgcgac ctcgaactcc cgactcc 27

<210> 136

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 136

cgttttcgtc ggaagttcg 19

<210> 137

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 137

tacgctcgat tcgacgtacg c 21

<210> 138

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 138

ctcgaactcc cgactccgcg aa 22

<210> 139

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 139

cggtatacgc gatattcgtc g 21

<210> 140

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 140

actttcccaa cccgatattt actta 25

<210> 141

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 141

cccgaacaac gaccgaacct acaaacaa 28

<210> 142

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 142

ggtatacgcg atattcgtcg c 21

<210> 143

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 143

acgaactttc ccaacccgat 20

<210> 144

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 144

cccgaacaac gaccgaacct acaaacaa 28

<210> 145

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 145

cgcgcaaact cctacttaca aa 22

<210> 146

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 146

gggttggttt gttttcgagc g 21

<210> 147

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 147

ccgaccgcta ctcgaaccaa ataaacacc 29

<210> 148

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 148

aatacttcat cgactaaacc accaa 25

<210> 149

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 149

gaatgaggaa ggagttgaag ttcg 24

<210> 150

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 150

taacgacgca cgccgcctac tccta 25

<210> 151

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 151

tacttcatcg actaaaccac caac 24

<210> 152

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 152

cgtatataag tacgttgtag aggacgg 27

<210> 153

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 153

taacgacgca cgccgcctac tcc 23

<210> 154

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 154

ctaatacttc atcgactaaa ccaccaa 27

<210> 155

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 155

gaatgaggaa ggagttgaag ttcg 24

<210> 156

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 156

taacgacgca cgccgcctac tccta 25

<210> 157

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 157

ttagttttgt cgcgttttag cg 22

<210> 158

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 158

ataaataaaa taaccatcta aatctcgacg 30

<210> 159

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 159

cgatacgacg aaaactccga cgacgc 26

<210> 160

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 160

ttttagtttt gtcgcgtttt agc 23

<210> 161

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 161

aaataaccat ctaaatctcg acgc 24

<210> 162

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 162

acgaaaactc cgacgacgcc gaa 23

<210> 163

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 163

attacctccc gaaaccaccc 20

<210> 164

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 164

gtaatgagta agatgattat ttggatttcg 30

<210> 165

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 165

ccaaccttac cgcgcctcaa cgact 25

<210> 166

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 166

cgcgcactac aaacctttac g 21

<210> 167

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 167

ttagttcgcg gggttcgtta 20

<210> 168

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 168

acgacgcccc aaataaaatc gccaca 26

<210> 169

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 169

ttagatgaag tcgttataga ggtcgta 27

<210> 170

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 170

aactaatccc taaccgtaac cacc 24

<210> 171

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 171

cttccaaccc gcgaaacccg ccac 24

<210> 172

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 172

cgttttagat gaagtcgtta tagaggt 27

<210> 173

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 173

ccgacaacta atccctaacc gtaa 24

<210> 174

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 174

cttccaaccc gcgaaacccg ccac 24

<210> 175

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 175

gtttagcggg tgttagtttt cgta 24

<210> 176

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 176

ttactaacgc ccaaaaccaa cg 22

<210> 177

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 177

aacacgaacc caaccgaacc atatcgaaa 29

<210> 178

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 178

gttttagtcg ggtgcggttt 20

<210> 179

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 179

cgcttactaa cgcccaaaac 20

<210> 180

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 180

aacgaaacac gaacccaacc gaacc 25

<210> 181

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 181

ttagcgggtg ttagttttcg t 21

<210> 182

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 182

cgcttactaa cgcccaaaac 20

<210> 183

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 183

aacgaaacac gaacccaacc gaacc 25

<210> 184

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 184

cgcccacgcc atattaacta c 21

<210> 185

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 185

ggttgttttc gttcgttatc gga 23

<210> 186

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 186

cgccgcccaa accgaaccaa aa 22

<210> 187

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 187

gtttgttcga tcggggtcg 19

<210> 188

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 188

cccgccaccg aaaactaatt 20

<210> 189

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 189

cgtaaacgcc tatactcgta c 21

<210> 190

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 190

ttagtcgggt tagaaggtag gaggc 25

<210> 191

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 191

tcgaatctac gtttccac 18

<210> 192

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 192

gattactttc gcccgccac 19

<210> 193

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 193

aaagaaagcg tttaacggtt gga 23

<210> 194

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 194

atctacaact ctcgcccaac tc 22

<210> 195

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 195

cgcgaactct acaacaccga cacc 24

<210> 196

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 196

cgctaaataa ccccgaaatc caa 23

<210> 197

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 197

cgggttttgt agtatcggta tcg 23

<210> 198

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 198

aaacgcccaa cgactaaacg cacac 25

<210> 199

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 199

gtttaacggt tggacgtata tttcg 25

<210> 200

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 200

atctacaact ctcgcccaac tcc 23

<210> 201

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 201

cgcgaactct acaacaccga caccg 25

<210> 202

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 202

ttagcgatta ttaggttagg gggc 24

<210> 203

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 203

tcgaccgcga aaacctctaa a 21

<210> 204

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 204

ttccgaacta ccaacccaca aacgcg 26

<210> 205

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 205

aatttaagta attttttcgt aatcgg 26

<210> 206

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 206

aaacgactac gttcctacgc gaaacagtc 29

<210> 207

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 207

ttccgaacta ccaacccaca aacgc 25

<210> 208

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 208

gggcgtagtt gagagaattt aagtaa 26

<210> 209

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 209

cgaccgcgaa aacctctaaa 20

<210> 210

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 210

atattccgaa ctaccaaccc acaaacgc 28

<210> 211

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 211

gtgatggagg aggtttagta agtt 24

<210> 212

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 212

ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25

<210> 213

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 213

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims

1.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的序列；或为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的完全互补序列。

2.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为：SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16的序列；或为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的完全互补序列。

3.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为：SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的序列；或为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的完全互补序列。

4.可用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物组合，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物的组合为：SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.21所示序列；或为SEQ ID NO.1~SEQ IDNO.21所示序列的完全互补序列。

5.检测权利要求1-4任一项所述DNA甲基化分子标记物或其组合的甲基化水平的试剂在制备检测肺结节良恶性、和/或早期肺癌的试剂盒中的应用。

6.一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测权利要求1~4任一项所述的DNA甲基化分子标记物组合的甲基化水平的试剂。

7.根据权利要求6所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括采用 PCR扩增法、荧光定量PCR法、数字PCR法、液相芯片法、三代测序法、二代测序法、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、简化亚硫酸氢盐测序技术或它们的组合所使用的试剂。

8.根据权利要求7所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括针对权利要求1-4任一DNA甲基化分子标记物组合的荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物和探针选自如下：

针对SEQ ID NO.1的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示引物，以及SEQ ID NO.24所示探针；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示引物，以及SEQ IDNO.27所示探针；SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示引物，以及SEQ ID NO.30所示探针；

针对SEQ ID NO.2的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示引物，以及SEQ ID NO.33所示探针；SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示引物，以及SEQ IDNO.36所示探针；SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示引物，以及SEQ ID NO.39所示探针；

针对SEQ ID NO.3的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示引物，以及SEQ ID NO.42所示探针；SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示引物，以及SEQ IDNO.45所示探针；SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示引物，以及SEQ ID NO.48所示探针；

针对SEQ ID NO.4的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示引物，以及SEQ ID NO.51所示探针；SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53所示引物，以及SEQ IDNO.54所示探针；SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示引物，以及SEQ ID NO.57所示探针；

针对SEQ ID NO.5的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59所示引物，以及SEQ ID NO.60所示探针；SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62所示引物，以及SEQ IDNO.63所示探针；SEQ ID NO.64和SEQ ID NO.65所示引物，以及SEQ ID NO.66所示探针；

针对SEQ ID NO.6的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68所示引物，以及SEQ ID NO.69所示探针；SEQ ID NO.70和SEQ ID NO.71所示引物，以及SEQ IDNO.72所示探针；SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74所示引物，以及SEQ ID NO.75所示探针；

针对SEQ ID NO.7的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.76和SEQ ID NO.77所示引物，以及SEQ ID NO.78所示探针；SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80所示引物，以及SEQ IDNO.81所示探针；SEQ ID NO.82和SEQ ID NO.83所示引物，以及SEQ ID NO.84所示探针；

针对SEQ ID NO.8的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.86所示引物，以及SEQ ID NO.87所示探针；SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.89所示引物，以及SEQ IDNO.90所示探针；SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.92所示引物，以及SEQ ID NO.93所示探针；

针对SEQ ID NO.9的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.94和SEQ ID NO.95所示引物，以及SEQ ID NO.96所示探针；SEQ ID NO.97和SEQ ID NO.98所示引物，以及SEQ IDNO.99所示探针；SEQ ID NO.100和SEQ ID NO.101所示引物，以及SEQ ID NO.102所示探针；

针对SEQ ID NO.10的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.104所示引物，以及SEQ ID NO.105所示探针；SEQ ID NO.106和SEQ ID NO.107所示引物，以及SEQ ID NO.108所示探针；SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.110所示引物，以及SEQ ID NO.111所示探针；

针对SEQ ID NO.11的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.112和SEQ ID NO.113所示引物，以及SEQ ID NO.114所示探针；SEQ ID NO.115和SEQ ID NO.116所示引物，以及SEQ ID NO.117所示探针；SEQ ID NO.118和SEQ ID NO.119所示引物，以及SEQ ID NO.120所示探针；

针对SEQ ID NO.12的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.122所示引物，以及SEQ ID NO.123所示探针；SEQ ID NO.124和SEQ ID NO.125所示引物，以及SEQ ID NO.126所示探针；SEQ ID NO.127和SEQ ID NO.128所示引物，以及SEQ ID NO.129所示探针；

针对SEQ ID NO.13的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.130和SEQ ID NO.131所示引物，以及SEQ ID NO.132所示探针；SEQ ID NO.133和SEQ ID NO.134所示引物，以及SEQ ID NO.135所示探针；SEQ ID NO.136和SEQ ID NO.137所示引物，以及SEQ ID NO.138所示探针；

针对SEQ ID NO.14的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.139和SEQ ID NO.140所示引物，以及SEQ ID NO.141所示探针；SEQ ID NO.142和SEQ ID NO.143所示引物，以及SEQ ID NO.144所示探针；SEQ ID NO.145和SEQ ID NO.146所示引物，以及SEQ ID NO.147所示探针；

针对SEQ ID NO.15的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.148和SEQ ID NO.149所示引物，以及SEQ IDNO.150所示探针；SEQ ID NO.151和SEQ ID NO.152所示引物，以及SEQ ID NO.153所示探针；SEQ ID NO.154和SEQ ID NO.155所示引物，以及SEQ ID NO. 156所示探针；

针对SEQ ID NO.16的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.157和SEQ ID NO.158所示引物，以及SEQ ID NO. 159所示探针；SEQ ID NO.160和SEQ ID NO.161所示引物，以及SEQ ID NO.162所示探针；SEQ ID NO.163和SEQ ID NO.164所示引物，以及SEQ ID NO. 165所示探针；

针对SEQ ID NO.17的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.166和SEQ ID NO.167所示引物，以及SEQ ID NO.168所示探针；SEQ ID NO.169和SEQ ID NO.170所示引物，以及SEQ ID NO.171所示探针；SEQ ID NO.172和SEQ ID NO.173所示引物，以及SEQ ID NO.174所示探针；

针对SEQ ID NO.18的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.175和SEQ ID NO.176所示引物，以及SEQ ID NO.177所示探针；SEQ ID NO.178和SEQ ID NO.179所示引物，以及SEQ ID NO.180所示探针；SEQ ID NO.181和SEQ ID NO.182所示引物，以及SEQ ID NO.183所示探针；

针对SEQ ID NO.19的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.184和SEQ ID NO.185所示引物，以及SEQ ID NO.186所示探针；SEQ ID NO.187和SEQ ID NO.188所示引物，以及SEQ ID NO.189所示探针；SEQ ID NO.190和SEQ ID NO.191所示引物，以及SEQ ID NO.192所示探针；

针对SEQ ID NO.20的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.193和SEQ ID NO.194所示引物，以及SEQ ID NO.195所示探针；SEQ ID NO.196和SEQ ID NO.197所示引物，以及SEQ ID NO.198所示探针；SEQ ID NO.199和SEQ ID NO.200所示引物，以及SEQ ID NO.201所示探针；

针对SEQ ID NO.21的引物和探针选自以下至少一组：SEQ ID NO.202和SEQ ID NO.203所示引物，以及SEQ ID NO.204所示探针；SEQ ID NO.205和SEQ ID NO.206所示引物，以及SEQ ID NO.207所示探针；SEQ ID NO.208和SEQ ID NO.209所示引物，以及SEQ ID NO.210所示探针。

9.根据权利要求8所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针为：

针对SEQ ID NO.1的引物和探针为：SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示引物，以及SEQID NO.24所示探针；

针对SEQ ID NO.2的引物和探针为：SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示引物，以及SEQID NO.36所示探针；

针对SEQ ID NO.3的引物和探针为：SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示引物，以及SEQID NO.42所示探针；

针对SEQ ID NO.4的引物和探针为：SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示引物，以及SEQID NO.57所示探针；

针对SEQ ID NO.5的引物和探针为：SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59所示引物，以及SEQID NO.60所示探针；

针对SEQ ID NO.6的引物和探针为：SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68所示引物，以及SEQID NO.69所示探针；

针对SEQ ID NO.7的引物和探针为：SEQ ID NO.76和SEQ ID NO.77所示引物，以及SEQID NO.78所示探针；

针对SEQ ID NO.8的引物和探针为：SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.89所示引物，以及SEQID NO.90所示探针；

针对SEQ ID NO.9的引物和探针为：SEQ ID NO.100和SEQ ID NO.101所示引物，以及SEQ ID NO.102所示探针；

针对SEQ ID NO.10的引物和探针为：SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.110所示引物，以及SEQ ID NO.111所示探针；

针对SEQ ID NO.11的引物和探针为：SEQ ID NO.112和SEQ ID NO.113所示引物，以及SEQ ID NO.114所示探针；

针对SEQ ID NO.12的引物和探针为：SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.122所示引物，以及SEQ ID NO.123所示探针；

针对SEQ ID NO.13的引物和探针为：SEQ ID NO.130和SEQ ID NO.131所示引物，以及SEQ ID NO.132所示探针；

针对SEQ ID NO.14的引物和探针为：SEQ ID NO.142和SEQ ID NO.143所示引物，以及SEQ ID NO.144所示探针；

针对SEQ ID NO.15的引物和探针为：SEQ ID NO.151和SEQ ID NO.152所示引物，以及SEQ ID NO.153所示探针；

针对SEQ ID NO.16的引物和探针为：SEQ ID NO.160和SEQ ID NO.161所示引物，以及SEQ ID NO.162所示探针；

针对SEQ ID NO.17的引物和探针为：SEQ ID NO.166和SEQ ID NO.167所示引物，以及SEQ ID NO.168所示探针；

针对SEQ ID NO.18的引物和探针为：SEQ ID NO.175和SEQ ID NO.176所示引物，以及SEQ ID NO.177所示探针；

针对SEQ ID NO.19的引物和探针为：SEQ ID NO.184和SEQ ID NO.185所示引物，以及SEQ ID NO.186所示探针；

针对SEQ ID NO.20的引物和探针为：SEQ ID NO.199和SEQ ID NO.200所示引物，以及SEQ ID NO.201所示探针；

针对SEQ ID NO.21的引物和探针为： SEQ ID NO.208和SEQ ID NO.209所示引物，以及SEQ ID NO.210所示探针。

10.根据权利要求8所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含针对内参基因ACTB的荧光定量PCR检测的引物和探针。

11.根据权利要求10所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述针对内参基因ACTB所述引物和探针为：SEQ ID NO.211和SEQ ID NO.212所示引物，以及SEQ IDNO.213所示探针。

12.根据权利要求8-11任一项所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为呼吸道样本。