CN110527721B

CN110527721B - 一种陈旧性结核病标志物及其应用

Info

Publication number: CN110527721B
Application number: CN201910851826.1A
Authority: CN
Inventors: 喻德华; 曹艳华; 毛玉
Original assignee: Shenzhen You Shengkang Bioscience Co ltd
Current assignee: Shenzhen You Shengkang Bioscience Co ltd
Priority date: 2019-09-10
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2039-09-10
Also published as: CN110527721A

Abstract

本发明提供了一种陈旧性结核病标志物及其应用，所述陈旧性结核病标志物包括BATF2和B3GALTL基因，其应用优选包括实时定量PCR、基因芯片检测、治疗结核病的药物中的任一种。经实验证明，BATF2和B3GALTL基因在陈旧性结核感染者血液的表达量远低于活动性结核感染者血液和健康人血液中的表达量，因此，BATF2和B3GALTL基因可作为陈旧性结核病标志物，有效区分陈旧性结核病和非陈旧性结合病，为结合病的治疗与预后诊断提供依据。

Description

一种陈旧性结核病标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种结核病标志物及其应用，尤其涉及一种陈旧性结核病标志物及其应用。

背景技术

由结核杆菌引起的结核病是第九大传染病，每年致死人数比艾滋病还要多。在2016年，共有一百三十万结核病人死亡，其中90％是成人，65％是男性。结核病同时也是一种常见的艾滋病引起的并发症。在2017年，全球共有一千八百名HIV感染者死于肺结核引起的并发症。除此之外，虽然世界各国的医药卫生水平不断发展，但是近些年来由于耐药结核杆菌(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)引发的结核病可以对抗包括利福平(rifampicin)在内的多种抗生素，结核病仍然是一种严重的威胁。尽管如此，人们发现大部分的结核病如果在早期确诊的话可以很大程度上被治愈。因此快速准确的早期确诊方法对于降低结核病的死亡率至关重要，然而目前使用的传统确诊方法，例如痰培养等，都需要2-3天。

CN107523626A公开了一种用于活动性肺结核无创诊断的外周血基因标记物，该标记物为包括GBP5基因在内的56个基因，并且根据该组外周血基因标记物设计引物，所设计的引物可用于活动性肺结核的无创诊断。该发明可区分肺结核病人与正常人群、肺结核病人与其他肺部疾病人群、肺结核病人与潜在肺结核感染个人，并可作为检测抗结核疗效的指标。

US20150315643A1公开了包括GBP5基因在内的48个基因与肺结核的关系，ANKRD22、FCGR1A、SERPING1、BATF2、FCGR1C、FCGR1B、LOC728744、IFITM3、EPSTI1、GBP5、IF144L、GBP6、GBP1、LOC400759、IFIT3、AIM2、SEPT4、C1QB、GBP1、RSAD2、RTP4、CARD17、IFIT3、CASP5、CEACAM1、CARD17、ISG15、IF127、TIMM10、WARS、IF16、TNFAIP6、PSTPIP2、IF144、SCO2、FBXO6、FER1L3、CXCL10、DHRS9、OAS1、STAT1、HP、DHRS9、CEACAM1、SLC26A8、CACNA1E、OLFM4和APOL6。

但现有技术中多为针对活动性结核病进行检测，但非活动性结核不等同于陈旧性结核，且检测标志物过多显著增加时间和经济成本。因此，亟待提供一种结核病标志物快速鉴别陈旧性结核与非陈旧性结核，为临床提供依据。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种陈旧性结核病标志物及其应用。本发明的结核病标志物检测灵敏度高，特异性好，可以有效区分陈旧性结核病和非陈旧性结核病，为结核病的治疗与预后判断提供基础。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种陈旧性结核病标志物，所述陈旧性结核病标志物包括BATF2和B3GALTL基因。

本发明中，通过对健康人与陈旧性结核病人的差异表达基因分析，发现BATF2和B3GALTL基因在陈旧性结核病人中的表达量远低于活动性结核病感染者组织和健康人中的表达量。经qPCR验证，所述两个基因可作为鉴别陈旧性结核病的标志物组合，且具有较高的特异性和灵敏度，显著缩短检测时间，为临床诊断和治疗提供依据。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述陈旧性结核病标志物在制备检测陈旧性结核病的产品中的应用。

优选地，所述产品包括试剂盒、检测试剂、装置、检测芯片、或诊断和/或治疗陈旧性结核病的药物中的任一种。

第三方面，本发明提供一种鉴别陈旧性结核病的试剂盒，包括检测BATF2和B3GALTL基因的试剂。

所述试剂可以是引物、探针或其他可以检测BATF2和B3GALTL基因相对表达量的试剂或物质。

第四方面，本发明提供一种鉴别陈旧性结核病的装置，所述装置包括如下(a1)和(a2)所示的功能的模块：

(a1)分别检测待测者组织样本中BATF2和B3GALTL基因的相对表达量，然后根据如下公式计算待测样本的两种基因的联合表达量，其中基因名称代表该基因的表达量：

联合表达量＝-6.53428212+0.26172894*BATF2+0.84170131*B3GALTL；

(a2)根据所述联合表达量计算P值，根据P值大小鉴别陈旧性结核病，其中P值＝1/(1+e^{-联合表达量})。

本发明中，所述装置包括两个功能模块，先通过两个基因的相对表达量计算出联合表达量的值，再计算得到P值，P值即为待测者为陈旧性结核阴性的几率。虽然BATF2已有现有报道其与结核病的关系，但尚未见B3GALTL基因与结核病的潜在联系，且发明人验证发现，单独的BATF2和B3GALTL基因的表达量均与陈旧性结核明显相关，但二者联合检测时特异性最高，灵敏度最好。

第五方面，本发明提供一种非疾病诊断治疗目的的鉴别陈旧性结核病的方法，包括如下步骤：

(1)分别检测如第一方面所述陈旧性结核病标志物的相对表达量，计算两种基因的联合表达量，计算公式如第四方面中所述模块(a1)所示；

(2)根据步骤(1)所得联合表达量分计算对应的P值，计算公式如第四方面所述模块(a2)所示。

优选地，步骤(1)所述检测的方法包括PCR、基因组测序或基因芯片中的任一种或至少两种的组合。

本发明中，PCR、基因组测序或基因芯片检测均可以检测BATF2和B3GALTL基因相对表达量，其中PCR为本领域技术人员公知的聚合酶链式反应，以其为基础衍生出的各种PCR方式也在本发明的保护范围之内。

第六方面，本发明提供一种鉴别陈旧性结核病的系统，包括检测如第一方面所述陈旧性结核病标志物的相对表达量的试剂和/或如第四方面所述的鉴别陈旧性结核病的装置。

第七方面，本发明提供一种诊断和/或治疗结核病的药物，所述药物的靶点为BATF2和B3GALTL基因。

第八方面，本发明提供一种如第一方面所述的陈旧性结核病标志物、第三方面所述的试剂盒、第四方面所述的装置、第五方面所述的方法、第六所述鉴别陈旧性结核病的系统、第七方面所述的药物在制备监测结核病发生或发展的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的陈旧性结核病标志物可辅助指示陈旧性结核的发生和发展，且仅检测BATF2和B3GALTL基因的相对表达量即可鉴定陈旧性结核病，降低了时间和经济成本；

本发明提供的陈旧性结核病标志物可采用血液样本进行实时定量PCR或基因芯片检测，取样方便，操作简单，实时定量PCR检测时间缩短至8小时。

附图说明

图1为实施例2中BATF2基因在不同人群中的ΔΔCt值；

图2为实施例2中B3GALTL基因在不同人群中的ΔΔCt值；

图3为实施例3中BATF2基因区分陈旧性结核感染者与非陈旧性结核感染者的ROC曲线；

图4为实施例3中B3GALTL基因区分陈旧性结核感染者与非陈旧性结核感染者的ROC曲线；

图5为实施例3中BATF2和B3GALTL基因联合区分陈旧性结核感染者与非陈旧性结核感染者的ROC曲线。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1芯片法筛选差异表达基因

1、供试者

(1)芯片筛选：3例经临床确诊的活动性结核病患者(T)，3例经临床确诊的陈旧性结核感染者(M)和3例健康人(H)供试者均为自愿参与。

(2)RT-PCR验证：

供试者共43人，用于验证BATF2和B3GALTL基因，其中包括26例经临床确诊的活动性结核病患者(T)，9例经临床确诊的陈旧性结核感染者(M)和8例健康人(H)。

2、芯片筛选差异表达基因

使用Thermo Fisher Scientific公司PrimeView Human Gene Expression Array(普瑞麦迪(北京)实验室技术有限公司)对供试者外周血单个核细胞进行基因芯片分析，分析的具体步骤参照芯片使用说明书，经P<0.05，Fold change>2标准筛选获得差异基因表达谱。

按照组间差异倍数Fold change>10且在T和M，T和H中趋势一致，在T与M组间共筛选得到23个差异表达基因，在T与H组间共筛选得到30个差异表达基因。T与M组间的23个差异表达基因和T与H组间的30个差异表达基因共存在14个为重叠基因，最终筛选得到39个差异表达基因。

实施例2RT-PCR验证

分别提取中43例供试者血液样本中的RNA，反转录获得cDNA。采用RT-PCR对芯片筛选得到的39个基因进行验证，以43例供试者的cDNA为模板，采用RT-PCR检测供试者中芯片差异中筛选获得的前30个差异表达基因的组间相对表达量。相对表达量采用ΔΔCt方法，即ΔΔCtgene＝ΔCtgene-ΔCtref；其中gene为目的基因，，所述ref为GAPDH基因，作为内参基因。差异假设检验采用双边two-sample Mann-Whitney test，并经过FDR(FalseDiscovery Rate)方法矫正，BATF2和B3GALTL基因的编号及引物序列见表1，在不同人群中的表达差异见表2,在不同人群中的ΔΔCt值结果分别见图1-2，其中纵坐标为目的基因的ΔΔCt值，横坐标为不同类型的人群分组，其中T为活动性结核感染者，M为陈旧性结核感染者，H为健康人。标题内数字代表除去不合格样本后实际参与数据计算的样本数，为了表示方便，表2中显示的是p-value的-log10值，即当p-value值为0.01时，其-log10值为2。经计算发现BATF2和B3GALTL两种基因在陈旧性结核感染者血液，活动性结核结核病感染者血液和健康人血液中存在明显的表达差异，两者在陈旧性结核感染者血液的表达量远低于活动性结核感染者血液和健康人血液中的表达量。

表1基因引物探针序列及编号

表2基因在不同人群中的表达差异

实施例3联合表达量和ROC曲线验证

根据43名供试者BATF2和B3GALTL两种基因的相对表达量(相对于GAPDH)分别计算每个样本的联合表达量和P值；

联合表达量＝-6.53428212+0.26172894*BATF2相对表达量+0.84170131*B3GALTL相对表达量；

P值＝1/(1+e^{-联合表达量})，P值即为待测者为陈旧性结核阴性的几率。

对疾病组和对照组测定结果进行ROC曲线分析，通过确定测定值的上下限、组距以及截断点(cut-off point)，按选择的组距间隔列出累积频数分布表，分别计算出所有截断点的敏感性、特异性和假阳性率(1-特异性)。以敏感性(代表真阳性率)为纵坐标，1-特异性(代表假阳性率)为横坐标作图绘成ROC曲线。ROC曲线下的面积值在0.5和1.0之间。在AUC＞0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC为0.5时，说明诊断方法接近与随机猜测，无诊断价值。ROC曲线分析采用Python计算机语言编程，具体源代码见https://github.com/yaotianran/general_feature_selection.

采用单独的BATF2基因、B3GALTL基因以及两个基因的组合，检测其对于陈旧性结核病的特异性、准确度和AUC值，结果见表3.

表3单独使用BATF2或B3GALTL基因与联合使用两种基因诊断的效果

使用的基因	准确度	特异性	AUC
				BATF2	0.9233	0.9899	0.977
B3GALTL	0.9733	0.9899	0.987
				BATF2，B3GALTL	0.9751	0.9899	0.993

从表3和图3-5中可以看出当联合使用BATF2和B3GALTL两种基因组合区分陈旧性结核感染者和非陈旧性结核感染者时，准确率>97％，特异性>98％。

综上，本发明提供一种陈旧性结核病标志物BATF2和B3GALTL基因，具有高特异性和准确度，能够用于鉴别陈旧性结核病与其他非陈旧性结核病的情况，具有重要的临床意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市优圣康生物科技有限公司

<120> 一种陈旧性结核病标志物及其应用

<130> 20190904

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cctaaagcca cagcagaaga g 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cagggtcctt cctcattctt tc 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ttcatctcat aaacaaaaag gaag 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttgtcttact cacatttcct ttgct 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tgttaacatc cctagcctaa aaata 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

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ttgtcttact cacatttcct ttgct 25

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tggaaggact catgaccaca gt 22

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gccatcacgc cacagtttc 19

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ccatcactgc cacccagaag actgt 25

Claims

1.一种陈旧性结核病标志物在制备检测陈旧性结核病的产品中的应用，其特征在于，所述陈旧性结核病标志物包括BATF2和B3GALTL基因。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测陈旧性结核病的方法包括实时定量PCR、基因芯片检测中的任一种。

3.一种鉴别陈旧性结核病的试剂盒，其特征在于，包括检测BATF2和B3GALTL基因的试剂；

所述试剂包括检测BATF2和B3GALTL基因的引物组和探针组，所述引物组和探针组包括SEQ ID NO.1-9所示的序列。

4.一种鉴别陈旧性结核病的装置，其特征在于，所述装置包括如下（a1）和（a2）所示的功能的模块：

（a1）分别检测待测者组织样本中BATF2和B3GALTL基因的相对表达量，然后根据如下公式计算待测样本的两种基因的联合表达量，其中基因名称代表该基因的表达量：

联合表达量= -6.53428212 + 0.26172894 * BATF2 + 0.84170131 * B3GALTL；

（a2）根据所述联合表达量计算P值，根据P值大小鉴别陈旧性结核病，其中P值 = 1 /（1+e^{-联合表达量}）。

5.一种非疾病诊断治疗目的的鉴别陈旧性结核病的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）分别检测如权利要求1所述陈旧性结核病标志物的相对表达量，计算两种基因的联合表达量，计算公式如权利要求4中所述模块（a1）所示；

（2）根据步骤（1）所得联合表达量分计算对应的P值，计算公式如权利要求4所述模块（a2）所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述检测的方法包括PCR、基因组测序或基因芯片中的任一种或至少两种的组合。

7.一种鉴别陈旧性结核病的系统，其特征在于，包括如权利要求4所述的鉴别陈旧性结核病的装置。

8.一种如权利要求4所述的装置、权利要求7所述鉴别陈旧性结核病的系统在制备监测陈旧性结核病发生或发展的产品中的应用。