CN116411073A - 用于检测食管癌或癌前病变的核酸产品、试剂盒及应用 - Google Patents

用于检测食管癌或癌前病变的核酸产品、试剂盒及应用 Download PDF

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CN116411073A CN202211702205.5A CN202211702205A CN116411073A CN 116411073 A CN116411073 A CN 116411073A CN 202211702205 A CN202211702205 A CN 202211702205A CN 116411073 A CN116411073 A CN 116411073A
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Abstract

本申请涉及用于检测食管癌或癌前病变的核酸产品、试剂盒及应用。本申请提供一种检测食管癌或癌前病变的核酸组合，所述核酸组合包括检测靶序列甲基化水平的核酸组合，所述靶序列包括第一靶序列和/或第二靶序列，所述第一靶序列包括Chr18:3012367‑3012756区域的全长或其部分区域；所述第二靶序列包括Chr7:155459949‑155460426区域的全长或其部分区域。本申请通过检测Chr18:3012367‑3012756和/或Chr7:155459949‑155460426区域的甲基化水平的改变可以对食管鳞癌及癌前病变进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性，可以有效地提高食管鳞癌及癌前病变的检出率。

Description

用于检测食管癌或癌前病变的核酸产品、试剂盒及应用
技术领域
本申请涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测食管癌或癌前病变的核酸产品、试剂盒及应用。
背景技术
食管癌是全球第八大常见癌症类型，死亡率在所有癌症类型中排第六位，5年生存率<20％。食管腺癌(EAC)和食管鳞状细胞癌(ESCC)是食管恶性肿瘤的两种主要亚型，各有不同的流行病学和病理生理学特征。ESCC是由于食管上皮细胞的恶性转化而发生的，在中国，ESCC是最主要的食管癌病理类型，且好发于中老年男性。地理位置是显著影响ESCC发病率的一个因素。在全球范围内，ESCC发病率差异高达16倍，80％的病例发生在发展中国家。中国部分地区位于“食管癌带”，所以针对食管鳞癌的早诊早治是非常必要的。
ESCC患者通常临床表现为吞咽困难和体重减轻，出现相应症状时通常处于疾病晚期。虽然常规检查中的一些指标异常可能提示ESCC的存在，但诊断的金标准仍然是内镜检查及组织活检，而内镜具有侵入性，患者依从性低。尽管在某些临床病例中，通过内镜直接显示肿块几乎可以确定肿瘤的可能性，但必须对病变部位进行活检，通过组织学检测上皮内瘤变(不确定的、低级别的或高级别的，后两者被认为是ESCC的癌前前体)或ESCC，以及肿瘤分化状态来确认诊断。除了传统的内镜检查，人们还发明了多种技术来加强对食管癌变的检测，如进行肿瘤相关标志物(鳞状细胞癌抗原)检查、食管吞钡X线检查等，然而鳞状细胞癌抗原(SCC)检测可检测多种鳞状细胞癌，例如：肺癌、头颈鳞癌、宫颈上皮癌等，不具备检测食管鳞癌的单一性；同时，术前麻醉等影响会使SCC检测值升高，使得SCC检测的准确度不足；而食管吞钡X线检查除具有一定的放射性外，X线钡餐检查结果仅能作为诊断参考，不能直接判断是否为癌。这几种检测方法的不足造成的漏诊和过诊问题一直困扰着临床，迫切需要具备稳定性高、灵敏度高且特异性强的新检测方法精准识别出高级别病变，用于食管癌和癌前病变的早期诊断或辅助诊断。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测食管癌或癌前病变的核酸组合、试剂盒，可以有效区分健康人与食管癌及食管上皮内瘤变患者。
具体技术方案如下：
一种检测食管癌或癌前病变的核酸组合，所述核酸组合包括检测靶序列甲基化水平的核酸组合，所述靶序列包括第一靶序列和/或第二靶序列，其中以GRCh38.p14为参考，所述第一靶序列包括Chr18:3012367-3012756区域的全长或其部分区域；所述第二靶序列包括Chr7:155459949-155460426区域的全长或其部分区域。
在其中一个实施例中，所述Chr18:3012367-3012756区域的部分区域包括区域1、区域2、区域3和区域4中的一个或多个；和/或，所述Chr7:155459949-155460426区域的部分区域包括区域5、区域6、区域7和区域8中的一个或多个。
其中，所述区域1为Chr18:3012374-3012558正链；所述区域2为Chr18:3012539-3012718正链；所述区域3为Chr18:3012566-3012756负链；所述区域4为Chr18:3012367-3012565bp负链；所述区域5为Chr7:155459949-155460122正链；所述区域6为Chr7:155460212-155460376正链；所述区域7为Chr7:155460291-155460426负链；所述区域8为Chr7:155459956-155460122负链。
在其中一个实施例中，所述检测第一靶序列甲基化水平的核酸组合包括第一核酸组合、第二核酸组合、第三核酸组合和第四核酸组合中的至少一组。
在其中一个实施例中，所述检测第二靶序列甲基化水平的核酸组合包括第五核酸组合、第六核酸组合、第七核酸组合和第八核酸组合中的至少一组。
在其中一个实施例中，所述第一核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物对；所述第二核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5所示的引物对；所述第三核酸组合包括核苷酸序列如SEQ IDNO.7～8所示的引物对；所述第四核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示的引物对；所述第五核酸组合包括核苷酸序列如SEQ IDNO.13～14所示的引物对；所述第六核酸组合包括核苷酸序列如SEQ IDNO.16～17所示的引物对；所述第七核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20所示的引物对；所述第八核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.22～23所示的引物对。
在其中一个实施例中，所述第一核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针；所述第二核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的探针；所述第三核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示的探针；所述第四核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的探针；所述第五核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的探针；所述第六核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的探针；所述第七核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的探针；所述第八核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的探针。
一种检测食管癌或癌前病变的试剂盒，包括上述任一项所述的检测食管癌或癌前病变的核酸组合。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括样本的采样装置、核酸提取试剂、核酸纯化试剂中至少一种。
核酸组合在制备如下任一项产品中的应用：(a)诊断食管癌或癌前病变；(b)区分食管癌样本和食管炎样本；(c)区分食管癌前病变样本和食管炎样本，其中，所述核酸组合包括检测靶序列甲基化水平的核酸组合，所述靶序列包括第一靶序列和/或第二靶序列，其中所述第一靶序列包括Chr18:3012367-3012756区域的全长或其部分区域；所述第二靶序列包括Chr7:155459949-155460426区域的全长或其部分区域。
在其中一个实施例中，所述Chr18:3012367-3012756区域的部分区域包括区域1、区域2、区域3和区域4中的一个或多个。
在其中一个实施例中，所述Chr7:155459949-155460426区域的部分区域包括区域5、区域6、区域7和区域8中的一个或多个。
在其中一个实施例中，所述区域1为Chr18:3012374-3012558正链；所述区域2为Chr18:3012539-3012718正链；所述区域3为Chr18:3012566-3012756负链；所述区域4为Chr18:3012367-3012565bp负链；所述区域5为Chr7:155459949-155460122正链；所述区域6为Chr7:155460212-155460376正链；所述区域7为Chr7:155460291-155460426负链；所述区域8为Chr7:155459956-155460122负链。
在其中一个实施例中，所述靶序列包括区域1～区域8中的至少一个。
可选地，所述靶序列包括区域1～区域4中的至少一个，且包含区域5～区域8中的至少一个。
在其中一个实施例中，所述核酸组合包括第一核酸组合、第二核酸组合、第三核酸组合、第四核酸组合、第五核酸组合、第六核酸组合、第七核酸组合和第八核酸组合中的至少一组。
所述第一核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物对；所述第二核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5所示的引物对；所述第三核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的引物对；所述第四核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示的引物对；所述第五核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示的引物对；所述第六核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.16～17所示的引物对；所述第七核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20所示的引物对；所述第八核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.22～23所示的引物对。
可选地，所述第一核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针；所述第二核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的探针；所述第三核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针；所述第四核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的探针；所述第五核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的探针；所述第六核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的探针；所述第七核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的探针；所述第八核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的探针。
在其中一个实施例中，所述食管癌包括食管鳞癌，所述癌前病变包括食管上皮内瘤变。
相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：
本申请通过检测Chr18:3012367-3012756bp和/或Chr7:155459949-155460426bp区域的甲基化水平的改变可以对食管鳞癌及癌前病变进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性，可以有效地提高食管鳞癌及癌前病变的检出率。
本申请提供的试剂或试剂盒可以快速、简单地进行测试，检测稳定，检测灵敏度高，特异性高，有助于食管鳞癌和癌前病变的早期诊断。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将对本申请进行更全面的描述。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本申请公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
术语解释
术语“和/或”均是指包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
术语“基因”是指编码产生氨基酸多肽链的DNA区段，它包括参与基因转录/翻译和转录/翻译调控的位于编码区和非编码区的序列，以及外显子和内含子序列。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代笔定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100％，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
本申请一实施方式提供了一种检测食管癌或癌前病变的核酸组合，核酸组合包括检测靶序列甲基化水平的核酸组合，靶序列包括第一靶序列和/或第二靶序列，其中，第一靶序列包括LPIN2基因上的Chr18:3012367-3012756区域的全长或其部分区域，第二靶序列包括EN2基因上的Chr7:155459949-155460426区域的全长或其部分区域。本申请中所提到的位点或区域的位置均是以GRCh38.p14为参考。
LPIN2基因位于人类18号染色体上，具体位置为2916994-3013144bp，小鼠研究表明，该基因在正常脂肪组织发育过程中发挥作用，并可能在人类甘油三酯代谢中发挥作用，该基因可能与人类脂肪营养不良有关。
EN2基因位于人类7号染色体上，具体位置为155458129-155464831bp，该基因与人类中枢神经系统发育过程中模式形成的控制有关。
在一个具体示例中，Chr18:3012367-3012756区域的部分区域包括区域1、区域2、区域3和区域4中的一个或多个；和/或，Chr7:155459949-155460426区域的部分区域包括区域5、区域6、区域7和区域8中的一个或多个。
其中，所述区域1为Chr18:3012374-3012558正链；所述区域2为Chr18:3012539-3012718正链；所述区域3为Chr18:3012566-3012756负链；所述区域4为Chr18:3012367-3012565bp负链；所述区域5为Chr7:155459949-155460122正链；所述区域6为Chr7:155460212-155460376正链；所述区域7为Chr7:155460291-155460426负链；所述区域8为Chr7:155459956-155460122负链。
在一个具体示例中，检测第一靶序列甲基化水平的核酸组合包括第一核酸组合、第二核酸组合、第三核酸组合和第四核酸组合中的至少一组。
在一个具体示例中，检测第二靶序列甲基化水平的核酸组合包括第五核酸组合、第六核酸组合、第七核酸组合和第八核酸组合中的至少一组。
在一个具体示例中，第一核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物对；第二核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5所示的引物对；第三核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的引物对；第四核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示的引物对；第五核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示的引物对；第六核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.16～17所示的引物对；第七核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20所示的引物对；第八核酸组合包括核苷酸序列如SEQ IDNO.22～23所示的引物对。
在一个具体示例中，第一核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针；第二核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的探针；第三核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针；第四核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的探针；第五核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示的探针；第六核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的探针；第七核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的探针；第八核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的探针。
在一个具体示例中，本申请的探针可以为TaqMan探针，其5’端连接有荧光基团，其3’端连接有荧光淬灭基团。
本申请一实施方式提供了一种检测食管癌或癌前病变的试剂盒，包括上述任一项所述的检测食管癌或癌前病变的核酸组合。
在一个具体示例中，该试剂盒还包括样本的采样装置、核酸提取试剂、核酸纯化试剂中至少一种。可选地，试剂盒还包括将基因的未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂，例如，该试剂可以是亚硫酸氢盐。
在一个具体示例中，试剂盒通过如下方法中的一种或几种实现对所述靶序列甲基化的检测：
甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
本申请一实施方式还提供了核酸组合在制备如下(a)～(c)任一项产品中的应用：
(a)在制备诊断食管癌或癌前病变的产品中的应用；
(b)在制备区分食管癌样本和食管炎样本的产品中的应用；
(c)在制备区分食管癌前病变样本和食管炎样本的产品中的应用。
其中，该核酸组合包括检测靶序列的甲基化水平的核酸组合，靶序列包括第一靶序列和/或第二靶序列，其中第一靶序列包括Chr18:3012367-3012756区域的全长或其部分区域，第二靶序列包括Chr7:155459949-155460426区域的全长或其部分区域。
在一个具体示例中，Chr18:3012367-3012756区域的部分区域包括区域1、区域2、区域3和区域4中的一个或多个。Chr7:155459949-155460426区域的部分区域包括区域5、区域6、区域7和区域8中的一个或多个。
具体地，区域1为Chr18:3012374-3012558正链；区域2为Chr18:3012539-3012718正链；区域3为Chr18:3012566-3012756负链；区域4为Chr18:3012367-3012565bp负链；区域5为Chr7:155459949-155460122正链；区域6为Chr7:155460212-155460376正链；区域7为Chr7:155460291-155460426负链；区域8为Chr7:155459956-155460122负链。
在一个具体示例中，靶序列包括区域1～区域8中的至少一个。可选地，靶序列包括区域1～区域4中的至少一个，且包含区域5～区域8中的至少一个。当靶序列为两个以上区域组合时，诊断食管癌或癌前病变的效果更优。
对于组织样本，该区域组合诊断食管癌及食管上皮内瘤变的灵敏度显著提升，最高分别可达到96.77％和86.54％，此外，区域组合检测癌旁正常组织的特异性最高可以达到85％。
对于脱落细胞样本，该区域组合对于食管鳞癌检测灵敏度可以达到94.29％，对于上皮内瘤变的检测灵敏度为82.14％。在非癌患者样本中该区域组合的特异性表现较好，可以高达96.15％。
对于血浆样本，该区域组合检测食管鳞癌的灵敏度可以达到90％，对上皮内瘤变的检测灵敏度最高达到84.31％。而且，在健康人中的检测特异性可高达99.09％。
本申请一实施方式还提供了使用上述靶序列的甲基化水平诊断食管癌或癌前病变的方法，包括如下步骤：
检测上述靶序列的甲基化水平；及
根据靶序列的甲基化水平判定待测样本是否为样本阳性。
可选地，当靶序列为多个区域组合时，判定方法为至少一个区域的Ct值小于等于阈值时，则认为待测样本为阳性样本即食管癌或癌前病变阳性。阈值为本领域技术人员通过对食管癌或癌前病变患者和健康人的样本集进行ROC曲线分析，选择约登指数最大时的截断值作为阈值。不同类型的样本选择的阈值可不同。
具体实施例
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1
本实施例提供用于食管鳞癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合1，核苷酸组合1包括SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合1可检测LPIN2基因上Chr18:3012374-3012558bp区域正链(区域1)的甲基化。
区域1正链碱基序列如SEQ ID NO.28所示(5’-3’)：
TTAAAATGTTCAGGCGAGTGGAGAAAATGGTGATCCGCTGGCGTTAGAAGTGGACAGAGAGGCT CTCAGTACAAACTGTATCTGAACGTGTTCCTCACAAATTAAGATCTGCACCGGGGGCTGGGGGGCTTT GAGAAAACTAACCACATTTGAATCCGGTCCACACAGCTTGAAGGCGGAGGTAC。
完全甲基化的区域1经亚硫酸氢盐转化后的序列如SEQ ID NO.36所示(5’-3’)：
TTAAAATGTTTAGGCGAGTGGAGAAAATGGTGATTCGTTGGCGTTAGAAGTGGATAGAGAGGTTT TTAGTATAAATTGTATTTGAACGTGTTTTTTATAAATTAAGATTTGTATCGGGGGTTGGGGGGTTTTGAG AAAATTAATTATATTTGAATTCGGTTTATATAGTTTGAAGGCGGAGGTAC。
SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr18:3012388、Chr18:3012409、Chr18:3012415、Chr18:3012550、Chr18:3012558位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例2
本实施例提供用于食管鳞癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合2，核苷酸组合2包括SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合2可检测LPIN2基因上Chr18:3012539-3012718bp区域正链(区域2)的甲基化。
区域2正链碱基序列如SEQ ID NO.29所示(5’-3’)：
CAGCTTGAAGGCGGAGGTACGGGGCAAAGCGCGGCGGGGAAGAAACACCAGCAACTCGGCGG CCCCCGCCTCGCCGCAGATCACGTGCCCGGCGCCCCCTCCCGCAGGGCCGGGGGCGGGATGGAGAC GCGGCCTCCCGCGCGCCTTCCGCACTCCCCTCCGCGCCCCAAACCCAGGGGT。
完全甲基化的区域2经亚硫酸氢盐转化后的序列如SEQ ID NO.37所示(5’-3’)：
TAGTTTGAAGGCGGAGGTACGGGGTAAAGCGCGGCGGGGAAGAAATATTAGTAATTCGGCGGTT TTCGTTTCGTCGTAGATTACGTGTTCGGCGTTTTTTTTCGTAGGGTCGGGGGCGGGATGGAGACGCGG TTTTTCGCGCGTTTTTCGTATTTTTTTTCGCGTTTTAAATTTAGGGGT。
SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr18:3012550、Chr18:3012558、Chr18:3012595、Chr18:3012598、Chr18:3012605、Chr18:3012610、Chr18:3012613、Chr18:3012699、Chr18:3012701位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例3
本实施例提供用于食管鳞癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合3，核苷酸组合3包括SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合3可检测LPIN2基因上Chr18:3012566-3012756bp区域负链(区域3)的甲基化。
区域3负链碱基序列如SEQ ID NO.30所示(5’-3’)：
CGCCGCCGCCCTGGGGATGGTTACCCGAGACCACCCCTACCCCTGGGTTTGGGGCGCGGAGGGG AGTGCGGAAGGCGCGCGGGAGGCCGCGTCTCCATCCCGCCCCCGGCCCTGCGGGAGGGGGCGCCGG GCACGTGATCTGCGGCGAGGCGGGGGCCGCCGAGTTGCTGGTGTTTCTTCCCCGCCGCGCT。
完全甲基化的区域3经亚硫酸氢盐转化后的序列如SEQ ID NO.38所示(5’-3’)：
CGTCGTCGTTTTGGGGATGGTTATTCGAGATTATTTTTATTTTTGGGTTTGGGGCGCGGAGGGGAG TGCGGAAGGCGCGCGGGAGGTCGCGTTTTTATTTCGTTTTCGGTTTTGCGGGAGGGGGCGTCGGGTA CGTGATTTGCGGCGAGGCGGGGGTCGTCGAGTTGTTGGTGTTTTTTTTTCGTCGCGTT。
GSEQ ID NO.7-9所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr18:3012569、Chr18:3012571、Chr18:3012574、Chr18:3012642、Chr18:3012650、Chr18:3012656、Chr18:3012753、Chr18:3012756位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例4
本实施例提供用于食管鳞癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合4，核苷酸组合4包括SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合4可检测LPIN2基因上Chr18:3012367-3012565bp区域负链(区域4)的甲基化。
区域4负链碱基序列如SEQ ID NO.31所示(5’-3’)：
TTGCCCCGTACCTCCGCCTTCAAGCTGTGTGGACCGGATTCAAATGTGGTTAGTTTTCTCAAAGC CCCCCAGCCCCCGGTGCAGATCTTAATTTGTGAGGAACACGTTCAGATACAGTTTGTACTGAGAGCCT CTCTGTCCACTTCTAACGCCAGCGGATCACCATTTTCTCCACTCGCCTGAACATTTTAAGACTCTT。
完全甲基化的区域4经亚硫酸氢盐转化后的序列如SEQ ID NO.39所示(5’-3’)：
TTGTTTCGTATTTTCGTTTTTAAGTTGTGTGGATCGGATTTAAATGTGGTTAGTTTTTTTAAAGTTTTTTAGTTTTCGGTGTAGATTTTAATTTGTGAGGAATACGTTTAGATATAGTTTGTATTGAGAGTTTTTTTGT TTATTTTTAACGTTAGCGGATTATTATTTTTTTTATTCGTTTGAATATTTTAAGATTTTT。
SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr18:3012389、Chr18:3012410、Chr18:3012416、Chr18:3012551、Chr18:3012559位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例5
本实施例提供用于食管鳞癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合5，核苷酸组合5包括SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合5可检测EN2基因上Chr7:155459949-155460122bp区域正链(区域5)的甲基化。
区域5正链碱基序列如SEQ ID NO.32所示(5’-3’)：
TGCATTCCATGCGGGTCTGCGGCTGGGAACCGCCATTAGAAGTGGACTGTTTGACCCCGAGCTG GCAGCGGATCCCCGCTGCCCCCAAACCCTCAACTATTTTGCGGGGGTCATTTGCCCAGATCACAGCAG GAGTGAGCCAACCCTTGGGCCGCCATCCCGCAGAACTATGCG。
完全甲基化的区域5经亚硫酸氢盐转化后的序列如SEQ ID NO.40所示(5’-3’)：
TGTATTTTATGCGGGTTTGCGGTTGGGAATCGTTATTAGAAGTGGATTGTTTGATTTCGAGTTGGTAGCGGATTTTCGTTGTTTTTAAATTTTTAATTATTTTGCGGGGGTTATTTGTTTAGATTATAGTAGGAGTGA GTTAATTTTTGGGTCGTTATTTCGTAGAATTATGCG。
SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr7:155459960、Chr7:155459968、Chr7:155460006、Chr7:155460017、Chr7:155460025、Chr7:155460101、Chr7:155460109、Chr7:155460121位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例6
本实施例提供用于食管鳞癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合6，核苷酸组合6包括SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合6可检测EN2基因上Chr7:155460212-155460376bp区域正链(区域6)的甲基化。
区域6正链碱基序列如SEQ ID NO.33所示(5’-3’)：
ACATACAGGCTCACAATGCCGGGCGAGGAGACTCGGCCGGGCTTTGTGCGGCGCGGGAGTTCGC TGAGCCAGCCCCCAACGGCCCGGGAGCTGGGCAGCACCGCCCGGCCCGGCCTGGCCCGGCCCAGCT CAGCCCAGCCCAAGTCGCCTATCTTCATGGGCTTT。
完全甲基化的区域6经亚硫酸氢盐转化后的序列如SEQ ID NO.41所示(5’-3’)：
ATATATAGGTTTATAATGTCGGGCGAGGAGATTCGGTCGGGTTTTGTGCGGCGCGGGAGTTCGTTG AGTTAGTTTTTAACGGTTCGGGAGTTGGGTAGTATCGTTCGGTTCGGTTTGGTTCGGTTTAGTTTAGTTTAGTTTAAGTCGTTTATTTTTATGGGTTTT。
SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr7:155460231、Chr7:155460235、Chr7:155460313、Chr7:155460317、Chr7:155460322、Chr7:155460332、Chr7:155460357位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例7
本实施例提供用于食管鳞癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合7，核苷酸组合7包括SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合7可检测EN2基因上Chr7:155460291-155460426bp区域负链(区域7)的甲基化。
区域7负链碱基序列如SEQ ID NO.34所示(5’-3’)：
CGGAGAAACCAAAGAACAGAAACATTATCTTGCAGGGATATTTTAAAGCCCATGAAGATAGGCG ACTTGGGCTGGGCTGAGCTGGGCCGGGCCAGGCCGGGCCGGGCGGTGCTGCCCAGCTCCCGGGCCG。
完全甲基化的区域7经亚硫酸氢盐转化后的序列如SEQ ID NO.42所示(5’-3’)：
CGGAGAAATTAAAGAATAGAAATATTATTTTGTAGGGATATTTTAAAGTTTATGAAGATAGGCGATTTGGGTTGGGTTGAGTTGGGTCGGGTTAGGTCGGGTCGGGCGGTGTTGTTTAGTTTTCGGGTCG。
SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr7:155460292、Chr7:155460297、Chr7:155460314、Chr7:155460318、Chr7:155460323、Chr7:155460333、Chr7:155460420位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例8
本实施例提供用于食管鳞癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合8，核苷酸组合8包括SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合8可检测EN2基因上Chr7:155459956-155460122bp区域负链(区域8)的甲基化。
区域8负链碱基序列如SEQ ID NO.35所示(5’-3’)：
CGCATAGTTCTGCGGGATGGCGGCCCAAGGGTTGGCTCACTCCTGCTGTGATCTGGGCAAATGAC CCCCGCAAAATAGTTGAGGGTTTGGGGGCAGCGGGGATCCGCTGCCAGCTCGGGGTCAAACAGTCCA CTTCTAATGGCGGTTCCCAGCCGCAGACCCGCATG。
完全甲基化的区域8经亚硫酸氢盐转化后的序列如SEQ ID NO.43所示(5’-3’)：
CGTATAGTTTTGCGGGATGGCGGTTTAAGGGTTGGTTTATTTTTGTTGTGATTTGGGTAAATGATTTTCGTAAAATAGTTGAGGGTTTGGGGGTAGCGGGGATTCGTTGTTAGTTCGGGGTTAAATAGTTTATTTTTAATGGCGGTTTTTAGTCGTAGATTCGTATG。
SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr7:155459961、Chr7:155459969、Chr7:155459980、Chr7:155460007、Chr7:155460018、Chr7:155460102、Chr7:155460110、Chr7:155460122位置上胞嘧啶的甲基化。
表1各目的基因区域的引物和探针序列
Figure SMS_1
实施例9
利用甲基化荧光定量PCR法分析目标区域诊断食管鳞癌组织样本的性能。
发明人发现，通过检测食管鳞癌患者的肿瘤组织样本中，选自Chr18:3012367-3012756bp和/或Chr7:155459949-155460426bp一个或多个区域的甲基化水平，可以有效区分食管鳞癌样本和健康组织样本，具体的检测过程如下所示。
1.组织样本的收集
共收集了62例经病理检测确诊为食管鳞癌患者的癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本62例，食管上皮内瘤变组织样本52例。所有的样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.样本DNA的提取
使用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本的DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA的转化和纯化
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体步骤参见试剂盒说明书。
4.甲基化荧光定量PCR反应
为了保证荧光定量PCR反应的扩增效率位于95％-105％之间，且没有非特异性扩增和引物二聚体出现，分别以亚硫酸氢盐转化后Chr18:3012367-3012756bp及Chr7:155459949-155460426bp区域序列为模板，设计多对用于甲基化荧光定量PCR反应的引物对。然后对所述引物对进行验证，使用SYBR Green PCR体系扩增目的片段，通过溶解曲线和标准曲线分析，筛选到满足上述要求的4对用于扩增Chr18:3012367-3012756bp和4对用于扩增Chr7:155459949-155460426bp的部分区域的引物对，并针对每对引物设计对应的Taqman检测探针，用于Taqman PCR反应体系，具体扩增的反应体系为：5×的Platinum IIPCR缓冲液5μL，10μM目标区域上游引物0.5μL，10μM目标区域下游引物0.5μL，10μM目标区域探针0.5μL，10μM ACTB上游引物0.5μL，10μM ACTB下游引物0.5μL，10μM ACTB检测探针0.5μL，Platinum II Taq Hot-Start DNAPolymerase 0.5μL，10mM dNTPs 1μL，待测样本DNA 5μL，纯化水补至25μL。反应条件为：98℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s,72℃补充延伸5min(在退火及补充延伸过程中采集荧光)，共47个循环；4℃保存。各个引物对和探针的序列及其所检测的目标区域如表1所示。
阴性对照和阳性对照：在进行PCR反应检测样本时，阴性对照和阳性对照也应同时进行检测，阴性对照管的DNA模板为TE缓冲液。阳性对照管的DNA模板的制备方法为：将ACTB基因扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒；将目标区域进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。若只检测单一区域的甲基化水平，阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含检测区域的人工合成质粒，二者1:1混合而成；若按照表3检测组合物的甲基化水平，则阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含一个目的区域的人工合成质粒和103拷贝/微升的含另一个目的区域的人工合成质粒，三者1:1:1混合而成。
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照各基因的Ct值应在26-30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
5.PCR结果分析
根据各个目的区域检测的Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于组织样本，若扩增某一区域的Ct值≤38，则认为该样本中此区域为甲基化阳性，若扩增某一区域的Ct值＞38，则认为该样本中此区域为甲基化阴性。在检测单一区域时，若待测样本在该区域为甲基化阳性，则该样本为癌症阳性样本，若待测样本在该区域为甲基化阴性，则该样本为癌症阴性样本。在检测组合物时，若待测样本在组合物中至少一个区域为甲基化阳性，则该样本为癌症阳性样本，仅当待测样本在构成组合物的两个区域都为甲基化阴性，则该样本为癌症阴性样本。
利用甲基化荧光定量PCR检测的方法，通过检测区域1-区域8的甲基化水平来诊断食管鳞癌癌组织样本、癌旁组织样本的灵敏度和特异性如表2所示；通过检测区域1-4分别与区域5-8任一区域的组合物的甲基化水平来诊断食管鳞癌癌组织样本、癌旁组织样本的灵敏度和特异性如表3所示。
表2、区域1-区域8在组织样本中的甲基化状态及诊断的灵敏度和特异性
Figure SMS_2
Figure SMS_3
表3、组合物在组织样本中的甲基化状态及诊断的灵敏度和特异性
Figure SMS_4
由表2可以看出，区域1-区域8任意区域用来检测食管鳞癌的灵敏度最高为95.16％，检测癌前病变的灵敏度最高为78.85％，检测癌旁正常组织特异性最高为88.71％，总体来看检测效果较好。由表3可以看出，若改用检测区域1-4任一区域分别与区域5-8任一区域的组合物的甲基化水平时，其诊断食管鳞癌癌组织样本的灵敏度相比单区域检测得到了显著提升，其中B及M、N、P组合方式灵敏度最高，对于癌组织的检测灵敏度达到96.77％，同时，优势检测区域对于检测上皮内瘤变的灵敏度也达到了86.54％；此外，组合物的检测癌旁正常组织的特异性最高也可以达到85％。
实施例10
利用甲基化荧光定量PCR法分析组合物诊断食管鳞癌及癌前病变患者食管脱落细胞的性能
通过检测食管鳞癌及癌前病变患者的食管脱落细胞中，选自Chr18:3012367-3012756bp和/或Chr7:155459949-155460426bp一个或多个区域的组合物的甲基化水平，可以有效区分食管鳞癌、癌前病变患者和非癌患者，具体的检测过程如下所示。
1.食管脱落细胞样本的收集
食管脱落细胞由食管细胞取样包取样。
共收集经病理检测确诊的食管鳞癌患者的食管脱落细胞35例，食管上皮瘤变患者食管脱落细胞28例，食管炎患者26例。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.样本DNA提取
利用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210836号)进行脱落细胞样本DNA的提取，具体步骤参见试剂盒说明书。
3.样本DNA转化、纯化方法同实施例9。
4.甲基化荧光定量PCR的检测方法同实施例9。
5.甲基化荧光定量PCR结果分析
Ct值的读取、质量控制等同实施例9。
PCR结果分析和判读方法：对于脱落细胞样本，若待测样本在某一检测区域的Ct值≤38时，即认为该样本在此区域为甲基化阳性，若待测样本在某一检测区域的Ct值>38，则认为该样本在此区域为甲基化阴性。在检测单一区域时，若待测样本在该区域为甲基化阳性，则该样本为癌症阳性样本，若待测样本在该区域为甲基化阴性，则该样本为癌症阴性样本。在检测组合物时，若待测样本在组合物中至少一个区域为甲基化阳性，则该样本为癌症阳性样本，仅当待测样本在构成组合物的两个区域都为甲基化阴性，则该样本为癌症阴性样本。
表4、区域1-区域8在脱落细胞样本中的甲基化状态及诊断的灵敏度和特异性
Figure SMS_5
表5、组合物在脱落细胞样本中的甲基化状态及诊断的灵敏度和特异性
Figure SMS_6
Figure SMS_7
表4为区域1-区域8在脱落细胞样本中的甲基化状态及诊断的灵敏度和特异性的检测结果。由表4可以看出，区域1-区域8单个区域检测食管鳞癌的灵敏度均在80％以上，其中，区域1、5、6、7检测食管鳞癌的灵敏度最好，可以达到91.43％；区域1、5检测癌前病变的灵敏度达到78.57％；区域1、4、6、7的检测非癌样本的特异性达到100％。
表5检测了组合物在脱落细胞样本中的甲基化状态及诊断的灵敏度和特异性。表5显示，在同时检测区域1-4分别与区域5-8任一区域的组合物的甲基化水平时，其诊断食管鳞癌的效果显著，其中区域1、4分别与区域5-8组合时，灵敏度最高可达94.29％。同时，该组合物在检测癌前病变时也展现出优势，对于上皮内瘤变的检测灵敏度最高可达82.14％。在非癌患者样本中该组合物的特异性表现较好，优势组合物的总特异性达到96.15％。综合来看，利用组合方式A-D及M-P的组合物的甲基化水平进行检测，其诊断性能最佳。
实施例11
利用甲基化荧光定量PCR法分析组合物诊断食管鳞癌及癌前病变患者血浆样本的性能
1.血浆样本的收集
共收集食管鳞癌患者血浆样本60例，食管上皮内瘤变患者血浆51例，健康人血浆样本110例。所有样本由专业医务人员收集并经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.DNA模板的提取：
采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作参见试剂盒说明书。.
3.甲基化荧光定量PCR的检测方法同实施例9。
4.甲基化荧光定量PCR结果分析
Ct值的读取、质量控制等同实施例9。
PCR结果分析和判读方法：若待测样本在某一检测区域的Ct值≤45时，即认为该样本在此区域为甲基化阳性，若待测样本在某一检测区域的Ct值>45，则认为该样本在此区域为甲基化阴性。在检测单一区域时，若待测样本在该区域为甲基化阳性，则该样本为癌症阳性样本，若待测样本在该区域为甲基化阴性，则该样本为癌症阴性样本。在检测组合物时，若待测样本在组合物中至少一个区域为甲基化阳性，则该样本为癌症阳性样本，仅当待测样本在构成组合物的两个区域都为甲基化阴性，则该样本为癌症阴性样本。
表6、区域1-区域8在脱落细胞样本中的甲基化状态及诊断的灵敏度和特异性
Figure SMS_8
表7、组合物在血浆样本中的甲基化状态及诊断的灵敏度和特异性
Figure SMS_9
从表6可以看出，单区域检测食管鳞癌的灵敏度最高为88.33％，检测癌前病变的灵敏度最高为82.35％，检测健康人血浆的特异性最高为100％，均达到较高水平。表7中，区域组合物对食管鳞癌血浆样本和健康人血浆样本可以实现较好的区分，且相比单区域，虽然特异性有所降低，但是灵敏度略有提高。其各区域的检测食管鳞癌的灵敏度均在86％以上，其中，A、B、D、N、O、P组合值灵敏度明显高于其他区域，达到90％；在上皮内瘤变患者的血浆样本中灵敏度最高达到了84.31％。而且，在健康人血浆样本中，上述组合的特异性也较高，其中O、P组合的特异性达99.09％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。

Claims (11)

1.一种检测食管癌或癌前病变的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括检测靶序列甲基化水平的核酸组合，所述靶序列包括第一靶序列和/或第二靶序列，其中以GRCh38.p14为参考，所述第一靶序列包括Chr18:3012367-3012756区域的全长或其部分区域；所述第二靶序列包括Chr7:155459949-155460426区域的全长或其部分区域。
2.根据权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述Chr18:3012367-3012756区域的部分区域包括区域1、区域2、区域3和区域4中的一个或多个，和/或
所述Chr7:155459949-155460426区域的部分区域包括区域5、区域6、区域7和区域8中的一个或多个；
其中，所述区域1为Chr18:3012374-3012558正链；所述区域2为Chr18:3012539-3012718正链；所述区域3为Chr18:3012566-3012756负链；所述区域4为Chr18:3012367-3012565负链；所述区域5为Chr7:155459949-155460122正链；所述区域6为Chr7:155460212-155460376正链；所述区域7为Chr7:155460291-155460426负链；所述区域8为Chr7:155459956-155460122负链。
3.根据权利要求2所述的核酸组合，其特征在于，所述检测第一靶序列甲基化水平的核酸组合包括第一核酸组合、第二核酸组合、第三核酸组合和第四核酸组合中的至少一组；
所述检测第二靶序列甲基化水平的核酸组合包括第五核酸组合、第六核酸组合、第七核酸组合和第八核酸组合中的至少一组；
所述第一核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物对；
所述第二核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5所示的引物对；
所述第三核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的引物对；
所述第四核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示的引物对；
所述第五核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示的引物对；
所述第六核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.16～17所示的引物对；
所述第七核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20所示的引物对；
所述第八核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.22～23所示的引物对。
4.根据权利要求3所述的核酸组合，其特征在于，所述第一核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针；所述第二核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的探针；所述第三核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针；所述第四核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的探针；所述第五核酸组合还包括核苷酸序列如SEQID NO.15所示的探针；所述第六核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的探针；所述第七核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的探针；所述第八核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的探针。
5.一种检测食管癌或癌前病变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的检测食管癌或癌前病变的核酸组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本的采样装置、核酸提取试剂、核酸纯化试剂中至少一种。
7.核酸组合在制备如下(a)～(c)任一项产品中的应用：
(a)诊断食管癌或癌前病变；
(b)区分食管癌样本和食管炎样本；
(c)区分食管癌前病变样本和食管炎样本；
所述核酸组合包括检测靶序列甲基化水平的核酸组合，所述靶序列包括第一靶序列和/或第二靶序列，其中所述第一靶序列包括Chr18:3012367-3012756区域的全长或其部分区域；所述第二靶序列包括Chr7:155459949-155460426区域的全长或其部分区域。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述Chr18:3012367-3012756区域的部分区域包括区域1、区域2、区域3和区域4中的一个或多个；
所述Chr7:155459949-155460426区域的部分区域包括区域5、区域6、区域7和区域8中的一个或多个；
所述区域1为Chr18:3012374-3012558正链；所述区域2为Chr18:3012539-3012718正链；所述区域3为Chr18:3012566-3012756负链；所述区域4为Chr18:3012367-3012565负链；所述区域5为Chr7:155459949-155460122正链；所述区域6为Chr7:155460212-155460376正链；所述区域7为Chr7:155460291-155460426负链；所述区域8为Chr7:155459956-155460122负链。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述靶序列包括区域1～区域8中的至少一个；
可选地，所述靶序列包括区域1～区域4中的至少一个，且包含区域5～区域8中的至少一个。
10.根据权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于，所述核酸组合包括第一核酸组合、第二核酸组合、第三核酸组合、第四核酸组合、第五核酸组合、第六核酸组合、第七核酸组合和第八核酸组合中的至少一组；
所述第一核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物对；
所述第二核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5所示的引物对；
所述第三核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的引物对；
所述第四核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示的引物对；
所述第五核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示的引物对；
所述第六核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.16～17所示的引物对；
所述第七核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20所示的引物对；
所述第八核酸组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.22～23所示的引物对；
可选地，所述第一核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针；所述第二核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的探针；所述第三核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针；所述第四核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的探针；所述第五核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的探针；所述第六核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的探针；所述第七核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的探针；所述第八核酸组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的探针。
11.根据权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于，所述食管癌包括食管鳞癌，所述癌前病变包括食管上皮内瘤变。
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