CN114182019B - 用于血液septin9基因甲基化检测的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的方法和试剂盒，该试剂盒中包括用于检测血浆中SEPTIN9基因甲基化程度的引物、探针组合，本检测方法基于Tet1酶及吡啶硼烷特异性将血浆中的ctDNA上甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而不影响未甲基化的胞嘧啶。通过多重荧光PCR方法检测SEPTIN9基因甲基化程度，可用于结直肠癌和肝癌的早期筛查、诊断，具有较好的灵敏度和准确度。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的方法和试剂盒。
背景技术
直肠癌(colorectalcancer，CRC)是来源于结直肠黏膜上皮的癌性病变，其发病率逐年攀升。CRC预后与早期诊断密切相关，大多数早期CRC可以治愈，5年生存率可达90％，而晚期则不足10％。内镜是早期诊断的主要手段，然而在中国，人群对于结肠镜检查的依从性较低，如何筛选出高危人群进行结肠镜检查是提高CRC早期诊断率的重点。由于CRC隐匿性较强，目前早期检出率仅为5％～10％，严重影响了该病的诊治效果。故临床上急需一种高效便捷的CRC早期筛查方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的方法和试剂盒，所述血液SEPTIN9基因甲基化检测的试剂盒检测结果准确，且
为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的试剂盒，包括第一靶标特异引物对、第一特异性引物探针、第二靶标特异引物对、第二特异性引物探针、第三靶标特异引物对、第三特异性引物探针、第四靶标特异引物、第四特异性引物探针以及内参引物对以及内参引物探针，其中，第一靶标特异引物对、第一特异性引物探针、第二靶标特异引物对、第二特异性引物探针、第三靶标特异引物对、第三特异性引物探针、第四靶标特异引物、第四特异性引物探针的序列如下：
第一靶标特异引物对：
Seq ID NO.1F CTGCCCTCTGTGTGACCTG；
Seq ID NO.1R CCATCCAGCTGCACATTGACCA；
第一特异性引物探针：
Seq ID NO.1P FAM-CCCACCAGCCATCATGTTGGACC-BHQ1；
第二靶标特异引物对：
Seq ID NO.2F AGCTGGATGGGATCATTTTGGACT；
Seq ID NO.2R CACACCAGGCCCACCCACA；
第二特异性引物探针：
Seq ID NO.2P FAM-TCCTCTCCAGCACATCCACAGCCACA-BHQ1；
第三靶标特异引物对：
Seq ID NO.3F GATGGGACCCCTAATCCAGGTG；
Seq ID NO.3R CCCCCACATAGGCAGCACAG；
第三特异性引物探针：
Seq ID NO.3P FAM-CAGGGGCACACAGCACTCTCAGC-BHQ1；
第四靶标特异引物对：
Seq ID NO.4F TGCCTGTGCTGCCTATGTGG；
Seq ID NO.4R CCAGGCAGCAGTGCACAGAA；
第四特异性引物探针：
Seq ID NO.4P FAM-TAGGGGCACCTGTGTAGACCCTG-BHQ1。
进一步地，所述内参引物对以及内参引物探针的序列如下：
内参引物对：
Seq ID NO.5F GGTGCCAGATTTTCTCCATGTCGTC；
Seq ID NO.5R ACGAGGCCCAGAGCAAGAGA；
内参引物探针：
Seq ID NO.5P VIC-TACCCCATCGAGCACGGCATCGTC-BHQ1。
同时，本发明还提供一种用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的试剂盒在用于筛查、诊断、治疗癌症疾病中的应用。
进一步地，所述癌症选自直肠癌(包括Ras突变)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、卵巢癌、转移性乳癌、胰腺癌、肝胆癌(包括肝细胞癌、胆道癌和胆管癌)、胃癌、睾丸癌、头和颈鳞状细胞癌、白血病(包括急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、宫颈癌、淋巴瘤(包括套细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤)和前列腺癌。
更进一步地，直肠癌(包括Ras突变)、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌和前列腺癌。
第二方面，本发明还提供一种用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的方法，采用如权利要求1-2任意一项所述的用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的试剂盒对SEPTIN9基因甲基化进行检测。
进一步地，该方法具体包括以下步骤：
(1)从血浆中提取总cfDNA；
(2)加入Tet1酶和吡啶硼烷先后与cfDNA孵育，使甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
(3)加入多重PCR引物进行扩增，收集特异引物组FAM信号以及内参引物VIC信号，通过计算特异引物与内参引物ct值之差得到ΔCt，以此判断血液SEPTIN9基因甲基化水平。
第三方面，本发明还提供一种预测癌症风险的方法，具体包括以下步骤：
S1：从血浆中提取总cfDNA；
S2：加入Tet1酶和吡啶硼烷先后与cfDNA孵育，使甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
S3：加入多重PCR引物进行扩增，收集特异引物组FAM信号和内参引物VIC信号；
S4：判断特异引物与内参引物ct值之差是否超过阈值，以预测癌症风险。与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的一种用于血液SEPTIN9基因甲基化检测试剂盒，所述血液SEPTIN9基因甲基化检测试剂盒中包括用于检测血浆中SEPTIN9基因甲基化程度的引物、探针组合。本检测方法基于Tet1酶及吡啶硼烷特异性将血浆中的ctDNA上甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而不影响未甲基化的胞嘧啶，与重亚硫酸盐转化相比不会引起核酸降解，具有更高的灵敏度和特异性。通过多重荧光PCR方法检测SEPTIN9基因甲基化程度，操作方法简单，可用于结直肠癌和肝癌的早期筛查、诊断，具有较好的灵敏度和准确度。
附图说明
图1为本发明一实施例提供采用本发明方法检测与BS转化法检测同一份结直肠癌患者血浆样品的检测结果对比；
图2为本发明一实施例提供的采用4对特异性引物多重扩增与1对特异性引物分别扩增的检测效果对比；
图3为本发明一实施例提供的采用本发明的试剂盒和检测方法对10对结直肠癌组织与癌旁样本进行检测的检测结果；
图4为本发明一实施例提供的采用本发明的试剂盒和检测方法健康人群和Ⅰ-Ⅲ期结直肠癌血浆患者进行检测的检测结果；
图5为本发明一实施例提供的早期结直肠癌风险检测方法的ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的试剂盒的组成，包括第一靶标特异引物对、第一特异性引物探针、第二靶标特异引物对、第二特异性引物探针、第三靶标特异引物对、第三特异性引物探针、第四靶标特异引物、第四特异性引物探针以及内参引物对以及内参引物探针，其中，第一靶标特异引物对、第一特异性引物探针、第二靶标特异引物对、第二特异性引物探针、第三靶标特异引物对、第三特异性引物探针、第四靶标特异引物、第四特异性引物探针的序列如下：
第一靶标特异引物对：
Seq ID NO.1F CTGCCCTCTGTGTGACCTG；
Seq ID NO.1R CCATCCAGCTGCACATTGACCA；
第一特异性引物探针：
Seq ID NO.1P FAM-CCCACCAGCCATCATGTTGGACC-BHQ1；
第二靶标特异引物对：
Seq ID NO.2F AGCTGGATGGGATCATTTTGGACT；
Seq ID NO.2R CACACCAGGCCCACCCACA；
第二特异性引物探针：
Seq ID NO.2P FAM-TCCTCTCCAGCACATCCACAGCCACA-BHQ1；
第三靶标特异引物对：
Seq ID NO.3F GATGGGACCCCTAATCCAGGTG；
Seq ID NO.3R CCCCCACATAGGCAGCACAG；
第三特异性引物探针：
Seq ID NO.3P FAM-CAGGGGCACACAGCACTCTCAGC-BHQ1；
第四靶标特异引物对：
Seq ID NO.4F TGCCTGTGCTGCCTATGTGG；
Seq ID NO.4R CCAGGCAGCAGTGCACAGAA；
第四特异性引物探针：
Seq ID NO.4P FAM-TAGGGGCACCTGTGTAGACCCTG-BHQ1。
内参引物对以及内参引物探针的序列如下：
内参引物对：
Seq ID NO.5F GGTGCCAGATTTTCTCCATGTCGTC；
Seq ID NO.5R ACGAGGCCCAGAGCAAGAGA；
内参引物探针：
Seq ID NO.5P VIC-TACCCCATCGAGCACGGCATCGTC-BHQ1。
实施例2
本实施例采用同一直肠癌患者血浆样品作为待测样品，分别采用本发明方法与BS转化法进行检测，
其中，BS转化法的检测操作如下：
本实施例采用BS转化法对血液SEPTIN9基因甲基化进行检测，具体包括以下步骤：
(1)采取5mL血浆，Qiagen血浆游离DNA提取试剂盒(Cat:55204)提取cfDNA。
(2)取20ng cfDNA使用EZ DNA Methylation-Gold kit(Cat:D5005)处理。
(3)配置qPCR体系，具体组成见下表：
(4)在ABI 7500仪器上进行检测，qPCR反应程序为：95℃/3min；40cycle(98℃/15s，60℃/60s)；每轮循环结束前采集FAM及VIC通道信号。
本发明的检测方法如下：
(1)取5mL血浆样品，使用Qiagen血浆游离DNA提取试剂盒(Cat:55204)提取cfDNA；
(2)取20ng提取后cfDNA加入Tet1酶及缓冲液进行孵育，孵育温度37℃，孵育温度80min，孵育体系如下；
上步反应完成后加入1U蛋白酶K，于50℃下孵育60min；
上述体系反应完成后加入醋酸钠及吡啶硼烷孵育，37℃下孵育16h，孵育体系如下：
反应完成后向体系中加入20μL 0.5M Tris-HCl，加入磁珠进行核酸纯化；
(3)取纯化后核酸配置qPCR体系，每反应加入4对靶标特异引物(每种0.25μM)，以及对应的4个特异性引物探针(每种0.1μM)，再加1对内参引物(0.05μM)，及内参引物探针(0.02μM)，并在ABI 7500仪器上进行检测，qPCR反应程序为：95℃/3min；40cycles(98℃/15s，60℃/60s)；每轮循环结束前采集FAM及VIC通道信号，扩增体系如下：
两种方法的检测结果如附图1所示，本发明方法出峰时间更早，灵敏度更高。
实施例3
本实施例设置一组实验组和四组对照组，实验组采用本发明提供的试剂盒中的4对特异性引物进行多重扩增，每个对照组仅采用本发明提供的4组特异性引物中的一组特异性引物分别进行扩增，对实验组和四个对照组的扩增效果对比，实验结果如附图2所示。
实验结果表明，本实施例中的实验组较对照组的多重扩增出峰时间更早，检测灵敏度更高。
实施例4
本实施例采用本发明提供的一种用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的方法及试剂盒对10对结直肠癌组织与癌旁样本进行检测，该用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的方法及试剂盒能很好区分两种样品来源。
检测结果如附图3所示。
实施例5
本实施例共采用59例健康人及87例Ⅰ-Ⅲ期结直肠癌血浆作为待检样品，分别采用本发明提供的试剂盒以及检测方法进行检测，具体检测方法如下：
(1)检测使用Qiagen血浆游离DNA提取试剂盒(Cat:55204)提取cfDNA；
(2)取20ng提取后cfDNA加入Tet1酶及缓冲液进行孵育，孵育温度37℃，孵育温度80min，孵育体系如下；
上步反应完成后加入1U蛋白酶K，于50℃下孵育60min；
上述体系反应完成后加入醋酸钠及吡啶硼烷孵育，37℃下孵育16h，孵育体系如下：
反应完成后向体系中加入20μL 0.5M Tris-HCl，加入磁珠进行核酸纯化；
(3)取纯化后核酸配置qPCR体系，每反应加入4对靶标特异引物(每种0.25μM)，以及对应的4个特异性引物探针(每种0.1μM)，再加1对内参引物(0.05μM)，及内参引物探针(0.02μM)，并在ABI 7500仪器上进行检测，qPCR反应程序为：95℃/3min；40cycles(98℃/15s，60℃/60s)；每轮循环结束前采集FAM及VIC通道信号，计算特异引物与内参引物ct值之差得到ΔCt。扩增体系如下：
检测结果如附图4所示，本发明提供的用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的方法以及试剂盒能够较好地区分区分健康人群和癌症患者。
将检测数据数据导入到Graphpad prism 6.0软件中，自动生成ROC曲线且生成的ROC曲线如附图5所示，并统计曲线下面积AUC值，AUC＝0.927。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
序列表
<110> 北京求臻医学检验实验室有限公司
<120> 用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的方法和试剂盒
<141> 2021-12-23
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctgccctctg tgtgacctg 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ccatccagct gcacattgac ca 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
agctggatgg gatcattttg gact 24
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cacaccaggc ccacccaca 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gatgggaccc ctaatccagg tg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cccccacata ggcagcacag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tgcctgtgct gcctatgtgg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ccaggcagca gtgcacagaa 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ggtgccagat tttctccatg tcgtc 25
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
acgaggccca gagcaagaga 20
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cccaccagcc atcatgttgg acc 23
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
tcctctccag cacatccaca gccaca 26
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
caggggcaca cagcactctc agc 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
taggggcacc tgtgtagacc ctg 23
Claims (4)
1.用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的试剂盒，其特征在于；包括多重PCR引物，所述多重PCR引物包括第一靶标特异引物对、第一特异性引物探针、第二靶标特异引物对、第二特异性引物探针、第三靶标特异引物对、第三特异性引物探针、第四靶标特异引物以及第四特异性引物探针，其中，第一靶标特异引物对、第一特异性引物探针、第二靶标特异引物对、第二特异性引物探针、第三靶标特异引物对、第三特异性引物探针、第四靶标特异引物、第四特异性引物探针的序列如下：
第一靶标特异引物对：
Seq ID NO.1F CTGCCCTCTGTGTGACCTG；
Seq ID NO.1R CCATCCAGCTGCACATTGACCA；
第一特异性引物探针：
Seq ID NO.1P FAM-CCCACCAGCCATCATGTTGGACC-BHQ1；
第二靶标特异引物对：
Seq ID NO.2F AGCTGGATGGGATCATTTTGGACT；
Seq ID NO.2R CACACCAGGCCCACCCACA；
第二特异性引物探针：
Seq ID NO.2P FAM-TCCTCTCCAGCACATCCACAGCCACA-BHQ1；
第三靶标特异引物对：
Seq ID NO.3F GATGGGACCCCTAATCCAGGTG；
Seq ID NO.3R CCCCCACATAGGCAGCACAG；
第三特异性引物探针：
Seq ID NO.3P FAM-CAGGGGCACACAGCACTCTCAGC -BHQ1；
第四靶标特异引物对：
Seq ID NO.4F TGCCTGTGCTGCCTATGTGG；
Seq ID NO.4R CCAGGCAGCAGTGCACAGAA；
第四特异性引物探针：
Seq ID NO.4P FAM-TAGGGGCACCTGTGTAGACCCTG-BHQ1。
2.如权利要求1所述的用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的试剂盒，其特征在于，还包括内参引物对以及内参引物探针，所述内参引物对和内参引物探针的序列如下：
内参引物对：
Seq ID NO.5F GGTGCCAGATTTTCTCCATGTCGTC；
Seq ID NO.5R ACGAGGCCCAGAGCAAGAGA；
内参引物探针：
Seq ID NO.5P VIC-TACCCCATCGAGCACGGCATCGTC-BHQ1。
3.用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的方法，其特征在于，采用如权利要求2所述的用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的试剂盒对SEPTIN9基因甲基化进行检测，所述方法为以非疾病诊断、治疗为目的。
4.如权利要求3所述的用于血液SEPTIN9基因甲基化检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从血浆中提取总cfDNA；
（2）加入Tet1酶和吡啶硼烷先后与cfDNA孵育，使甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
（3）加入多重PCR引物进行扩增，收集特异引物组FAM信号以及内参引物VIC信号，通过计算特异引物与内参引物ct值之差得到ΔCt，以此判断血液SEPTIN9基因甲基化水平。
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2021
- 2021-12-23 CN CN202111620152.8A patent/CN114182019B/zh active Active
Patent Citations (5)
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| Title |
|---|
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Also Published As
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|---|---|
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