CN117660622A - 用于检测肺结节的甲基化分子标记物及其应用 - Google Patents
用于检测肺结节的甲基化分子标记物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117660622A CN117660622A CN202311431003.6A CN202311431003A CN117660622A CN 117660622 A CN117660622 A CN 117660622A CN 202311431003 A CN202311431003 A CN 202311431003A CN 117660622 A CN117660622 A CN 117660622A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- nos
- primer pair
- marker
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 114
- 206010056342 Pulmonary mass Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 109
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 109
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 306
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 101150058573 hoxb3 gene Proteins 0.000 claims description 21
- 101000703741 Homo sapiens Short stature homeobox protein 2 Proteins 0.000 claims description 19
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 16
- 101000839788 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B4 Proteins 0.000 claims description 15
- 102100028404 Homeobox protein Hox-B4 Human genes 0.000 claims description 14
- 101000619927 Homo sapiens LIM/homeobox protein Lhx9 Proteins 0.000 claims description 14
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 14
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 102100022141 LIM/homeobox protein Lhx9 Human genes 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 12
- 101000712958 Homo sapiens Ras association domain-containing protein 1 Proteins 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- 101000737778 Homo sapiens Cysteine dioxygenase type 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000785563 Homo sapiens Zinc finger and SCAN domain-containing protein 31 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100035342 Cysteine dioxygenase type 1 Human genes 0.000 claims description 9
- 102100033243 Ras association domain-containing protein 1 Human genes 0.000 claims description 9
- 102100026586 Zinc finger and SCAN domain-containing protein 31 Human genes 0.000 claims description 9
- 101001117509 Homo sapiens Prostaglandin E2 receptor EP4 subtype Proteins 0.000 claims description 8
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 8
- 102100024450 Prostaglandin E2 receptor EP4 subtype Human genes 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 7
- 101000839775 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B3 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100031976 Short stature homeobox protein 2 Human genes 0.000 claims description 6
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 102100028411 Homeobox protein Hox-B3 Human genes 0.000 claims description 4
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 claims description 3
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 abstract description 44
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 36
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 abstract description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 83
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 18
- 101150024390 CDO1 gene Proteins 0.000 description 17
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 15
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 14
- 101150109738 Ptger4 gene Proteins 0.000 description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 13
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 13
- 206010054107 Nodule Diseases 0.000 description 12
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 11
- 101150092960 ZSCAN31 gene Proteins 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 101100523593 Homo sapiens RASSF1 gene Proteins 0.000 description 8
- 101150098078 RASSF1 gene Proteins 0.000 description 8
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 8
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 6
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 6
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000012549 training Methods 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 101150115057 hoxb4 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000012706 support-vector machine Methods 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000041239 Antp homeobox family Human genes 0.000 description 2
- 108091061391 Antp homeobox family Proteins 0.000 description 2
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 2
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 description 2
- 102000015295 Cysteine Dioxygenase Human genes 0.000 description 2
- 108010039724 Cysteine dioxygenase Proteins 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100024165 G1/S-specific cyclin-D1 Human genes 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003066 decision tree Methods 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 101150000168 lhx9 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 238000007637 random forest analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 208000002927 Hamartoma Diseases 0.000 description 1
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 101100112904 Homo sapiens CDO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100477520 Homo sapiens SHOX gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- XTPIFIMCFHNJOH-VKHMYHEASA-N N-formimidoyl-L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC=N XTPIFIMCFHNJOH-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 101710195838 Prostaglandin E2 receptor EP4 subtype Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 101150012871 SHOX gene Proteins 0.000 description 1
- 108700025071 Short Stature Homeobox Proteins 0.000 description 1
- 208000020221 Short stature Diseases 0.000 description 1
- 102100029992 Short stature homeobox protein Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000000017 Solitary Pulmonary Nodule Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OBZKMHQCWJWLEJ-GWPKAZDLSA-L [H+].[H+].[Zn++].N[C@@H](C[S-])C(O)=O.N[C@@H](C[S-])C(O)=O.N[C@@H](Cc1c[n-]cn1)C(O)=O.N[C@@H](Cc1c[n-]cn1)C(O)=O Chemical group [H+].[H+].[Zn++].N[C@@H](C[S-])C(O)=O.N[C@@H](C[S-])C(O)=O.N[C@@H](Cc1c[n-]cn1)C(O)=O.N[C@@H](Cc1c[n-]cn1)C(O)=O OBZKMHQCWJWLEJ-GWPKAZDLSA-L 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000007635 classification algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000010224 classification analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013145 classification model Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L dithionite(2-) Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])=O GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 101150101299 gene 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000558 gonadal hypoplasia Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 210000003254 palate Anatomy 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 238000003909 pattern recognition Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种用于检测肺结节的甲基化分子标记物、试剂盒及检测方法。所述DNA甲基化分子标记物与肺癌高度相关，尤其是其组合使用，克服了检测样本获取量低的限制，有效提高检测效率，对肺结节良恶性的检测具有很好的灵敏度和特异性，能有效提高恶性肺结节的检出率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物及其组合和应用，所述应用包括检测试剂盒及检测方法。
背景技术
肺结节，即孤立性肺结节(solitary pulmonary nodule)是指影像为类圆形阴影、单一的、边界清楚的、直径小于或等于3cm、周围为含气肺组织所包绕的高低密度的实性或者亚实性病变，不伴肺不张、肺门肿大或胸腔积液。肺结节分为良恶性两类，常无明显症状，良性结节需要针对病因治疗，恶性需要早期手术。良性的病因常与自身性免疫疾病或各种感染相关，恶性的病因常与肺癌相关。
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。然而，在肺癌发生早期对病人进行治疗，是能够有效的提高其五年生存率。因此，对早期癌症患者的诊断和治疗，显得尤为重要。
目前，临床上使用的肺癌检测方法有：影像学检测、细胞学检测和分子标记物检测。
LDCT(低剂量螺旋CT)影像检测是常用的比较有效的早期肺癌筛查方法。该方法在不降低结节灶的发现率的前提下，将曝光剂量降至常规CT的10％～25％，对结节发现率的敏感性高。而LDCT并不能确定结节性质，导致4％～55％良性病灶过度治疗，假阳性率增高。在NLST试验中LDCT的阳性结果中有96.4％为假阳性。
临床上，肺癌早期诊断另一主要手段为常规痰脱落细胞学检查。肺癌表面脱落的癌细胞可随痰咯出，痰细胞学检查找到癌细胞可明确诊断，准确率可达80％以上，而痰细胞学早期肺癌的敏感性仅为20％～30％。因其敏感性受到肿瘤的位置、组织类型和痰标本留取正确与否的影响，同时也受病理科医生技术水平的影响，总体的检出阳性率偏低。
肺癌分子标记物检测的检测样本主要来源于组织活检和液体活检。组织样本主要通过外科手术或纤维支气管镜刷片直接从肿瘤部位取得，因此其检测的准确性更高，然而因组织活检具有一定的侵入性，肿瘤异质性的存在及由于种种原因而无法取得组织标本或者组织标本量不足以完成分子检测，使得组织活检在肺癌的早期诊断、预测转移以及预后等方面的作用存在一定的局限性。相对于组织活检，液体活检具有操作简便、非侵入性、重复性强和利于疾病的动态监测等优势。
目前可以确诊肺结节良恶性的主要是病理活检，但是病理活检是一种有创的操作，而且较小的结节不易通过穿刺活检取得标本，所以大部分的肺结节是通过结节大小、形态、密度，等来确定结节的良恶性。良性结节与恶性结节常常有不同的影像学表现，医生就是根据影像学的特点来判断肺结节的良恶性的，从而确定结节是否需要手术切除、或者进一步检查、或者是定期随访。
DNA甲基化与癌症的发生密切相关，尤其是CpG岛区的启动子超甲基化可能会导致抑癌基因转录沉默，从而影响肿瘤发生的进程，是癌症诊断的理想标记物。肺癌液体活检以患者的血液、痰液和肺泡灌洗液等为标本，对其中的肿瘤细胞DNA及其修饰水平，如DNA甲基化等，进行检测和分析。对于癌症患者，因其血液中含有来源于病灶的ctDNA，且血液样本能够无创采集，虽然提高ctDNA检测灵敏性是该检测方法面临的一个巨大挑战，但目前将多个互补性较高的分子标记物进行联合使用，在信号检测的灵敏度上较单个分子标记物会更有优势。在样本采集方式上，血液无创采集的方式也更安全，可操作性也更高。
通过寻找基于肺癌血浆样本特异性DNA甲基化生物分子标记物，联合检测多个与肺癌相关的分子标记物，可增强肺癌的检出率，这对检测肺结节良恶性起到了关键作用。
发明内容
基于此，本公开提供了一种可用于检测肺结节的甲基化分子标记物、检测试剂盒及方法，所述甲基化分子标记物与肺癌高度相关，尤其是其组合使用，对肺结节良恶性的检测具有很好的灵敏度和特异性，能有效提高恶性肺结节的检出率。
根据本公开的第一方面，提供了一种可用于肺结节的甲基化分子标记物，所述甲基化分子标记物包括RASSF1、PTGER4、HOXB3、HOXB4、LHX9、CDO1、ZSCAN31和SHOX2基因中的任意一种或两种以上的组合。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因；和以下基因中的任意一个或多个：RASSF1、PTGER4、HOXB4、LHX9、CDO1、ZSCAN31和SHOX2中的任意一个或多个。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因，和包括RASSF1、PTGER4、HOXB4、LHX9、CDO1、ZSCAN31和SHOX2基因中至少一种。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因和CDO1基因。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因和CDO1基因，和包括RASSF1、PTGER4、HOXB4、LHX9、ZSCAN31和SHOX2基因中至少一种。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因和PTGER4基因。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因和PTGER4基因，和包括RASSF1、HOXB4、LHX9、ZSCAN31和SHOX2基因中至少一种。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因、PTGER4基因和RASSF1基因。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因、PTGER4基因和RASSF1基因，和包括HOXB4、LHX9、ZSCAN31和SHOX2基因中至少一种。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因、PTGER4基因、RASSF1基因和ZSCAN31基因。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因、PTGER4基因、RASSF1基因和ZSCAN31基因，和包括HOXB4、LHX9和SHOX2基因中至少一种。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因、PTGER4基因、RASSF1基因、ZSCAN31基因和SHOX2基因。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因、PTGER4基因、RASSF1基因、ZSCAN31基因和SHOX2基因，和包括HOXB4和LHX9基因中至少一种。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因、PTGER4基因、RASSF1基因、ZSCAN31基因、SHOX2基因和HOXB4基因。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因、PTGER4基因、RASSF1基因、ZSCAN31基因、SHOX2基因和HOXB4基因和LHX9基因的组合。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因、PTGER4基因和SHOX2基因。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因、PTGER4基因和SHOX2基因，和包括RASSF1、HOXB4、LHX9和ZSCAN31基因中至少一种。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因、PTGER4基因、SHOX2基因和ZSCAN31基因。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因、CDO1基因、SHOX2基因。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括：SEQ ID NO:1～22中的任意一个或多个或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括：SEQ ID NO:22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括：SEQ ID NO:7和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；在一些具体的实施方式中，所述甲基化分子标记物还包括：SEQ ID NO:1～6和8～21中的任意一个或多个，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括以下任一项或多项：
(1)SEQ ID NO:7、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(2)SEQ ID NO:4、7、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(3)SEQ ID NO:4、7、11、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(4)SEQ ID NO:3、4、7、11、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(5)SEQ ID NO:3、4、7、11、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(6)SEQ ID NO:3、4、7、10、11、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(7)SEQ ID NO:3、4、7、10、11、13、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(8)SEQ ID NO:3、4、7、9、10、11、13、16、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(9)SEQ ID NO:3、4、7～11、13、16、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(10)SEQ ID NO:3、4、7～13、15、16、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(11)SEQ ID NO:2～5、7～13、15、16、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(12)SEQ ID NO:1～13、15、16、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(13)SEQ ID NO:1～17、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(13)SEQ ID NO:1～22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(14)SEQ ID NO:4、7、13、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(15)SEQ ID NO:4、7～10、13、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(16)SEQ ID NO:4、7和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(17)SEQ ID NO:4、7、13和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(18)SEQ ID NO:7、13和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(19)SEQ ID NO:7、13、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括：SEQ ID NO:19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；在一些具体的实施方式中，所述甲基化分子标记物还包括：SEQ ID NO:1～18和20～21中的任意一个或多个，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括：SEQ ID NO:13、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物包括：SEQ ID NO:4、13、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
本公开的上述本公开的上述甲基化分子标记物可以与临床因子联合建模，来鉴别肺结节的良恶性。
在一些实施方式中，所述临床因子包括患者年龄，结节长径，结节短径，结节实性，结节面积和CT平扫值。
根据本公开的第二方面，提供了第一方面所述甲基化分子标记物在制备诊断肺结节的试剂盒中的用途。
在一些实施方式中，所述肺结节可以为早期肺癌。
在一些实施方式中，所述甲基化分子标记物可用判断肺结节的良性或恶性。
根据本公开的第三方面，提供了一种用于检测肺结节的试剂盒，所述试剂盒包含检测第一方面所述的甲基化分子标记物的甲基化水平的试剂。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括针对甲基化分子标记物的引物对，所述引物对包括：第一引物，所述第一引物包括以下项中的一项或多项：SEQ ID NO:23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、200、203、206、209、212、215、218；和，第二引物，所述第二引物包括以下项中的一项或多项：SEQ ID NO:24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219，，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括针对甲基化分子标记物的引物对，所述引物对包括：第一引物，所述第一引物包括以下项中的一项或多项：SEQ ID NO:26、35、44、53、65、68、80、86、95、110、119、122、134、140、152、164、167、179、191、194、203、215；和，第二引物，所述第二引物包括以下项中的一项或多项：SEQ ID NO:27、36、45、54、66、69、81、87、96、111、120、123、135、141、153、165、168、180、192、195、204、216，，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括针对甲基化分子标记物的引物对，所述引物对选自以下项中的一项或多项：
(1)SEQ ID NO:23和24；(2)SEQ ID NO:26和27；(3)SEQ ID NO:29和30；(4)SEQ IDNO:32和33；(5)SEQ ID NO:35和36；(6)SEQ ID NO:38和39；(7)SEQ ID NO:41和42；(8)SEQID NO:44和45；(9)SEQ ID NO:47和48；(10)SEQ ID NO:50和51；(11)SEQ ID NO:53和54；(12)SEQ ID NO:56和57；(13)SEQ ID NO:59和60；(14)SEQ ID NO:62和63；(15)SEQ ID NO:65和66；(16)SEQ ID NO:68和69；(17)SEQ ID NO:71和72；(18)SEQ ID NO:74和75；(19)SEQID NO:77和78；(20)SEQ ID NO:80和81；(21)SEQ ID NO:83和84；(22)SEQ ID NO:86和87；(23)SEQ ID NO:89和90；(24)SEQ ID NO:92和93；(25)SEQ ID NO:95和96；(26)SEQ ID NO:98和99；(27)SEQ ID NO:101和102；(28)SEQ ID NO:104和105；(29)SEQ ID NO:107和108；(30)SEQ ID NO:110和111；(31)SEQ ID NO:113和114；(32)SEQ ID NO:116和117；(33)SEQID NO:119和120；(34)SEQ ID NO:122和123；(35)SEQ ID NO:125和126；(36)SEQ ID NO:128和129；(37)SEQ ID NO:131和132；(38)SEQ ID NO:134和135；(39)SEQ ID NO:137和138；(40)SEQ ID NO:140和141；(41)SEQ ID NO:143和144；(42)SEQ ID NO:146和147；(43)SEQ ID NO:149和150；(44)SEQ ID NO:152和153；(45)SEQ ID NO:155和156；(46)SEQ IDNO:158和159；(47)SEQ ID NO:161和162；(48)SEQ ID NO:164和165；(49)SEQ ID NO:167和168；(50)SEQ ID NO:170和171；(51)SEQ ID NO:173和174；(52)SEQ ID NO:176和177；(53)SEQ ID NO:179和180；(54)SEQ ID NO:182和183；(55)SEQ ID NO:185和186；(56)SEQ IDNO:188和189；(57)SEQ ID NO:191和192；(58)SEQ ID NO:194和195；(59)SEQ ID NO:197和198；(60)SEQ ID NO:200和201；(61)SEQ ID NO:203和204；(62)SEQ ID NO:206和207；(63)SEQ ID NO:209和210；(64)SEQ ID NO:212和213；(65)SEQ ID NO:215和216；(66)SEQ IDNO:218和219。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括针对甲基化分子标记物的引物对，所述引物对选自以下项中的一项或多项：(1)SEQ ID NO:26和27；(2)SEQ ID NO:35和36；(3)SEQ IDNO:44和45；(4)SEQ ID NO:53和54；(5)SEQ ID NO:65和66；(6)SEQ ID NO:68和69；(7)SEQID NO:80和81；(8)SEQ ID NO:86和87；(9)SEQ ID NO:95和96；(10)SEQ ID NO:110和111；(11)SEQ ID NO:119和120；(12)SEQ ID NO:122和123；(13)SEQ ID NO:134和135；(14)SEQID NO:140和141；(15)SEQ ID NO:152和153；(16)SEQ ID NO:164和165；(17)SEQ ID NO:167和168；(18)SEQ ID NO:179和180；(19)SEQ ID NO:191和192；(20)SEQ ID NO:194和195；(21)SEQ ID NO:203和204；(22)SEQ ID NO:215和216。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括针对甲基化分子标记物的探针，所述探针选自以下项中的一项或多项：SEQ ID NO:25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、199、202、205、208、211、214、217、220，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括针对甲基化分子标记物的探针，所述探针选自以下项中的一项或多项：SEQ ID NO:28、37、46、55、67、70、82、88、97、112、121、124、136、142、154、166、169、181、193、196、205、217，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括针对甲基化分子标记物的引物对和探针的组合，所述引物对和探针的组合选自以下项中的一项或多项：
(1)SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的引物对，和SEQ ID NO:25所示探针；
(2)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的引物对，和SEQ ID NO.28所示探针；
(3)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的引物对，和SEQ ID NO:31所示探针；
(4)SEQ ID NO:32和SEQ ID NO.33所示的引物对，和SEQ ID NO:34所示探针；
(5)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的引物对，和SEQ ID NO:37所示探针；
(6)SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示的引物对，和SEQ ID NO:40所示探针；
(7)SEQ ID NO:41和SEQ ID NO.42所示的引物对，和SEQ ID NO:43所示探针；
(8)SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示的引物对，和SEQ ID NO:46所示探针；
(9)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48所示的引物对，和SEQ ID NO:49所示探针；
(10)SEQ ID NO:50和SEQ ID NO.51所示的引物对，和SEQ ID NO:52所示探针；
(11)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示的引物对，和SEQ ID NO:55所示探针；
(12)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57所示的引物对，和SEQ ID NO:58所示探针；
(13)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO.60所示的引物对，和SEQ ID NO:61所示探针；
(14)EQ ID NO.62和SEQ ID NO:63所示的引物对，和SEQ ID NO:64所示探针；
(15)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示的引物对，和SEQ ID NO:67所示探针；
(16)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO.69所示的引物对，和SEQ ID NO:70所示探针；
(17)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72所示的引物对，和SEQ ID NO:73所示探针；
(18)SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75所示的引物对，和SEQ ID NO:76所示探针；
(19)SEQ ID NO:77和SEQ ID NO.78所示的引物对，和SEQ ID NO:79所示探针；
(20)SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81所示的引物对，和SEQ ID NO:82所示探针；
(21)SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84所示的引物对，和SEQ ID NO:85所示探针；
(22)SEQ ID NO:86和SEQ ID NO.87所示的引物对，和SEQ ID NO:88所示探针；
(23)SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示的引物对，和SEQ ID NO:91所示探针；
(24)SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:93所示的引物对，和SEQ ID NO:94所示探针；
(25)SEQ ID NO:95和SEQ ID NO.96所示的引物对，和SEQ ID NO:97所示探针；
(26)SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99所示的引物对，和SEQ ID NO:100所示探针；
(27)SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102所示的引物对，和SEQ ID NO:103所示探针；
(28)SEQ ID NO:104和SEQ ID NO.105所示的引物对，和SEQ ID NO:106所示探针；
(29)SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108所示的引物对，和SEQ ID NO:109所示探针；
(30)SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111所示的引物对，和SEQ ID NO:112所示探针；
(31)SEQ ID NO:113和SEQ ID NO.114所示的引物对，和SEQ ID NO:115所示探针；
(32)SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117所示的引物对，和SEQ ID NO:118所示探针；
(33)SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120所示的引物对，和SEQ ID NO.121所示探针；
(34)SEQ ID NO:122和SEQ ID NO.123所示的引物对，和SEQ ID NO:124所示探针；
(35)SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126所示的引物对，和SEQ ID NO:127所示探针；
(36)SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129所示的引物对，和SEQ ID NO.130所示探针；
(37)SEQ ID NO:131和SEQ ID NO.132所示的引物对，和SEQ ID NO:133所示探针；
(38)SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135所示的引物对，和SEQ ID NO:136所示探针；
(39)SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:138所示的引物对，和SEQ ID NO.139所示探针；
(40)SEQ ID NO:140和SEQ ID NO.141所示的引物对，和SEQ ID NO:142所示探针；
(41)SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144所示的引物对，和SEQ ID NO:145所示探针；
(42)SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:147所示的引物对，和SEQ ID NO.148所示探针；
(43)SEQ ID NO:149和SEQ ID NO.150所示的引物对，和SEQ ID NO:151所示探针；
(44)SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153所示的引物对，和SEQ ID NO:154所示探针；
(45)SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:156所示的引物对，和SEQ ID NO.157所示探针；
(46)SEQ ID NO:158和SEQ ID NO.159所示的引物对，和SEQ ID NO:160所示探针；
(47)SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162所示的引物对，和SEQ ID NO:163所示探针；
(48)SEQ ID NO:164和SEQ ID NO:165所示的引物对，和SEQ ID NO.166所示探针；
(49)SEQ ID NO:167和SEQ ID NO.168所示的引物对，和SEQ ID NO:169所示探针；
(50)SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171所示的引物对，和SEQ ID NO:172所示探针；
(51)SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:174所示的引物对，和SEQ ID NO.175所示探针；
(52)SEQ ID NO:176和SEQ ID NO.177所示的引物对，和SEQ ID NO:178所示探针；
(53)SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:180所示的引物对，和SEQ ID NO:181所示探针；
(54)SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:183所示的引物对，和SEQ ID NO:184所示探针；
(55)SEQ ID NO:185和SEQ ID NO.186所示的引物对，和SEQ ID NO:187所示探针；
(56)SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:189所示的引物对，和SEQ ID NO:190所示探针；
(57)SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192所示的引物对，和SEQ ID NO.193所示探针；
(58)SEQ ID NO:194和SEQ ID NO.195所示的引物对，和SEQ ID NO:196所示探针；
(59)SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198所示的引物对，和SEQ ID NO:199所示探针；
(60)SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201所示的引物对，和SEQ ID NO.202所示探针；
(61)SEQ ID NO:203和SEQ ID NO.204所示的引物对，和SEQ ID NO:205所示探针；
(62)SEQ ID NO:206和SEQ ID NO:207所示的引物对，和SEQ ID NO:208所示探针；
(63)SEQ ID NO:209和SEQ ID NO:210所示的引物对，和SEQ ID NO.211所示探针；
(64)SEQ ID NO:212和SEQ ID NO.213所示的引物对，和SEQ ID NO:214所示探针；
(65)SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:216所示的引物对，和SEQ ID NO:217所示探针；
(66)SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219所示的引物对，和SEQ ID NO.220所示探针。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括针对甲基化分子标记物的引物对和探针的组合，所述引物对和探针的组合选自以下项中的一项或多项：
(1)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的引物对，和SEQ ID NO.28所示探针；
(2)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的引物对，和SEQ ID NO:37所示探针；
(3)SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示的引物对，和SEQ ID NO:46所示探针；
(4)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示的引物对，和SEQ ID NO:55所示探针；
(5)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示的引物对，和SEQ ID NO:67所示探针；
(6)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69所示的引物对，和SEQ ID NO:70所示探针；
(7)SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81所示的引物对，和SEQ ID NO:82所示探针；
(8)SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87所示的引物对，和SEQ ID NO:88所示探针；
(9)SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96所示的引物对，和SEQ ID NO:97所示探针；
(10)SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111所示的引物对，和SEQ ID NO:112所示探针；
(11)SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120所示的引物对，和SEQ ID NO:121所示探针；
(12)SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:123所示的引物对，和SEQ ID NO:124所示探针；
(13)SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135所示的引物对，和SEQ ID NO:136所示探针；
(14)SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:141所示的引物对，和SEQ ID NO:142所示探针；
(15)SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153所示的引物对，和SEQ ID NO:154所示探针；
(16)SEQ ID NO:164和SEQ ID NO:165所示的引物对，和SEQ ID NO:166所示探针；
(17)SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:168所示的引物对，和SEQ ID NO:169所示探针；
(18)SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:180所示的引物对，和SEQ ID NO:181所示探针；
(19)SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192所示的引物对，和SEQ ID NO:193所示探针；
(20)SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:195所示的引物对，和SEQ ID NO:196所示探针；
(21)SEQ ID NO:203和SEQ ID NO:204所示的引物对，和SEQ ID NO:205所示探针；
(22)SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:216所示的引物对，和SEQ ID NO:217所示探针。
根据本公开的第四方面，提供了一种第一方面所述的甲基化分子标记物的甲基化水平的检测方法，包括以下步骤：
(1)从待测样本中提取DNA；和
(2)采用本公开的上述的试剂盒，检测第一方面所述甲基化分子标记物的甲基化模式。
在一些实施方式中，可以采用例如PCR扩增法、荧光定量PCR法、数字PCR法、液相芯片法、代测序法、三代测序法二代测序法、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、简化亚硫酸氢盐测序技术等，来检测所述甲基化分子标记物的甲基化模式。
在一些实施方式中，所述方法的检测样本为血液样本或呼吸道样本。
在一些实施方式中，所述血液样本可以包括血液、血清、血浆和它们的处理物。
在一些实施方式中，所述呼吸道样本可以包括肺部组织样本或呼吸道液体样本。
在一些实施方式中，所述肺部组织样本可以包括肺部组织、肺部肿瘤组织、肿瘤细胞和它们的处理物。
在一些实施方式中，所述呼吸道液体样本包括痰液、肺泡灌洗液、拭子液和它们的处理物。
本发明试剂盒提供的针对所述甲基化分子标记物的检测引物和探针克服了多个引物和探针在进行多重PCR扩增和检测时存在相互干扰的缺点，利用所述引物组合经过亚硫酸氢盐处理的DNA进行多重PCR时，每个甲基化分子标记物均能得到有效扩增和富集；后续对多重PCR产物进行多重荧光定量PCR检测时，相应甲基化分子标记物在多重荧光定量PCR检测中获得的CT值与该甲基化分子标记物单独进行荧光定量PCR反应的CT值没有显著差异，定量性能与单个区域定量等同。所述试剂盒经过优化，针对不同甲基化分子标记物的引物和探针相互之间没有干扰，可成功实现多重PCR扩增和检测，有效提高检测效率。
本发明提供的针对所述DNA甲基化分子标记物的检测方法通过引入多重PCR扩增，能有效对目标分子进行富集，克服了检测样本获取量低的限制，在放大检测信号的同时也能进行多个分子标记物的联合检测，提高检测灵敏度和检测效率，能增强对肺癌的检出率以及肺结节良恶性检测的准确率。
附图说明
图1示例性示出了一个分子标记物(Marke10)的荧光定量PCR反应检测扩增曲线。
图2示出了不同分子标记物组合的ROC曲线图。
图3示出了不同分子标记物组合的ROC曲线图。
图4示出了不同分子标记物组合的ROC曲线图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
在本公开中，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本公开中，术语“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
在本公开中，术语“甲基化”，其是指涉及向胞嘧啶或腺嘌呤DNA核苷酸添加甲基的生化过程。在胞嘧啶(尤其是启动子区中的胞嘧啶)5位的DNA甲基化可具有降低基因表达的效应，并且已经在检测的每种脊椎动物中发现。在成体非配子细胞中，DNA甲基化通常发生在CpG位点。”CpG位点”或”CpG二核苷酸”是指，在沿其长度的线性碱基序列中胞嘧啶核苷酸紧接鸟嘌呤核苷酸出现。”CpG”是”C-磷酸-G”的简写，即胞嘧啶和鸟嘌呤通过仅一个磷酸隔开；在DNA中磷酸将任意两个核苷连接在一起。使用”CpG”符号来将这种线性序列与胞嘧啶和鸟嘌呤的CG碱基配对区分开。CpG二核苷酸中的胞嘧啶可被甲基化以形成5-甲基胞嘧啶。”CpG位点”或”基因组DNA的CpG位点”还用于DNA中前(未甲基化的)CpG位点的其中该CpG位点的未甲基化C被转化成如本文所述的另一种(例如，通过重亚硫酸盐转化成尿嘧啶)的位点。本公开提供了每个相关DNA区域的基因组序列，提及的CpG位点是指基因组序列的CpG位点，即使经转化的序列由于转化而不再包含这些CpG位点。
在本公开中，术语“甲基化标记物”被宽泛地解释为既包括1)在生物样品或基因组DNA中发现的原始标记物(处于特定的甲基化)，也包括2)其经过处理的序列(例如亚硫酸氢盐转化后的对应区域)。亚硫酸氢盐转化后的对应区域与基因组序列中的目标标记物不同之处在于，一个或多个未甲基化的胞嘧啶残基被转化为尿嘧啶碱基、胸腺嘧啶碱基或在杂交行为上与胞嘧啶不同的其他碱基。
在本公开中，术语“基因”包括所涉基因在其基因组上的编码序列和非编码序列。其中非编码序列包括内含子、启动子和调节元件或序列等。
在本公开中，术语“RASSF1”基因是Ras关联域家族成员1基因(Ras associationdomain family member 1)，该基因编码一种类似于Ras效应蛋白的蛋白质。该基因的表达缺失或改变与多种癌症的发病机制有关，这表明该基因具有肿瘤抑制功能。发现该基因的失活与其CpG岛启动子区域的超甲基化相关。发现编码的蛋白质与DNA修复蛋白XPA相互作用。该蛋白还显示可抑制细胞周期蛋白D1的积累，从而诱导细胞周期停滞。已经报道了编码不同同种型的该基因的几种可变剪接的转录物变体。
在本公开中，术语“PTGER4”基因是前列腺素E受体4基因(prostaglandinEreceptor 4)，该基因编码一种类似于Ras效应蛋白的蛋白质。该基因的表达缺失或改变与多种癌症的发病机制有关，这表明该基因具有肿瘤抑制功能。发现该基因的失活与其CpG岛启动子区域的超甲基化相关。发现编码的蛋白质与DNA修复蛋白XPA相互作用。该蛋白还显示可抑制细胞周期蛋白D1的积累，从而诱导细胞周期停滞。已经报道了编码不同同种型的该基因的几种可变剪接的转录物变体。
在本公开中，术语“HOXB3”基因是同源框B3基因(homeobox B3)，该基因是Antp同源框家族的成员，编码具有同源框DNA结合域的核蛋白。它包含在位于17号染色体上的同源框B基因簇中。编码的蛋白质作为参与发育的序列特异性转录因子发挥作用。该基因的表达增加与急性髓性白血病(AML)的一个独特的生物学亚群相关。有研究表明，与肿瘤相邻正常肺样本相比，肺癌组织的HOXB3基因表现出高甲基化。
在本公开中，术语“HOXB4”是同源框B4基因(homeobox B4 Gene)。该基因是Antp同源框家族的成员，编码具有同源框DNA结合域的核蛋白。它包含在位于17号染色体上的同源框B基因簇中。编码的蛋白质作为参与发育的序列特异性转录因子发挥作用。据报道，HOXB4在肺腺癌中具有差异甲基化。
在本公开中，术语“LHX9”是LIM同源框9基因(LIM homeobox 9)。该基因编码发育表达的转录因子LIM同源盒基因家族的成员。编码的蛋白质包含一个同源结构域和两个参与蛋白质-蛋白质相互作用的富含半胱氨酸的锌结合LIM结构域。该蛋白质与小鼠蛋白质高度相似，后者在失活时会导致性腺发育不全，表明其在性腺发育中发挥作用。可变剪接导致多个转录本变体。TCGA数据库中显示该基因的CpG位点在肺癌和正常组织之间具有显着不同的甲基化水平。
在本公开中，术语“CDO1”基因是指半胱氨酸双加氧酶1型基因(cysteinedioxygenaset ype1Gene)。人类CDO1基因位于5号染色体上，在晚期肺癌中CDO1基因表达常常被抑制。Kwon So Yeon等人在Genome-Wide Mapping Targets of theMetazoan Chromatin Remodeli ng Factor NURF Reveals Nucleosome Remodeling atEnhancers,Core Promoters and Gene Insulators.PLoS Genet.2016,12中的研究认为半胱氨酸双加氧酶的损耗会增强肿瘤细胞中的氧化应激，从而诱导肿瘤细胞对ROS产生抵抗和促进肿瘤转移，因此CDO1被认为是关键的肿瘤抑制基因，可能是癌细胞耐药的一个标志。CDO1的CpG岛启动子的甲基化目前已报道于多种类型的癌症，包括乳腺癌、结肠癌、肾癌、胃癌、食道癌、膀胱、胰腺癌和肺癌，而且研究还发现CDO1启动子甲基化频率在来自结肠、乳腺、食管、膀胱、胃和肺的肿瘤组织与正常组织间均存在统计学差异。
在本公开中，术语“ZSCAN31”是锌指和包含SCAN结构域31(Homo sapiens zincfinger and SCAN domain containing 31)该基因编码含有多个C2H2型锌指基序的蛋白质。在卵巢(RPKM 2.2)、睾丸(RPKM 2.1)和25种其他组织中普遍表达，有研究发现ZSCAN31基因在肺癌中显示出高甲基化。
在本公开中，术语“SHOX2”(short stature homobox 2，又名矮小同源盒基因-2)属于SHOX基因家族，处于3号染色体长臂。该基因编码产物为60个氨基酸构成的DNA结合蛋白，该产物是一种常见的DNA转录调控因子，通过识别并结合靶基因的特定位点，从而激活或抑制靶基因的表达，而改变人的生物性状。经研究发现，SHOX-2基因与骨、软骨、脑、神经、肌肉、心脏、颅面部、上颚等部位的生长发育有关。研究也发现，SHOX2甲基化与肺癌密切相关。
在本公开中，关于核酸或核苷酸的“序列”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸。此术语仅指分子的一级结构。因此，此术语包含双链和单链DNA，以及RNA。本文所使用的术语“核酸”是单链或双链共价连接的核苷酸序列，其中每个核苷酸上的3′和5′末端通过磷酸二酯键连接。多核苷酸可以由脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基构成。核酸可以在体外合成制造，或者从天然来源中分离。核酸可以进一步包含经修饰的DNA或RNA，例如已经被甲基化的DNA或RNA。根据碱基互补原则，核苷酸序列已知的同时，可相应地获得其互补序列的核苷酸信息。当本公开给出一条核酸序列时，也涵盖与该核酸序列互补的核酸序列。
在本公开中，术语“互补”指两个多核苷酸链的区域之间或相同的多核苷酸链的两个区域之间的序列互补的概念。已知多核苷酸的第一区域的腺嘌呤碱基能够同与该第一个区域反向平行的多核苷酸第二区域的碱基(如果该碱基是胸腺嘧啶或尿嘧啶)形成特定的氢键(”碱基对”)。类似的，已知第一多核苷酸链的胞嘧啶碱基能够同与第一区域反向平行的第二多核苷酸链的碱基(如果该碱基是鸟嘌呤)进行碱基配对。如果当多核苷酸的第一区域与同一或另一不同多核苷酸的第二区域以反向平行的方式排列时，第一区域的至少一个核苷酸能够与第二区域的碱基进行碱基配对，则这两个区域互补。因此，两个互补的多核苷酸并不需要在每一个核苷酸位置都碱基配对。”互补”指第一多核苷酸与第二多核苷酸100％或”完全”互补，且因此在每个核苷酸位点都形成碱基配对。”互补”也指并非100％互补(例如，90％，或80％或70％，或60％，或50％互补)的第一多核苷酸在一个或多个核苷酸位置包含错配核苷酸。在一个实施方案中，两个互补的多核苷酸能够在高严格性的杂交条件下彼此杂交。
在本公开中，术语“严格性杂交条件”被定义为可根据经验确定的、探针或引物与目标序列而不与非目标序列特异性杂交时的条件。通过Sambrook等人，1989，9.52-9.55中讨论的特异性杂交方法，在核酸探针与目标核酸(即与特定的目的核酸序列)杂交方面，对术语“严格性条件”进行了功能性定义。还可以参见Sambrook等人，19899.47-9.52，9.56-9.58；Kanehisa1984Nucl.Acids Res.12：203-213；和Wetmur等人1968J.Mol.Biol.31：349-370。促进DNA杂交的适当的严格性条件是本领域技术人员已知的，或者可参见CurrentProtocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6。
在本公开中，类似表述“SEQ ID NO:1、2和3，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列”，其中的“其片段”指SEQ ID NO:1、2和3中任一个的片段，“与其具有至少85％序列同一性的序列”指与SEQ ID NO:1、2和3中任一个具有至少85％序列同一性的序列。
在本公开中，“序列同一性”是指两个多核苷酸之间的”序列同一性百分比”或”同一性百分比”，即在考虑到了为了两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即，空位)的情况下，比较窗口内序列所共有的相同匹配位置的数量。匹配位置是其中在靶序列和参考序列中都存在相同核苷酸的任何位置。由于空位不是核苷酸，所以靶序列中存在的空位不计在内。同样，由于计入靶序列核苷酸，而不计来自参考序列的核苷酸，所以不计参考序列中存在的空位。本公开提及“至少85％序列同一性”包括所述序列全长的至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％具有序列同一性的连续片段。
可以通过以下过程来计算序列同一性百分比：确定其中两个序列中都出现相同核酸碱基的位置数，以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。序列的比较和两个序列之间序列同一性百分比的确定可使用易用于在线使用和下载的软件来完成。合适的软件程序可从各种来源获得，用于核苷酸序列的比对。确定序列同一性百分比的一个合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)上获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列。其它合适的程序是，例如，Needle、Stretcher、Water或Matcher、生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分，并且也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。
在本公开中，“片段”是指与所述序列全长的至少55％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或100％具有序列同一性的连续片段。
在本公开中，术语“引物”是指寡核苷酸，无论是天然的或合成的，只要它能够在诱导合成互补于核酸链的引物延伸产物的条件下，即在适宜的缓冲液中和在适合的温度下有四种不同核苷三磷酸和聚酶(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在的条件下，可作为DNA合成的起始点。寡核苷酸类似物，如”肽核酸”，可以作为引物并包含于本文所用的术语“引物”的含义内。引物优选是单链寡脱氧核糖核苷酸。引物的适宜长度取决于想要的引物用途，通常是6～50个核苷酸的范围，优选地，引物的适宜长度包括15～35个核苷酸。短引物分子通常需要较冷的温度以形成与模板足够稳定杂交的复合体。引物不需要反映模板核酸的确切序列，但必需充分互补以使之与模板杂交。
在本公开中，术语“探针”是指用捕获标记或检测标记来标记引物，检测引物产物。探针序列用于与引物序列所产生的序列进行杂交，并且通常与不包括引物序列的序列杂交。与引物序列类似，探针序列也用捕获标记或检测标记来标记，需说明的是当引物用捕获标记来标记时，用检测标记来标记探针，反之亦然。探针的适宜长度取决于想要的探针用途，通常是6～50个核苷酸的范围，优选地，探针的适宜长度包括15～35个核苷酸。在本公开中的探针可以为TaqMan探针、MGB探针、杂交探针中的一种。比如，所述探针为TaqMan探针，标记探针5’端的为一种荧光发光基团，其是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一种；标记探针3’端为一种荧光猝灭基团，其是BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。
在本公开中，术语“DNA”，全称”脱氧核糖核酸”(DeoxyriboNucleicAcid，缩写为DNA)是生物细胞内含有的四种生物大分子之一核酸的一种。DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。
本公开中，术语“亚硫酸氢盐试剂”是指在一些实施方案中包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)或其组合的试剂，经过亚硫酸氢盐试剂处理的DNA，其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变，因此可以区分例如CpG二核苷酸序列中的甲基化和未甲基化胞苷。
本公开中，术语“算法”或“模型”是采用一个或多个连续或分类输入并计算输出值的任何数学方程，算法，分析或编程过程，或统计技术，有时被称为”指数”或”指数值””公式”的非限制性例子包括和，比率和回归算子，例如系数或指数，生物标记值转换和标准化(包括但不限于基于诸如性别，年龄或人种的临床参数的那些标准化方案)，规则和准则，统计分类模型，以及在历史人群上训练的神经网络。特别用于结合各种生物标志位点的羟甲基化水平和临床参数，任选地进一步结合其它因素(例如，非羟甲基化生物标记物)是线性方程和非线性方程以及统计分类分析，以确定在患者样品中检测到的生物标记物位点处的羟甲基化水平与患者患有或发展成胰腺癌的风险之间的关系。在面板和组合结构中，特别感兴趣的是结构和语法统计分类算法，以及构建风险指数的方法，利用模式识别和机器学习特征，包括建立的技术，例如互相关，主成分分析(PCA)，因子旋转，逻辑回归(Logreg)，线性判别分析(LDA)，本征线性判别分析(ELDA)，支持向量机(SVM)，随机森林(RF)，递归分区树(RPART)，以及其它相关的决策树分类技术，收缩质心(SC)，Stepaic，第k个最近邻，增强，决策树，神经网络，贝叶斯网络，支持向量机和隐马尔科夫模型等。
本公开下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
实施例1用于血浆样本检测肺结节良恶性的试剂盒
一个用于血浆样本检测肺结节良恶性的试剂盒，包含了8个检测基因RASSF1、PTGER4、HOXB3、HOXB4、LHX9、CDO1、ZSCAN31和SHOX2中的22个甲基化区域及序列编号具体如表1所示(其中每个区域下划线部分为实施例中优选所用引物扩增的片段的对应序列的标记物)。
表1.分子标记物检测区域序列
表1(续)
所述试剂盒针对22个用于血液样本检测肺结节良恶性的分子标记物标记物1至标记物22中的特异性甲基化位点各设计了三对引物和三条探针(探针荧光标记可采用FAM、VIC及NED等荧光基团标记)，并分别标记为组合1、2、3。其中，每个分子标记物中被选择的引物和探针组合，可任意选择与其他分子标记物中的引物和探针的组合1、2、3进行组合并在同一平台进行检测。具体的各分子标记物对应的引物和探针序列如表2所示。
表2相关分子标记物的引物和探针序列
表2(续)
表2(续)
本实施例和以下实施例中，优选所用的引物和探针组合为：
标记物1的引物和探针组合2，标记物2的引物和探针组合2，标记物3的引物和探针组合2，标记物4的引物和探针组合2，标记物5的引物和探针组合3，标记物6的引物和探针组合1，标记物7的引物和探针组合2，标记物8的引物和探针组合1，标记物9的引物和探针组合1，标记物10的引物和探针组合3，标记物11的引物和探针组合3，标记物12的引物和探针组合1，标记物13的引物和探针组合2，标记物14的引物和探针组合1，标记物15的引物和探针组合2，标记物16的引物和探针组合3，标记物17的引物和探针组合1，标记物18的引物和探针组合2，标记物19的引物和探针组合3，标记物20的引物和探针组合1，标记物21的引物和探针组合1，标记物22的引物和探针组合2，在实际应用中，将根据甲基化分子标记物的不同组合进行选择相应的引物和探针。
所述试剂盒还包含内参基因ACTB的引物和探针，其序列具体如表3所示。
表3.内参基因ACTB引物和探针
实施例2标记物1～22的甲基化水平检测
本实施例利用实施例1所述试剂盒对肺呼吸道样本中标记物1至标记物22的甲基化水平进行检测。
一种DNA甲基化分子标记物的甲基化水平检测方法，包括以下步骤：
1、肺呼吸道样本中gDNA的提取
对肺呼吸道样本样本gDNA提取：石蜡组织gDNA提取具体操作步骤按照美基公司的HiPure Universal DNAKit说明书进行；
2、对提取的gDNA进行亚硫酸盐转化
将提取的gDNA进行亚硫酸氢盐转化，投入5-30ng gDNA，本实施例优选在10ng，按照Zymo DNAMethylation-Lightning MagPrep说明书进行操作，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。经过亚硫酸氢盐转化后的DNA产物全部用于进行多重PCR扩增。
3、对转化后的DNA进行多重PCR扩增
转化后的DNA产物全部进行多重PCR扩增，其中的反应组分为：特定组合的分子标记物及1个内参基因的引物混合液，其中每条引物浓度在200nM-300nM，本实施例优选300nM；镁离子的浓度在1-3mM，本实施例优选在1.5mM；dNTP混合液浓度在200-600uM，本实施例优选在400uM；反应酶为Q5U(NEB，Cat#M0515L)，一个反应的单位数为1-3U，本实施例优选2U。多重PCR反应体系配制如表4。
表4.多重PCR反应体系
| 组分 | 体积(ul) | 终浓度 |
| Q5U Reaction Buffer(5X) | 10 | 1X |
| MgCl2(25mM) | 3 | 1.5mM |
| dNTP mix(10mM/dNTP) | 2 | 400uM/dNTP |
| 引物混合液(100uM/引物) | 14 | 300nM/引物 |
| Q5U Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | 1 | 2U |
| DNA模板 | 15-20 | - |
| DEPCH2O | 补充至50 | - |
具体反应条件为：预变性，98℃，30s；5～10个循环反应，本实施例优选5个循环：变性，98℃，15s；退火，58～66℃，15～30s，本实施例优选63℃，15s，每个循环退火温度下降0.3℃；延伸72℃，15～30s，本实施例优选15s；10～20个循环，本实施例优选13个循环：98℃15s，退火，60℃～65℃，15～30s本实施例优选60℃，15s；72℃，15～30s，本实施例优选15s；72℃5min。
4、对多重PCR扩增产物进行多重荧光定量PCR测定
对多重PCR产物进行5～15稀释，本实施例优选10倍稀释。多重荧光定量PCR反应组分如表5所示，包括：引物探针混合液，其中各引物浓度在100-500nM，本实施例优选160nM；探针浓度在50-250nM，本实施例优选80nM；镁离子的浓度在1-3mM，本实施例优选在2.4mM；dNTP混合液浓度在200-600μM，本实施例优选在400uM；反应酶为TaKaRa EpiTaqTm HS(forBisufite-Treated DNA)(TaKaRa，Cat#XA0280)，一个反应体系为25ul体系。
表5.qPCR荧光定量反应体系
| 组分 | 体积(ul) | 终浓度 |
| 10×EpiTaq PCR缓冲液(Mg2+free) | 2.5 | 1× |
| MgCl2(50mM) | 1.2 | 2.4mM |
| dNTPs(10mM) | 1 | 400uM |
| ROX Reference Dye | 0.045 | 0.045μM |
| 引物和探针混合液(75uM/引物，10uM/探针) | 2 | (正/反向引物分别160nM，探针80nM) |
| TaKaRa EpiTaqTmHS | 0.6 | 3U |
| DNA模板 | 2 | - |
| TE缓冲液 | 补充至25 | - |
本实施例进一步提供一种检测肺结节良恶性的方法，还包括以下步骤：
5、根据荧光定量PCR反应测定的内参基因在样本中的CT值判断该检测样本是否为有效样品，若检测样本内参基因的CT值在10～25之间，则该样本判断为有效样品；对于初始投入量判定为无效样本，不纳入检测和分析。
6、在样品判断为有效样品的前提下，若目标DNA甲基化分子标记物CT值<40判断该DNA甲基化分子标记物被检出，得到该目标DNA甲基化分子标记物的相对循环数ΔCT：ΔCT＝目标DNA甲基化分子标记物CT值-内参基因CT值；若目标DNA甲基化分子标记物CT值≥40则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出，则赋予其ΔCT＝30。
7、根据各样本中的目标分子标记物校正后的ΔCT进行数据分析，将数据集按照6:4分为训练集和测试集，并进行100次随机切分为，然后针对训练集以含有不同分子标记物的组合采用朴素贝叶斯算法建立良恶性预测模型，最后在对应的含有特定的分子标记物组合的测试集中评估模型的分类能力。
实施例3血浆样本的甲基化水平检测
本实施例利用实施例1所述试剂盒对血浆样本中标记物1至标记物22的甲基化水平进行检测。
一种游离外周血DNA(cfDNA)甲基化分子标记物的甲基化水平检测方法，包括以下步骤：
1、外周血血浆的分离：采用二步离心法，先将外周血样本进行低温低速离心处理，4℃，1600g，15min，此时样本分为三层，取上层；然后将第一步得到的血浆样本进行进行低温高速离心处理，4℃，16000g，10min；取上清。
2、血浆中cfDNA的提取：对血浆中cfDNA的提取：先将步骤1血浆样本再次进行低温高速离心处理，4℃，16000g，10min；取上清，避免取到沉淀；然后按照Qiagen公司的QIAampCirculating Nucleic Acid Kit说明书进行操作提取cfDNA；
3、对提取的cfDNA进行亚硫酸盐转化
将提取的cfDNA进行亚硫酸氢盐转化，投入1～4mL血浆提取所得cfDNA，本实施例优选在2mL提取所得，按照Zymo DNA Methylation-Lightning MagPrep说明书进行操作，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。经过亚硫酸氢盐转化后的DNA产物全部用于进行多重PCR扩增。
4、对转化后的cfDNA进行多重PCR，同实施例2；
5、多重PCR产物进行多重荧光定量PCR，同实施例2；
6、检测肺结节良恶性的方法，同实施例2。
实施例4标准品的甲基化水平检测
本实施例提供分子标记物在标准品中的检测，其检测步骤如下：
1、标准品制备
1)0％甲基化标准品制备：
利用Single Cell Kit(Qiagen，Cat#150343)和Mung Bean Nuclease(NEB，Cat#M0250L)处理NA12878 DNA以制备0％甲基化标准品；
2)100％甲基化标准品制备：
利用CpG Methyltransferase(M.SssI)处理所制备的0％的甲基化标准品，得到100％的甲基化标准品。
2、不同甲基化比例的标准品制备：
按照所需的甲基化比例梯度混合0％与100％甲基化标准品，得到0.25％，0.5％，1％甲基化比例的标准品。
3、对不同甲基化比例的标准品DNA进行亚硫酸氢盐转化：步骤如实施例2，转化投入量为3-10ng，优选10ng。
4、对转化后的标准品DNA进行多重PCR扩增，步骤如实施例2，多重PCR引物混合液为66个分子标记物以及内参基因的引物。
5、对上述多重PCR扩增产物进行荧光定量PCR测定，步骤如实施例2。
6、根据荧光定量PCR反应测定的内参基因ACTB在样本中的CT值判断该检测样本是否为有效样品，若检测样本内参基因的CT值在10-25之间，则该样本判断为有效样品；
7、在样品判断为有效样品的前提下，若目标DNA甲基化分子标记物CT值<40判断该DNA甲基化分子标记物被检出，若目标DNA甲基化分子标记物CT值≥40则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出。
本实施例及以下实施例中，各分子标记物的引物探针组合如实施例1中优选的组合。
本实施例及以下实施例中，每一次试验都会设置阴性对照，该阴性对照以水作为模板进行多重PCR，得到的阴性对照多重PCR产物再进行各特定分子标记物的荧光定量PCR测定。如阴性对照无检测信号，则判定整个实验操作无外源污染。
本实施例进行了3次完全独立重复试验，3次重复试验中检出检测信号的次数如表6所示。
表6.分子标记物在各甲基化比例标准品中的测试结果
| 分子标记物名称 | 0.25％甲基化 | 0.5％甲基化 | 1％甲基化 |
| 标记物-001 | 2 | 2 | 3 |
| 标记物-002 | 2 | 3 | 3 |
| 标记物-003 | 2 | 3 | 3 |
| 标记物-004 | 2 | 3 | 3 |
| 标记物-005 | 2 | 3 | 3 |
| 标记物-006 | 3 | 3 | 3 |
| 标记物-007 | 3 | 3 | 3 |
| 标记物-008 | 3 | 3 | 3 |
| 标记物-009 | - | 2 | 3 |
| 标记物-010 | 2 | 2 | 3 |
| 标记物-011 | 2 | 3 | 3 |
| 标记物-012 | 1 | 2 | 3 |
| 标记物-013 | 2 | 3 | 3 |
| 标记物-014 | 3 | 3 | 3 |
| 标记物-015 | 2 | 2 | 3 |
| 标记物-016 | 3 | 3 | 3 |
| 标记物-017 | 2 | 1 | 3 |
| 标记物-018 | - | - | 3 |
| 标记物-019 | 2 | 3 | 3 |
| 标记物-020 | - | - | 3 |
| 标记物-021 | 3 | 3 | 3 |
| 标记物-022 | 3 | 3 | 3 |
| 内参基因 | 3 | 3 | 3 |
如表6所示，22个分子标记物在100％甲基化标准品中均有检测信号，而阴性对照和非甲基化检测标准品中都无检测信号，以其中一个分子标记物(标记物10)扩增曲线为例，如图1所示。在甲基化比例≥0.25％的各标准品中，标记物6-标记物8，标记物14，标记物16，标记物21和标记物22，三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物对甲基化比例≥0.25％的样品检出率达到了100％；在甲基化比例≥0.5％的各标准品中，标记物2-标记物8，标记物11，标记物13，标记物14，标记物16，标记物19，标记物21和标记物22，三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物对甲基化比例≥0.5％的样品的检出率达到了100％；22个分子标记物在甲基化比例为1％的标准品中，三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物都能检出甲基化比例为1％的信号。
实施例5分子标记物与肺癌的相关性
本实施例研究本发明提供的分子标记物与肺癌的相关性，具体方法如下：
1、对肺部组织石蜡切片样本进行DNA提取，如实施例2所述。
2、对提取的DNA进行亚硫酸盐转化，投入量为10ng-50ng，本实施例优选30ng，如实施2所述。
3、对转化后的DNA通过用包含有特定分子标记物的扩增引物进行多重PCR扩增，如实施例2所述。
4、对多重PCR扩增产物进行荧光定量PCR测定，如实施例2所述。
5、根据荧光测定的结果，判断样本是否为有效样品，如实施例2所述。
6、对所检测的样本中的目标分子标记物CT值进行校正，如实施例2所述。
7、根据对样本中校正后的目标分子标记物的ΔCT进行数据分析，如实施例2所述。
本实施例对51例肺结节组织样本中(26例恶性和25例良性)的22个分子标记物进行了单分子标记物的检测。结果见表7。
表7.分子标记物与肺癌的相关性
| 标记物名称 | AUC | 敏感性(％) | 特异性(％) |
| 标记物-001 | 0.71 | 100.00 | 42.31 |
| 标记物-002 | 0.72 | 84.00 | 46.15 |
| 标记物-003 | 0.83 | 88.00 | 73.08 |
| 标记物-004 | 0.85 | 80.00 | 73.08 |
| 标记物-005 | 0.89 | 88.00 | 80.77 |
| 标记物-006 | 0.80 | 84.00 | 65.38 |
| 标记物-007 | 0.87 | 96.00 | 80.77 |
| 标记物-008 | 0.73 | 96.00 | 53.85 |
| 标记物-009 | 0.93 | 92.00 | 92.31 |
| 标记物-010 | 0.85 | 100.00 | 80.77 |
| 标记物-011 | 0.86 | 80.00 | 80.77 |
| 标记物-012 | 0.75 | 100.00 | 50.00 |
| 标记物-013 | 0.92 | 84.00 | 88.46 |
| 标记物-014 | 0.81 | 100.00 | 53.85 |
| 标记物-015 | 0.88 | 88.00 | 80.77 |
| 标记物-016 | 0.78 | 88.00 | 69.23 |
| 标记物-017 | 0.83 | 84.00 | 73.08 |
| 标记物-018 | 0.73 | 100.00 | 46.15 |
| 标记物-019 | 0.81 | 92.00 | 73.08 |
| 标记物-020 | 0.77 | 80.00 | 69.23 |
| 标记物-021 | 0.87 | 84.00 | 80.77 |
| 标记物-022 | 0.74 | 88.00 | 57.69 |
如表7所示，前述各分子标记物的平均AUC均大于0.70，说明该22分子标记物与肺癌组织甲基化信号变化相关；其中标记物-003～标记物-007，标记物-009～标记物-011，标记物-013～标记物-015，标记物-017，标记物-019和标记物-021平均AUC均>0.80，说明这些分子标记物与肺癌甲基化信号变化高度相关；在较强的特异性SP>80％下，标记物-005，标记物-007，标记物-009～标记物-011，标记物-013，标记物-015和标记物-021都有很强的灵敏性(SN>80％)，说明这些分析标记物除与肺癌甲基化信号变化高度相关以外，同时也具有对肺癌检测很强的特异性(SP>0.80)和灵敏性(SN>0.80)。
实施例6不同分子标记物组合对血浆样本进行肺结节良恶性检测的表现
本实施例利用22个分子标记物包含标记物1至标记物22的任意组合，通过实施例3的实验方法，利用实施例1所述试剂盒对133例外周血血浆样本中的22个分子标记物的组合进行检测。其中，样本中手术活检鉴定为良性样本有63例，恶性样本70例，其中恶性样本包含33例I期样本，2例II期样本，2例III期样本，1例IV样本和32例未知分期的恶性样本。良性样本亚型包括15例炎性肉芽肿，3例不典型增生，5例错构瘤，2例真菌感染，33例炎症和5例其他良性亚型。具体的检测试剂盒、试验方法以及数据判断处理如实施例3所述，引物和探针组合如实施例1所优选的组合。
本实施例及以下实施例选取包含了不同特定分子标记物的组合，具体分子标记物组合如表8所示，利用逻辑回归模型进行建模分析，将数据集按照6:4随机切分为训练集和测试集，采用逻辑回归算法建立良恶性预测模型。
表8.不同分子标记物组合
表8(续)
| 标记物-004 | √ | - | - | √ | √ | - | √ | - | √ | - | - | √ |
| 标记物-005 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-002 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-007 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | - | - | - |
| 标记物-011 | √ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-014 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-015 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-019 | √ | √ | - | - | √ | - | - | √ | √ | √ | √ | √ |
| 标记物-020 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 6-临床因子 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物ID | 组合25 | 组合26 | 组合27 | 组合28 | 组合29 | 组合30 | 组合31 | 组合32 | 组合33 | 组合34 | 组合35 | 组合36 |
| 标记物-012 | √ | - | √ | √ | √ | √ | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-013 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | - | - | - |
| 标记物-018 | √ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-001 | √ | - | √ | √ | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-009 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | - | - | - | - |
| 标记物-017 | √ | - | √ | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-006 | √ | - | √ | √ | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-021 | √ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-010 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | - | - |
| 标记物-016 | √ | - | √ | √ | √ | √ | √ | √ | - | - | - | - |
| 标记物-022 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 标记物-003 | √ | - | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 标记物-008 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | - | - | - | - | - |
| 标记物-004 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 标记物-005 | √ | - | √ | √ | √ | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-002 | √ | - | √ | √ | √ | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-007 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 标记物-011 | √ | - | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 标记物-014 | √ | - | √ | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-015 | √ | - | √ | √ | √ | √ | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-019 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 标记物-020 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | - |
| 6-临床因子 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 标记物ID | 组合37 | 组合38 | 组合39 | 组合40 | 组合41 | 组合42 | 组合43 | 组合44 | 组合45 | 组合46 | 组合47 | 组合48 |
| 标记物-012 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-013 | - | - | - | - | - | √ | √ | √ | √ | - | √ | √ |
| 标记物-018 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-001 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-009 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-017 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-006 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-021 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-010 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-016 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-022 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 标记物-003 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-008 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-004 | √ | - | - | √ | √ | - | √ | - | √ | - | - | √ |
| 标记物-005 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-002 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-007 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | - | - | - |
| 标记物-011 | √ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-014 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-015 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 标记物-019 | √ | √ | - | - | √ | - | - | √ | √ | √ | √ | √ |
| 标记物-020 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 6-临床因子 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
将表8中分子标记物组合1～24分别进行建模分析，ROC如图2～4所示，性能数据如表9所示，分析如下：
选取表8中分子标记物组合15和组合22分别进行建模分析，其在测试集中组合22的AUC(0.74)略优于组合15的AUC(0.68)，在特异性(SP)85％下，组合15对应的灵敏性(SN)(45.7％)高于组合22的SN(31.4％)。所述所选分子标记的组合对于肺结节良恶性诊断有较好特异性；将所述组合所有标记物进行合并的组合14，其AUC(0.76)和SP 85％下的SN(48.57％)都较前述两个组合有提升；在组合15和组合22基础上分别增加标记物-013的组合18(AUC，0.70)和组合23(AUC，0.77)，该两个组合的AUC较前述各自原始组合基础上也都有提升，在SP 85％下，组合23的SN为50％，高于前述所选组合。在组合15基础上增加标记物-004的组合16，性能较前述组合没有差异。
选取表8中分子标记物组合17和和组合19分别进行建模分析，其在组合16的基础上分别增加了标记物-019和标记物-013。该两个组合的AUC较组合16都有提升(组合17，AUC0.76；组合19，AUC 0.70)，且在SN 80％下，组合17对于肺结节良恶性诊断的SP为66.7％，组合19的SP为62.55％，而组合16的SN无法达到80％以上。组合17基础上增加标记物-013的组合21，其AUC提升为0.77，SP 85％下的SN(50％)以及SN 80％下的SP(66.7％)都较组合17有提升，且与组合20，组合23和组合24的性能相似。
选取表8中分子标记物组合10，组合11，组合12和组合13分别进行建模分析，其AUC均为0.80，在SN 80％下，SP约为65-68％，而在SP 85％下，组合13具有较其他三个组合更高的肺结节良恶性诊断灵敏性(55.71％)。
选取表8中分子标记物组合7，组合8和组合9分别进行建模分析，其AUC均为0.81，在SN 80％下，SP均为69.8％，而在SP 85％下，组合7的肺结节良恶性诊断灵敏性(58.57％)略高于其他两个组合。
选取表8中分子标记物组合2进行建模，其AUC为0.78，在此基础上增加标记物-012，标记物-016，标记物-003，标记物-011和标记物-015的组合6，其AUC提升至0.82；两个组合在SN 80％下的SP均为65.08％，但在SP 85％下，组合6(61.43％)的肺结节良恶性诊断灵敏性略高于组合2(57.14％)。
选取表8中分子标记物组合1，组合3，组合4和组合5分别进行建模，其AUC均为0.84，但在SP 85％下，组合5的肺结节良恶性诊断灵敏性最高，为65.71％；而在SN 80％下，组合3的肺结节良恶性诊断特异性最高，为77.78％。
表9相关分子标记物组合性能测试结果
表9(续)
实施例7不同甲基化分子标记物与特定临床因子组合对血浆样本进行肺结节良恶性检测的表现
本实施例利用实施例6中所述的甲基化分子标记物组合和133例临床样本，将甲基化分析标记物组合与6个临床因子(包括患者年龄，结节长径，结节短劲，结节实性，结节面积和CT平扫值)联合建模。以期进一步提升肺结节良恶性鉴别的性能。
选取6个临床因子组合(6个临床因子为年龄、结节长径、结节短径、结节面积、结节类型和结节CT值)进行模型建立，其AUC在测试集为0.845，在SP 95％下，该组合对肺结节良恶性诊断的灵敏性有62.16％，略低于甲基化分子标记物组合5；在SN 80％下，该组合的特异性为77.78％，与甲基化分子标记物组合3一致。
本实施例选取包含了不同特定分子标记物与6个临床因子联合的组合，具体分子标记物组合如表8中组合25～48所示，利用逻辑回归模型进行建模分析，将数据集按照6:4随机切分为训练集和测试集，采用逻辑回归算法建立良恶性预测模型。ROC如图2～4所示，性能数据如表9所示，分析如下：
选取表8中组合39，组合40，组合42，组合43和组合46分别进行建模分析，其AUC比单独6个临床因子组合提高了3％-5％；在SP 85％下，该些组合对肺结节良恶性诊断的灵敏性比单独6个临床因子组合提高了10％-14％；组合42，组合43和组合46，在SN 80％下的肺结节良恶性诊断特异性均为84.13％，比单独6个临床因子提高6％左右。
选取表8中组合26，组合34，组合35，组合36，组合37，组合38，组合41，组合44，组合45，组合47和组合48分别进行建模分析，其AUC为0.90-0.92之间，比单独6个临床因子组合提高了约5％左右；在SP 85％下，组合26，组合45，组合47和组合48对肺结节良恶性诊断的灵敏性分别87.69％，86.15％，86.15％和87.69％，均达到85％以上，比单独6个临床因子组合提高了23％左右；组合26，组合34，组合35，组合36，组合37，组合38，组合41和组合44，在SN 80％下的肺结节良恶性诊断特异性均大于80％，其中组合26，组合38，组合41和组合44特异性超过了85％，比单独6个临床因子组合提高了7％左右。
选取表8中组合25，组合27，组合28，组合29，组合30，组合31和组合32分别进行建模分析，其AUC为0.91-0.95之间，比单独6个临床因子组合提高了约5％-10％左右；在SP85％下，组合28和组合29对肺结节良恶性诊断的灵敏性较高均为90.77％，高于其他所述组合，比单独6个临床因子组合提高了27％左右；组合25，组合27，组合30，组合31和组合32，在SN 80％下的肺结节良恶性诊断特异性均大于90％，其中组合25特异性超过了95％，比单独6个临床因子组合提高了17％左右。
表8所列不同标记物组合通过逻辑回归算法训练得到的公式如下：
标记物组合1:X＝83.986737+0.040574×标记物-012-0.028830×标记物-013-1.507624×标记物-018+0.020738×标记物-001-0.001081×标记物-009+0.043824×标记物-017-0.017028×标记物-006+0.008756×标记物-021-0.052931×标记物-010-0.102367×标记物-016-1.248533×标记物-022+0.016787×标记物-003+0.022036×标记物-008-0.032152×标记物-004+0.072351×标记物-005+0.009589×标记物-002-0.001996×标记物-007-0.094349×标记物-011+0.016834×标记物-014+0.026381×标记物-015-0.086310×标记物-019-0.046677×标记物-020。
标记物组合2:X＝37.388120-0.028912×标记物-013+0.020684×标记物-009-0.001310×标记物-010-1.109350×标记物-022+0.003417×标记物-008-0.050336×标记物-004-0.003215×标记物-007-0.076012×标记物-019-0.043286×标记物-020。
标记物组合3:X＝36.919609+0.042767×标记物-012-0.028578×标记物-013+0.019217×标记物-001-0.001958×标记物-009+0.047281×标记物-017-0.018148×标记物-006-0.059713×标记物-010-0.107666×标记物-016-1.178598×标记物-022+0.018295×标记物-003+0.024021×标记物-008-0.033247×标记物-004+0.075600×标记物-005+0.007797×标记物-002-0.001812×标记物-007-0.087909×标记物-011+0.016157×标记物-014+0.025501×标记物-015-0.086183×标记物-019-0.048270×标记物-020。
标记物组合4:X＝37.244988+0.046821×标记物-012-0.023419×标记物-013+0.021498×标记物-001+0.001116×标记物-009-0.013189×标记物-006-0.048677×标记物-010-0.082892×标记物-016-1.194628×标记物-022+0.026637×标记物-003+0.016596×标记物-008-0.029922×标记物-004+0.075299×标记物-005+0.013094×标记物-002-0.007683×标记物-007-0.059546×标记物-011+0.032317×标记物-015-0.084892×标记物-019-0.048150×标记物-020。
标记物组合5:X＝37.435962+0.046320×标记物-012-0.024200×标记物-013+0.001407×标记物-009-0.056534×标记物-010-0.074735×标记物-016-1.199161×标记物-022+0.028516×标记物-003+0.028982×标记物-008-0.035504×标记物-004+0.078336×标记物-005+0.021267×标记物-002-0.009368×标记物-007-0.023035×标记物-011+0.028700×标记物-015-0.087559×标记物-019-0.053047×标记物-020。
标记物组合6:X＝38.975295+0.056623×标记物-012-0.023414×标记物-013-0.001775×标记物-009-0.041072×标记物-010-0.082921×标记物-016-1.199875×标记物-022+0.027927×标记物-003+0.026662×标记物-008-0.043425×标记物-004-0.005894×标记物-007+0.025577×标记物-011+0.040390×标记物-015-0.083230×标记物-019-0.050896×标记物-020。
标记物组合7:X＝37.994424-0.026234×标记物-013+0.010242×标记物-009-0.018080×标记物-010-0.044209×标记物-016-1.148487×标记物-022+0.024164×标记物-003+0.003087×标记物-008-0.054645×标记物-004+0.003110×标记物-007+0.177781×标记物-011-0.078890×标记物-019-0.045412×标记物-020。
标记物组合8:X＝38.066279-0.026161×标记物-013+0.010073×标记物-009-0.017928×标记物-010-0.044717×标记物-016-1.148215×标记物-022+0.024184×标记物-003-0.054311×标记物-004+0.003144×标记物-007+0.177543×标记物-011-0.078832×标记物-019-0.045398×标记物-020。
标记物组合9:X＝38.048075-0.025945×标记物-013-0.014214×标记物-010-1.149713×标记物-022+0.023979×标记物-003-0.054789×标记物-004+0.006099×标记物-007+0.172036×标记物-011-0.078155×标记物-019-0.046309×标记物-020。
标记物组合10:X＝38.564053-0.023469×标记物-010-1.175931×标记物-022+0.022327×标记物-003-0.044650×标记物-004-0.002551×标记物-007+0.178453×标记物-011-0.081530×标记物-019-0.046525×标记物-020。
标记物组合11:X＝38.141193-1.171267×标记物-022+0.021651×标记物-003-0.056467×标记物-004-0.002275×标记物-007+0.170463×标记物-011-0.081411×标记物-019-0.046451×标记物-020。
标记物组合12:X＝36.938584-1.172171×标记物-022+0.023113×标记物-003-0.058827×标记物-004-0.005605×标记物-007+0.162988×标记物-011-0.078708×标记物-019。
标记物组合13:X＝36.432690-1.154467×标记物-022-0.046752×标记物-004-0.006491×标记物-007+0.184037×标记物-011-0.078128×标记物-019。
标记物组合14:X＝36.198380-1.153546×标记物-022-0.012311×标记物-007-0.076506×标记物-019。
标记物组合15:X＝36.335200-1.192706×标记物-022-0.034034×标记物-007。
标记物组合16:X＝36.932805-1.170662×标记物-022-0.044504×标记物-004-0.031508×标记物-007。
标记物组合17:X＝36.782490-1.137613×标记物-022-0.037565×标记物-004-0.010501×标记物-007-0.076066×标记物-019。
标记物组合18:X＝35.857259-0.029879×标记物-013-1.164768×标记物-022-0.024246×标记物-007。
标记物组合19:X＝36.469154-0.030448×标记物-013-1.138799×标记物-022-0.048785×标记物-004-0.021474×标记物-007。
标记物组合20:X＝35.815169-0.023530×标记物-013-1.132682×标记物-022-0.005371×标记物-007-0.073629×标记物-019。
标记物组合21:X＝36.489872-0.024376×标记物-013-1.112741×标记物-022-0.044400×标记物-004-0.003257×标记物-007-0.073110×标记物-019。
标记物组合22:X＝36.016747-1.152454×标记物-022-0.080792×标记物-019。
标记物组合23:X＝35.726623-0.024799×标记物-013-1.131306×标记物-022-0.075215×标记物-019。
标记物组合24:X＝36.446546-0.025146×标记物-013-1.110696×标记物-022-0.046008×标记物-004-0.074029×标记物-019。
标记物组合25:X＝153.169438+0.014450×标记物-012-0.025290×标记物-013-3.370942×标记物-018-0.017725×标记物-001-0.006568×标记物-009+0.086425×标记物-017-0.008200×标记物-006+0.029071×标记物-021-0.091713×标记物-010-0.181536×标记物-016-1.784280×标记物-022-0.006895×标记物-003-0.068944×标记物-008+0.026306×标记物-004+0.184940×标记物-005+0.073236×标记物-002-0.044055×标记物-007-0.368351×标记物-011+0.102002×标记物-014+0.118003×标记物-015-0.145203×标记物-019+0.038422×标记物-020-0.147927×年龄+0.307860×结节长径+0.835012×结节短径-0.023844×结节面积-0.688429×结节类型+0.001198×结节CT值。
标记物组合26:X＝44.982304-0.048980×标记物-013+0.015219×标记物-009+0.043338×标记物-010-1.313889×标记物-022-0.014980×标记物-008-0.010086×标记物-004-0.013038×标记物-007-0.085528×标记物-019+0.018149×标记物-020-0.113625×年龄+0.055604×结节长径+0.205306×结节短径-0.002169×结节面积-0.244310×结节类型-0.000352×结节CT值。
标记物组合27:X＝48.096313+0.037457×标记物-012-0.043409×标记物-013-0.006692×标记物-001+0.001807×标记物-009+0.043878×标记物-017+0.013413×标记物-006-0.126940×标记物-010-0.160527×标记物-016-1.477687×标记物-022-0.005253×标记物-003+0.002809×标记物-008+0.028596×标记物-004+0.134040×标记物-005+0.053408×标记物-002-0.041023×标记物-007-0.234272×标记物-011+0.051409×标记物-014+0.101440×标记物-015-0.124072×标记物-019+0.000952×标记物-020-0.134630×年龄+0.042399×结节长径+0.360080×结节短径-0.003884×结节面积-0.361080×结节类型+0.000868×结节CT值。
标记物组合28:X＝48.468481+0.041170×标记物-012-0.040611×标记物-013-0.007165×标记物-001+0.005753×标记物-009+0.022848×标记物-006-0.085741×标记物-010-0.130069×标记物-016-1.486159×标记物-022+0.003218×标记物-003-0.000877×标记物-008+0.034889×标记物-004+0.136089×标记物-005+0.058803×标记物-002-0.052384×标记物-007-0.204674×标记物-011+0.099124×标记物-015-0.122797×标记物-019+0.012416×标记物-020-0.141870×年龄+0.038920×结节长径+0.340399×结节短径-0.003581×结节面积-0.336907×结节类型+0.000686×结节CT值。
标记物组合29:X＝48.035004+0.043892×标记物-012-0.040982×标记物-013+0.008795×标记物-009-0.069785×标记物-010-0.132889×标记物-016-1.475450×标记物-022+0.003635×标记物-003-0.006023×标记物-008+0.035720×标记物-004+0.136057×标记物-005+0.053007×标记物-002-0.048838×标记物-007-0.219155×标记物-011+0.097238×标记物-015-0.118660×标记物-019+0.013124×标记物-020-0.138776×年龄+0.036888×结节长径+0.330797×结节短径-0.003458×结节面积-0.324029×结节类型+0.000582×结节CT值。
标记物组合30:X＝46.130464+0.070793×标记物-012-0.035319×标记物-013-0.003294×标记物-009-0.015370×标记物-010-0.151483×标记物-016-1.466259×标记物-022+0.006867×标记物-003+0.010186×标记物-008+0.055197×标记物-004-0.034907×标记物-007-0.100448×标记物-011+0.112675×标记物-015-0.094884×标记物-019+0.013107×标记物-020-0.110185×年龄+0.048418×结节长径+0.276120×结节短径-0.002542×结节面积-0.307102×结节类型+0.000231×结节CT值。
标记物组合31:X＝45.481495-0.041747×标记物-013+0.014121×标记物-009+0.030025×标记物-010-0.086132×标记物-016-1.337447×标记物-022+0.001658×标记物-003-0.022472×标记物-008+0.005663×标记物-004-0.014628×标记物-007+0.091928×标记物-011-0.088165×标记物-019+0.013734×标记物-020-0.111507×年龄+0.054296×结节长径+0.218790×结节短径-0.002254×结节面积-0.233158×结节类型-0.000326×结节CT值。
标记物组合32:X＝44.608896-0.041445×标记物-013+0.015602×标记物-009+0.027986×标记物-010-0.077580×标记物-016-1.336685×标记物-022+0.001310×标记物-003+0.007627×标记物-004-0.015098×标记物-007+0.095280×标记物-011-0.087976×标记物-019+0.013447×标记物-020-0.109575×年龄+0.058905×结节长径+0.212754×结节短径-0.002233×结节面积-0.231404×结节类型-0.000325×结节CT值。
标记物组合33:X＝44.814874-0.044538×标记物-013+0.041135×标记物-010-1.334279×标记物-022-0.001289×标记物-003+0.001842×标记物-004-0.010660×标记物-007+0.083552×标记物-011-0.087130×标记物-019+0.011096×标记物-020-0.113046×年龄+0.057318×结节长径+0.202093×结节短径-0.002077×结节面积-0.237183×结节类型-0.000274×结节CT值。
标记物组合34:X＝43.907246+0.007760×标记物-010-1.386829×标记物-022+0.006488×标记物-003+0.036826×标记物-004-0.018869×标记物-007+0.120237×标记物-011-0.088366×标记物-019+0.000313×标记物-020-0.087202×年龄+0.074392×结节长径+0.194257×结节短径-0.002096×结节面积-0.222600×结节类型-0.000749×结节CT值。
标记物组合35:X＝44.101008-1.388162×标记物-022+0.007055×标记物-003+0.037212×标记物-004-0.018823×标记物-007+0.123334×标记物-011-0.088304×标记物-019-0.000161×标记物-020-0.086653×年龄+0.074645×结节长径+0.194902×结节短径-0.002134×结节面积-0.219882×结节类型-0.000756×结节CT值。
标记物组合36:X＝44.070572-1.387277×标记物-022+0.007061×标记物-003+0.037215×标记物-004-0.018833×标记物-007+0.123286×标记物-011-0.088294×标记物-019-0.086660×年龄+0.074646×结节长径+0.194919×结节短径-0.002134×结节面积-0.219974×结节类型-0.000755×结节CT值。
标记物组合37:X＝44.299013-1.383807×标记物-022+0.039286×标记物-004-0.019822×标记物-007+0.125120×标记物-011-0.089564×标记物-019-0.090422×年龄+0.077425×结节长径+0.190929×结节短径-0.002138×结节面积-0.216503×结节类型-0.000715×结节CT值。
标记物组合38:X＝45.890002-1.366896×标记物-022-0.020753×标记物-007-0.089373×标记物-019-0.093740×年龄+0.087923×结节长径+0.181586×结节短径-0.002453×结节面积-0.214818×结节类型-0.000745×结节CT值。
标记物组合39:X＝40.659694-1.299465×标记物-022-0.031422×标记物-007-0.065116×年龄+0.112136×结节长径+0.153949×结节短径-0.002339×结节面积-0.212826×结节类型-0.001166×结节CT值。
标记物组合40:X＝39.876147-1.303390×标记物-022+0.031993×标记物-004-0.032097×标记物-007-0.065793×年龄+0.117325×结节长径+0.143501×结节短径-0.002155×结节面积-0.210676×结节类型-0.001161×结节CT值。
标记物组合41:X＝45.113482-1.371592×标记物-022+0.032170×标记物-004-0.021815×标记物-007-0.089408×标记物-019-0.094436×年龄+0.090214×结节长径+0.177654×结节短径-0.002299×结节面积-0.212547×结节类型-0.000743×结节CT值。
标记物组合42:X＝41.647989-0.046420×标记物-013-1.258631×标记物-022-0.021700×标记物-007-0.088863×年龄+0.091638×结节长径+0.166836×结节短径-0.002269×结节面积-0.219263×结节类型-0.000803×结节CT值。
标记物组合43:X＝41.734153-0.046535×标记物-013-1.259356×标记物-022-0.002092×标记物-004-0.021615×标记物-007-0.088883×年龄+0.091343×结节长径+0.167445×结节短径-0.002280×结节面积-0.219535×结节类型-0.000802×结节CT值。
标记物组合44:X＝46.546668-0.042108×标记物-013-1.328673×标记物-022-0.011614×标记物-007-0.087293×标记物-019-0.112531×年龄+0.070521×结节长径+0.191796×结节短径-0.002391×结节面积-0.213514×结节类型-0.000325×结节CT值。
标记物组合45:X＝46.582517-0.042071×标记物-013-1.330395×标记物-022+0.000494×标记物-004-0.011643×标记物-007-0.087292×标记物-019-0.112523×年龄+0.070563×结节长径+0.191732×结节短径-0.002389×结节面积-0.213445×结节类型-0.000325×结节CT值。
标记物组合46:X＝44.810398-1.347030×标记物-022-0.092378×标记物-019-0.089666×年龄+0.085692×结节长径+0.186271×结节短径-0.002434×结节面积-0.227766×结节类型-0.000596×结节CT值。
标记物组合47:X＝46.027333-0.044603×标记物-013-1.316721×标记物-022-0.088982×标记物-019-0.111347×年龄+0.068305×结节长径+0.194922×结节短径-0.002379×结节面积-0.219868×结节类型-0.000227×结节CT值。
标记物组合48:X＝46.253196-0.044997×标记物-013-1.317563×标记物-022-0.006094×标记物-004-0.088951×标记物-019-0.111492×年龄+0.067862×结节长径+0.195613×结节短径-0.002408×结节面积-0.220514×结节类型-0.000226×结节CT值。
通过上述公式我们先求出X的值，然后再通过(e为自然常数)即可计算得到每个样本的预测风险评分。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (14)
1.一种用于检测肺结节的甲基化分子标记物，其特征在于，所述甲基化分子标记物包括以下基因中的任意一个或多个：RASSF1、PTGER4、HOXB3、HOXB4、LHX9、CDO1、ZSCAN31和SHOX2。
2.根据权利要求1所述的甲基化分子标记物，其特征在于，所述甲基化分子标记物包括HOXB3基因；和以下基因中的任意一个或多个：RASSF1、PTGER4、HOXB4、LHX9、CDO1、ZSCAN31和SHOX2。
3.根据权利要求1所述的甲基化分子标记物，其特征在于，所述甲基化分子标记物包括：SEQ ID NO:1～22中的任意一个或多个，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
4.根据权利要求3所述的甲基化分子标记物，其特征在于，所述甲基化分子标记物包括：SEQ ID NO:22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
优选地，所述甲基化分子标记物包括：SEQ ID NO:7和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
更优选地，所述甲基化分子标记物还包括：SEQ ID NO:1～6和8～21中的任意一个或多个，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；进一步优选地，所述甲基化分子标记物包括以下任一项或多项：
(1)SEQ ID NO:7、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(2)SEQ ID NO:4、7、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(3)SEQ ID NO:4、7、11、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(4)SEQ ID NO:3、4、7、11、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(5)SEQ ID NO:3、4、7、11、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(6)SEQ ID NO:3、4、7、10、11、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(7)SEQ ID NO:3、4、7、10、11、13、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(8)SEQ ID NO:3、4、7、9、10、11、13、16、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(9)SEQ ID NO:3、4、7～11、13、16、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(10)SEQ ID NO:3、4、7～13、15、16、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(11)SEQ ID NO:2～5、7～13、15、16、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(12)SEQ ID NO:1～13、15、16、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(13)SEQ ID NO:1～17、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(13)SEQ ID NO:1～22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(14)SEQ ID NO:4、7、13、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(15)SEQ ID NO:4、7～10、13、19、20和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(16)SEQ ID NO:4、7和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(17)SEQ ID NO:4、7、13和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(18)SEQ ID NO:7、13和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
(19)SEQ ID NO:7、13、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
5.根据权利要求3所述的甲基化分子标记物，其特征在于，所述甲基化分子标记物包括：SEQ ID NO:19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
优选地，所述甲基化分子标记物还包括：SEQ ID NO:1～18和20～21中的任意一个或多个，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
更优选地，所述甲基化分子标记物包括：SEQ ID NO:13、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
进一步优选地，所述甲基化分子标记物包括：SEQ ID NO:4、13、19和22，或其片段，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
6.权利要求1～5任一项所述的甲基化分子标记物在制备诊断肺结节的试剂盒中的用途，所述肺结节优选为早期肺癌。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述诊断还包括对患者年龄，结节长径，结节短径，结节实性，结节面积和CT平扫值中的一种或多种临床因子的检测。
8.一种用于检测肺结节的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测权利要求1～5任一项所述的甲基化分子标记物的甲基化水平的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对甲基化分子标记物的引物对，所述引物对包括：第一引物，所述第一引物包括以下项中的一项或多项：SEQ IDNO:23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、200、203、206、209、212、215、218；和，第二引物，所述第二引物包括以下项中的一项或多项：SEQ ID NO:24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219，，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
优选地，所述引物对包括：第一引物，所述第一引物包括以下项中的一项或多项：SEQID NO:26、35、44、53、65、68、80、86、95、110、119、122、134、140、152、164、167、179、191、194、203、215；和，第二引物，所述第二引物包括以下项中的一项或多项：SEQ ID NO:27、36、45、54、66、69、81、87、96、111、120、123、135、141、153、165、168、180、192、195、204、216，，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对甲基化分子标记物的引物对，所述引物对选自以下项中的一项或多项：
(1)SEQ ID NO:23和24；(2)SEQ ID NO:26和27；(3)SEQ ID NO:29和30；(4)SEQ ID NO:32和33；(5)SEQ ID NO:35和36；(6)SEQ ID NO:38和39；(7)SEQ ID NO:41和42；(8)SEQ IDNO:44和45；(9)SEQ ID NO:47和48；(10)SEQ ID NO:50和51；(11)SEQ ID NO:53和54；(12)SEQ ID NO:56和57；(13)SEQ ID NO:59和60；(14)SEQ ID NO:62和63；(15)SEQ ID NO:65和66；(16)SEQ ID NO:68和69；(17)SEQ ID NO:71和72；(18)SEQ ID NO:74和75；(19)SEQ IDNO:77和78；(20)SEQ ID NO:80和81；(21)SEQ ID NO:83和84；(22)SEQ ID NO:86和87；(23)SEQ ID NO:89和90；(24)SEQ ID NO:92和93；(25)SEQ ID NO:95和96；(26)SEQ ID NO:98和99；(27)SEQ ID NO:101和102；(28)SEQ ID NO:104和105；(29)SEQ ID NO:107和108；(30)SEQ ID NO:110和111；(31)SEQ ID NO:113和114；(32)SEQ ID NO:116和117；(33)SEQ IDNO:119和120；(34)SEQ ID NO:122和123；(35)SEQ ID NO:125和126；(36)SEQ ID NO:128和129；(37)SEQ ID NO:131和132；(38)SEQ ID NO:134和135；(39)SEQ ID NO:137和138；(40)SEQ ID NO:140和141；(41)SEQ ID NO:143和144；(42)SEQ ID NO:146和147；(43)SEQ IDNO:149和150；(44)SEQ ID NO:152和153；(45)SEQ ID NO:155和156；(46)SEQ ID NO:158和159；(47)SEQ ID NO:161和162；(48)SEQ ID NO:164和165；(49)SEQ ID NO:167和168；(50)SEQ ID NO:170和171；(51)SEQ ID NO:173和174；(52)SEQ ID NO:176和177；(53)SEQ IDNO:179和180；(54)SEQ ID NO:182和183；(55)SEQ ID NO:185和186；(56)SEQ ID NO:188和189；(57)SEQ ID NO:191和192；(58)SEQ ID NO:194和195；(59)SEQ ID NO:197和198；(60)SEQ ID NO:200和201；(61)SEQ ID NO:203和204；(62)SEQ ID NO:206和207；(63)SEQ IDNO:209和210；(64)SEQ ID NO:212和213；(65)SEQ ID NO:215和216；(66)SEQ ID NO:218和219；
优选地，所述引物对选自以下项中的一项或多项：
(1)SEQ ID NO:26和27；(2)SEQ ID NO:35和36；(3)SEQ ID NO:44和45；(4)SEQ ID NO:53和54；(5)SEQ ID NO:65和66；(6)SEQ ID NO:68和69；(7)SEQ ID NO:80和81；(8)SEQ IDNO:86和87；(9)SEQ ID NO:95和96；(10)SEQ ID NO:110和111；(11)SEQ ID NO:119和120；(12)SEQ ID NO:122和123；(13)SEQ ID NO:134和135；(14)SEQ ID NO:140和141；(15)SEQID NO:152和153；(16)SEQ ID NO:164和165；(17)SEQ ID NO:167和168；(18)SEQ ID NO:179和180；(19)SEQ ID NO:191和192；(20)SEQ ID NO:194和195；(21)SEQ ID NO:203和204；(22)SEQ ID NO:215和216。
11.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对甲基化分子标记物的探针，所述探针选自以下项中的一项或多项：SEQ ID NO:25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、199、202、205、208、211、214、217、220，或与其具有至少85％序列同一性的序列；
优选地，所述探针选自以下项中的一项或多项：SEQ ID NO:28、37、46、55、67、70、82、88、97、112、121、124、136、142、154、166、169、181、193、196、205、217，或与其具有至少85％序列同一性的序列。
12.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对甲基化分子标记物的引物对和探针的组合，所述引物对和探针的组合选自以下项中的一项或多项：
(1)SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的引物对，和SEQ ID NO:25所示探针；
(2)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的引物对，和SEQ ID NO.28所示探针；
(3)SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的引物对，和SEQ ID NO:31所示探针；
(4)SEQ ID NO:32和SEQ ID NO.33所示的引物对，和SEQ ID NO:34所示探针；
(5)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的引物对，和SEQ ID NO:37所示探针；
(6)SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示的引物对，和SEQ ID NO:40所示探针；
(7)SEQ ID NO:41和SEQ ID NO.42所示的引物对，和SEQ ID NO:43所示探针；
(8)SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示的引物对，和SEQ ID NO:46所示探针；
(9)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48所示的引物对，和SEQ ID NO:49所示探针；
(10)SEQ ID NO:50和SEQ ID NO.51所示的引物对，和SEQ ID NO:52所示探针；
(11)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示的引物对，和SEQ ID NO:55所示探针；
(12)SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57所示的引物对，和SEQ ID NO:58所示探针；
(13)SEQ ID NO:59和SEQ ID NO.60所示的引物对，和SEQ ID NO:61所示探针；
(14)EQ ID NO.62和SEQ ID NO:63所示的引物对，和SEQ ID NO:64所示探针；
(15)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示的引物对，和SEQ ID NO:67所示探针；
(16)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO.69所示的引物对，和SEQ ID NO:70所示探针；
(17)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72所示的引物对，和SEQ ID NO:73所示探针；
(18)SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75所示的引物对，和SEQ ID NO:76所示探针；
(19)SEQ ID NO:77和SEQ ID NO.78所示的引物对，和SEQ ID NO:79所示探针；
(20)SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81所示的引物对，和SEQ ID NO:82所示探针；
(21)SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84所示的引物对，和SEQ ID NO:85所示探针；
(22)SEQ ID NO:86和SEQ ID NO.87所示的引物对，和SEQ ID NO:88所示探针；
(23)SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示的引物对，和SEQ ID NO:91所示探针；
(24)SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:93所示的引物对，和SEQ ID NO:94所示探针；
(25)SEQ ID NO:95和SEQ ID NO.96所示的引物对，和SEQ ID NO:97所示探针；
(26)SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99所示的引物对，和SEQ ID NO:100所示探针；
(27)SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102所示的引物对，和SEQ ID NO:103所示探针；
(28)SEQ ID NO:104和SEQ ID NO.105所示的引物对，和SEQ ID NO:106所示探针；
(29)SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108所示的引物对，和SEQ ID NO:109所示探针；
(30)SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111所示的引物对，和SEQ ID NO:112所示探针；
(31)SEQ ID NO:113和SEQ ID NO.114所示的引物对，和SEQ ID NO:115所示探针；
(32)SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117所示的引物对，和SEQ ID NO:118所示探针；
(33)SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120所示的引物对，和SEQ ID NO.121所示探针；
(34)SEQ ID NO:122和SEQ ID NO.123所示的引物对，和SEQ ID NO:124所示探针；
(35)SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126所示的引物对，和SEQ ID NO:127所示探针；
(36)SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129所示的引物对，和SEQ ID NO.130所示探针；
(37)SEQ ID NO:131和SEQ ID NO.132所示的引物对，和SEQ ID NO:133所示探针；
(38)SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135所示的引物对，和SEQ ID NO:136所示探针；
(39)SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:138所示的引物对，和SEQ ID NO.139所示探针；
(40)SEQ ID NO:140和SEQ ID NO.141所示的引物对，和SEQ ID NO:142所示探针；
(41)SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144所示的引物对，和SEQ ID NO:145所示探针；
(42)SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:147所示的引物对，和SEQ ID NO.148所示探针；
(43)SEQ ID NO:149和SEQ ID NO.150所示的引物对，和SEQ ID NO:151所示探针；
(44)SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153所示的引物对，和SEQ ID NO:154所示探针；
(45)SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:156所示的引物对，和SEQ ID NO.157所示探针；
(46)SEQ ID NO:158和SEQ ID NO.159所示的引物对，和SEQ ID NO:160所示探针；
(47)SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162所示的引物对，和SEQ ID NO:163所示探针；
(48)SEQ ID NO:164和SEQ ID NO:165所示的引物对，和SEQ ID NO.166所示探针；
(49)SEQ ID NO:167和SEQ ID NO.168所示的引物对，和SEQ ID NO:169所示探针；
(50)SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171所示的引物对，和SEQ ID NO:172所示探针；
(51)SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:174所示的引物对，和SEQ ID NO.175所示探针；
(52)SEQ ID NO:176和SEQ ID NO.177所示的引物对，和SEQ ID NO:178所示探针；
(53)SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:180所示的引物对，和SEQ ID NO:181所示探针；
(54)SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:183所示的引物对，和SEQ ID NO:184所示探针；
(55)SEQ ID NO:185和SEQ ID NO.186所示的引物对，和SEQ ID NO:187所示探针；
(56)SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:189所示的引物对，和SEQ ID NO:190所示探针；
(57)SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192所示的引物对，和SEQ ID NO.193所示探针；
(58)SEQ ID NO:194和SEQ ID NO.195所示的引物对，和SEQ ID NO:196所示探针；
(59)SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:198所示的引物对，和SEQ ID NO:199所示探针；
(60)SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201所示的引物对，和SEQ ID NO.202所示探针；
(61)SEQ ID NO:203和SEQ ID NO.204所示的引物对，和SEQ ID NO:205所示探针；
(62)SEQ ID NO:206和SEQ ID NO:207所示的引物对，和SEQ ID NO:208所示探针；
(63)SEQ ID NO:209和SEQ ID NO:210所示的引物对，和SEQ ID NO.211所示探针；
(64)SEQ ID NO:212和SEQ ID NO.213所示的引物对，和SEQ ID NO:214所示探针；
(65)SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:216所示的引物对，和SEQ ID NO:217所示探针；
(66)SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219所示的引物对，和SEQ ID NO.220所示探针；
优选地，所述引物和探针的组合选自以下项中的一项或多项：
(1)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的引物对，和SEQ ID NO.28所示探针；
(2)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的引物对，和SEQ ID NO:37所示探针；
(3)SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示的引物对，和SEQ ID NO:46所示探针；
(4)SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示的引物对，和SEQ ID NO:55所示探针；
(5)SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示的引物对，和SEQ ID NO:67所示探针；
(6)SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69所示的引物对，和SEQ ID NO:70所示探针；
(7)SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81所示的引物对，和SEQ ID NO:82所示探针；
(8)SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87所示的引物对，和SEQ ID NO:88所示探针；
(9)SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96所示的引物对，和SEQ ID NO:97所示探针；
(10)SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111所示的引物对，和SEQ ID NO:112所示探针；
(11)SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120所示的引物对，和SEQ ID NO:121所示探针；
(12)SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:123所示的引物对，和SEQ ID NO:124所示探针；
(13)SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135所示的引物对，和SEQ ID NO:136所示探针；
(14)SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:141所示的引物对，和SEQ ID NO:142所示探针；
(15)SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:153所示的引物对，和SEQ ID NO:154所示探针；
(16)SEQ ID NO:164和SEQ ID NO:165所示的引物对，和SEQ ID NO:166所示探针；
(17)SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:168所示的引物对，和SEQ ID NO:169所示探针；
(18)SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:180所示的引物对，和SEQ ID NO:181所示探针；
(19)SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:192所示的引物对，和SEQ ID NO:193所示探针；
(20)SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:195所示的引物对，和SEQ ID NO:196所示探针；
(21)SEQ ID NO:203和SEQ ID NO:204所示的引物对，和SEQ ID NO:205所示探针；
(22)SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:216所示的引物对，和SEQ ID NO:217所示探针。
13.一种检测待测样本中的甲基化水平的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)从待测样本中提取DNA；和
(2)检测权利要求1～5任一项所述的甲基化分子标记物的甲基化模式。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法的检测样本为血液样本或呼吸道样本，优选地，所述血液样本包括血液、血清、血浆和它们的处理物；和/或，所述呼吸道样本包括肺部组织样本或呼吸道液体样本；
更优选地，所述肺部组织样本包括肺部组织、肺部肿瘤组织、肿瘤细胞和它们的处理物；和/或，所述呼吸道液体样本包括痰液、肺泡灌洗液、拭子液和它们的处理物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311431003.6A CN117660622A (zh) | 2023-10-31 | 2023-10-31 | 用于检测肺结节的甲基化分子标记物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311431003.6A CN117660622A (zh) | 2023-10-31 | 2023-10-31 | 用于检测肺结节的甲基化分子标记物及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117660622A true CN117660622A (zh) | 2024-03-08 |
Family
ID=90076069
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311431003.6A Pending CN117660622A (zh) | 2023-10-31 | 2023-10-31 | 用于检测肺结节的甲基化分子标记物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117660622A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113637745A (zh) * | 2020-04-27 | 2021-11-12 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用 |
| CN113637746A (zh) * | 2020-04-27 | 2021-11-12 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用 |
| CN115896281A (zh) * | 2022-05-25 | 2023-04-04 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 甲基化生物标记物、试剂盒及用途 |
-
2023
- 2023-10-31 CN CN202311431003.6A patent/CN117660622A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113637745A (zh) * | 2020-04-27 | 2021-11-12 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用 |
| CN113637746A (zh) * | 2020-04-27 | 2021-11-12 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用 |
| CN115896281A (zh) * | 2022-05-25 | 2023-04-04 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 甲基化生物标记物、试剂盒及用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110872631B (zh) | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 | |
| CN114277135B (zh) | 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒 | |
| EP3083993B1 (en) | Gene methylation based colorectal cancer diagnosis | |
| US20210222256A1 (en) | Pancreatic cancer | |
| CN107849618A (zh) | 鉴别和检测水生生物传染病致病病毒的遗传标记以及使用其的致病病毒鉴别和检测方法 | |
| CN110484621B (zh) | 一种肝癌早期预警的方法 | |
| JP2011505812A5 (zh) | ||
| EP3740590A1 (en) | Kits and methods for diagnosing lung cancer | |
| WO2021003629A1 (en) | Methods and Compositions for Lung Cancer Detection | |
| JP7084034B2 (ja) | 神経芽腫の微小残存病変を評価するために用いられる試薬、およびそれを用いた生体試料の分析方法 | |
| WO2022127717A1 (zh) | 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用 | |
| CN113637754B (zh) | 生物标志物在诊断食管癌中的应用 | |
| CN117660622A (zh) | 用于检测肺结节的甲基化分子标记物及其应用 | |
| JP2023516525A (ja) | Ｄｎａメチル化バイオマーカーの組み合わせ、検出方法および試薬キット | |
| CN115786502B (zh) | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用 | |
| WO2024001668A1 (zh) | 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物及其应用 | |
| CN115948561B (zh) | 一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用 | |
| CN113755584A (zh) | Dna甲基化生物标志物组合及其应用 | |
| CN116287222A (zh) | 甲状腺癌良恶性结节诊断的甲基化标志物及其应用 | |
| CN117004720A (zh) | 用于检测甲状腺癌的组合物及其用途 | |
| CN117778582A (zh) | 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用 | |
| CN116356027A (zh) | 一种用于食管鳞癌或癌前病变检测的试剂、试剂盒及应用 | |
| CN116798606A (zh) | 用于检测甲状腺癌的系统 | |
| CN116732180A (zh) | 用于检测甲状腺癌的组合物及其用途 | |
| CN116640852A (zh) | 用于检测甲状腺癌的组合物及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |