CN113755584A - Dna甲基化生物标志物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于膀胱癌风险分层的DNA甲基化标志物组合，包括SEQ ID NO.3或其完全互补序列、SEQ ID NO.5或其完全互补序列、和SEQ ID NO.7或其完全互补序列的组合。本发明根据筛选到的合适的分子标记物组合，提出了术前三级风险分层模型的临床应用，以促进当前的诊疗方式的合理利用，其中BC阴性的患者可以避免过度侵入性膀胱镜检查，而HR‑NMIBC或MIBC可以加速并包括更彻底的手术计划，而判定的LMR‑NMIBC患者可以遵循标准的诊断方式。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种DNA甲基化生物标志物组合及其应用。
背景技术
膀胱癌(BC)是全球第十大最常见的癌症，也是男性癌症死亡的第九大主要原因。根据组织学分级，TNM分类，肿瘤大小和病灶，中低危非肌层浸润膀胱癌(LMR-NMIBC)，高危非肌层浸润膀胱癌(HR-NMIBC)和肌层浸润膀胱癌(MIBC)这三种膀胱癌风险分层，预示了患者的不同预后及复发风险程度，因此也决定了不同的监测方式和治疗方式。尽管被诊断出患有非肌层浸润膀胱癌(NMIBC)的患者占70-80％，且高达50％的LMR-NMIBC显示出了良好的预后，但是被诊断为HR-NMICB的患者的5年复发率高达80％，并且高达50％会发展成MIBC，而一旦发展成MIBC，生存率仅有35％。同时，MIBC(肌层浸润膀胱癌)具有更高的复发率和远端转移的风险。因此，MIBC患者和HR-NMICB患者都需要更深入的治疗和监视计划。
目前用于诊断和监测膀胱癌的金标准仍然是膀胱镜检查或经尿道膀胱肿瘤切除(TURBT)，然后对可疑病变进行活检。由于这些检测昂贵且带有侵入性，使用膀胱镜检查或TURBT进行初始诊断并不理想。据报道，在美国，每年约有20,000例中高危血尿患者漏诊癌症病例，而每年有230,000多例癌症风险接近零的患者进行了侵入性的膀胱镜检查。另一方面，确定膀胱癌肿瘤的分期，浸润，淋巴结和转移状态需要术后病理基础上使用多种放射成像，包括磁共振成像(MRI)，计算机断层扫描(CT)，超声检查和静脉尿道造影。有报告估计，由于肿瘤的异质性及手术中未包含相应的肌层组织，高达41％的肿瘤在最初的TURBT手术中被低估分级，而需要第二次TURBT进行确认。基于上述的原因，现有的诊断由于缺乏风险分层的提示而未能有效的被利用，加上高复发率的HR-NMIBC和MIBC患者对术后频繁监测的需求，膀胱癌的诊疗耗费巨大的医疗费用，已占所有癌症相关医疗费用的3％。因此，除了侵入性膀胱镜检查外，还需要开发具有高灵敏度，有助于膀胱癌准确风险分层的非侵入性诊断工具，以减少因延迟诊断导致的强化治疗及减轻患者的经济负担。而迄今为止，尚无任何商用化的非侵入性尿液测试能够对HR-NMIBC或MIBC患者进行手术前分层和鉴定。
尿液肿瘤DNA甲基化可以作为改善膀胱癌检测和术前风险分层的非侵入性诊断工具。本发明开发了用于膀胱癌术前风险分层的生物标记物组合及其基于尿液DNA甲基化的检测方法，既可以用于排除接近零癌症风险的血尿患者，使这些患者避免膀胱镜的过度检查，同时从疑似膀胱癌患者中鉴别出高风险的HR-NMIBC及MIBC患者，使这些患者可以从加速诊断和手术计划中受益，而判别为LMR-NMIBC的患者可以遵从标准诊疗方案以避免漏诊。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种可用于膀胱癌风险分层的DNA甲基化标志物组合。
实现上述目的的技术方案如下。
一种用于膀胱癌风险分层检测的DNA甲基化标志物组合，包括由CG指示的共甲基化区域的SEQ ID NO.3或其完全互补序列、SEQ ID NO.5或其完全互补序列、和SEQ ID NO.7或其完全互补序列的组合。
在其中一些实施例中，还包括有由CG指示的共甲基化区域的SEQ ID NO.1或其完全互补序列。
在其中一些实施例中，还包括有由CG指示的共甲基化区域的SEQ ID NO.2或其完全互补序列。
在一些优选的实施例中，包括有SEQ ID NO.1或其完全互补序列，和SEQ ID NO.2或其完全互补序列。
在一些优选的实施例中，所述用于膀胱癌风险分层检测的DNA甲基化标志物组合包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
本发明还提供了上述DNA甲基化标志物组合在膀胱癌风险分层检测中的应用。
本发明还提供了一种用于膀胱癌风险分层检测的试剂盒。
一种用于膀胱癌风险分层检测的试剂盒，包括检测有上述的任意一种DNA甲基化标志物组合的甲基化程度的试剂。
在其中一个优选的实施方式中，采用荧光定量PCR方法，所述检测试剂盒包括针对单个甲基化区域的扩增引物和荧光探针，所述扩增引物和荧光探针包括：
针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.47，以及SEQ ID NO.69；
针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.49，以及SEQ ID NO.71；
针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.51，以及SEQ ID NO.73；
或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
在其中一个优选的实施方式中，采用荧光定量PCR方法，所述检测试剂盒包括针对单个甲基化区域的扩增引物和荧光探针，所述扩增引物和荧光探针包括：针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.113，以及SEQ ID NO.135；针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.93和SEQ ID NO.115，以及SEQ ID NO.137；针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.95和SEQ IDNO.117，以及SEQ ID NO.139；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
在其中一个优选的实施方式中，采用荧光定量PCR方法，所述检测试剂盒包括针对单个甲基化区域的扩增引物和荧光探针，所述扩增引物和荧光探针包括：针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.157和SEQ ID NO.179，以及SEQ ID NO.201；针对SEQ ID NO.5的SEQ IDNO.159和SEQ ID NO.181，以及SEQ ID NO.203；针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.161和SEQID NO.183，以及SEQ ID NO.205；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
在其中一个优选的实施方式中，还包括针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.23和SEQID NO.45，以及SEQ ID NO.67；
或针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.111，以及SEQ ID NO.133；
或针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.155和SEQ ID NO.177，以及SEQ ID NO.199；
或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
在其中一个优选的实施方式中，还包括针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.24和SEQID NO.46，以及SEQ ID NO.68；
或针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.90和SEQ ID NO.112，以及SEQ ID NO.134；
或针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.156和SEQ ID NO.178，以及SEQ ID NO.200；
或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
在其中一些实施例中，还包括有内参基因的引物和探针：SEQ ID NO.221-SEQ IDNO.223；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
本发明的另一个目的是提供了一种膀胱癌风险分层的检测方法。
实现上述目的的技术方案如下：
一种膀胱癌风险分层的检测方法，包括以下步骤：提取将待测的生物样品基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA和对照进行如上述DNA甲基化标志物组合的共甲基化检测，得到甲基化图谱；
将甲基化标志物组合的甲基化图谱与从基于数据集数学建模得到的图谱判定阈值进行比较，判断生物样品中膀胱癌的存在以及风险分层。
在其中一些实施例中，所述共甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、数字PCR定量及荧光定量PCR。
另一个方面，本发明还提供了一种对膀胱癌诊断和分期、分类的方法。
一种对膀胱癌诊断和分期、分类的方法，包括以下步骤：提取待测的生物样品基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行如上述DNA甲基化标志物组合的共甲基化检测；
得到目标DNA甲基化标志物区域的相对循环数d-CT，与设定阈值相比较，对不同来源的生物样品的膀胱癌级别或分期进行判断。
另一个方面，本发明还提供了一种对膀胱癌预测、治疗监测、预后或其它评价的方法。
一种对膀胱癌预测、治疗监测、预后或其它评价的方法，包括以下步骤：
获得个体的生物样品，
提取所述生物样品基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA与特异性检测上述的DNA甲基化标志物的共甲基化程度的多种试剂接触，测定所述生物样品的所述的DNA甲基化标志物的共甲基化程度，比对从基于数据集数学建模得到的共甲基化程度判定阈值，对膀胱癌的预测、治疗检测、预后作出判断。
本发明从众多个特异性甲基化区域(生物标志物，marker)中对膀胱癌进行检测，找到适合用于膀胱癌风险分层的DNA甲基化标志物组合(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQID NO.7),特别是五个DNA甲基化标志物组合(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)的三类分层模型显示，对HR-NMIBC和MIBC进行风险分层的敏感性为82.1％，特异性为90.0％，阳性预测值(PPV)为88.6％。高阳性预测值可以实现对HR-NMIBC和MIBC的准确预测，因此可实现这些患者的加快诊疗。另外，三分类模型对非膀胱癌患者进行风险分层的敏感性为84.7％，特异性为87.2％，阴性预测值(NPV)为79.1％，高阴性预测值可有效排除非癌患者，使他们免于膀胱镜的过度检查。此外，模型对LMR-NMIBC组和HR-NMIBC或MIBC组的NPV分别为93.1％和83.3％，高的阴性预测值同时也确保了这些癌症患者不被漏诊。
附图说明
图1.五个甲基化生物标记物的甲基化水平在不同膀胱癌风险分层中的分布。甲基化水平由40-ΔCt(40减去相对扩增循环数)表示。越高的40-ΔCt表明越高的甲基化水平。LMR-NMIBC,中低危非肌层浸润膀胱癌；HR-NMIBC，高危肌层浸润膀胱癌；MIBC，肌层浸润膀胱癌；Non-BC，非膀胱癌。
图2.单个甲基化生物标记物对于膀胱癌风险分层的预测表现。单个甲基化生物标记物分析中对于膀胱癌风险分层预测中表现突出的生物标记物的预测性能，包括三个组别的平均平衡准确性、总体准确度及总体AUC。这些参数显示为100次训练-测试切分下的平均值及95％CI范围；各生物标记物的聚类分组由非监控层次式聚类得到；Balanced accuracyave,三个组别平衡准确性的平均值；Overall accuracy,总体准确度；Overall AUC，总体AUC。
图3. 5个生物标记物组合模型在两个临床试验中对于膀胱癌风险分层的预测性能表现。虚线为在临床试验1中的ROC曲线，实线为在临床试验2中的ROC曲线。
图4. 5个生物标记物组合模型在临床试验2中对于膀胱癌风险分层的预测性能特征。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
术语“互补”和“互补性”是指与碱基配对规则相关的核苷酸(例如，1个核苷酸)或多核苷酸(例如核苷酸的序列)。例如，序列5′-A-G-T-3′与序列3′-T-C-A-5′互补。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则进行匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“总”互补。核酸链之间的互补程度影响核酸链之间杂交的效率和强度。这在扩增反应和依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。
术语“聚合酶链式反应”用于扩增靶序列,该方法由以下步骤组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入到含有期望靶序列的DNA混合物中，随后在DNA聚合酶存在下进行精确的热循环顺序。两种引物与双链靶序列的相应链互补。为了进行扩增，将混合物变性，然后引物与靶分子内的其互补序列退火。退火后，用聚合酶扩增引物，形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多“循环”)以获得高浓度的期望靶序列的扩增片段。期望靶序列的扩增片段的长度由引物相对于彼此的相对位置确定，因此该长度是可控参数。由于该方法的重复方面，该方法被称为“聚合酶链式反应”(“PCR”)。由于靶序列的期望扩增片段成为混合物中的主要序列(以浓度计)，所以称其被“PCR扩增”，是“PCR产物”或“扩增子”。
如本发明所用，术语“核酸检测测定”是指确定目标核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法。
术语“可扩增核酸”是指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增核酸”通常将包含“样品模板”。
术语“样品模板”是指来源于样品的用于分析“靶”(下文定义)的存在的核酸。相比之下，“背景模板”用于指样品模板以外的核酸，其可能存在或可能不存在于样品中。背景模板通常是无意的。这可能是遗留的结果，或者可能是由于试图从样品中纯化走的核酸污染物的存在。例如，来自生物体的待检测核酸以外的核酸可以作为测试样品的背景存在。
术语“引物”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的寡核苷酸，当处于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时，其能够作为合成的起点。引物优选是单链的，用于扩增的最大效率，但也可以是双链的。如果是双链，则在用于制备延伸产物之前首先处理引物以分离其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源以及方法的使用。
术语“探针”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或者合成、重组或通过PCR扩增产生的寡核苷酸(例如，核苷酸序列)，其能够与另一种感目标寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离(例如，“捕获探针”)。预期在一些实施方案中，本发明中使用的任何探针可以用任何“报道分子”进行标记，使得在任何检测系统中可检测。
如本文所用，“甲基化”是指胞嘧啶位置C5或N4的胞嘧啶甲基化，腺嘌呤的N6位点或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常是未甲基化的，因为通常体外DNA扩增方法不能保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化DNA”或“甲基化DNA”也可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。
因此，如本文所用，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”是指在核苷酸碱基上存在甲基部分，其中甲基部分不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶环上不包含甲基部分，但是5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的5位包含甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸，5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一个实例中，胸腺嘧啶在其嘧啶环的5位含有甲基部分；然而，为了本文的目的，当存在于DNA中时不认为胸腺嘧啶是甲基化核苷酸，因为胸腺嘧啶是DNA的典型核苷酸碱基。
甲基化状态可任选地由“甲基化值”表示或指示(例如，表示甲基化频率、分数、比例、百分比等)。甲基化值可以例如在用甲基化依赖性限制酶限制性消化之后定量存在的完整核酸的量，或者通过比较亚硫酸氢盐反应后的扩增谱，或者通过比较亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸的序列来产生。因此，诸如甲基化值的值代表甲基化状态，因此可用作基因座的多个拷贝中甲基化状态的定量指标。共甲基化程度由多于一个甲基化位点的甲基化状态表示或指示，在一段甲基化区域内，当多于一个甲基化位点的甲基化状态均为甲基化时定义为共甲基化。
如本文所用，术语“亚硫酸氢盐试剂”是指在一些实施方案中包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)或其组合的试剂，经过亚硫酸氢盐试剂处理的DNA，其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变，因此可以区分例如CpG二核苷酸序列中的甲基化和未甲基化胞苷。
术语“甲基化测定”是指用于确定核酸序列内的一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
风险分层：本申请将膀胱癌风险根据发病进展、预后、复发等分为三个组别：非癌组(non-BC,无膀胱癌风险)，中低危非肌层浸润膀胱癌组(LMR-NMIBC,其中非肌层浸润膀胱癌由病理诊断确认，非肌层浸润膀胱癌风险分层依照美国NCCN标准，本申请将低风险及中风险归为一类)，以及高危膀胱癌组(HR-MIBC和MIBC,该组别包含高危非肌层浸润膀胱癌及肌层浸润膀胱癌，其中肌层浸润由病理诊断确认，非肌层浸润膀胱癌风险分层依照美国NCCN标准)。
另一个方面，本发明涉及到一种膀胱癌的风险分层的检测方法，其中，所述检测手段包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶捕获。
一种膀胱癌的风险分层的检测方法，主要包括如下步骤：
采用DNA提取试剂盒，提取待测生物样本的基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行多个甲基化区域的共甲基化检测；
共甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR(MSP)、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、数字PCR定量及荧光定量PCR。
在一些实施方案中，通过本领域中的任何标准手段，包括使用可商购的试剂盒，来分离DNA(例如，基因组DNA，如提取的基因组DNA或经处理的基因组DNA)。
在一些实施方案中，待检测的生物样品为活检物。在一些情况下，该生物样品为组织样品。在一些情况下，该生物样品为组织活检样品。在一些情况下，该生物样品为血液样品包括血浆、唾液、血清。在一些情况下，该生物样品为尿液样品包括尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清。
MSP检测方法的主要步骤包括
1)利用特异性引物对对经过亚硫酸氢盐转化的DNA分别进行选定目的区域共甲基化片段的扩增；
2)利用特异性引物对对经过亚硫酸氢盐转化的DNA分别进行选定目的区域非甲基化片段的扩增；
3)对所述1)和2)的扩增产品进行琼脂凝胶电泳分析；
4)根据电泳结果条带的有无及密度判断选定目的区域的共甲基化程度。
DNA甲基化芯片检测方法的主要步骤包括：
1)对经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行全基因组的扩增，
2)使用SEQ ID NO.1，2，3，5和7或其在序列上完全互补的核酸序列作为目标区域在芯片上合成共甲基化及非甲基化的捕获探针，
3)对所述1)中的扩增产物在芯片中进行靶向捕获，并进行带有标记的单碱基延伸反应，
4)根据荧光染色反应将捕获的序列信号进行放大及读取，计算目的区域的共甲基化程度。
靶向DNA甲基化测序的主要步骤包括：
1)对经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行全基因组的扩增，
2)对所述1)中的扩增产物进行接头连接，
3)对所述2)中的建库产物进行靶向捕获，其中所用捕获探针为包含SEQ ID NO.1,2,3,5,7或与其反向互补配对序列的经过转化的DNA序列，
4)对所述3)的捕获产物进行测序，
5)根据测序结果计算选定目的区域的共甲基化程度。
数字PCR法的主要步骤包括
1)利用针对相应各个Marker的特异性引物及探针对经过亚硫酸氢盐转化的DNA分别进行选定目的区域共甲基化程度的绝对定量，
2)利用特异性引物及探针对经过转化的DNA分别进行选定目的区域的非甲基化程度的绝对定量，
3)根据每个区域的非甲基化程度及共甲基化程度的绝对定量计算该区域的甲基化率(优选方法)荧光定量PCR法的主要步骤见下述方法。
实施例1
包括用于膀胱癌风险分层的5个marker的序列组成相应为下表中的：SEQ IDNO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.7。表1除上述5个marker的组成之后，还包括其他共22个所列生物标记物的核酸序列。每个生物标记物由序列由[CG]指示的多个甲基化位点的共甲基化程度指示。
表1 DNA甲基化区域的共甲基化组成
针对上述甲基化序列，用于多个甲基化区域的共甲基化的特异性引物对及探针，如表2所示。
表2-1 22个甲基化区域共甲基化检测的引物及探针序列组合1表2-1 22个甲基化区域共甲基化检测的引物及探针序列组合1
表2-2 22个甲基化区域共甲基化检测的引物及探针序列组合2
表2-3 22个甲基化区域共甲基化检测的引物及探针序列组合3
在实际应用中，将根据特异性甲基化区域的组合进行选择相应的引物和探针。
内参引物和探针：
试剂盒需包括PCR扩增引物及探针组(探针荧光标记可采用FAM、VIC及NED等荧光基团标记)3组组合的其中一组，3组组合对于22个区域的检测性能类似。
本发明所述引物购于Invitrogen公司，多重PCR反应试剂购于Thermo Fisher公司，多重荧光定量PCR试剂购于Qiagen公司或Bio-Rad公司或诺唯赞公司。
实施例2多重荧光定量PCR对于22个甲基化区域中5个甲基化区域的共甲基化检测
使用商业化的完全甲基化(阳性对照)及非甲基化(阴性对照)标准品(购自QIAGEN公司)对包含所述5个甲基化生物标记物的22个甲基化区域(SEQ ID NO.1-22)进行每2-3个甲基化区域的共甲基化检测。
具体流程如下：
1、DNA提取
提取试剂盒购自QIAGEN公司，按照试剂盒说明书进行。
2、DNA亚硫酸氢盐转化
DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒购于Zymo公司，按照试剂盒说明书进行。
3、多重PCR扩增
采用22个甲基化区域(SEQ ID NO.1-22)的引物对，在1个反应孔(引物序列见表2，本实施例使用表2-2中序列)中进行多重PCR，扩增出含目标区域的目标序列，产物大小在70-130bp左右。
1)配置单个引物浓度为5μM(每个引物)PCR引物混合物，里面包含多重反应里每个甲基化区域的正向和反向引物，共1个反应孔。
2)PCR混合液配置：根据表3配制PCR混合液，DNA不要加在其中。
表3 PCR混合液配置方案
| 试剂 | 终浓度 | 体积(μL) |
| DEPC水 | / | 18.5 |
| 5x PCR Buffer | 1X | 10.0 |
| 25mM MgCl<sub>2</sub> | 0.25mM | 0.5 |
| 25mM dNTP混合物 | 250μM | 0.5 |
| 5μM Primer混合物 | 0.5μM | 5.00 |
| 5U/μl PCR酶 | 2.5Unit | 0.5 |
| 体积[μl] | / | 35.00 |
3)加入DNA样本：加35μL PCR混合液到PCR反应孔，向其中加入转化后的DNA，DNA转化前上样量25ng，PCR反应总体积50μL。涡旋震荡和离心。
4)PCR反应程序：98℃30秒；98℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，20个循环；72℃5分钟；4℃保存备用
4、多重荧光定量PCR测定
1)22个甲基化区域的引物及探针(序列见表2，本实施例使用表2-2序列，即组合2，以下实施例都相同)，及内参的引物及探针中的每个甲基化区域按照每个引物浓度10μM,每个探针浓度5μM的终浓度配制成一套混合液，22个甲基化区域的22套混合液可等比进行每2-3个甲基化区域的混合。其中列举的一些3个甲基化区域组合如表4所示：
表4 22个甲基化区域(SEQ ID NO.1-22)的引物探针混合液组合方案(组合内的3个甲基化区域可选任意2-3个进行组合)。
| 组合方案 | FAM标记荧光通道 | VIC标记荧光通道 | NED标记荧光通道 |
| 组合A | SEQ ID NO.2 | 内参 | SEQ ID NO.1 |
| 组合B | SEQ ID NO.17 | SEQ ID NO.20 | SEQ ID NO.1 |
| 组合C | SEQ ID NO.2 | SEQ ID NO.9 | SEQ ID NO.8 |
| 组合D | SEQ ID NO.15 | 内参 | SEQ ID NO.6 |
| 组合E | SEQ ID NO.3 | SEQ ID NO.18 | SEQ ID NO.14 |
| 组合F | SEQ ID NO.16 | SEQ ID NO.12 | |
| 组合G | SEQ ID NO.22 | SEQ ID NO.5 | SEQ ID NO.4 |
| 组合H | SEQ ID NO.13 | SEQ ID NO.10 | SEQ ID NO.21 |
| 组合I | SEQ ID NO.19 | SEQ ID NO.11 | SEQ ID NO.7 |
| 组合J | 内参 | SEQ ID NO.7 | |
| 组合K | SEQ ID NO.2 | 内参 | SEQ ID NO.6 |
| 组合L | SEQ ID NO.3 | 内参 | SEQ ID NO.4 |
| 组合M | SEQ ID NO.3 | SEQ ID NO.7 | SEQ ID NO.5 |
2)多重qPCR反应液配置：根据表4的组合方案将选定的2-3个甲基化区域的引物探针混合液等比混合配制PCR混合液，DNA不要加在其中。
表5 PCR混合液配置方案
| 试剂 | 体积(μL) |
| DEPC水 | 1.5-2 |
| 2X PCR Master Mix | 5.00 |
| 2种或3种标志物的引物和探针 | 0.5(每套) |
| 体积[μl] | 8.00 |
3)加入DNA样本：加8μL PCR混合液到PCR反应孔，向其中加入2μL经过两倍稀释的多重PCR产物。PCR反应总体积10μL。涡旋震荡和离心。
4)荧光定量PCR反应程序：95℃5分钟；95℃20秒，62℃60秒，于62℃收集荧光信号，40个循环。
5、数据分析
以商业化的完全甲基化(阳性对照)及非甲基化(阴性对照)标准品对22个甲基化区域的共甲基化程度按照表格4所示混合方式(组合A-M)进行多重荧光定量PCR测定，与22个甲基化区域的单个甲基化荧光定量PCR测定(单个定量)的CT值比较，其中阴性对照在所有组合及单个定量中均无检出，阳性对照的CT值如表6所示：
表6 阳性对照在2-3个甲基化区域组合方案的多重荧光定量PCR与单个甲基化区域荧光定量PCR测定的CT值比较
实施例3
22个甲基化区域中任意1-3个甲基化区域的共甲基化并行检测
当目标甲基化区域的共甲基化并行检测为22个甲基化区域的任意1-3个时，使用实施例2中表4的组合方案，可以采用以下的检测方法。具体检测流程如下：
1、DNA提取
提取试剂盒购自QIAGEN公司，按照试剂盒说明书进行。
2、DNA亚硫酸氢盐转化
DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒购于Zymo公司，按照试剂盒说明书进行。
3、荧光定量PCR测定
选用1-3个甲基化区域的引物及探针及内参的引物及探针，在1个反应孔进行测定(引物探针序列见表2，甲基化区域的组合方案见实施例2)
1)qPCR反应液配置：根据表7配制PCR混合液，DNA不要加在其中。
表7 PCR混合液配置方案
2)加入DNA样本：加15μL PCR混合液到PCR反应孔，向其中加入转化后的DNA，DNA转化前上样量25ng，转化产物作为一个PCR反应孔。PCR反应总体积20μL。涡旋震荡和离心。
3)荧光定量PCR反应程序：95℃5分钟；95℃15秒，62℃40秒，于62℃收集荧光信号，60个循环。
4、数据处理与分析
将目标区域的检测所得每个甲基化区域的CT值通过内参CT值进行校正，得到目标区域的相对循环数d-CT＝CT(目标区域)-CT(内参)；若目标区域未检出，则赋予目标区域的相对循环数d-CT＝35。
以阳性对照、甲基化区域引物探针组合方案A和L(实施例3)的检测为例，对照实施例2的检测方法，所得到的甲基化区域的相对循环数d-CT值与实施例2中的对比如表8。
表8 阳性对照任意1-3个甲基化区域的共甲基化并行检测与22个甲基化区域检测方法的d-CT值比较
| 1-3个区域并行检测法d-C<sub>T</sub>值 | 22个区域检测法d-C<sub>T</sub>值 | |
| SEQ ID NO.1 | 2.48 | 2.19 |
| SEQ ID NO.2 | 3.40 | 4.17 |
| SEQ ID NO.3 | -0.58 | -1.03 |
| SEQ ID NO.4 | -3.09 | -3.89 |
表8的结果表明，使用该实施例所述检测方法检测所得的d-CT值与检测22个甲基化区域所述检测方法(实施例2)得到的d-CT值高度一致，对这些区域两种检测方法的d-CT值做相关性分析，其相关系数为R＝0.995(Pearson R)，因此可以判定这两种检测方法在检测同一个甲基化区域的共甲基化程度上没有差别。
当目标甲基化区域的共甲基化并行检测为22个甲基化区域的任意1-3个时，本实施例所述检测方法可以减少多重PCR预扩增目标片段的步骤，使少于7个甲基化区域的并行检测更为方便快捷。
实施例4
设计了两个单独的临床试验，分别用于膀胱癌风险分层预测的生物标记物鉴定和组合优化，及组合的性能验证。其临床预测性能使用最终的病理诊断作对参照。用于测试的尿液样本收集于膀胱镜检查或TUBRT手术之前，在中山大学孙逸仙纪念医院进行。具有血尿症状或/和膀胱影像学结果异常但无其他恶性肿瘤病史的患者被纳入研究。膀胱癌组别患者通过膀胱镜检查或TURBT标本的病理学确认为膀胱癌阳性，而在膀胱癌患者中，进一步根据病理诊断中的浸润程度、高低级别、T分期、肿瘤大小及多发程度、是否复发等，按照美国NCCN标准及AUA定义，将非肌层浸润膀胱癌进行风险分级，最后将膀胱癌患者分为中低危非肌层浸润膀胱癌组(LMR-NMIBC)，以及高危膀胱癌组(HR-NMIBC+MIBC,该组别包含高危非肌层浸润膀胱癌及肌层浸润膀胱癌)。而非膀胱癌患者组(Non-BC)包括被诊断患有泌尿系统结石，泌尿系统感染，泌尿系统良性病变的患者。基因组DNA量少于25ng的尿液样本由于可供分析的材料不足，故不采用。表9总结了本研究的患者临床信息。该研究是在中山大学孙逸仙纪念医院的地方和区域机构审查委员会的批准下进行的。书面知情同意书已获得所有参与者的同意。
表9 研究中的患者临床信息统计
使用实施例3的检测方法对试验1和2中的样本进行22个特异性的甲基化生物标记物进行检测。首先使用试验1中的样本数据对22个甲基化生物标记物在膀胱癌风险预测的三个组别(Non-BC,LMR-NMIBC，HR-NMIBC+MIBC)的性能进行单标记物分析，所得的风险预测性能较好的生物标记物如图2所示，这些生物标记物有较好的平均平衡准确率、总体准确率及总体AUC，表明这些marker具有一定的膀胱癌风险分层预测性能，但是与22-marker的总体预测性能相比仍然较差(图2)。可见，并不是任意的marker或者其组合能够实现对膀胱癌风险分层的预测。
此外，发明人比较了多种marker及其组合，通过各种筛选，最后创造性地找到5个生物标记物(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)及其之间最优的组合，可用于膀胱癌风险分层预测。将上述5个生物标记物的组合以及其他的几组marker的组合，用于检测表9研究中的试验1患者样本，其风险分层预测性能请见表10.。
表10
表10显示，22-marker组合的风险分层性能较单个marker有所提升，但是并未达到最佳性能，而有SEQ ID NO.3，5，7及SEQ ID NO.3，5，7，1，2所构成的组合模型对膀胱癌风险分层具有最优的预测性能，其他marker组合所组成的模型未能达到所需预测性能。
此外，这5个生物标记物的组合进一步在试验2的样本数据中进行验证，其性能参数列举如图3和图4，其中图4显示，5个生物标记物组合的模型在试验2的数据中显示对于non-BC的判别具有较理想的灵敏度(84.7％)及特异性(87.2％)，其较高的NPV(79.1％)显示对于非癌患者有较好的预测能力，可以在受试人群中对非癌患者进行排除，使其免予膀胱镜的过度侵入性检查。同时，这些组合在高危膀胱癌组(HR-NMIBC+MIBC)中具有同样理想的高敏感性(81.2％)和特异性(90.0％)，而其高PPV(88.6％)可以保证在受试人群中准确鉴定出高危膀胱癌患者，使他们在侵入性检查及手术前可以更有效的制定诊疗方案。另外，LMR-NMIBC组和HR-NMIBC或MIBC组均显示出较高的NPV(93.1％及83.3％)，从而确保了膀胱癌患者预测较低的假阴性率，避免漏诊。本发明根据筛选到的合适的分子标记物组合，提出了术前三级风险分层模型的临床应用，以促进当前的诊疗方式的合理利用，其中BC阴性的患者可以避免过度侵入性膀胱镜检查，而HR-NMIBC或MIBC可以加速并包括更彻底的手术计划，而判定的LMR-NMIBC患者可以遵循标准的诊断方式。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市基准医疗有限责任公司
<120> DNA甲基化生物标志物组合及其应用
<160> 223
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taggaagact cgggcaccgt tcagcgcatt ggcttcgcgg acccagccgc ccaggcggat 60
cgccggaagc gcaagtagcg gtgtgtgcgc acag 94
<210> 2
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgttcggcg gcccgggcac cgcgagccgg ccgagctcca gccggagcta cgtgactacg 60
tccacccgca cctacagcct gggcagc 87
<210> 3
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttggcggtca aagtggcccc gactcgggat gacaattgac ggggatcaag ggattgccca 60
ttctgtgcct gtaagaaccg attcgtgcca gagaaactca tcaagtgg 108
<210> 4
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgccgggctc cagggctccc gcgctccagt ggcccagcct gggcggagag cagagcgcgg 60
cccccgcggc cccgcggcct cgagccccg 89
<210> 5
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccggagtgg ggcaggtgtc ggagctgggt gggaagcaga cgcggtacgg tgggcagagg 60
tccccagcct gcggggagcg ctat 84
<210> 6
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccggtggtgc accacgaggg ctacccgttt gccgccgccg ccgccgcagc tgccgccgcc 60
gccgccagcc gctgcagcca tg 82
<210> 7
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgggaactga gtgctggccc gggagaccct ccggagagct cgcgggctcg gcctcggcct 60
cggcctcggc cttcggccgc ggttaccgaa acacagacgg tagact 106
<210> 8
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcccgcgcc cccgcccccg cgttccggcc tggcctgcgg gattcgggcc gaggcaactg 60
cagggacggg gcacccctcc tgctcc 86
<210> 9
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggagagggg tcatccgccc cggaaccgac gtgagcgcgg ggccggcccg tggaggcggc 60
tgagggatcc cccacttcca gcccgcccg 89
<210> 10
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcagcagctg caggaagcgg actcggcgga aaggagcccc ggaggggaac tgagtgcctt 60
cagccaggca cgttcgggga gacagcg 87
<210> 11
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgccgcaaaa ttcgcagacg aagggcttgt agcccgcgtg gatgcggata tgcgtgttga 60
gcgtggagct gcggttgaac gctttgccg 89
<210> 12
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgctacccca gccgtgtccc gctccggaga ccccagggcg ccgggaccca tctgccgctc 60
gccggccgga ggctaccagg agcaggagca gcagcgccgc ccgcagtag 109
<210> 13
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggccttccg gtggggcacc aaaagggaag cctcctcggc ccctggcgac ccggtgactt 60
gcagcggcgt gtgattaatc ttccacagct gtcgtgcccc atccacttga g 111
<210> 14
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcaaccggca gcgtccagct cccgcacctc gctgcacatc gcacctgagc cccgccgcga 60
ccgcatcgcg ctcgctgcga cccattcaga ccc 93
<210> 15
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cttcagctgc cctcgatttt gctccacgcc tgccggccag agcctcccgg cgtttcttcc 60
gccccagcgg agtgcgctgg ggcgcgccag ggctaggccc gccggaggag cgcgtc 116
<210> 16
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgtgtctgag gctcgcgggc aactggaact gagagtctga gttggcctcg cgggagccgc 60
cagaagggtg cgggctgcgt gtggcagagt aggagcactg t 101
<210> 17
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcggcagtgg ccaccacatc tggttctcgt taacttttct aaggcagcgg ccgctggagc 60
agcggggctg gcggggtaaa agctc 85
<210> 18
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgcggccacc gcccgttcat cacccgcgcg catctgggct ggcaccgggc gaagaatcgt 60
gcgggtctgg gac 73
<210> 19
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agattgcgcg gagcccacgc gatccctggg acgccggaga caacggggct cttgggaagg 60
cgcggagccc ggggaagccg gggatgtgcg cgtgagccgt gcccgcaggg tc 112
<210> 20
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggagcgtgcg ggcagcgccc ccgaacccta gcgcagccca ggaagcggtc ggaggagact 60
gtcctggccg cggtggcagc cccatccgga gtg 93
<210> 21
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaaactgatc cgtgtcctgc atgttggcag cagacaacct tccttgctgc tgagctgtcc 60
cgggtggctt caccgcggct ggggaatccg agccattcc 99
<210> 22
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggagagaaag tcctatctgc agcagccgaa tggtccccat tccggtaatg ggacggcggg 60
agcatttggg aggacgcgat tctaaagaga gcg 93
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggaagattcg ggtatcgttt agcgta 26
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgttcggcgg ttcgggtatc g 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tggcggttaa agtggtttcg a 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgggttttag ggttttcgcg t 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttcggagtgg ggtaggtgtc 20
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcggtggtgt attacgaggg tt 22
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcgggaattg agtgttggtt c 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tcgcgttttc gttttcgcgt 20
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
attcgtttcg gaatcgacgt gagc 24
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtagtagttg taggaagcgg attc 24
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acgacaaaac gttcaaccgc a 21
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttattttagt cgtgtttcgt ttcgga 26
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tcggtggggt attaaaaggg aa 22
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cggtagcgtt tagttttcgt atttc 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tttcgatttt gttttacgtt tgtcg 25
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgtgtttgag gttcgcgggt 20
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tcggtagtgg ttattatatt tggttttc 28
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cgcggttatc gttcgtttat tattc 25
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgcgcggagt ttacgcgatt 20
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ggagcgtgcg ggtagcgtt 19
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ttgattcgtg ttttgtatgt tggtagt 27
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gagagaaagt tttatttgta gtagtcgaa 29
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gcacacaccg ctacttacgc ttccg 25
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gctacccaaa ctataaatac gaataaacgt 30
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cacttaataa atttctctaa cacgaatcga t 31
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cgaaactcga aaccgcgaaa c 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ataacgctcc ccgcaaacta a 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aacgactaac gacgacgacg a 21
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
taccgtctat atttcgataa ccgcga 26
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ataccccgtc cctacaatta cct 23
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cgaacgaact aaaaata 17
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cgctatctcc ccgaacgtac c 21
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tttgtcgtaa aattcgtaga cgaag 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ctacgaacga cgctactact cctac 25
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
taaataaaac acgacaacta taa 23
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ctaaataaat cgcaacgaac gcga 24
<210> 59
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
aacgcgctcc tccgacg 17
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ctactctacc acacgcaacc cgcac 25
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
acttttaccc cgccaacccc g 21
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
atcccaaacc cgcacgatt 19
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
acgaacacga ctcacgcgca 20
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
cgaataaaac taccaccgcg a 21
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
aaaataactc gaattcccca acc 23
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
acgctctctt taaaatcgcg tcc 23
<210> 67
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
cgatccgcct aaacgactaa atccgcga 28
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gagtcggtcg agttttagtc ggagttacgt 30
<210> 69
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cccttaatcc ccgtcaatta tcatcccga 29
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gcgaaaaccg cgctctactc tccg 24
<210> 71
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
cctctaccca ccgtaccgcg tctacttcc 29
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
tacgacgacg acgacgacaa acg 23
<210> 73
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
cgaaaccgaa cccgcgaact ctccga 26
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gacccgaatc ccgcaaacca aaccg 25
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
cgcctccacg aaccgacccc g 21
<210> 76
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
tcaattcccc tccgaaactc ctttccgc 28
<210> 77
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
cgctcaacac gcatatccgc atccacgc 28
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
cgaccgacga acgacaaata aatcccgacg 30
<210> 79
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
cggtttttgg cgattcggtg atttgtagcg gc 32
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
cgatcgcgac gaaactcaaa tacgatatac 30
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
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<210> 82
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 182
cgataataca ccacgaaaac tacccg 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 187
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgacaacgtc caactcccgc acctcg 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 192
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtatctaaa actcgcgaac aacta 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 193
tcgacaataa ccaccacatc taattctc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 194
gcgaccaccg cccgttc 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 198
aaatcctatc tacaacaacc gaata 25
<210> 199
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 199
gaacccaacc gcccaaacga atcgccg 27
<210> 200
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 200
gaaccgaccg aactccaacc gaaactacg 29
<210> 201
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 201
ctataaaaac cgattcgtac caaa 24
<210> 202
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 202
cgcgacctcg aacc 14
<210> 203
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 203
aaacaaacgc gatacgataa acaa 24
<210> 204
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 204
gccgccgccg caactaccgc cg 22
<210> 205
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 205
gacctcgacc tcgacctcga ccttcga 27
<210> 206
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 206
acgaaattcg aaccgaaaca actac 25
<210> 207
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 207
cgtaaacgcg aaaccgaccc gtaaaaacga 30
<210> 208
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 208
cgacgaaaaa aaaccccgaa a 21
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 209
cgtttaatac gtatattcgt atttacgcg 29
<210> 210
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 210
cgccgaaacc catctaccgc tcgccgaccg 30
<210> 211
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 211
cgtcgttgta agttatcggg tcgttagggg tc 32
<210> 212
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 212
cgcacctaaa ccccgccgcg accgcatcg 29
<210> 213
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 213
caacgaaata cgctaaaacg cgcca 25
<210> 214
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 214
tctaaattaa cctcgcgaaa accgccaa 28
<210> 215
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 215
gttttagcgg tcgttgtttt agaaaagtta ac 32
<210> 216
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 216
ccgcgcgcat ctaaactaac accga 25
<210> 217
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 217
aaacgccgaa aacaacgaaa ctcttaa 27
<210> 218
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 218
cctaacgcaa cccaaaaaac gatcgaa 27
<210> 219
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actaaactat cccgaataac ttcaccg 27
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<211> 27
<212> DNA
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tccccattcc gataataaaa cgacgaa 27
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<212> DNA
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gtgatggagg aggtttagta agtt 24
<210> 222
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 223
accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30
Claims (20)
1.一种用于膀胱癌风险分层检测的DNA甲基化标志物组合，其特征在于，包括由CG指示的共甲基化区域的SEQ ID NO.3或其完全互补序列、SEQ ID NO.5或其完全互补序列、和SEQID NO.7或其完全互补序列的组合。
2.根据权利要求1所述的DNA甲基化标志物组合，其特征在于，还包括由CG指示的共甲基化区域的SEQ ID NO.1或其完全互补序列。
3.根据权利要求1或2所述的DNA甲基化标志物组合，其特征在于，还包括由CG指示的共甲基化区域的SEQ ID NO.2或其完全互补序列。
4.根据权利要求3所述的DNA甲基化标志物组合，其特征在于，所述用于膀胱癌风险分层检测的DNA甲基化标志物组合包括SEQ ID NO.3或其完全互补序列的组合、SEQ ID NO.5或其完全互补序列的组合、SEQ ID NO.7或其完全互补序列的组合、SEQ ID NO.1或其完全互补序列的组合、和SEQ ID NO.2或其完全互补序列的组合。
5.根据权利要求4所述的DNA甲基化标志物组合，其特征在于，所述用于膀胱癌风险分层检测的DNA甲基化标志物组合包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2。
6.权利要求1-5任一项的DNA甲基化标志物组合在膀胱癌风险分层检测中的应用。
7.一种用于膀胱癌风险分层检测的试剂盒，其特征在于，包括检测有权利要求1-5任一项DNA甲基化标志物组合的甲基化程度的试剂。
8.根据权利要求7所述的用于膀胱癌风险分层检测的试剂盒，其特征在于，采用荧光定量PCR方法，所述检测试剂盒包括针对单个甲基化区域的扩增引物和荧光探针，所述扩增引物和荧光探针包括：
针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.47，以及SEQ ID NO.69；
针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.49，以及SEQ ID NO.71；
针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.51，以及SEQ ID NO.73；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
9.根据权利要求7所述的用于膀胱癌风险分层检测的试剂盒，其特征在于，采用荧光定量PCR方法，所述检测试剂盒包括针对单个甲基化区域的扩增引物和荧光探针，所述扩增引物和荧光探针包括：
针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.113，以及SEQ ID NO.135；
针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.93和SEQ ID NO.115，以及SEQ ID NO.137；
针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.117，以及SEQ ID NO.139；
或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
10.根据权利要求7所述的用于膀胱癌风险分层检测的试剂盒，其特征在于，采用荧光定量PCR方法，所述检测试剂盒包括针对单个甲基化区域的扩增引物和荧光探针，所述扩增引物和荧光探针包括：
针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.157和SEQ ID NO.179，以及SEQ ID NO.201；
针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.159和SEQ ID NO.181，以及SEQ ID NO.203；
针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.161和SEQ ID NO.183，以及SEQ ID NO.205；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
11.根据权利要求8-10任一项所述的用于膀胱癌风险分层检测的试剂盒，其特征在于，还包括针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.45，以及SEQ ID NO.67；或针对SEQID NO.1的SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.111，以及SEQ ID NO.133；或
针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.155和SEQ ID NO.177，以及SEQ ID NO.199；
或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
12.根据权利要求8-10任一项所述的用于膀胱癌风险分层检测的试剂盒，其特征在于，还包括针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.46，以及SEQ ID NO.68；
或针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.90和SEQ ID NO.112，以及SEQ ID NO.134；
或针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.156和SEQ ID NO.178，以及SEQ ID NO.200；
或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
13.根据权利要求8-10任一项所述的用于膀胱癌风险分层检测的试剂盒，其特征在于，还包括有内参基因的引物和探针：SEQ ID NO.221-SEQ ID NO.223；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸且至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
14.一种膀胱癌风险分层检测的方法，其特征在于，包括以下步骤,
提取将待测的生物样品基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA和对照进行如权利要求1-5任一项所述DNA甲基化标志物组合的共甲基化检测，得到甲基化图谱；
将甲基化标志物组合的甲基化图谱与从基于数据集数学建模得到的图谱判定阈值进行比较，判断生物样品中膀胱癌的存在以及风险分层。
15.根据权利要求14所述的膀胱癌风险分层检测的方法，其特征在于，所述共甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、数字PCR定量及荧光定量PCR。
16.一种对膀胱癌诊断、分期、分类的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测的生物样品基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行如权利要求1-5任一项所述DNA甲基化标志物组合的共甲基化检测；
得到目标DNA甲基化标志物区域的相对循环数d-CT，与设定阈值相比较，
对不同来源的生物样品的膀胱癌级别或分期进行判断。
17.一种对膀胱癌预测、治疗监测、预后或其它评价的方法，其特征在于，包括以下步骤：获得个体的生物样品，
提取所述生物样品基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA与特异性检测权利要求1-5所述的DNA甲基化标志物的共甲基化的多种试剂接触，测定所述生物样品的所述的DNA甲基化标志物的共甲基化程度；比对从基于数据集数学建模得到的共甲基化程度判定阈值，对膀胱癌的预测、治疗检测、预后作出判断。
18.根据权利要求14-17任一项所述的方法，其特征在于，所述生物样品为血液、血浆、唾液、血清。
19.根据权利要求14-17任一项所述的检测膀胱癌的方法，其特征在于，所述生物样品为组织。
20.根据权利要求14-17任一项所述的检测膀胱癌的方法，其特征在于，所述生物样品为尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清。
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