WO2019117257A1 - 乳がんの検出を補助する方法 - Google Patents

乳がんの検出を補助する方法 Download PDF

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mirna
isomir
breast cancer
rna fragment
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栄俊 田原
孝広 落谷
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国立大学法人広島大学
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to methods of assisting in the detection of breast cancer.
  • diagnostic imaging and palpation such as echo test and mammography are performed.
  • these methods are said to be overlooked and can not detect stage 0 breast cancer that has not led to the formation of a mass at all.
  • JP 2009-505639 gazette JP, 2014-117282, A JP, 2016-25853, A
  • the inventors of the present invention have newly developed miRNAs whose isoforms (isomiRs), transfer RNA fragments (tRF) and non-coding RNA fragments (RRNA, snoRNA, LincRNA) whose abundance is increased or decreased in breast cancer as a result of earnest studies. By finding out and making these into a parameter
  • the nucleotide sequence contained in the test sample separated from the living body is SEQ ID NO: 2, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 152, 151, 15, 28 , 41, 1, 14, 27, 40, 25, 12, 160, 3 to 11, 13, 16 to 20, 29, 35 to 39, 42 to 150, 153 to 159, 161 to 269.
  • the nucleotide sequences are SEQ ID NOs: 1 to 19, 27, 28, 34 to 51, 74, 76, 77, 80 to 84, 96, 101 to 104, 115 to 122, 125, 128, 134 to 139, 151, 152, 159-165, 1
  • the abundance of at least one of miRNA, isomiR, miRNA precursor, transfer RNA fragment or non-coding RNA fragment shown in any of 8, 169, 174, 175 to 199 is greater than that of a healthy person, or the base sequence is SEQ ID NOs: 20 to 26, 29 to 33, 52 to 54, 56 to 73, 75, 78 to 79, 85 to 95, 97 to 100, 105 to 114, 123,
  • the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 2, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 152, 151, 28, 41, 1, 14, 27, 40, 25, 12, 160, 3 to 11, 13, 16 to 20, 29, 35 to 39, 42 to 150, 153 to 159, 161 to 174, miRNAs, isoforms (isomiRs) or transfer RNA fragments thereof ( The method according to (1), wherein the amount of at least one of tRF) is used as an indicator.
  • the base sequence is SEQ ID NO: 2, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 152, 151, 28, 41, 1, 14, 27, 40, 25, 12, 160, 3 to 11, 13, 16, 20, 27, 29, 37 to 39, 41, 43, 45, 47 to 52, 56, 60, 66, 82, 86, 90 to 92, 107, 111,
  • the abundance of at least one of miRNA, isomiR, miRNA precursor, transfer RNA fragment or non-coding RNA fragment represented by any of 112, 126, 127, 130, 137, 158, 161, 162, 173, 175 to 265 The method described in (1), wherein (4)
  • the base sequence is SEQ ID NO: 2, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 152, 151, 28, 41, 1, 14, 27, 40, 25, 12, 160, 3 to 11, 13, 16, 20, 27, 29, 37 to 39, 41, 43, 45, 47 to 52, 56, 60, 66, 82, 86, 90 to 92, 107, 111, Using at least
  • the amount of isomiR (where “the amount of isoform (isomiR)” indicates the total amount of 1 to 5 bases deleted or 1 to 5 bases long sequence at the 3 'or 5' end of the mature miRNA)
  • the method according to (2) which comprises measuring the proportion, and showing that the proportion is lower than that of a healthy person is highly likely to develop breast cancer.
  • the method of the present invention it is possible to detect breast cancer with high accuracy and yet, which contributes greatly to the detection of breast cancer.
  • miRNA etc. a specific miRNA, isomiR, miRNA precursor, transfer RNA fragment or non-coding RNA fragment (hereinafter referred to as "miRNA etc.” for convenience) contained in a test sample separated from a living body It may be called as an indicator of the abundance of These miRNAs and the like are known per se, and their nucleotide sequences are as shown in the sequence listing. A list of miRNAs and the like used in the method of the present invention is shown in Table 1 below.
  • miRNAs etc. whose base sequences are shown by SEQ ID NOs: 1 to 33, 56 to 173, 175 to 269 (hereinafter, for convenience, for example, “miRNAs etc. whose base sequence is represented by SEQ ID NO: 1”
  • the miRNAs of SEQ ID NO: 1 or the like (sometimes referred to as “SEQ ID NO: 1”) are present in serum, and those of SEQ ID NOs: 34-55, 174 are present in exosomes in serum It is
  • miRNAs are the ratio of the abundance in the serum or exosome of a breast cancer patient to the abundance in the serum or exosome of a healthy individual (base 2 is the logarithm of “log FC” (FC Is that whose absolute value is called f old c hange) is greater than 0.585 (that is, the ratio is about 1.5 or more or about 1.5 or less), and statistically significant (p ⁇ 0.05 by t test). )belongs to.
  • the miRNAs of 168, 169, 175 to 199, etc. have abundances in breast cancer patients higher than those in healthy subjects, and are SEQ ID NOs: 20 to 26, 29 to 33, 52 to 54, 56 to 73, 75, 78 to 79, 85 to 95, 97 to 100, 105 to 114, 123, 124, 126, 127, 129 to 133, 140 to 150, 153 to 158, 166, 167, 170 to 173, 200 to 269
  • the miRNA etc. are smaller in abundance in breast cancer patients than in healthy individuals.
  • the base sequences are SEQ ID NOs: 2, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 152, 151, 28, 41, 1, 14, 27, 40, 25 , 12, 160, 3 to 11, 13, 16, 20, 27, 29, 37 to 39, 41, 43, 45, 47 to 52, 56, 66, 82, 86, 90 to 92, 107, 111
  • the miRNAs shown by any of 112, 126, 127, 130, 137, 158, 161, 162, 173 and 175 to 265 have an absolute value of log FC of 1.5 or more, which is a particularly sensitive index. And is preferred.
  • stage 0 breast cancer that is, a stage in which a mass is not formed, image diagnosis or palpation, as specifically described in the following examples. Even those that can not be detected).
  • the area under the ROC curve (AUC (Area Under Curve)) is used as an index indicating the accuracy of a cancer marker, and it is generally said that an AUC of 0.7 or more is effective as a cancer marker.
  • An AUC of 0.90 or more is high accuracy, 0.97 or higher is very high accuracy, 0.98 or higher is extremely high accuracy, and 1.00 is perfect (there is no false positive or false negative). Therefore, also in the present invention, the AUC is preferably 0.90, more preferably 0.97 or more, still more preferably 0.98 or more, still more preferably 0.99 or more, and most preferably 1.00.
  • the base sequences are SEQ ID NOs: 2, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 152, 15, 28, 41, 1, 14, 27, 40, 25, 12, 160 Of AUC 0.97 or more, among which those of SEQ ID NOs: 2, 21, 22, 23, 24, 26, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 152, 151, 15, 28, 41, 1 Is more preferably AUC 0.98 or more, and those of SEQ ID NOs: 2, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 152 are most preferable at AUC 1.00.
  • miRNAs having a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 2, 21, 22, 23, 24, 26, 31 to 33 or 55 have an abundance of 0 in cancer patients or in healthy individuals, By using it, as in the case of AUC 1.00, highly accurate determination is possible (in most cases, AUC is also 1.00).
  • the test sample is not particularly limited as long as it is a body fluid containing miRNA, but in general, a blood sample (including plasma, serum and whole blood) is preferably used.
  • a blood sample including plasma, serum and whole blood
  • the ones of SEQ ID NOs: 1 to 33, 56 to 173 and 175 to 265 present in serum are convenient and preferable to use serum or plasma as test samples.
  • serum or plasma it is preferable to use serum or plasma as a test sample and extract total RNA from exosomes in this to measure the abundance of each miRNA or the like.
  • Methods for extraction of total RNA in serum or plasma are well known and are specifically described in the Examples below.
  • a method for extracting total RNA from exosomes in serum or plasma is also known, and the details are specifically described in the following examples.
  • the measurement (quantification) of the abundance of each miRNA or the like is preferably performed using a next-generation sequencer.
  • a next-generation sequencer There is no limitation on the type of device as long as it is a device that reads an array like a next-generation sequencer.
  • miRNAs etc. to be quantified are, for example, missing one or more bases from the 5 'end and / or the 3' end of a normal mature miRNA. Since it is necessary to distinguish and quantify the isomiR that has only been lost or added from the basic miRNA, from the viewpoint of accuracy, quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) widely used for quantification of miRNA is required. Is also preferably performed using a next-generation sequencer.
  • RNA present in serum or plasma is constant, the number of reads read in the next generation sequencing analysis using them, converting human-derived sequences into 1,000,000 reads, per 1,000,000 reads The number of leads of each isomiR or mature miRNA is taken as the measurement value.
  • miRNA changes in serum or plasma as compared to healthy individuals due to disease miRNAs with less variation in abundance in serum and plasma may be used.
  • let-7g-5p, miR-425-3p, miR-425-5p, miR- which are miRNAs with less fluctuation in the amount in serum and plasma.
  • at least one miRNA selected from the group consisting of 23a-3p, miR-484-5p, and miR-191-5p is used as an internal standard.
  • the cutoff value of the abundance of each miRNA etc. used for determination is a statistically significant difference (p ⁇ 0.05, preferably p ⁇ 0.01, preferably It is preferable to be based on the presence or absence of 0.001). Specifically, preferably, for example, the log 2 read number (cutoff value) at the plot point where the false positive rate is the best value (the lowest value) can be set for each miRNA etc. Cutoff values (log 2 read numbers) for each miRNA etc. are as shown in Table 2. The cut-off values shown in Table 2 are merely examples, and other values can be adopted as cut-off values as long as a statistically significant difference occurs. Also, different patients and healthy populations from which data are collected will have different best cutoff values. However, in general, the cutoff value can be set within a range of ⁇ 20% of the cutoff value shown in Table 2 or Table 3, particularly within a range of ⁇ 10%.
  • the abundances of the miRNAs and various isomiRs differ between patients and healthy individuals, even if the miRNAs and the like have the same basic type.
  • the miRNA of the basic type is miR-15a 5p, but in the miRNA of Comparative Example 1 (SEQ ID NO: 270), the log FC is 0, while Example 2 In the mature 5 'sub isomiR of (SEQ ID NO: 2), the log FC is 5.67, which is overwhelmingly more abundant in breast cancer patients.
  • SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 270 of a single patient can be measured to aid in the detection of breast cancer based on the ratio.
  • Examples 85 to 88 are also miR-15a 5p iso miRs, but since each has a different log FC, the ratio between them is also added to the index to help more accurate detection. It is also possible to As described above, when measuring the abundance of a given miRNA and its isomiR, it is necessary to accurately distinguish subtle differences in base sequences, so quantitative reverse transcription that is usually used for quantification of miRNA is necessary. It is preferable to carry out using a next-generation sequencer rather than PCR (qRT-PCR).
  • each of the miRNAs described above has a statistically significant difference between breast cancer patients and healthy individuals, it can be used alone as an indicator, but a combination of multiple miRNAs may be used as an indicator, in that case Can help with more accurate breast cancer detection.
  • miR-150-5p SEQ ID NO: 83
  • miR-26b-5p contained in serum or plasma separated from a living body 126)
  • the amount of each isoform (isomiR) relative to the mature miRNA is 1 to 5 bases deleted or 1 to 5 of the 3 'or 5' end of the mature miRNA
  • Measurement of the proportion of the sequence that is longer by ⁇ 5 bases can also help detection of breast cancer. In this case, the fact that the ratio is higher than that of the healthy person indicates that the possibility of developing breast cancer is high. This method is accurate because the statistical significance is very large (p value is very small).
  • miR-93-5p SEQ ID NO: 155) and / or miR-17-5p (SEQ ID NO: 4) contained in serum or plasma separated from a living organism, as specifically described in the following examples.
  • the amount of each isoform (isomiR) relative to the mature miRNA is 1 to 5 bases deleted or 1 to 5 of the 3 'or 5' end of the mature miRNA.
  • Measurement of the proportion of the amount of the sequence can also help detection of breast cancer. In this case, the fact that the ratio is lower than that of the healthy person indicates that the possibility of developing breast cancer is high. This method is accurate because the statistical significance is very large (p value is very small).
  • the nucleotide sequence of a test sample of a human suspected of having breast cancer or suffering from breast cancer is SEQ ID NO: 2, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 152, 151, 15, 28 , 41, 1, 14, 27, 40, 25, 12, 160, 3 to 11, 13, 16 to 20, 29, 35 to 39, 42 to 150, 153 to 159, 161 to 265.
  • a method for detecting the abundance of at least one of miRNA, isoform (isomiR), miRNA precursor, transfer RNA fragment (tRF) or non-coding RNA fragment (RRNA, snoRNA, LincRNA), Obtaining a blood sample from a human, and measuring the abundance of RNA strands in the blood sample using a next-generation sequencer or qRT-PCR,
  • the base sequences are SEQ ID NOs: 1 to 19, 27, 28, 34 to 51, 74, 76, 77, 80 to 84, 96, 101 to 104, 115 to 122, 125, 128, 134 to 139, 151
  • the abundance of at least one miRNA, isomiR, miRNA precursor, transfer RNA fragment or non-coding RNA fragment shown in any of 152, 159 to 165, 168, 169, 174, 175 to 199 is higher than that of a healthy person
  • the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 20 to 26, 29 to 33, 52 to 54
  • breast cancer when breast cancer is detected by the method of the present invention described above, breast cancer can be treated by administering an effective amount of an anti-breast cancer agent to a patient in whom breast cancer is detected.
  • anti-breast cancer agents include herceptin, trastuzumab, pertuzumab, trastuzumab emtansine paclitaxel, docetaxel, vinorelbine, lapatinib, capecitabine and the like.
  • Examples 1 to 269, Comparative Examples 1 to 12 1. Materials and methods (1) Clinical samples The sera of 109 breast cancer patients and 72 healthy subjects were used. Stages of breast cancer patients were 6 at stage 0 and 134 at stage 1 and higher.
  • RNA extraction control 10 ⁇ L of 0.05 nM cel-miR-39 was added as a control RNA, mixed by pipetting, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • step 8) until all the solution of 7) is passed through the column to adsorb all RNA to the filter.
  • 650 ⁇ L of Buffer RWT was added to the column and centrifuged at 8000 xg for 15 seconds at room temperature. The solution passed from the column was discarded.
  • 500 ⁇ L of Buffer RPE was added to the column and centrifuged at 8000 xg for 15 seconds at room temperature. The solution passed from the column was discarded.
  • To wash the RNA adsorbed to the filter 500 ⁇ L of Buffer RPE was added to the column and centrifuged at 8000 xg for 2 minutes at room temperature.
  • the solution passed from the column was discarded. 13) To completely remove the solution attached to the filter, transfer the column to a new 2 mL collection tube and centrifuge at 10000 xg for 1 minute at room temperature. 14) The column was transferred to a 1.5 mL tube, 50 ⁇ L of RNase-free water was added, and allowed to stand at room temperature for 1 minute. 15) Centrifuge at 8000 xg for 1 minute at room temperature to elute the RNA adsorbed on the filter. The eluted RNA was used as it was in the next experiment, and the rest was stored at -80 ° C.
  • RNA from Exosome Exosome in serum was purified by _Total Exosome Isolation (from serum) of Thermo Fisher Scientific, a commercially available kit. Extraction of RNA from the recovered exosomes was performed using miRNeasy Mini kit (trade name, manufactured by QIAGEN).
  • RNA is purified by the same method using extracellular vesicles (including exosomes) recovered by the same method, and a cDNA library is prepared for next-generation sequencing The analysis was done.
  • the next-generation sequence analysis is not limited as long as it is a device that reads an array.
  • Examples 1 to 265 high accuracy is achieved as compared with the case where miRNAs and the like used for them have a length slightly different from that of miRNAs and the like (Comparative Examples 1 to 13) It has been shown that detection of breast cancer is possible. In addition, the p-value by the t-test in Examples 1 to 265 was in most cases less than 0.05, and was shown to be effective for detection of breast cancer.
  • Example 270 In the same manner as in Examples 1 to 269, the presence of mature miRNAs ("mature” in Table 3) of miR-150-5p (SEQ ID NO: 83) and miR-26b-5p (SEQ ID NO: 126) contained in serum. The amount and the abundance of its respective isoform (isomiR) were determined. The “amount of isoform (isomiR)” is a total amount of a sequence with 1 to 5 bases deleted or 1 to 5 bases longer at the 3 'or 5' end of the mature miRNA. The ratio of each miRNA and its isoform was measured. The results are shown in Table 3 below.
  • Example 271 In the same manner as in Examples 1 to 269, miR-93-5p (SEQ ID NO: 155) and / or miR-17-5p (mature miRNA of SEQ ID NO: 282 (“mature” in Table 3) contained in serum) The amount of each isoform and the amount of each isoform (isomiR) were measured. "The amount of isoform (isomiR)" refers to 1 to 5 base deletion or 1 to 5 bases of the 3 'or 5' end of mature miRNA. The ratio of each miRNA to its isoform was measured, and the results are shown in Table 3 below.

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Abstract

要約　乳がんを高精度に検出することを補助する、乳がんの検出を補助する方法が開示されている。乳がんの検出を補助する方法は、生体から分離された被検試料中に含まれる、特定の塩基配列を持つmiRNA、isomiR、miRNA前駆体若しくは転移RNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする。塩基配列が配列番号１～１９、２７、２８、３４～５１等のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA等が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２０～２６、２９～３３、５２～５４等のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA等の存在量が健常者よりも少ないことが、乳がんを発症している可能性が大きいことを示す。

Description

乳がんの検出を補助する方法
　本発明は、乳がんの検出を補助する方法に関する。
　乳がんの診断方法としては、エコー検査やマンモグラフィー等の画像診断や触診が行われている。しかしながら、これらの方法では、見落としもあると言われており、また、腫瘤の形成に至っていないステージ０の乳がんを発見することは全くできない。
　一方、血液中のマイクロRNA（以下、「miRNA」）の存在量を指標として乳がんを検出する方法が提案されている（特許文献１～３）。
特表2009-505639号公報 特開2014-117282号公報 特開2016-25853号公報
　上記の通り、種々のmiRNAが、乳がん検出のための指標として提案されているが、より正確に乳がんを検出することができれば有利であることは言うまでもない。
　したがって、本発明の目的は、乳がんを高精度に検出することを補助する、乳がんの検出を補助する方法を提供することである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、乳がんにおいて存在量が増大又は減少するmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR）、転移ＲＮＡ断片(tRF)および非コードRNA断片 (RRNA, snoRNA, LincRNA)を新たに見出し、これらを指標とすることにより、高精度に乳がんが可能になることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1) 生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０、３～１１、１３、１６～２０、２９、３５～３９、４２～１５０、１５３～１５９、１６１～２６９のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR）、miRNA前駆体、転移ＲＮＡ断片(tRF) 又は非コードRNA断片 (RRNA、snoRNA、LincRNA)の少なくとも１種の存在量を指標とする乳がんの検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号１～１９、２７、２８、３４～５１、７４、７６、７７、８０～８４、９６、１０１～１０４、１１５～１２２、１２５、１２８、１３４～１３９、１５１、１５２、１５９～１６５、１６８、１６９、１７４、１７５～１９９のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２０～２６、２９～３３、５２～５４、５６～７３、７５、７８～７９、８５～９５、９７～１００、１０５～１１４、１２３、１２４、１２６、１２７、１２９～１３３、１４０～１５０、１５３～１５８、１６６、１６７、１７０～１７３、２００～２６９のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも少ないことが、乳がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法。
(2)　塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０、３～１１、１３、１６～２０、２９、３５～３９、４２～１５０、１５３～１５９、１６１～１７４のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR）又は転移ＲＮＡ断片(tRF)の少なくとも１種の存在量を指標とする(1)記載の方法。
(3)　塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０、３～１１、１３、１６、２０、２７、２９、３７～３９、４１、４３、４５、４７～５２、５６、６０、６６、８２、８６、９０～９２、１０７、１１１、１１２、１２６、１２７、１３０、１３７、１５８、１６１、１６２、１７３、１７５～２６５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片若しくは非コードRNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする(1)記載の方法。
(4)　塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０、３～１１、１３、１６、２０、２７、２９、３７～３９、４１、４３、４５、４７～５２、５６、６０、６６、８２、８６、９０～９２、１０７、１１１、１１２、１２６、１２７、１３０、１３７、１５８、１６１、１６２、１７３のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体若しくは転移RNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする(3)記載の方法。
(5)　塩基配列が配列番号３～９のいずれかで示されるisomiR又はmiRNA前駆体の少なくとも１種の存在量を指標とする(4)記載の方法。
(6)　塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体若しくは転移RNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする(2)記載の方法。
(7)　塩基配列が配列番号１５２、１５１、１５、４０、４１、１又は１４で示されるisomiR又は転移RNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする(6)記載の方法。
(8)　塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３１～３３又は５５で示されるisomiR又は転移RNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする(2)記載の方法。
(9)　生体から分離された血清又は血漿中に含まれる、miR-150-5p（配列番号８３）及び／又は、miR-26b-5p（配列番号１２６）の成熟miRNAに対する、そのそれぞれのアイソフォーム(isomiR)の量（ここで、「アイソフォーム(isomiR)の量」は、成熟miRNAの3'若しくは5'側末端が１～５塩基欠損又は１～５塩基長い配列の総量を示す）の割合を測定することを含み、該割合が健常者よりも多いことが乳がんを発症している可能性が大きいことを示す、(2)記載の方法。
(10)　生体から分離された血清又は血漿中に含まれる、miR-93-5p（配列番号１５５）及び／又はmiR-17-5p（配列番号２８２）の成熟miRNAに対する、そのそれぞれのアイソフォーム(isomiR)の量（ここで、「アイソフォーム(isomiR)の量」は、成熟miRNAの3'若しくは5'側末端が１～５塩基欠損又は１～５塩基長い配列の総量を示す）の量の割合を測定することを含み、該割合が健常者よりも少ないことが乳がんを発症している可能性が大きいことを示す、(2)記載の方法。
　本発明の方法によれば、高精度に、かつ、それでいて簡便に乳がんを検出することが可能であるので、乳がんの検出に大いに寄与する。
　上記の通り、本発明の方法では、生体から分離された被検試料中に含まれる特定のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片又は非コードRNA断片（以下、便宜的に「miRNA等」と呼ぶことがある）の存在量を指標とする。これらのmiRNA等自体は公知であり、その塩基配列は配列表に示すとおりである。本発明の方法に用いるmiRNA等の一覧を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　これらのmiRNA等のうち、塩基配列が配列番号１～３３、５６～１７３、１７５～２６９で示されるmiRNA等（以下、便宜上、例えば「塩基配列が配列番号１で示されるmiRNA等」を単に「配列番号１のmiRNA等」や「配列番号１のもの」と呼ぶことがある）は、血清中に存在するものであり、配列番号３４～５５、１７４のものは、血清中のエクソソーム中に存在するものである。
　これらのmiRNA等のうちの多くは、乳がん患者の血清又はエクソソーム中の存在量と、健常者の血清又はエクソソーム中の存在量との比の対数（底が２の対数で「log FC」（FCは、fold change）と呼ばれる）の絶対値が0.585超のものであり（すなわち、比が約1.5倍以上又は約1.5分の１以下）、統計学的に有意(t検定でp<0.05)のものである。
　配列番号１～１９、２７、２８、３４～５１、７４、７６、７７、８０～８４、９６、１０１～１０４、１１５～１２２、１２５、１２８、１３４～１３９、１５１、１５２、１５９～１６５、１６８、１６９、１７５～１９９のmiRNA等は、乳がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも多いものであり、配列番号２０～２６、２９～３３、５２～５４、５６～７３、７５、７８～７９、８５～９５、９７～１００、１０５～１１４、１２３、１２４、１２６、１２７、１２９～１３３、１４０～１５０、１５３～１５８、１６６、１６７、１７０～１７３、２００～２６９のmiRNA等は、乳がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも少ないものである。
　これらの中でも、塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０、３～１１、１３、１６、２０、２７、２９、３７～３９、４１、４３、４５、４７～５２、５６、６０、６６、８２、８６、９０～９２、１０７、１１１、１１２、１２６、１２７、１３０、１３７、１５８、１６１、１６２、１７３、１７５～２６５のいずれかで示されるmiRNA等は、log FCの絶対値が1.5以上のものであり、特に感度の高い指標となるものであり、好ましい。
　また、これらのうち、配列番号３～９のものを指標とする方法では、下記実施例に具体的に記載するとおり、ステージ０の乳がん（すなわち、腫瘤が未形成のステージで、画像診断や触診では検出できないもの）でも検出可能である。
　がんマーカーの精度を示す指標としてROC曲線下面積(AUC(Area Under Curve))が用いられており、一般的にAUCが0.7以上のものががんマーカーとして有効であると言われている。AUCが0.90以上のものは高精度であり、0.97以上は非常に高精度、0.98以上は極めて高精度、1.00で完璧（偽陽性及び偽陰性が全くない）である。したがって、本発明においても、AUCが0.90のものが好ましく、さらに0.97以上のものが好ましく、さらに0.98以上のものが好ましく、さらに0.99以上のものが好ましく、1.00のものが最も好ましい。塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０のものがAUC 0.97以上で好ましく、これらのうち、配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１のものがAUC 0.98以上でさらに好ましく、配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２のものがAUC 1.00で最も好ましい。
　さらに、塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３１～３３又は５５のmiRNA等は、がん患者中又は健常者中の存在量が０のものであるので、これらを用いることにより、AUCが1.00の場合と同様に高精度の判定が可能である（ほとんどのものは、AUCが1.00でもある）。
　被検試料としては、miRNAを含む体液であれば特に限定されないが、通常、血液試料（血漿、血清及び全血を包含する）が好ましく用いられる。血清中に存在する配列番号１～３３、５６～１７３、１７５～２６５のものは、血清又は血漿を被検試料とすることが簡便で好ましい。エクソソーム中に存在する配列番号３４～５４のものは、血清又は血漿を被検試料として、この中のエクソソームから全ＲＮＡを抽出して各miRNA等の存在量を測定することが好ましい。血清又は血漿中の全ＲＮＡの抽出方法は周知であり、下記実施例に具体的に記載されている。血清又は血漿中のエクソソームからの全ＲＮＡの抽出方法自体も公知であり、詳細は下記実施例に具体的に記載されている。
　各miRNA等の存在量の測定（定量）は、次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。次世代シーケンサーのように配列を読む機器であれば、機種は限定されない。下記実施例に具体的に記載されるように、本発明の方法では、定量するmiRNA等には、例えば、通常の成熟型miRNAの5'末端及び／又は3'末端からわずか１塩基以上が欠失又は付加されているだけのisomiRを、基本となるmiRNAと区別して定量する必要があるので、精度の観点から、miRNAの定量に広く用いられている定量的逆転写ＰＣＲ(qRT-PCR)よりも次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。具体的には下記実施例において詳細に記載するが、簡単に述べると、この定量方法は、例えば次のようにしておこなうことができる。血清又は血漿中に存在するRNAが一定である場合、それらを用いた次世代シークエンス解析において読まれたリード数のうち、ヒト由来のシーケンスを100万リード数に換算して、100万リード数当たりのそれぞれのisomiRや成熟型miRNAのリード数を測定値とする。疾患によって健常人に比較して血清中または血漿中のRNAが変化する場合は、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAを用いる場合がある。なお、血清又は血漿中のmiRNA等を定量する場合には、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAであるlet-7g-5p、miR-425-3p、 miR-425-5p、miR-23a-3p、miR-484-5p、miR-191-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のmiRNAを内部標準として用いることが好ましい。
　判定に用いる、各miRNA等の存在量のカットオフ値としては、各miRNA等について、健常者に対する統計学的有意差(t検定で、p<0.05、好ましくはp<0.01、さらに好ましくはp<0.001)の有無を基準とすることが好ましい。具体的には、好ましくは、例えば、偽陽性率が最良の値（最も低くなる値）なるプロット点におけるlog2リード数（カットオフ値）を各miRNA等について設定することができ、例えば、いくつかの各miRNA等におけるカットオフ値(log2リード数)は表２に示すとおりである。なお、表２に示されるカットオフ値は、単なる例に過ぎず、統計学的有意差が出る限り、他の値をカットオフ値として採用することができる。また、データを採取する患者及び健常者の集団が異なれば、最良のカットオフ値も異なる。もっとも、通常、表２又は表３に示されるカットオフ値の±２０％の範囲内、特には±１０％の範囲内でカットオフ値を設定することができる。
　また、下記実施例及び比較例から明らかなように、基本型が同一のmiRNA等であっても、miRNAと各種isomiRとでは、患者と健常者の間で存在量が異なる。例えば、下記実施例２及び比較例１では、基本型のmiRNAはmiR-15a 5pであるが、比較例１のmiRNA（配列番号２７０）では、log FCが0であるのに対し、実施例２（配列番号２）のMature 5' subのisomiRではlog FCが5.67であり、乳がん患者で圧倒的に存在量が多くなっている。したがって、一人の患者の配列番号２と配列番号２７０を測定し、その比に基づいて乳がんの検出を補助することができる。さらに、実施例８５～８８（配列番号８５～８８）も同じくmiR-15a 5p群のisomiRであるが、それぞれlog FCが異なるので、これらの間の比率も指標に加えてより正確な検出の補助を行うことも可能である。なお、このように、あるmiRNA及びそのisomiRの存在量を測定する場合には、微妙な塩基配列の違いを的確に区別する必要があるため、通常miRNAの定量に用いられている定量的逆転写ＰＣＲ(qRT-PCR)よりも次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。比較例１のmiRNA（配列番号２７０）のようにqRT-PCRで検出される配列であるmature型のマイクロRNAでは差が見いだせないが、実施例２（配列番号２）のMature 5' subのisomiRでは有意差のある違いが見いだせる優位性は、次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。
　なお、上記した各miRNA等は、乳がん患者と健常者の間でそれぞれ統計学的有意差を持つので、単独で指標として用いることもできるが、複数のmiRNAを組み合わせて指標としてもよく、その場合にはさらに正確な乳がん検出の補助が可能になる。
　また、下記実施例に具体的に記載されるように、生体から分離された血清又は血漿中に含まれる、miR-150-5p（配列番号８３）及び／又は、miR-26b-5p（配列番号１２６）の成熟miRNAに対する、そのそれぞれのアイソフォーム(isomiR)の量（ここで、「アイソフォーム(isomiR)の量」は、成熟miRNAの3'若しくは5'側末端が１～５塩基欠損又は１～５塩基長い配列の総量を示す）の割合を測定することによっても、乳がんの検出を補助することができる。この場合、前記割合が健常者よりも多いことが乳がんを発症している可能性が大きいことを示す。この方法は、統計学的有意差が非常に大きい（p値が非常に小さい）ので、正確な方法である。
　同様に、下記実施例に具体的に記載されるように、生体から分離された血清又は血漿中に含まれる、miR-93-5p（配列番号１５５）及び／又はmiR-17-5p（配列番号２８２）の成熟miRNAに対する、そのそれぞれのアイソフォーム(isomiR)の量（ここで、「アイソフォーム(isomiR)の量」は、成熟miRNAの3'若しくは5'側末端が１～５塩基欠損又は１～５塩基長い配列の総量を示す）の量の割合を測定することによっても、乳がんの検出を補助することができる。この場合、前記割合が健常者よりも少ないことが乳がんを発症している可能性が大きいことを示す。この方法は、統計学的有意差が非常に大きい（p値が非常に小さい）ので、正確な方法である。
　また、乳がんが疑われるか又は乳がんに罹患するヒトの被検試料中のmiRNA等の存在量を検出する方法も提供される。すなわち、
　乳がんが疑われる又は乳がんに罹患するヒトの被検試料中の塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０、３～１１、１３、１６～２０、２９、３５～３９、４２～１５０、１５３～１５９、１６１～２６５のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR）、miRNA前駆体、転移ＲＮＡ断片(tRF) 又は非コードRNA断片 (RRNA、snoRNA、LincRNA)の少なくとも１種の存在量を検出する方法であって、
　ヒトから血液試料を得る工程、及び
　次世代シーケンサーまたはqRT-PCRを用いて、前記血液試料内のRNA鎖の存在量を測定する工程を含み、
　ここで、塩基配列が配列番号１～１９、２７、２８、３４～５１、７４、７６、７７、８０～８４、９６、１０１～１０４、１１５～１２２、１２５、１２８、１３４～１３９、１５１、１５２、１５９～１６５、１６８、１６９、１７４、１７５～１９９のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも多い、又は塩基配列が配列番号２０～２６、２９～３３、５２～５４、５６～７３、７５、７８～７９、８５～９５、９７～１００、１０５～１１４、１２３、１２４、１２６、１２７、１２９～１３３、１４０～１５０、１５３～１５８、１６６、１６７、１７０～１７３、２００～２６５のいずれかで示される少なくとも１種の１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも少ない、方法、も提供される。
　また、上記した本願発明の方法により、乳がんが検出された場合、乳がんが検出された患者に有効量の抗乳がん剤を投与することにより、乳がんを治療することができる。抗乳がん剤としては、ハーセプチン、トラスツズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブエムタンシンパクリタキセル，ドセタキセル、ビノレルビン、ラパチニブ、カペシタビン等を挙げることができる。
　以下、本発明を実施例及び比較例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１～２６９、比較例１～１２
１．　材料及び方法
(1)　臨床検体
　乳がん患者１０９例、健常者７２例の血清を用いた。乳がん患者のステージは、ステージ０が６名、ステージ１以上が１３４名であった。
(2)　血清中のＲＮＡの抽出
　血清中 RNA の抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。
1) 凍結した血清サンプルを融解し、10000 rpm で 5 分間、室温で遠心し、凝集タンパク質や血球成分を沈殿させた。
2) 上清 200 μＬ を新しい 1.5 mL チューブ に移した。
3) 1000 μＬ の QIAzol Lysis Reagent を加えて十分に混和し、タンパク質成分を変性した。
4) RNA 抽出のコントロール RNA として 0.05 nM cel-miR-39 を 10 μＬ 加え、ピペッティングで混和した後、室温で 5 分間静置した。
5) 水層と有機溶媒層の分離促進のため、200μＬのクロロホルムを加え、十分に混和し、室温で 3 分間静置した。
6) 12000 xg、15分間、4℃で遠心し、上層の水層650μＬを新しい2mLチューブ に移した。
7) RNA を析出させるため、975μＬの 100% エタノールを加え、ピペッティングで混和した。
8) 650 μＬ の 7) を miRNeasy Mini spin column (以下、カラム) に移し、室温で 1 分間静置後、8000 xg、15 秒間、室温で遠心し、RNA をカラムのフィルターに吸着させた。カラムから通過した溶液は廃棄した。
9) 7) の溶液を全てカラムに通すまで 8) を繰り返し、全ての RNA をフィルターに吸着させた。
10) フィルターに付着した夾雑物の除去のため、650 μＬ の Buffer RWT をカラムに加え、 8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
11) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
12) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、2 分間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
13) フィルターに付着している溶液を完全に除去するため、カラムを新しい 2 mL collection チューブ に移し、10000 xg、1 分間、室温で遠心した。
14) カラムを 1.5 mL チューブ に移し、50 μＬ の RNase-free water を加え、室温で 1 分間静置した。
15) 8000 xg、1 分間、室温で遠心し、フィルターに吸着した RNA を溶出した。溶出した RNAは、そのまま次の実験に用い、残りは -80 ℃ で保存した。
(3)　エクソソームからのＲＮＡの抽出
　血清中のエクソソームは、市販のキットであるサーモフィッシャーサイエンティフィック社の＿Total Exosome Isolation (from serum)で精製した。回収したエクソソームからのＲＮＡの抽出は、miRNeasy Mini kit (商品名、QIAGEN社製) を用いて行った。
(4)　miRNA等の定量
　miRNA等の定量は、次のようにして行った。二群等でmiRNA等の定量を行う場合は、同様の方法で回収した細胞外小胞(エクソソームを含む)を用いて同様の方法でRNAを精製してcDNAライブラリーを作成して次世代シークエンス解析を行った。なお、次世代シークエンス解析は、配列を読む機器であれば機器は限定されない。
(5)　カットオフ値及びAUCの算出
　定量結果からのカットオフ値及びAUCの算出は、具体的に次のようにして行った。JMP Genomics 8（商品名）を用いてロジスティック回帰分析を実施し、ROC曲線とAUCの算出を行った。また、ROC曲線の左上隅の点（感度1.0, 特異度 1.0）との距離が最小となる点をカットオフ値とした。
２．　結果
　結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　これらの結果からわかるように、配列番号１～１９、２７、２８、３４～５１、７４、７６、７７、８０～８４、９６、１０１～１０４、１１５～１２２、１２５、１２８、１３４～１３９、１５１、１５２、１５９～１６５、１６８、１６９、１７４、１７５～１９９のmiRNA等は、乳がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも有意に多く、配列番号２０～２６、２９～３３、５２～５４、５６～７３、７５、７８～７９、８５～９５、９７～１００、１０５～１１４、１２３、１２４、１２６、１２７、１２９～１３３、１４０～１５０、１５３～１５８、１６６、１６７、１７０～１７３、２００～２６５のmiRNA等は、乳がん患者中の存在量が健常者中の存在量よりも有意に少なかった。本発明の方法（実施例１～２６５）によれば、これらに用いるmiRNA等と長さがわずかに異なるだけのmiRNA等（比較例１～１３）を指標とする場合と比較して、高精度に乳がんの検出が可能であることが示された。また、実施例１～２６５のt検定によるp値はほとんどの場合0.05未満であり、乳がんの検出に有効であることが示された。
　また、配列番号３～９のものを指標とする方法では、ステージ０の乳がんでも検出可能であった。さらに、配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０のものは、AUCが0.97以上であり、特に好ましいものである。さらに、配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３１～３３又は５５のmiRNA等は、がん患者中又は健常者中の存在量が０のものであるので、これらを用いることにより、AUCが1.00の場合と同様に高精度の判定が可能であることが明らかになった。
実施例２７０
　実施例１～２６９と同様にして、血清に含まれる、miR-150-5p（配列番号８３）及びmiR-26b-5p（配列番号１２６）の成熟miRNA（表３中、「mature」）の存在量と、そのそれぞれのアイソフォーム(isomiR)の存在量を測定した。なお、「アイソフォーム(isomiR)の量」は、成熟miRNAの3'若しくは5'側末端が１～５塩基欠損又は１～５塩基長い配列の総量である。各miRNAと、そのアイソフォームの比率を測定した。結果を下記表３に示す。
実施例２７１
　実施例１～２６９と同様にして、血清に含まれる、miR-93-5p（配列番号１５５）及び／又はmiR-17-5p（配列番号２８２の成熟miRNA（表３中、「mature」）の存在量と、そのそれぞれのアイソフォーム(isomiR)の存在量を測定した。なお、「アイソフォーム(isomiR)の量」は、成熟miRNAの3'若しくは5'側末端が１～５塩基欠損又は１～５塩基長い配列の総量である。各miRNAと、そのアイソフォームの比率を測定した。結果を下記表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　表３から、miR-150-5p（配列番号８３）及びmiR-26b-5p（配列番号１２６）では、isomiR／成熟miRNAの比率が健常者よりも多いことが乳がんを発症している可能性が大きく、miR-93-5p（配列番号１５５）及びmiR-17-5p（配列番号２８２）では、isomiR／成熟miRNAの比率が健常者よりも少ないことが乳がんを発症している可能性が大きいことが示された。

Claims (10)

  1. 　生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０、３～１１、１３、１６～２０、２９、３５～３９、４２～１５０、１５３～１５９、１６１～２６９のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR）、miRNA前駆体、転移ＲＮＡ断片(tRF) 又は非コードRNA断片 (RRNA、snoRNA、LincRNA)の少なくとも１種の存在量を指標とする乳がんの検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号１～１９、２７、２８、３４～５１、７４、７６、７７、８０～８４、９６、１０１～１０４、１１５～１２２、１２５、１２８、１３４～１３９、１５１、１５２、１５９～１６５、１６８、１６９、１７４、１７５～１９９のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２０～２６、２９～３３、５２～５４、５６～７３、７５、７８～７９、８５～９５、９７～１００、１０５～１１４、１２３、１２４、１２６、１２７、１２９～１３３、１４０～１５０、１５３～１５８、１６６、１６７、１７０～１７３、２００～２６９のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片若しくは非コードRNA断片の存在量が健常者よりも少ないことが、乳がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法。
  2. 　塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０、３～１１、１３、１６～２０、２９、３５～３９、４２～１５０、１５３～１５９、１６１～１７４のいずれかで示されるmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR）、miRNA前駆体、又は転移ＲＮＡ断片(tRF)の少なくとも１種の存在量を指標とする請求項１記載の方法。
  3. 　塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０、３～１１、１３、１６、２０、２７、２９、３７～３９、４１、４３、４５、４７～５２、５６、６０、６６、８２、８６、９０～９２、１０７、１１１、１１２、１２６、１２７、１３０、１３７、１５８、１６１、１６２、１７３、１７５～２６５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片若しくは非コードRNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする請求項１記載の方法。
  4. 　塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０、３～１１、１３、１６、２０、２７、２９、３７～３９、４１、４３、４５、４７～５２、５６、６０、６６、８２、８６、９０～９２、１０７、１１１、１１２、１２６、１２７、１３０、１３７、１５８、１６１、１６２、１７３のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体若しくは転移RNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする請求項３記載の方法。
  5. 　塩基配列が配列番号３～９のいずれかで示されるisomiR又はmiRNA前駆体の少なくとも１種の存在量を指標とする請求項４記載の方法。
  6. 　塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３０、３１、３２、３３、３４、１５２、１５１、１５、２８、４１、１、１４、２７、４０、２５、１２、１６０のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体若しくは転移RNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする請求項２記載の方法。
  7. 　塩基配列が配列番号１５２、１５１、１５、４０、４１、１又は１４で示されるisomiR又は転移RNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする請求項６記載の方法。
  8. 　塩基配列が配列番号２、２１、２２、２３、２４、２６、３１～３３又は５５で示されるisomiR、miRNA前駆体又は転移RNA断片の少なくとも１種の存在量を指標とする請求項２記載の方法。
  9. 　生体から分離された血清又は血漿中に含まれる、miR-150-5p（配列番号８３）及び／又は、miR-26b-5p（配列番号１２６）の成熟miRNAに対する、そのそれぞれのアイソフォーム(isomiR)の量（ここで、「アイソフォーム(isomiR)の量」は、成熟miRNAの3'若しくは5'側末端が１～５塩基欠損又は１～５塩基長い配列の総量を示す）の割合を測定することを含み、該割合が健常者よりも多いことが乳がんを発症している可能性が大きいことを示す、請求項２記載の方法。
  10. 　生体から分離された血清又は血漿中に含まれる、miR-93-5p（配列番号１５５）及び／又はmiR-17-5p（配列番号２８２）の成熟miRNAに対する、そのそれぞれのアイソフォーム(isomiR)の量（ここで、「アイソフォーム(isomiR)の量」は、成熟miRNAの3'若しくは5'側末端が１～５塩基欠損又は１～５塩基長い配列の総量を示す）の量の割合を測定することを含み、該割合が健常者よりも少ないことが乳がんを発症している可能性が大きいことを示す、請求項２記載の方法。
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Class et al. Patent application title: Method for Identifying a Subset of Polynucleotides from an Initial Set of Polynucleotides Corresponding to the Human Genome for the In Vitro Determination of the Severity of the Host Response of a Patient Inventors: Eva Möller (Jena, DE) Andriy Ruryk (Jena, DE) Britta Wlotzka (Erfurt, DE) Cristina Guillen (Jena, DE) Karen Felsmann (Jena, DE) Assignees: Analytik Jena AG

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