CN112646888B - 乳腺肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳腺癌相关的甲基化生物标记物的检测试剂盒，其包括有：针对生物标记物cg23035715的选自以下任一组的引物和探针：SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.70‑SEQ ID NO.72，SEQ ID NO.139‑SEQ ID NO.141。本发明首先通过独特的多重PCR技术和设计的引物和探针，靶向富集多基因靶向区域，避免多基因检测原始cfDNA量较低的问题，通过结合MethyLight PCR检测的低成本、快捷性，提高了检测通量，同时也提高了模型检测的灵敏度和特异性。单独的分子标记物cg16304215的引物探针的检测结果具有很好的灵敏度，其与其他分子标记物中的任何1个的引物探针组合具有更强、更稳定的诊断能力。通过本发明的所述检测试剂盒，可以很好地提高对乳腺癌检测的灵敏度和特异性，有效提高早期乳腺癌的检出率，及早进行治疗和干预，提高患者生存率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及乳腺肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒。
背景技术
据中国肿瘤登记年报显示：女性乳腺癌发病率在0～24岁年龄段处较低水平，25岁后逐渐上升，50～54岁年龄段达到高峰，55岁以后逐渐下降。针对乳腺癌的易感基因，欧、美国家做了大量研究，现已知的有BRCA-1、BRCA-2，还有p53、PTEN等，与这些基因突变相关的乳腺癌称为遗传性乳腺癌，占全部乳腺癌的5％～10％。乳腺癌21基因检测不仅提供1-5年及5年后复发风险预测，还能作为唯一多基因检测来预测雌激素受体阳性浸润性乳腺癌患者的化疗及内分泌治疗的获益程度。乳腺癌70基因检测也在早期乳腺癌诊断中发挥了重要作用。最新的研究成果发现72个新的常见基因变异将导致女性患乳腺癌的风险上升，这使目前已知与乳腺癌相关的基因突变数量增至177个。许多人都可能携带常见的变异基因，单个基因突变致癌的风险相对较小，但女性体内的相关变异基因越多，患乳腺癌的风险越大。目前乳腺癌基因检测手段属于一种非侵入性检测，但需要基于原来的手术(乳房肿瘤切除手术、乳房切除手术或核心穿刺活组织检查)过程中取出的组织检测基础上。
对肿瘤进行早筛和早诊，可以更大概率地发现早期癌症，从而提高其五年生存率，降低死亡率。中国乳腺癌筛查现状：乳腺癌5年生存率：原位癌100％，I期84-100％，II期76-87％，III期38-77％。中国多中心研究显示，初诊乳腺癌时，15.7％I期，44.9％II期，18.7％III期，2.4％IV期。乳腺癌影像筛查手段：1.钼靶X射线：中国女性乳腺发病年龄较轻(45-55岁)，乳腺腺体较西方女性致密，MG易遗漏，且MG对致密型乳腺病灶诊断敏感性仅为30％。2.B超：单纯MG阳性预测值为55.5％，MG联合B超阳性预测值为43.3％。3.核磁共振(MRI):MRI对微小钙化灶不敏感，且有明确禁忌症；所以，肿瘤的早筛早诊早治疗对提高五年生存率具有非常大的意义，肿瘤早筛早诊的关键是建立有效的检测模型，寻找能够作为筛查与诊断的分子标记。
cfDNA(cell-free DNA)是外周血中游离的核酸小片段DNA，源自正常细胞或肿瘤细胞代谢与凋亡，包含体细胞突变和DNA甲基化等遗传信息。通过检测疾病特异性cfDNA片段，掌握疾病的发生、发展的技术，称为液体活检(Liquid Biopsy)，与传统的组织活检相比，其有着迅速、便捷、损伤性小等众多优点。2015年卢煜明教授通过cfDNA全基因组甲基化测序证明了液体活检替代组织活检在技术上和理论上的可行性；2017年张鹍教授团队利用ctDNA的甲基化定量描述了肿瘤负荷以及肿瘤来源的ctDNA图谱。临床越来越多的研究表明血浆ctDNA可作为生物标志物应用在肿瘤早期诊断筛选、预测、治疗的反应，监测肿瘤大小和复发等。目前，国际上的研究方向是整合多组学、多种分子标志物、多基因、多位点来提高检测技术的灵敏度和特异性，以满足临床对检测产品的需求。
DNA甲基化是一种基因的表观遗传学修饰方式，不同的阶段的癌症患者和健康个体比较，DNA甲基化模式与甲基化水平均存在显著差异，并且在癌症发生早期，体液中的DNA甲基化水平会出现微量变化。因此准确且定量地检测DNA甲基化标志物对于癌症的早期诊断具有十分重要的意义。
本发明的发明人在早先的研究中,筛选到可用于乳腺癌检测的甲基化生物标记物或其组合(参见CN2020104264964)，通过研究这些血浆cfDNA甲基化修饰模式的基因组片段在各期乳腺癌患者及健康人群中的甲基化修饰差异，发现以上血浆基因组片段组合都能够作为乳腺癌早期诊断标记物。而且，发明人发现，其中一个甲基化标记物(cg23035715)或与前3个甲基化标记物(cg26371731，cg04541368，cg13973436)组合均具备了与两种算法LASSO和Random Forest筛选出来重叠的26个甲基化标记物组合相近的诊断力。
MethyLight荧光定量利用TaqMan探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸盐处理DNA片段，针对甲基化和未甲基化各设计一个探针，用不同的荧光标记，随后开展实时定量PCR。如果探针与DNA杂交则释放出荧光信号，根据荧光信号的比值计算甲基化水平。该方法适用于样本量大但是位点少的研究。
而目前对乳腺肿瘤患者血浆cfDNA甲基化检测多基因，存在由于cfDNA量较少，对于建库的低投入量要求高，而低投入量和损伤影响最终生信分析，对于整个assay的灵敏度要求高等缺陷。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种高灵敏度检测乳腺癌相关的甲基化生物标记物的试剂盒，该试剂盒将多重PCR技术靶向富集多基因和MethLight技术结合，先通过优化多重PCR，较高特异性靶向富集，再通过特异的筛选引物和探针的方法，使单基因检测具备了很高的灵敏度和特异性。
实现上述目的的技术方案如下。
一种乳腺癌相关的甲基化生物标记物的检测试剂盒，包括有：针对生物标记物cg23035715的选自以下任一组的引物和探针：SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.70-SEQ ID NO.72，SEQ ID NO.139-SEQ ID NO.141。
在其中一个实施例中，还包括选自针对cg26371731，cg04541368和cg13973436至少一种生物标记物的引物和探针；所述针对cg26371731生物标记物的引物和探针选自：SEQID NO.4-SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.73-SEQ ID NO.75，SEQ ID NO.142-SEQ ID NO.144；
所述针对cg04541368生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.76-SEQ ID NO.78，SEQ ID NO.145-SEQ ID NO.147；
所述针对cg13973436生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.10-SEQ IDNO.12，SEQ ID NO.79-SEQ ID NO.81，SEQ ID NO.148-SEQ ID NO.150。
在其中一个实施例中，还包括选自针对cg26371731，cg04541368和cg13973436生物标记物的引物和探针；所述针对cg26371731生物标记物的引物和探针为：SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6；所述针对cg04541368生物标记物的引物和探针为：SEQ ID NO.7-SEQ IDNO.9；
所述针对cg13973436生物标记物的引物和探针为：SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.12。
在其中一个实施例中，还包括选自cg16304215，cg20072171，cg21501525，cg22778178，cg08599259，cg25566568，cg15634980，cg07458308，cg01348584，cg14140881，cg25756435，cg00594560，cg18087672，cg14868703，cg17632299，cg18786873，cg20631750，cg25924096，和cg15321298中至少一种生物标记物的引物和探针；
所述针对cg16304215生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.13-SEQ IDNO.15，SEQ ID NO.82-SEQ ID NO.84，SEQ ID NO.151-SEQ ID NO.153；
所述针对cg20072171生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.16-SEQ IDNO.18，SEQ ID NO.85-SEQ ID NO.87，SEQ ID NO.154-SEQ ID NO.156；
所述针对cg21501525生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.19-SEQ IDNO.21，SEQ ID NO.88-SEQ ID NO.90，SEQ ID NO.157-SEQ ID NO.159；
所述针对cg22778178生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.22-SEQ IDNO.24，SEQ ID NO.91-SEQ ID NO.93，SEQ ID NO.160-SEQ ID NO.162；
所述针对cg08599259生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.25-SEQ IDNO.27，SEQ ID NO.94-SEQ ID NO.96，SEQ ID NO.163-SEQ ID NO.165；
所述针对cg25566568生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.28-SEQ IDNO.30，SEQ ID NO.97-SEQ ID NO.99，SEQ ID NO.166-SEQ ID NO.168；
所述针对cg15634980生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.31-SEQ IDNO.33，SEQ ID NO.100-SEQ ID NO.102，SEQ ID NO.169-SEQ ID NO.171；
所述针对cg07458308生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.34-SEQ IDNO.36，SEQ ID NO.103-SEQ ID NO.105，SEQ ID NO.172-SEQ ID NO.174；
所述针对cg01348584生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.37-SEQ IDNO.39，SEQ ID NO.106-SEQ ID NO.108，SEQ ID NO.175-SEQ ID NO.177；
所述针对cg14140881生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.40-SEQ IDNO.42，SEQ ID NO.109-SEQ ID NO.111，SEQ ID NO.178-SEQ ID NO.180；
所述针对cg25756435生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.43-SEQ IDNO.45，SEQ ID NO.112-SEQ ID NO.114，SEQ ID NO.181-SEQ ID NO.183；
所述针对cg00594560生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.46-SEQ IDNO.48，SEQ ID NO.115-SEQ ID NO.117，SEQ ID NO.184-SEQ ID NO.186；
所述针对cg18087672生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.49-SEQ IDNO.51，SEQ ID NO.118-SEQ ID NO.120，SEQ ID NO.187-SEQ ID NO.189；
所述针对cg14868703生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.52-SEQ IDNO.54，SEQ ID NO.121-SEQ ID NO.123，SEQ ID NO.190-SEQ ID NO.192；
所述针对cg17632299生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.55-SEQ IDNO.57，SEQ ID NO.124-SEQ ID NO.126，SEQ ID NO.193-SEQ ID NO.195；
所述针对cg18786873生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.58-SEQ IDNO.60，SEQ ID NO.127-SEQ ID NO.129，SEQ ID NO.196-SEQ ID NO.198；
所述针对cg20631750生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.61-SEQ IDNO.63，SEQ ID NO.130-SEQ ID NO.132，SEQ ID NO.199-SEQ ID NO.201；
所述针对cg25924096生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.64-SEQ IDNO.66，SEQ ID NO.133-SEQ ID NO.135，SEQ ID NO.202-SEQ ID NO.204；
所述针对cg15321298生物标记物的引物和探针选自：SEQ ID NO.67-SEQ IDNO.69，SEQ ID NO.136-SEQ ID NO.138，SEQ ID NO.205-SEQ ID NO.207。
在其中一个实施例中，还包括针对内参基因的引物和探针，所述针对内参基因的引物和探针为：SEQ ID NO.208-SEQ ID NO.210。
在其中一个实施例中，还包括选自cg16304215，cg20072171，cg21501525，cg22778178，cg08599259，cg25566568，cg15634980，cg07458308，cg01348584，cg14140881，cg25756435，cg00594560，cg18087672，cg14868703，cg17632299，cg18786873，cg20631750，cg25924096，和cg15321298的引物和探针。
在其中一个实施例中，所述针对cg16304215生物标记物的引物和探针为SEQ IDNO.13-SEQ ID NO.15；所述针对cg20072171生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.16-SEQID NO.18；
所述针对cg21501525生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.21；
所述针对cg22778178生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.22-SEQ ID NO.24；
所述针对cg08599259生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.27；
所述针对cg25566568生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.28-SEQ ID NO.30；
所述针对cg15634980生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.33；
所述针对cg07458308生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.34-SEQ ID NO.36；
所述针对cg01348584生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.37-SEQ ID NO.39；
所述针对cg14140881生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.40-SEQ ID NO.42；
所述针对cg25756435生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.43-SEQ ID NO.45；
所述针对cg00594560生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.46-SEQ ID NO.48；
所述针对cg18087672生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.49-SEQ ID NO.51；
所述针对cg14868703生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.52-SEQ ID NO.54；
所述针对cg17632299生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.55-SEQ ID NO.57；
所述针对cg18786873生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.60；
所述针对cg20631750生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.61-SEQ ID NO.63；
所述针对cg25924096生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.64-SEQ ID NO.66；
所述针对cg15321298生物标记物的引物和探针为SEQ ID NO.67-SEQ ID NO.69。
在其中一个实施例中，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括DNATaq聚合酶、dNTPs、Mg2+和10×DNA聚合酶buffer。
在其中一个实施例中，所述检测试剂盒检测的待测样本是血液、血清或血浆或者组织样本。
在其中一个实施例中，还包括引物混合液，在扩增体系中，其中每条引物浓度在300±10nM；镁离子的浓度为1.5±0.1mM,dNTP混合液浓度为400±10uM；反应酶为PhusionU，引物探针混合液，在多重荧光定量PCR反应中：其中各引物浓度在900±10nM；探针浓度在200±10nM。
本发明首先通过独特的多重PCR技术靶向富集多基因靶向区域，避免多基因检测原始cfDNA量较低的问题，通过结合MethyLight PCR检测的低成本、快捷性，提高了检测通量，同时也提高了模型检测的灵敏度和特异性。单独的分子标记物cg16304215的引物探针的检测结果具有很好的灵敏度，其与其他分子标记物中的任何1个的引物探针组合具有更强、更稳定的诊断能力。通过本发明的所述检测试剂盒，可以很好地提高对乳腺癌检测的灵敏度和特异性，有效提高早期乳腺癌的检出率，及早进行治疗和干预，提高患者生存率。
本发明试剂盒提供的针对所述DNA甲基化分子标记物的荧光定量PCR检测引物和探针设计时克服了多个引物和探针在进行多重PCR扩增和检测时存在相互干扰的缺点，利用所述引物对经过亚硫酸氢盐处理的DNA进行多重PCR时，每个DNA甲基化分子标记物均能得到有效扩增和富集；后续对多重PCR产物进行多重荧光定量PCR检测时，相应DNA甲基化分子标记物在多重荧光定量PCR检测中获得的CT值与该DNA甲基化分子标志物单独进行荧光定量PCR反应的CT值没有显著差异，定量性能与单个区域定量等同。所述试剂盒经过优化，针对不同DNA甲基化分子标记物的引物和探针相互之间没有干扰，可成功实现多重PCR扩增和多重荧光定量PCR检测，有效提高检测效率。
本发明提供的针对所述DNA甲基化分子标志物的检测方法通过引入多重PCR扩增，能有效对目标分子进行富集，克服了检测样本获取量低的限制，在放大检测信号的同时也能进行多个分子标记物的联合检测，提高检测灵敏度和检测效率，能增强对乳腺癌的检出率。
附图说明
图1是测序法独立验证集中1个标记物(cg23035715)、4个标记物(cg23035715，cg26371731，cg04541368和cg13973436)甲基化标记物组合ROC曲线。
图2是测序法独立验证集中cg23035715，cg26371731，cg04541368和cg13973436甲基化标记物随机组合的不同乳腺癌分期的灵敏度和特异性。
图3是测序法独立验证集中cg23035715标记物与随机挑选1个标记物cg25924096的ROC曲线(a)和不同乳腺癌分期的灵敏度、特异性(b)。
图4是实施例3中其中一个分子标记物(Marke9)荧光定量PCR反应检测扩增曲线。
图5是实施例4中标志物组合A(a)、B(b)和K(c)的ROC曲线。
图6是实施例4中标志物组合A/B(a)、A/C/J(b)、A/B/C/J(c)和A-L(d)的ROC曲线。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
除非特别说明或另有定义，本文所使用的“第一、第二…”仅仅是用于对名称的区分，不代表具体的数量或顺序。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
表1 26个甲基化标记物
发明人在前期的研究中，利用其中26个甲基化标记物(SEQ ID NO.1-26)的信息，对22例钼靶和彩超无异常的正常人以及47例乳腺癌病人血浆样本(其中，0期3例，I期12例，II期22例，III期8例，IV期2例)进行随机组合检验，利用LASSO和随机森进方法(RandomForest)分别在训练集和测试集进行标记物筛选和模型建立(可参照之前的研究CN2020104264964)，利用逻辑回归模型进行建模分析，进一步筛选4个标记物(cg23035715，cg26371731，cg04541368和cg13973436)，具体的数据分析方法与实施例2一致，Top1(cg23035715)和Top1/2/3/4(cg23035715，cg26371731，cg04541368和cg13973436)在98％的特异性下(22/22)，验证集的乳腺癌0期的检测灵敏度分别为100％(3/3)和100％(3/3)，乳腺癌I期的检测灵敏度分别为91.67％(11/12)和91.67％(11/12)，乳腺癌II期的检测灵敏度分别为90.90％(20/22)和90.91％(20/22)，III期的检测灵敏度分别为87.5％(7/8)和87.5％(7/8)，乳腺癌IV期的检测灵敏度分别为50％(1/2)和0％(0/2)，对于所有的乳腺癌样本，检测的整体灵敏度分别为91.49％(43/47)87.23％(41/47)，整体的AUC分别为0.9395和0.9796，表明了这些位点组合与乳腺癌早期的诊断高度相关。结果请见图1和图2a-2b。
所述4个生物标记物：cg23035715，cg26371731，cg04541368和cg13973436，其中，单个标记物cg23035715的AUC 0.9395，见图1，且图1为26个共甲基化标记物中4个标记物(cg23035715，cg26371731，cg04541368和cg13973436)组合一起，与marker1(cg23035715)标记物在鉴别乳腺癌能力方面的比较，通过图1可看出，4个甲基化标记物组合的AUC已经很接近于26个标记物的组合的AUC，marker1的标记物AUC也有0.9395，说明这4个甲基化物标记物的重要性，特别是marker1的标记物已经具有很强的诊断早期乳腺癌的能力。
图2c-2d所示，在98％的特异性下，Top1/2/3和Top1/2/4甲基化标记物组合在验证集的0期的检测灵敏度分别为100％(3/3)和33.33％(1/3)，I期的检测灵敏度分别为100％(12/12)和66.67％(8/12)，II期的检测灵敏度分别为81.82％(18/22)和63.63％(14/22)，III期的检测灵敏度分别为87.5％(7/8)和75％(6/8)，IV期检测灵敏度分别为50％(1/2)和0％(0/2)，整体检测的整体灵敏度为分别85.11％(40/47)和61.7％(29/47)。其中，图2c中的top1/2/3代表的是cg23035715，cg26371731和cg04541368组合，而top1/2/4代表的是3个标记物(cg23035715，cg26371731和cg13973436)的组合，以此类推。
进一步验证top1单独的重要性，在98％的特异性，top1(SEQ ID NO.1)与随机SEQID NO.5-26标记物中的cg23035715，cg16304215和cg08599259组合以及与其它剩余40个标记物(SEQ ID NO.27-66)的随机挑先的cg01167274，cg07790615，cg23134869和cg01832036组合，验证集的0期的检测灵敏度分别为100％(3/3)和100％(3/3)，I期的检测灵敏度分别为100％(12/12)和83.33％(10/12)，II期的检测灵敏度分别为95.45％(21/22)和95.45％(21/22)，III期的检测灵敏度分别为100％(8/8)和87.5％(7/8)，IV期检测灵敏度分别为0％(0/2)和0％(0/2)，整体检测的整体灵敏度分别为93.61％(40/47)和61.7％(29/47)，见图3a-3b和图3a-3b。
针对上述的22例钼靶和彩超无异常的正常人以及47例乳腺癌病人血浆样本进行检测的结果，cg23035715对于早期乳腺癌的诊断有很好的表现，与cg26371731,cg04541368和cg13973436的组合也展现出与top1-26的组合相似的诊断能力，而且cg23035715与随机SEQ ID NO.5-26标记物中的cg23035715，cg16304215和cg08599259组合，top1/2/3/4标记物的AUC也在0.75以上，如cg2303571、cg26371731,cg04541368和cg13973436的AUC为0.9395，0.8020，0.7701和0.7501，见表2，说明了利用该方法筛选出来的位点与乳腺癌早期的诊断有非常高的相关性。
表.2 26个甲基化标记物片段在乳腺癌诊断中的表现-AUC。
本发明公开了用于乳腺癌诊断的甲基化标记物(23种)检测的引物和探针和组合的PCR反应体系。根据TCGA数据库严格筛选乳腺癌特异性的甲基化markers，通过靶向甲基化高通量筛选出来原26个生物标记中的23个乳腺癌血浆中标志物，结合甲基化特异性聚合酶链式反应富集与MethyLight PCR荧光来检测多基因的甲基化标志物。
基于MethyLight PCR检测ctDNA甲基化来诊断乳腺癌的方法，包括如下步骤：
步骤一、采用cfDNA提取试剂盒，提取待测生物样本的游离DNA；
步骤二、对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
步骤三、上述DNA甲基化分子标记物的扩增引物对转化后的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；
步骤四、获得的多重PCR产物用针对上述DNA甲基化分子标记物的探针进行多重荧光定量PCR检测；
步骤五、通过内参基因CT值判断样本是否有效，然后用内参基因CT值对有效样本中检测的每个分子标记物的CT值进行校正；
步骤六、将校正后的数据进行模型分析，最后进行肺结节良恶性的判断。
所述步骤五中若内参基因的CT值在8-18之间，则该样本判断为有效样本；反之，则为无效样本；然后用内参基因CT值对有效样本中的每个DNA甲基化分子标记物的CT值进行校正；若目标DNA甲基化分子标记物CT值<35判断该DNA甲基化分子标记物被检出，得到该目标DNA甲基化分子标记物的相对循环数ΔCT：ΔCT＝目标DNA甲基化分子标记物CT值-内参基因CT值；若目标DNA甲基化分子标记物CT值≥35则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出，则赋予其ΔCT＝27。
所述步骤六中根据校正后的ΔCT值进行数据分析，采用朴素贝叶斯算法建立乳腺癌诊断模型。根据校正后的ΔCT值进行数据分析，将数据集按照6:4随机切分为训练集和测试集，然后针对训练集里含有不同DNA甲基化分子标记物的组合采用朴素贝叶斯算法建立恶性预测模型，最后在对应的含有特定的DNA甲基化分子标记物组合的测试集中评估模型的分类能力。
以下具体实施例，是对本发明做进一步的详细阐述，但不用于限制本发明的保护范围。
实施例1本实施例提供了一种用于血浆样本检测乳腺癌的试剂盒，其包含了23个检测基因TLR5、C1orf61、NR2F1-AS1、ZDHHC1、OTP、FEZF2、TSHZ3、FLJ45513、POU3F1、NKX2-1-AS1、PNPLA1、TIFAB、RADIL、EFCAB10、MAST1、ZFHX4-AS1、HOXB13、LHX5-AS1、LECT1、ALX3、BMP7、PRDM13和ULBP1中的23个甲基化区域的DNA甲基化分子标记物Marker1至Marker23的检测引物和探针。
所述试剂盒针对23个用于血浆样本检测乳腺癌的分子标志物Marker1至Marker23中的特异性甲基化位点各设计了三对引物和三条探针(探针荧光标记可采用FAM、VIC及NED等荧光基团标记)，并分别标记为组合1、2、3。其中，每个分子标志物中被选择的引物和探针组合，可任意选择与其它的甲基化标志物中的引物和探针的组合1、2、3进行组合并在同一平台进行检测。具体的各分子标记物对应的引物和探针序列如表1所示：
表1.1.相关分子标记物的引物和探针序列
本实施例和以下实施例中，优选所用的引物和探针组合均为Marker1-Marker23的引物和探针组合1。在实际应用中，将根据甲基化分子标记物的不同组合进行选择相应的引物和探针。
实施例2
本实施例利用实施例1所述试剂盒对血浆样本中23个生物标记物的甲基化水平进行检测。
一种DNA甲基化分子标记物的甲基化水平检测方法，包括以下步骤：
1、样本中cfDNA的提取：
血浆DNA提取具体操作步骤按照Life公司的MagMAX TM Cell-Free DNAIsolation Kit操作说明书进行。
2、对提取的cfDNA进行亚硫酸盐转化
将提取的cfDNA (10ng)进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，转化具体操作按照Zymo Research的EZ DNA Methylation-Lightning Kit说明书进行。使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。经过亚硫酸氢盐转化后的DNA产物全部用于进行多重PCR扩增。
3、对转化后的DNA进行多重PCR扩增
转化后的DNA产物全部进行多重PCR扩增，其中的反应组分为：特定组合的分子标记物及1个内参基因的引物混合液，其中每条引物浓度在200nM-300nM，本实施例优选300nM；镁离子的浓度在1-3mM，本实施例优选在1.5mM；dNTP混合液浓度在200-600uM，本实施例优选在400uM；反应酶为Phusion U(Thermo Fisher,Cat#F555L)，一个反应的单位数为1-3U，本实施例优选1.5U。多重PCR反应体系配制如表2.1：
表2.1.多重PCR反应体系
具体反应条件为：预变性，98℃，30s；15-35个循环反应，本实施例优选22个循环：变性，98℃，15s；退火，58-66℃，15-30s，本实施例优选63℃，15s；延伸72℃，15-30s，本实施例优选15s。
4、对多重PCR扩增产物进行多重荧光定量PCR测定
对多重PCR产物进行1-5倍稀释，本实施例优选3倍稀释。多重荧光定量PCR反应组分为：引物探针混合液，其中各引物浓度在200-900nM，本实施例优选900nM；探针浓度在100-200nM，本实施例优选200nM。采用的反应酶混合液为1倍的ChamQ Geno-SNP probeMaster Mix(Vazyme,Cat#Q811-02)，一个反应为10ul体系。
该体系中的引物探针混合液包含了2-3个分子标记物的引物和对应的不同荧光基团标记的探针，表2.2中列举了2个分子标记物的引物和探针进行混合的混合液方案：
表2.2.多重荧光定量PCR反应体系中的引物探针混合液组合方案
具体反应条件为：预变性，95℃，5min；40-50个循环，本实施例优选45个循环：变性，95℃ 15s；退火，60-64℃，本实施例优选62℃，1min，信号收集。qPCR荧光定量反应体系配制如表2.3：
表2.3.qPCR荧光定量反应体系
用完全甲基化(阳性对照)及非甲基化(阴性对照)标准品对23个分子标记物按照表格5所示的混合液组合(混合液A-M)进行多重荧光定量PCR测定的CT值，与对其进行单独荧光定量PCR反应的CT值比较，其中阴性对照在所有组合及单个定量中均无检出，结果显示各分子标记物在按照表2.2所示的混合液组合方案进行的荧光定量PCR反应的CT值与其单独进行荧光定量PCR反应的CT值相近，没有显著差异，由此判断多重荧光定量的引物探针混合液组合方案中各分子标记物的扩增效率没有相互干扰，定量性能与单个区域定量等同，可实现2-3个分子标记物的同时定量检测(表2.4)。
表2.4.各分子标记物在多重和单独荧光定量PCR反应下的CT值
本实施例进一步提供一种检测乳腺癌的方法，还包括以下步骤：
5、根据荧光定量PCR反应测定的内参基因在样本中的CT值判断该检测样本是否为有效样品，若检测样本内参基因的CT值在8-18之间，则该样本判断为有效样品；若检测样本内参基因的CT值<8，则样本初始投入量过剩；若检测样本内参基因的CT值>18,则初始样本投入量不足。对于初始投入量过剩或不足的样本，均判定为无效样本，不纳入检测和分析。
6、在样品判断为有效样品的前提下，若目标DNA甲基化分子标记物CT值<35判断该DNA甲基化分子标记物被检出，得到该目标DNA甲基化分子标记物的相对循环数ΔCT：ΔCT＝目标DNA甲基化分子标记物CT值-内参基因CT值；若目标DNA甲基化分子标记物CT值≥35则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出，则赋予其ΔCT＝27。
7、根据各样本中的目标分子标记物校正后的ΔCT进行数据分析，将数据集按照6:4分为训练集和测试集，并进行100次随机切分为，然后针对训练集以含有不同分子标记物的组合采用朴素贝叶斯算法建立良恶性预测模型，最后在对应的含有特定的分子标记物组合的测试集中评估模型的分类能力。
实施例3
本实施例提供分子标记物在标准品中的检测，其检测步骤如下：
1、标准品制备
1)0％甲基化标准品制备：利用
Single Cell Kit(Qiagen,Cat#150343)和Mung Bean Nuclease(NEB,Cat#M0250L)处理NA12878 DNA以制备0％甲基化标准品；
2)100％甲基化标准品制备：
利用CpG Methyltransferase(M.SssI)处理所制备的0％的甲基化标准品，得到100％的甲基化标准品。
2、不同甲基化比例的标准品制备：
按照所需的甲基化比例梯度混合0％与100％甲基化标准品，得到0.2％，0.4％，1％甲基化比例的标准品。
3、对不同甲基化比例的标准品DNA进行亚硫酸氢盐转化：步骤如实施例2，转化投入量为10-50ng，本实施例优选为50ng。
4、对转化后的标准品DNA进行多重PCR扩增，步骤如实施例2，多重PCR引物混合液为23个分子标记物以及内参基因的引物。
5、对上述多重PCR扩增产物进行荧光定量PCR测定，步骤如实施例2。
6、根据荧光定量PCR反应测定的内参基因ACTB在样本中的CT值判断该检测样本是否为有效样品，若检测样本内参基因的CT值在8-18之间，则该样本判断为有效样品；
7、在样品判断为有效样品的前提下，若目标DNA甲基化分子标记物CT值<35判断该DNA甲基化分子标记物被检出，若目标DNA甲基化分子标记物CT值≥35则判断该DNA甲基化分子标记物未被检出。
本实施例及以下实施例中，各分子标记物的引物探针组合如实施例1中优选的组合1。
本实施例及以下实施例中，每一次试验都会设置阴性对照，该阴性对照以水作为模板进行多重PCR，得到的阴性对照多重PCR产物再进行各特定分子标记物的荧光定量PCR测定。如阴性对照无检测信号，则判定整个实验操作无外源污染。
本实施例进行了3次完全独立重复试验，23个分子标记物在100％甲基化标准品中均有检测信号，而阴性对照和非甲基化检测标准品中都无检测信号，以其中一个分子标记物(Marker1)扩增曲线为例，如图1所示，在甲基化比例≥0.2％的各标准品中，Marker1，Marker2，Marker3，Marker4，Marker8，Marker10，Marker11，Marker15，Marker17，Marker19和Marker21三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物的引物和探针对甲基化比例≥0.2％的样品检出率达到了100％；在甲基化比例≥0.4％的各标准品中，Marker5，Marker6，Marker7，Marker9，Marker12，Marker13，Marker14，Marker15，Marker18，Marker20，Marker22和Marker23三次试验全有检测信号，说明这些探针和引物对甲基化比例≥0.4％的样品的检出率达到了100％；22个分子标记物在甲基化比例为1％的标准品中，三次试验全有检测信号，说明这些分子标记物的探针和引物都能检出甲基化比例为1％的信号，灵敏度较高。图4是分子标记物(cg08599259)荧光定量PCR反应检测扩增曲线。
实施例4不同分子标记物组合对血浆样本进行乳腺癌检测的表现
本实施例利用23个分子标记物包含Marker1至Marker23检测引物和探针的任意组合，通过实施例2的实验方法，具体的检测试剂盒、试验方法以及数据判断处理如实施例2所述，引物和探针组合如实施例1所优选的组合。
本实施例对200例血浆本的分子标记物Marker1-Marker23进行了标志物的检测,该200例血浆样本包括了确诊的100例健康人对照和100例乳腺癌患者血浆样本，利用逻辑回归模型进行建模分析，将数据集按照6:4随机切分为训练集和测试集，采用朴素贝叶斯算法建立良恶性预测模型。
选取表2.2中分子标志物组合A(Marker 1+内参)进行建模分析，其在测试集中AUC为0.885(特异性：92.5％；灵敏性：67.5％)，ROC如图5a所示。可见Marker 1的引物和探针的PCR检测结果的灵敏性和特异性都非常好。由于样本中有73％的恶性样本为乳腺癌早期样本，因此通过该引物和探针组合检测标志物组合A，对早期乳腺癌检测也有较高的灵敏性和特异性。
选取表2.2中分子标记物组合B进行建模分析，其在测试集中AUC为0.8316(特异性：92.5％；灵敏性：60％)，ROC如图5b所示，可见所述所选分子标记物的引物和探针的PCR检测结果，同样有较好的灵敏性和特异性。由于样本中有73％的恶性样本为乳腺癌早期样本，因此该分子标记物组合对早期乳腺癌检测也有较高的灵敏性和特异性。
选取表2.2中分子标记物组合K进行建模分析，其在测试集中AUC为0.7766(特异性：95％；灵敏性：32.5％)，ROC如图5c所示。可见所述所选分子标记物的引物和探针的PCR检测结果，具有较好的灵敏性和特异性，只是灵敏性比D组合稍差。
选取表2.2中分子标记物组合A和B进行建模分析，其在测试集中AUC为0.9144(特异性：92.5％；灵敏性：72.5％)，ROC如图6a所示。可见所述所选分子标记物的引物和探针组合检测结果，具有较好的灵敏度，特异性稍弱于其他组合。由于样本中有73％的恶性样本为乳腺癌早期样本，因此该分子标记物组合对早期乳腺癌检测也有较高的灵敏性和特异性。
选取表2.2中分子标记物组合A与随机C和J进行建模分析，其在测试集中AUC为0.8969(特异性：95％；灵敏性：65％)，ROC如图6b所示。可见所述所选分子标记物的引物和探针检测结果，具有较好的灵敏度，特异性稍弱于其他组合。由于样本中有73％的恶性样本为乳腺癌早期样本，因此该分子标记物的引物和探针的PCR检测结果对早期乳腺癌检测也有较高的灵敏性和特异性。
选取表2.2中分子标记物组合A、B组全与随机C和J进行建模分析，其在测试集中AUC为0.9163(特异性：95％；灵敏性：75％)，ROC如图6c所示。可见所选分子标记物的引物和探针的PCR检测结果具有较好的灵敏度，特异性稍弱于其他组合。由于样本中有73％的恶性样本为乳腺癌早期样本，因此该分子标记物的引物和探针的PCR检测结果对早期乳腺癌检测也有较高的灵敏性和特异性。
选取全部23个分子标记物组合进行建模分析，其在测试集中AUC为0.9481(特异性：95％；灵敏性：85％)，ROC如图6d所示。可见所述所选分子标记物的引物和探针的PCR检测结果，具有较好的灵敏度，特异性稍弱于其他组合。由于样本中有73％的恶性样本为乳腺癌早期样本，因此该分子标记物的引物和探针的PCR检测结果对早期乳腺癌检测也有较高的灵敏性和特异性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市基准医疗有限责任公司
<120> 乳腺肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒
<160> 236
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
tagcgtttta ggatggggtg cg 22
<210> 173
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
gcaactacga accgaacaat aattaacaa 29
<210> 174
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
aacaaaacct cccgcccctc ctc 23
<210> 175
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
cggataaggg aggatagaat ttacggt 27
<210> 176
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
gtcccgcctt atcactcaaa acaa 24
<210> 177
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
tttcgtcggt agaggaaggt agcggcg 27
<210> 178
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 178
tgattgtttt gtggttgcga ttc 23
<210> 179
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 179
cctaaatcgc gaacaataac gttaa 25
<210> 180
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 180
cctaccctct ctaccctact acatacccca 30
<210> 181
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 181
tggttgtttc gttttgttgt tatgg 25
<210> 182
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 182
taaaactccc tttacgacaa atcgaa 26
<210> 183
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
acgcgtacgc cctaaacgcg aaatctt 27
<210> 184
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 184
tttaaagttt ttagcgttgc ggt 23
<210> 185
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 185
aaaaacgcgt aaaatacgaa acc 23
<210> 186
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 186
ttggagtttc ggatgcggcg atc 23
<210> 187
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
cttgagttga gagttttcgg ttcgcgc 27
<210> 188
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
cgcttcgaac catctcgccg aatta 25
<210> 189
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 189
aactacctcg cgtacattac tcaaaacaca a 31
<210> 190
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 190
cggattaggt tttggaattc gtga 24
<210> 191
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 191
taccttccaa tttaaaacta acgaaacg 28
<210> 192
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 192
acgcgaaacg aaaattacgt ctctcttcct 30
<210> 193
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 193
ttttataacg ttgatttaag gcggaaagtc 30
<210> 194
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 194
gacgaacccc tcgaacccaa c 21
<210> 195
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
ccaacgtaaa ctcccctctc ccatcccac 29
<210> 196
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 196
ttttaaaata atcggttcgg agc 23
<210> 197
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 197
cgcaactacc caacctcgta a 21
<210> 198
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 198
ccgcaaataa aacgcaacta cgcgctcac 29
<210> 199
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 199
attgattgga gttgtgacga ttttg 25
<210> 200
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 200
aacaaatcta aaaaatatac gcac 24
<210> 201
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 201
ctccccgacc ctcgctacaa c 21
<210> 202
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 202
tgaggattaa tggtttcgtc ggat 24
<210> 203
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 203
cccctacata atcgaaaccg cta 23
<210> 204
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 204
cacacaataa tccaaaagac cttcccat 28
<210> 205
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 205
agataataaa gaagtagcgt ttagat 26
<210> 206
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 206
cgaataaaac agaaaagcga a 21
<210> 207
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 207
ctaacgtttc actcctccta tctcctac 28
<210> 208
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 208
gtgatggagg aggtttagta agtt 24
<210> 209
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 209
ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25
<210> 210
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 210
accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30
<210> 211
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 211
ctgtccttgc ctttcatggt gtcagcctct tcatgcctcc ccaccattcc aggcactccg 60
ggctttctct tcaaaccctc tttcgacacc tccaagtgct gagcctcctt gcttttctag 120
cccatctgcc agcctcctgc acgtctacac ctgacggctg ggctcctgtc gcagaaacca 180
tgcgccaggc acattggggc ccacataaat gtgcagtgtc cgatacgcca tgtggtcagc 240
acgacttctc cacgtctcct ctttctcttc ttcctgcaga gtgagcccac cggttcacca 300
cgttgctctt gcccctagcc caccaggccc tggccctcag cagcggacct gccgcggttt 360
ctggactagg aaggccctgc tcccgaccga cccggagcgc gctgctgccc tctaccggtc 420
atccgtgcgg ccggacaccg tgtcaggccc gcgaggaggg ctctgccgca gtcccgggga 480
acagcaccca gcagcgccac tgggagagga aactggggtc agggaggtgt gactgggccc 540
caggcagtca cactcaggcc aacaaggtca gggagggagg gcagctcact cgtgcaaacg 600
t 601
<210> 212
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 212
tgaaatggga ctgtgactcc tacctgtgcc gactggggtg ctgggggggt gaaatgtcgc 60
ccgaaccagt gaggtctctc tcctcctctt gtatcctctg gtgctggtca gtcctcgcgg 120
ctctagcccc tcgctcaagc ctctccctcc cgcccgtgag gccggctttc cccgggcccc 180
tctgcgcagt gtatggggtt atttttactt tcggttatct agctttatga agactccaca 240
ccactcatac agctagataa ccaaagataa caaccaaccc cgcctcctgg ctgctgtcgc 300
cgcctcttcc acgcagcctc ccggccgccg ccgccgccag cacctccgca gcttcccggt 360
cgcccgtcag cgggagtagg agggaaggga cacgagtgga gttgaggggg agggtgaaga 420
gagaaatgaa gtccgagaca aaacaacaac aaaaacctca gacacggaga tacagacacg 480
acagagaccg aaaaaggcgt ggaaaggacg cgatgacccg tggcgtcgaa gtcggggagt 540
tgaccccgat ccagacccaa aaagtttctg gtgccccatt tcccgctctc ccattcgggc 600
c 601
<210> 213
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 213
ctttccaccc tttctcactc cagtcactcc cgaggacttg gggcacgact atcacacgca 60
actgggagat cctggaagac ggaggaaaaa cgaacaaggg gacatggccc tcactgcagt 120
gacagggctt tccttcagtc agtggccaca ataaatttaa ccaaggctaa aggagattaa 180
tttcccagca taatccaatt aaaagatttc taaagtaatc ttttgcgaaa atgaaaagtg 240
cgcgactaaa gaggggactg gttttgatga cagtgattta tcgcctcagc acagcacgca 300
cgggacgctg tctctccaag cgatttgacc agagcatccc gtcctcgcct cctgtccaaa 360
ccttcctctt cctgaaagac agccatctat cacgccaacc tgggcaggag agaatgtgca 420
aggggctggg gcggcttaca agcaccacag acctttttaa gtgctattag atttatggtc 480
tctttttcga cacccatcca gagtaattag cacatatgtt ctaaatagat gatagttttg 540
tgagcaataa agcaattacc catcgttgga gctgacagtt cctccaacta aactccaacc 600
a 601
<210> 214
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 214
cgcgccagcg tgggctgtcg gccccggccc cgcggggcgg ccagagcggc gctgcccagg 60
cgcgtctgcg ccactggaat ctcgtccacg gactctgccg acgccgagtg gtaggcgccg 120
gcagggccag cggcgtgcac agggctggcg tccgcggaat ccgtcgacga gctggagcgg 180
cggctggggg ccctaggccc tgcgcaaggg aagggaacat gagcccagtg gctgcggctc 240
gcttgtggct ctgccttccc ctccctcgag ttcccagagc aggacccgga cagggagagg 300
cgctcacccg acgccggatc cgaggtctca gacgttcgca ctttatacac gcgcctcttc 360
ctctttttct gcagagacac gggggagcct gagggcccca catcgccaaa agaagcagag 420
gcgagcgcca gggtagaggc ttctttctat cccactccac ctggaccgga ggcccagcac 480
agtccctcct acctggggtc ggatccgggg aggcagggcg agagtgtctg gggaagaggg 540
tggtggaggt tccgcttggc cacgggtggc aagaaactgg gagggactga gggggaagca 600
g 601
<210> 215
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 215
taccactttc ttcctgtggt ttctacccca ttttgcagat tgctgcgtat cccagtgtcg 60
gcgatggata aacaggtctc gtctcttccc agttgcagcc cgtgagctgg tggcacaacg 120
gattaatgag gcaacagggc tctagatggt gagtgggatc aatgagaccc aattgagctg 180
ttagcggtct taggcggaga gcatctctca ggaggaaagg aaggcacagc gagaagacct 240
aaggccgaaa gtcgctgtgc agcacccacc caaggctgga ctcgggggag gtagacggga 300
cggtgtctgt gactaaacgg ttcccacacc ttacacgccg caccgggatt atgttttgaa 360
aggtgtctta taaaatcaag accggttcct aacaacctgc aagtgccagt gaatcccgaa 420
atgtttgttt gaggagaggg agtgtgaggg aaggagcaga aaaaagaaag agggggagga 480
ttgcccagta gaatttcaat agaaaatgtg actaccagaa tggtttctga atctaggatc 540
tgctcaggca caggcggaaa agaacagctg ttaaagaact aaatattata gaaataatcg 600
g 601
<210> 216
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 216
caaaggcttt cgccaggcca gcacgctctg caggcacaaa attatccaca cccaggtacg 60
tggcccccgg gtcgggccta gcccgcgcgc aacccccaga atcttagtga taacaccggg 120
gatacgatgg ccaaagatta tcccttaccc tctagggttg agtgggggtg ggggggatgt 180
cccttccagg tgttcccgag gtggcctctc cttactgtgc actcgcccct ttcctcagga 240
aaagccacat aaatgcaacc agtgcggcaa agcgttcaac cgcagctcca cgctcaacac 300
gcatatccgc atccacgcgg gctacaagcc cttcgtctgc gaattttgcg gcaaaggctt 360
tcaccaaaaa ggtaacgtgc caggcgaggc cttctcttct cacctcacct caggactcgg 420
gtcgcggctg gctggcagga aggcaaagag ggatctggag agagaaggcg aaatctgcag 480
gcgcgggcgc agcatttctt tagaatcggg ttgtgcctgg tgtaggggga agctctccta 540
gcggggttag tagaccacgc tgtatgcagg ctgggtgcac tgagagactc cgaattcgag 600
a 601
<210> 217
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 217
gttcggattt ttcggcagac gtgcaaagtt cagatacaaa gatcactgta actgtcagag 60
aggtaaggac ctctgataca atggatttaa gaggtttttt actccaacag tcagggcaag 120
ggaaagagaa aaccgtgctt ctcttggaat ctcttccaac aagggggttt cctccagtcc 180
cctccagatg cgttgaccgc gctgggaaac cgagtccagg gccaggattt gtttttccaa 240
agccgcgcga ccccagcagg gcttcagatc cgagttccca gttgctcttc agtctccccc 300
gcgttcttcc aaacgctatc aggagccacg caggttaccg caccaccggt catttccctg 360
tttcttctaa aagttctcca gccaaatttc agcaatttat ttaaaaaggc accaggtcac 420
cgcgaccttc gggcggctcc tcaggcctca tggggtagtt tggtcaggat ctgcgcgccc 480
ctcgacgtga tcagaaccgt gtgctcgaac tgcgccgacc tgtaacacag cacccagccg 540
tcagaacgcg cacgcaagct ccggccgggc cacaagcgcg ccgtcggacc aatcttcctt 600
t 601
<210> 218
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 218
caactctgaa gagtggggtg aaaagatttc tacacagtgt acattctaca gaattctagt 60
ttctccgcgg gcgcagactt ttccgccctc tagtctagcg tgaaaacagt tcgaccactg 120
gatgtgggcg gcgaagcccg caccctagag cgcggtgtct ccctgcagga gggagctcca 180
gcccgcgccg ccgcggccgc ttctggcctc ctcgggaacc gaaccgagca tacctcagtg 240
ctctcctaga agcggctcct tttccccttc ttactcgcga atggcgaaat gaatagccgc 300
gcgggatttt acccgtttgt gtagtggact ctgagggggc accaggtacc gagacggaaa 360
tctttgcggt aagaataaag tcaggtaaaa cgcctggtac agccgccctg cagatgtccc 420
aagagtaggt cccccgtaca ctcttcccat taagttctta gggggaggac agggaaggcc 480
ctttggtctg gctggattga tcagggaggt atgcgcatat gtttgccctc tggacatttg 540
gggaggggtt atgggggagt tgaaggcaag aggcaaaatc aggtagaaca aacaactaca 600
g 601
<210> 219
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 219
cggagaatgg gcagtctgaa gagacctgcg tcccccctct ccgatttgac ttttcctgaa 60
atttggaatt attgcgcctc tttttctctt tctgatcgag catttagtgc tggcgcaagc 120
cgggcagccg actggttact gagcccacgg ccagcccggc cttgtgcttc catttgcgct 180
cacctcagca agcccctgag cgctttctca gggattggag ttccccctca tttcccaaat 240
aaccctggag aagctcccgg gggaggagga ggggagaggt cttggggtca gcaccacttc 300
gatcccagca ctgcagtggg gctccccacg cccgtctccc gctccaccat cggcgacgct 360
ctcccggagt cttctttgca ttacttgcaa atttcagcct ctgctcagga aaagtctatt 420
tgagattagc tgggatgttt tatgcacaca ctaaacatgt taaaaacaaa actaggaaaa 480
attcttggga cacggggtgg ggggacggag gaagagagag agagacagag agagagagag 540
agagaaaacg gttaacaaaa aatgaggcgg ttttgagggt gtcttggagg caggctgcgc 600
c 601
<210> 220
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 220
aagcgcatga cccctgcggc cggcgcgggc cacccgccca tggacgatgt atacgcgcct 60
ggggagctag ggcctggcgg gggcggcgca tcgccaccct ccgcgccccc accgcccccg 120
ccggcggcgc tgcaccacca ccaccaccac acactgcccg gctcagtgca gtgaccccgc 180
gggccgggcc cccgccggcg cgctgcaggg cgcgggcgcg cagcccgccc gcgcggcctg 240
gactcttttt gttcggttgc tttggatttt acaaaaaaaa aaaaaagccc agaaactttc 300
gaacaaaacc aaacacccgg acgaccctct ccggtgagcg gcgaagacag cccggtaggc 360
tgcgtcgccc gagccccggg agagaggagc gaagatccgg aactcgccaa ctcaccccgg 420
gcatcctgcc cgccgcctgc tctctgcccc catcccctcg acgacccccg cccctgcccc 480
cccgggctgt tcggggccgg atcccggcag cggcctcccc aaagcgacag gtaacgcagt 540
gcggggttag ggattccccg ggagagagga cgaagcgagg agagttctcc atcccctctc 600
c 601
<210> 221
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 221
cttgtcccag gcagtttccg gtggccgcag tatcgacccc aggccattgg ggtgggtgtg 60
agggaagggt ggagggggaa tctccgaggc ccaatgtttt ctgggacttg agggaggctg 120
aattctccct cgctgcctag gacttggggt ctgaaggttg cagaccgagg cgatccgcag 180
cgccctcttc cggcggccgt ctggagaact gcagctttag agcggtctcg gggaagcttt 240
gctactagtt tccggctagg gaaaactggt ggtggtcgga gactggtagt acatcatcca 300
cgcattcgct cattctaact gtccgcccga ccatacgtca ggctgtctat cggtccaccc 360
aaagccaata taagttatga ttgactcttt gaatcaccca gtctccttgc acctgctatt 420
tgaaagagcc caggtgtaga tcagggcttg gaagctgctc ttgtacctaa aaccctcttt 480
taattatgct ttgcttcgga attttgttat gcgaatgtcc tgtccaagtc agagggcatt 540
tggaggcata tttggtgacc aatggagtag cttgcacttt ctgcatgtcc tttctggagg 600
a 601
<210> 222
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 222
tacccctgca gtgtagggca tagaaataaa atggtaaata aaccagggtc actgctcctc 60
ggaggctggc tgtcactgtg aggataaact gagataatag gtgggaaagc ctgtttaggg 120
aaacgattgt tgttaagatg ataacaatta ttattacgtt ggggtagggt attcaagata 180
tacccacagg aaaatgcaga ttacaattca gtctgcaatt agggaccaga tagcagccaa 240
ctctcaggtg atccatgcag ggattctgag cattcgtcgg cgcctcccca ggggctgctg 300
cgccccctgc ttcccgcgcg cccaccacgc acgctgctct gggagcaggg ccggcggcgc 360
cgccgcctcg cagcgattgg ttgaaccgga ggttgttgct aggctaccag tgcgccctga 420
gcctggggcc ccgcagtccc atcctctgtg gcagatccat ccctcactgc agacctaatt 480
ccggtaccct gtgaacggca tcctcagcag cttaaattat cagccccaac tgcccgcctt 540
tctatgattt ttcatttcgc aagaggccat gtggagttgg ggaagagaag ccttctgttt 600
t 601
<210> 223
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 223
cctaggctgc ctctctggca ggttaggaaa ttgactcatt aggatttcat ccaccttttc 60
actggctacc tctcccgctc cccacccccg ccctagactg cctcactaag tcaacactgc 120
aatctctctg gctcagctaa gtggtcccta gtgaggagca ggcctgagcg ccgggtaacc 180
gaggaactcg gaggcacctg gccgccggca tgctcacctg cagcgctcta ggatggggtg 240
cgcagtgggc agccaagcgc cccccaccca gacggaggag gggcgggagg ccctgttccc 300
gacctgtcaa tcactgcccg gcccgcagct gcgctctccg cagccccagc gcgctgttcc 360
tctgagggag ataaacatcg agaaatccaa tccagcgccg cttcagagat aaacagatgt 420
gcggccctct tcggtcagga gataacgccc ctgccccgcc ccacgcgccc gcccggcctg 480
cacctgcctg aggcgacagg gacgcgcctc tcgggaggca ggttgcgtcc cccagcctgg 540
agaaatggtc tccagagctg cgggtggggg tggggttgga gaagaaagaa gctcggtttg 600
t 601
<210> 224
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 224
ggtgaaaaaa ggtttggggt tgttttgctt ttagccagac cacatacaat gaaggtttcc 60
cacggtgact ctgtcattgg gaatccactg gaagggaagt cccagttaag tggcagtgag 120
ttattcccat gtaaaaagag gaaaagcaat cctttcacct ccactgtgct aagataagag 180
ttattttcaa gtcagagtca tagcggaaga aaaatatttc aaatgaaaac aaccacaaag 240
aggtttgcgg acaagggagg acagaactca cggcaccccg tcggcagagg aaggcagcgg 300
cgcttcccgc gtgcacacaa cagtccctgc ggcccgcaca cccctggctg tcatcgggga 360
ggccgagtcc tgctacctgt cctgagtgac aaggcgggac gacaaatgca aactcagagc 420
tggcactcag cgacaacaca gacctgccac ccgcctgcca gctccatcgc agcactgggg 480
gcaggagggc agcccaccac gccgccaggt ggccagggct gcaggttcct ctgtcgctca 540
agccacatcc acactcctgg acggccacac catccccaca ccaccctccc acacacacac 600
a 601
<210> 225
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 225
gaaagcgaat gtgtaagagg ggggtttcgt gtgggaagcg aaccccacat ggaggtatgg 60
ctgtaccggg gcatgggggc ccttacccgg ccgaaagaaa aggagggcgc tggtgaggta 120
gctaaccacc tccttgatct gatgcttttc caaatactcc gcggcttgga gctccctgct 180
gctggtctcc atcgctccgc gtcccgctgt tgctaggcga ctgcctggcg tctcagccgt 240
gcgactctgt ctccctctac ccggcgcggt cacgtgacac gcctgactgc cctgtggctg 300
cgacccggac ctggaatttc tagagctcac ggttcagggc aagcctgggg catgtagcag 360
ggcagagagg gcaggtgagg tgtggaccaa cgtcactgtc cgcgatccag gcttagggct 420
gggcccaggt gcctttttcc atctctctct agcacctagc tcggtacttg ttgatccaat 480
gattaacaag gcttgaagtg ctggcatcac aactcagcat gaactaataa cagaaggaac 540
ttgtgcaatt ttgagggtgc ccagtggaga gttcttttta ttattattat ttaagacctt 600
t 601
<210> 226
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 226
cgtttctcca gaaaacatca gagaaacctc tctgcctccc ccagtttcac caaaggccca 60
tagaaaattc atttaaggac accccagaaa ccctaagaga cccttggaaa gaaacctgag 120
attcctcccc ttgagaaaca gccctagtcg tcctccccca cctcggggac caagagtccc 180
tcgataggca tcgcgcaatc tgcgcttgcg cacgtcatct tggctgcccc gtcctgttgc 240
tatggaaaca cctggccagg agagcaaggc tcggagagac taagaccccg cgcccagggc 300
gcacgcgctt tcgacctgcc gcaaagggag ccccaccgcc ttccccgttc cagatcggcg 360
attggacccc gccttcttat aggccccgcc ccgaaggcta ggcgctcctt cccgctgaga 420
ccttggggca ctcgctggtc ccctcaggcc ccagctcggg tgcaattagg aggagaacag 480
atggcggccc agacagtggt tggggagggt ctgcccaggg ttctggggcc ctggagggga 540
gggactcacc ttcgggagga ggcaaacgag aagtgggcgg gggtgttggg ggagaagttt 600
c 601
<210> 227
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 227
ttatcgtttt agccctgttt aaaaaaatgg ctgattaagt tgagtgcgca tgtctttgtg 60
tgtctattcc cgatatgcac tctgggaatg agagaggaga gcgagggaga gggagaggga 120
gaggggggag agagaggtgt aattagtgag gtgatcaaca ttccccagac tgcaaatgac 180
gcgcagcccg gactcagagc agctccggag cctcacggct tccaaagctc ccagcgctgc 240
ggctggagcc ccggatgcgg cgaccgcgga gaggacaggg gatggggacc tccgggtctc 300
gcaccctacg cgcccctgcg cgcgactccc aaacttcatt agacacacac gcgctcttac 360
acacaaacac agacacacac agagcaagaa ggggaaagaa ataaaacata gataccgcca 420
aagcatggcc ctttaaccat tcgagatttt ttttttattt taatgaggca aagtaattat 480
tatcggacca gagatttgtt tactagggag ctttaagcag aaatatgagt tagggtaatg 540
aagagctttt ctctgcctag tttattctgc tgtgcacatg aatgcacttt aatggcgaaa 600
t 601
<210> 228
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 228
ccctgattcc cccagttggg gatgccttct gccttccctg cctcttttgg tgaccaggac 60
ttgtggagaa cgtaggaggg aaggaggtga gaaggcagaa tgaatggctg gtgagtaagt 120
ggtaggcatg tgaccagtgt gccagttttc ctggaggtgc aatttgccct tctatggttt 180
tgccaagagc aggggaacta acggcccaca gtgactgcct tctcaaggtt gtgcagctca 240
cctgaatgta gcaacagaaa gggaacagga ggggcagggg cagagaagcc tcccgtccca 300
cgtaaataat tacaaacaga gcacatgacc cctggcggtt tctgaacgcg cctggcaaca 360
gctccaccac ctgctgtttg gaaagtcaga ttcacagaag ctacaattac agactgtcag 420
ctgggtcttt tcatggctgg ggaccggagg ccaaaactta cagcccctaa ctcctagctc 480
agtgctcttt ccacttcatc tcccctgcca cctgccagac aatttacaca aacagcccat 540
gtgatgggtg ccagtgcaga gatctggggg gccttctacg cttgtatatc tctacctagg 600
g 601
<210> 229
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 229
aatgagaatg cattctggag gaagaaggga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa acaagcgctg 60
attgtccctt taagccattt caatcacagt ctcgcagtta aaataatgct cacctactgc 120
gcttccaact gggccatcta ccttttccgc cgggtcaggc ccagtcaagc ctgaggaggc 180
ggccgcggcc ctcgtgagcc cgctctaggc ccggttacac ctgtttatca ccaagtcgct 240
tcatttccct tcccctcctc cctgcttgaa aaggagcatt aattaaaccg gtaaacaagc 300
cggctcccat tctaaatcag agctgcaggc aaaggagaga taacttaggc tccggagaag 360
agggattttc agttaattta tggaatccac cgtcacactc tctccgagca gccagctccc 420
cgcttaacgg ggaaattgaa gcagacagcc tttgtctaaa cacttctttt gcccagaata 480
tcttaatttt cctatttgaa tgtttaataa ggtttggggt gcagcagctt ccttttaatt 540
gtgacggtgc ggccgcttgg gcgtgatccc ttggctgggg ctgcaggggg cccgtcctcc 600
a 601
<210> 230
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 230
tctccgtttc tctatatttt tactgtggag gactcagaag agagctgagg ctattgtccg 60
gggaggaaag gaattcgggc aaatttgtgg gtaggggccc agacccaaga cccgtgtttc 120
tcctgcgtgg gttggagtct gtctcaggtc gctccaggga catcaagagc ccgcgccgcc 180
gagagcccgc gccgccgtcc agcgggaagc agcggaccca caggggcctc cagccgcctc 240
cccgctcccg ccccgtgttt ctcctgggcc tccagctccg tggagagagc tgagagttct 300
cggcccgcgg gcttcctcac caaatcccca aaaaccgacg caggcacaga gggctgactg 360
tgttttgagt aatgcacgcg aggcagtcca atccggcgag atggcccgaa gcggggccca 420
gcggtcgggg gtgtgggtct ggagagagag ggtctcccca cttccttcct ccggctgctc 480
ggtcacccat cgactacccg ggcggaagcg gggcgcagag gggcgcagag ggaggcattg 540
ccctccagga gtatctattc ccatcggggt atggtgaatg ccatctaggc ccatgctcca 600
t 601
<210> 231
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 231
agctctctcc atgagaaagg cccggctggg ccccagcccc gtgtatgaca aaaagaagcc 60
ggggccggct ccaggagccg ggagaaccgc gctgacgcag cttcagggcg cagagggggc 120
gcgggggtgg gggaatccaa tctgggctgg ctgggctgga gaaggggagc gaagtgtggg 180
gcgtggggca acttctgcaa gttccaggga tggcgaaggg ggcaggggta cctcccggac 240
taggccttgg aacccgtgac ccccaaatat ttgtgaggag aaagagagag gaagagagac 300
gcaattttcg tttcgcgctg cccccgcccc gtcagcccca aactggaagg taaatactta 360
cttagcctcc gaaccaggta caagctaata ctcaacaata ctgatgcctt gttttttttg 420
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atggccacgg tgcgcccatt ggccgctggg ccccctacgt gcagcgccac gtcaccaaat 540
ctgaataagg atgcgcgaat tacgcggcga ccagacaaag atgaggatcc ggaccgcttg 600
a 601
<210> 232
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 232
tggctaggtc acaaaaaaac cttctgaaag gcaaaaattc cttcccaatg ggtctgaata 60
tgggtctgaa tattcctcca ctatctttgt cctggatttt aaacccacag cctttcttag 120
cagggacagg ccttagagat cgtccagttc cattttttcc cttcaggacg agtacactga 180
ggccaaaagg tgacgtgcct tccccacggt cgcgccactg cttagtggga gatgagccga 240
gaacggcctt tctcggaccg tccactacat tctcccctac tctacgcttc aatcttctcc 300
cgtgaaacct tcacttgctt ttctacaacg ttgacctaag gcggaaagcc gcgtgccaga 360
gtgggatggg agaggggagc tcacgctggg cccgaggggc ccgccggcag ccgcgcgccc 420
ctcgccggcc cgcgctcggg ctccccctag gggcaccatg ggcgacacgg gggtccccgc 480
gcgccgccct ctggacttac gtgactgtcg ctccccttcc agaagtagaa ggccccgatg 540
gccccaaaga gcagcagcac agctcccgaa atgaggacca cggctcccac cttgagcagc 600
c 601
<210> 233
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 233
gaatatatca aaatgagaac aagggggtaa gaaaattaac gatttcagtt gaacggagga 60
caggccaaac gaaagggagg caggcgggtg cgagcagagc ctggtagaga tcctggcggc 120
cgctagcctc tggcgctctt gccggtgttc aacgggctgc cagcgtccct gcggcagagc 180
ggacctcggc gcagcgcggc gcgcggtgga gcctggctgc ttgaggacag tcagccccca 240
gggccgcaca gcctacttgg tgggaagtgg cgggcgaaga gggaacccgc cttatttccc 300
ggtttttaaa ataaccggct cggagcgttt ccagtccaca cgagtgagcg cgcagctgcg 360
ccccatctgc ggcgcgatct ttcacgaggc tgggcagttg cgcgccccag agcctggcgc 420
acctcgctct tctcccgcct gcagtccgcc gcccgcgcag ccccaggccg ccctttgctg 480
agagcgccca gccttgctct gaacccaggc tgcgtgctgg cgctgccagc cactctcgcg 540
ccgtccgcgc ttggctagtc tgtcccgagt ttggctctga cgtcgaaaca cgccctcggc 600
a 601
<210> 234
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 234
cctcccgcct cagcctccca aagtggtgct gggattacag gcgtgagcca ctgtgccctg 60
ccgctagtct tctattttaa gtatttagtg gtaggtcccg ggccggcaga atctattttc 120
agcatttacc acgtgtggcg cgcaaaccac aggttttggc gattgggttg cgcgggatct 180
cagagctgac gccgcggggg cggctggggg tcccggtttc cgactggagc cgcgacgacc 240
ccggcgacgc gagcctgggg ctgcagcgag ggccggggag ctccccctcc atatgtgcgc 300
gcacattctc cagacttgct caaactaacc ccccggcagc gccagcgcgc tgcgggactg 360
atgatcaaat atttggtttc cgagataaca caccccgata gcgctgtttc ctgagccgct 420
ttcattctac ttgtgtaact tgctgcgaaa acccgaacca agtcaagaca gcaaactcac 480
gcccacgggc gctgtgtcaa catggaaata atgatactga agccccacgc tgggcacctg 540
gggcgtggac tgggggcgcg ggggaagcgc agatccgcct tcatgcttcc ccctcctgat 600
a 601
<210> 235
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 235
aatctccttt acaataaagc caaggggaga gaattaaaaa tctttgaagt agatcaaggc 60
tcaaaggaat cagccaagta gacttaaagt agtcacttat ttcccaaaac tggtttgtcg 120
gggaacaata aaaggaagta aaatttatgg agaaattata cagtggattt gtcacttaaa 180
atatcgtaac tgtctggagg acaatacccc atgctgagga ttaatggtcc cgccggacct 240
ttgattcacc agtgcctttt cttcgccctt gacaaattgg atttttagga atgggaaggt 300
cgcctggacc attgtgtgct agccattcag cggcctcgat tatgcagggg gctgagggaa 360
ccactccatg tgaccctctc gggtgggact ctgcagctgc ttcgcagcgc aactctctca 420
ccaaactccg cgcccttgcg ctagcggtgc caaaaggctc ccgccccgat tgaaaaggcg 480
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tggctagcgc gcagctccag ctctgtcact cgcgcccttc caaggacctg gagcacccga 600
g 601
<210> 236
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 236
tcgggacggg accggagctc gggcgcagac ggtgccacgg gagcgcgcag aaccctgagg 60
gatgctgccg ggcggaactg aaacccctcg caatgaactt tgaggaaagg ctttagcggt 120
tgaaatccac aaaagccttt aatatcctcc ctgaggcgcg caagagacaa aaatgacttt 180
agagcgactc cgacccgatt tcatcaccca cagacacaca aaaaccaacc acacagaaaa 240
agtacaaaac ccaatccgtg ctctttgtga aacactcatt taagacaata aagaagcagc 300
gctcagatgg gagaaaagat ttgcaaaaca atgaagtgaa atgatctcct ggaaaggatg 360
ggaagcagga gacaggagga gtgaaacgtc aggacttttc tccgcgcttc ggctccaccc 420
gggtgaccaa agccccacac ggctcagcgg gaagctccgc agtttcccct gcgcggcgaa 480
caccggtgtc ctcggcattc cgtcgccagg tcccggtccc aaaggcgctg gctgagggcc 540
ccacgttgat tcattgcatt ctggctctgc ttctgctgca ggactgtccc tggacggcgc 600
g 601
Claims (7)
1.一种乳腺癌相关的甲基化生物标记物的检测试剂盒，其特征是，包括有：针对生物标记物cg23035715引物和探针，还包括针对cg26371731，cg04541368和cg13973436的生物标记物的引物和探针；所述生物标记物cg23035715如SEQ ID NO.211所示，所述生物标记物
cg26371731如SEQ ID NO.212所示，所述生物标记物cg04541368如SEQ ID NO.213所示，
所述生物标记物cg13973436如SEQ ID NO.214所示。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌相关的甲基化生物标记物的检测试剂盒，其特征是，还
包括选自cg16304215，cg20072171，cg21501525，cg22778178，cg08599259，
cg25566568，cg15634980，cg07458308，cg01348584，cg14140881，cg25756435，cg00594560，cg18087672，cg14868703，cg17632299，cg18786873，cg20631750，
cg25924096，和cg15321298 中至少一种生物标记物的引物和探针；
所述生物标记物cg16304215如SEQ ID NO.215所示，
所述生物标记物cg20072171如SEQ ID NO.216所示，
所述生物标记物cg21501525如SEQ ID NO.218所示，
所述生物标记物cg22778178如SEQ ID NO.219所示，
所述生物标记物cg08599259如SEQ ID NO.220所示，
所述生物标记物cg25566568如SEQ ID NO.221所示，
所述生物标记物cg15634980如SEQ ID NO.222所示，
所述生物标记物cg07458308如SEQ ID NO.223所示，
所述生物标记物cg01348584如SEQ ID NO.224所示，
所述生物标记物cg14140881如SEQ ID NO.225所示，
所述生物标记物cg25756435如SEQ ID NO.226所示，
所述生物标记物cg00594560如SEQ ID NO.227所示，
所述生物标记物cg18087672如SEQ ID NO.230所示，
所述生物标记物cg14868703如SEQ ID NO.231所示，
所述生物标记物cg17632299如SEQ ID NO.232所示，
所述生物标记物cg18786873如SEQ ID NO.233所示，
所述生物标记物cg20631750如SEQ ID NO.234所示，
所述生物标记物cg25924096如SEQ ID NO.235所示，
所述生物标记物cg15321298如SEQ ID NO.236所示。
3.根据权利要求1或2所述的乳腺癌相关的甲基化生物标记物的检测试剂盒，其特征是，还包括针对内参基因的引物和探针。
4.根据权利要求2所述的乳腺癌相关的甲基化生物标记物的检测试剂盒，其特征是，还
包括选自cg16304215，cg20072171， cg21501525，cg22778178，cg08599259，
cg25566568，cg15634980，cg07458308，cg01348584，cg14140881，cg25756435，cg00594560，cg18087672，cg14868703，cg17632299，cg18786873，cg20631750，cg25924096，和cg15321298的引物和探针。
5.根据权利要求1或2所述的乳腺癌相关的甲基化生物标记物的检测试剂盒，其特征是，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括DNATaq聚合酶、dNTPs、Mg2+和10× DNA聚合酶buffer。
6.根据权利要1或2所述的乳腺癌相关的甲基化生物标记物的检测试剂盒，其特征是，所述检测试剂盒检测的待测样本是血液、血清或血浆。
7.根据权利要1或2所述的乳腺癌相关的甲基化生物标记物的检测试剂盒，其特征是，
还包括引物混合液，在扩增体系中，其中每条引物浓度为300±10nM；镁离子的浓度为
1.5±0.1 mM, dNTP 混合液浓度为400±10uM；反应酶为Phusion U；引物探针混合液，
在多重荧光定量PCR反应中：其中各引物浓度为900±10nM；探针浓度为200±10nM。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
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Denomination of invention: Kit for detecting specific methylation of breast tumor Effective date of registration: 20220314 Granted publication date: 20211130 Pledgee: Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch Pledgor: ANCHORDX MEDICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2022440000042 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
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Date of cancellation: 20230420 Granted publication date: 20211130 Pledgee: Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch Pledgor: ANCHORDX MEDICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2022440000042 |