CN113943813A - 用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用，用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合包括与膀胱癌人群早期甲基化位点相关的3对靶标特异引物、3个特异性引物探针及对应的内参引物、内参引物探针。与现有技术相比，本发明最终筛选出3对可以在甲基化敏感内切酶的辅助下对HOXB13基因甲基化水平进行判定的PCR效率高，特异性强，稳定性好的引物及对应探针序列，检测简单易行、判读客观，避免了人为判读结果的主观性，提高了准确率；可以区分胃癌患者与健康人群，用于肿瘤的早期筛查、早期诊断、疗效评价和追踪以及预后评估。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用。
背景技术
胃癌的发病率在全世界范围内排在前列，由于胃癌在组织学和病因学上具有非常高的异质性，不同的治疗方案在临床上也产生各种各样的结果。因此如何准确的预测胃癌病人的生存和预后风险具有非常重要的临床意义。
胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显高，年龄在50岁以上，男女发病率比为2：1。胃癌可发生于位的任何部位，胃大弯、胃小弯、前后壁均可受累。早期胃癌预后较中晚期胃癌更好治疗，因此，诊断早期胃癌极为重要。目前早期胃癌的诊断主要依赖于内镜技术，但内镜技术属于侵入性检查，存在痛苦大、费用高等局限性，因此收筛查条件、人群、接受程度及就医成本的制约，尚无法成为大规模筛查的检测手段。
发明内容
针对以上述背景技术的不足，本发明提供一种用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用，解决了胃部肿瘤检测敏感度低，特异性差，避免膀胱镜检查引发的并发症的问题。
本发明采用的技术方案如下：用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合，关键在于：包括与膀胱癌人群早期甲基化位点相关的3对靶标特异引物、3个特异性引物探针及对应的内参引物、内参引物探针；其中所述3对靶标特异引物的序列如下：
Seq ID NO.1：F-TCGCCACCGACCCCACTAC，
Seq ID NO.2：R-GCATTCTCCACGATTGAGCGCACAG；
Seq ID NO.3：F-GAGATCTTGCGCCTCTTGTCCTTG，
Seq ID NO.4：R-CAAGAAACGCATTCCGTACAGC；
Seq ID NO.5：F-TTGACAGCAGGCATCAGCGTA，
Seq ID NO.6：R-CCAAGGATATCGAAGGCTTGCTGG；
内参引物的序列如下：
Seq ID NO.7：F-GGTGCCAGATTTTCTCCATGTCGTC，
Seq ID NO.8：R-ACGAGGCCCAGAGCAAGAGA；
所述特异性引物探针序列如下：
Seq ID NO.9：FAM-ACAACCCGCAGAACCGAAGCTCC-BHQ1，
Seq ID NO.10：FAM-TTGTTAGCCGCATACTCCCGCTCC-BHQ1；
Seq ID NO.11：FAM-TCGCCCACTCCCCTCTGACC-BHQ1；
内参引物探针序列如下：
Seq ID NO.12：VIC-TACCCCATCGAGCACGGCATCGTC-BHQ1。
用于膀胱癌早期筛查的试剂盒，关键在于：包括用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合及甲基化敏感内切酶体系。
优选的，所述甲基化敏感内切酶体系包含HinP1I、HpaII、AciI。
试剂盒在制备膀胱癌早期筛查试剂中的应用，关键在于筛查方法包括以下步骤：
S1.提取尿液中游离的cfDNA；
S2.将cfDNA与甲基化敏感内切酶体系在37℃下孵育；
S3.将孵育产物作为模板，加入如权利要求3所述的试剂盒中的3对靶标特异引物及内参引物，进行多重PCR扩增；
S4.将扩增产物作为模板，加入如权利要求3所述的试剂盒中的3对靶标特异引物、3个特异性引物探针、内参引物探针及内参引物，进行qPCR检测反应；
S5.根据3对靶标特异引物与内参引物的Ct值之差ΔCt，评估膀胱癌风险；所述S5的评估方式为：
ΔCt＝3对引物特异扩增Ct值-内参引物扩增Ct值；
ΔCt>4.89胃部肿瘤低风险；
ΔCt≤4.89胃部肿瘤高风险。
优选的，所述S1具体为：采用Qiagen血浆游离DNA提取试剂盒提取尿液中的cfDNA。
优选的，所述S2的孵育条件为：37℃孵育16h，在80℃酶失活20min。
优选的，所述S3的扩增程序为：98℃/45s，8个循环；98℃/15s，55℃/30s，72℃/30s，8个循环；72℃/1min，1个循环；4℃/hold。
根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S4的qPCR检测反应程序为：95℃/3min，1个循环；98℃/15s，60℃/60s，45个循环。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过对比胃癌与癌变甲基化数据，筛选中国人群胃部肿瘤早期基因组超甲基化区域，并与白细胞基因组对应区域进行比对，发现HOXB13基因区域在胃部肿瘤中呈现超甲基化状态，而在白细胞中呈现低甲基化状态。针对该区域选择含有CCGC,CCGG,GCGC,ACGT,GCGG中至少两个位点的区间作为靶点设计若干对PCR引物，最终筛选出3对可以在甲基化敏感内切酶的辅助下对HOXB13基因甲基化水平进行判定的PCR效率高，特异性强，稳定性好的引物及对应探针序列；
2.利用甲基化敏感内切酶不能切割甲基化位点的特性，降解非肿瘤来源cfDNA，特异扩增肿瘤来源ctDNA极大提升检查灵敏度，克服了单个DNA甲基化信号低的问题，提高了检测的灵敏度及特异性；
3.基于DNA甲基化的检测简单易行、判读客观，避免了人为判读结果的主观性，提高了准确率；可以区分胃癌患者与健康人群，用于肿瘤的早期筛查、早期诊断、疗效评价和追踪以及预后评估。
附图说明
图1为基于本发明的风险判定图；
图2为基于本发明的分类性能AUC曲线图；
图3为基于本发明的风险模型测试图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
实施例1用于膀胱癌早期筛查的试剂盒
包括Qiagen血浆游离DNA提取试剂盒、包含HinP1I、HpaII、AciI的甲基化敏感内切酶体系、3对靶标特异引物及内参引物、3对特异性引物探针、内参引物探针及内参引物探针；
其中其中所述4对靶标特异引物的序列如下：
Seq ID NO.1：F-TCGCCACCGACCCCACTAC，
Seq ID NO.2：R-GCATTCTCCACGATTGAGCGCACAG；
Seq ID NO.3：F-GAGATCTTGCGCCTCTTGTCCTTG，
Seq ID NO.4：R-CAAGAAACGCATTCCGTACAGC；
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Seq ID NO.6：R-CCAAGGATATCGAAGGCTTGCTGG；
内参引物的序列如下：
Seq ID NO.7：F-GGTGCCAGATTTTCTCCATGTCGTC，
Seq ID NO.8：R-ACGAGGCCCAGAGCAAGAGA；
所述特异性引物探针序列如下：
Seq ID NO.9：FAM-ACAACCCGCAGAACCGAAGCTCC-BHQ1，
Seq ID NO.10：FAM-TTGTTAGCCGCATACTCCCGCTCC-BHQ1；
Seq ID NO.11：FAM-TCGCCCACTCCCCTCTGACC-BHQ1；
内参引物探针序列如下：
Seq ID NO.12：VIC-TACCCCATCGAGCACGGCATCGTC-BHQ1。
实施例2检测ctDNA甲基化水平变化的方法
1.取5mL血浆，采用Qiagen血浆游离DNA提取试剂盒(Cat：55204)提取游离cfDNA；
2.取20ngcfDNA与20μLHinP1I、HpaII、AciI三种甲基化敏感内切酶体系(终浓度10U/μL)，于37℃孵育16h，80℃酶失活20min；
3.将孵育完成的全部产物作为模板，3对靶标特异引物(每种50nM)加1个内参引物(10nM)配置体系，设置以下表1设定程序在普通PCR仪中进行扩增程序；
表1
4.取上步扩增产物1μL做为模板，加入3对靶标特异引物(每种0.25μM)，3个特异性引物探针(每种0.1μM)加1个内参引物(0.05μM)及内参引物探针(0.02μM)，设置以下表2设定程序在ABI7500荧光PCR仪中进行qPCR反应，每轮循环结束前采集FAM及VIC通道信号；
表2
根据内参引物与3对靶标特异引物的Ct值之差ΔCt，如图1所示，评估膀胱癌风险，ΔCt＝3对引物特异扩增Ct值-内参引物扩增Ct值；
ΔCt>4.89胃部肿瘤低风险；
ΔCt≤4.89胃部肿瘤高风险。
对40例健康者和34例Ⅰ-III期胃部肿瘤患者的血液样本同时采用本发明评估胃部肿瘤风险性能，样本信息和测试结果如下表3所示：
表3
将表3中的数据导入到Graphpadprism 6.0软件中，自动生成ROC曲线，并统计曲线下面积AUC值(图2)，横坐标为1-特异度，纵坐标为敏感度，软件统计结果以ΔCt≤4.89为阈值，分类器敏感度70.59％，特异度95.00％；
以ΔCt≤4.89为阈值，构建风险模型，将40例健康者和34例Ⅰ-III期胃部肿瘤患者进行胃部肿瘤风险等级评估(图3)。
最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合，其特征在于：包括与膀胱癌人群早期甲基化位点相关的3对靶标特异引物、3个特异性引物探针及对应的内参引物、内参引物探针；其中所述3对靶标特异引物的序列如下：
Seq ID NO.1：F-TCGCCACCGACCCCACTAC，
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Seq ID NO.3：F-GAGATCTTGCGCCTCTTGTCCTTG，
Seq ID NO.4：R-CAAGAAACGCATTCCGTACAGC；
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Seq ID NO.6：R-CCAAGGATATCGAAGGCTTGCTGG；
内参引物的序列如下：
Seq ID NO.7：F-GGTGCCAGATTTTCTCCATGTCGTC，
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所述特异性引物探针序列如下：
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Seq ID NO.11：FAM-TCGCCCACTCCCCTCTGACC-BHQ1；
内参引物探针序列如下：
Seq ID NO.12：VIC-TACCCCATCGAGCACGGCATCGTC-BHQ1。
2.用于膀胱癌早期筛查的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的用于胃部肿瘤筛查的生物标志物组合及甲基化敏感内切酶体系。
3.根据权利要求2所述用于膀胱癌早期筛查的试剂盒，其特征在于：所述甲基化敏感内切酶体系包含HinP1I、HpaII、AciI。
4.根据权利要求3所述的试剂盒在制备膀胱癌早期筛查试剂中的应用，其特征在于筛查方法包括以下步骤：
S1.提取尿液中游离的cfDNA；
S2.将cfDNA与甲基化敏感内切酶体系在37℃下孵育；
S3.将孵育产物作为模板，加入如权利要求3所述的试剂盒中的3对靶标特异引物及内参引物，进行多重PCR扩增；
S4.将扩增产物作为模板，加入如权利要求3所述的试剂盒中的3对靶标特异引物、3个特异性引物探针、内参引物探针及内参引物，进行qPCR检测反应；
S5.根据3对靶标特异引物与内参引物的Ct值之差ΔCt，评估膀胱癌风险；所述S5的评估方式为：
ΔCt＝3对引物特异扩增Ct值-内参引物扩增Ct值；
ΔCt>4.89胃部肿瘤低风险；
ΔCt≤4.89胃部肿瘤高风险。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S1具体为：采用Qiagen血浆游离DNA提取试剂盒提取尿液中的cfDNA。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S2的孵育条件为：37℃孵育16h，在80℃酶失活20min。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S3的扩增程序为：98℃/45s，8个循环；98℃/15s，55℃/30s，72℃/30s，8个循环；72℃/1min，1个循环；4℃/hold。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述S4的qPCR检测反应程序为：95℃/3min，1个循环；98℃/15s，60℃/60s，45个循环。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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