WO2019117306A1 - アルツハイマー病の検出を補助する方法 - Google Patents

アルツハイマー病の検出を補助する方法 Download PDF

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栄俊 田原
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to methods of assisting in the detection of Alzheimer's disease.
  • Alzheimer's disease is a typical dementia that accounts for the majority of dementia, and it is thought that the number of patients will increase in the future aging society. Alzheimer's disease is progressive, and current medicine can not cure it completely or stop its progression completely, but there are drugs and therapies that delay the progression. Therefore, it is desirable to detect Alzheimer's disease as early as possible. At present, diagnosis of Alzheimer's disease is performed by interviews, MRI images of the brain, etc. However, it is not easy to detect early Alzheimer's disease.
  • microRNA microRNA
  • an object of the present invention is to provide a method for assisting detection of Alzheimer's disease, which aids in detecting Alzheimer's disease with high accuracy.
  • the inventors of the present invention have newly developed miRNAs whose abundances increase or decrease in Alzheimer's disease, their isoforms (isomiRs), non-coding RNAs (ncRNAs), transfer RNA fragments (tRFs), LincRNAs and MiscRNAs as a result of earnest studies. By finding out and making these into a parameter
  • the present invention provides the following.
  • miRNA, isomiR, miRNA precursor the base sequence of which is shown in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 12, 2, 4-11, 13-85, contained in a test sample separated from a living body
  • a method for assisting detection of Alzheimer's disease using an abundance of at least one of ncRNA, transfer RNA fragment, LincRNA or MiscRNA as a marker wherein the nucleotide sequence is represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 66 to 71
  • the abundance of at least one miRNA, isomiR, miRNA precursor, ncRNA, transfer RNA fragment, LincRNA or MiscRNA is greater than that of a healthy person, or the nucleotide sequence is shown in any of SEQ ID NOs: 23 to 65, 72 to 85
  • the presence of at least one miRNA, isomiR, miRNA precursor, ncRNA, transfer RNA fragment, LincRNA or MiscRNA which is lower than that of a healthy
  • the method of the present invention it is possible to detect Alzheimer's disease with high accuracy and yet, which contributes greatly to the detection of Alzheimer's disease.
  • miRNA etc. for convenience contained in a test sample separated from a living body As an indicator.
  • miRNAs etc. for convenience, for example, "a miRNA whose base sequence is shown by SEQ ID NO: 1” may be simply referred to as “the miRNA etc. of SEQ ID NO: 1” or "the one of SEQ ID NO: 1) itself is known
  • the nucleotide sequence is as shown in the sequence listing. A list of miRNAs and the like used in the method of the present invention is shown in Table 1 below.
  • the miRNAs of SEQ ID NOS: 1 to 22 and 66 to 71 are more abundant in patients with Alzheimer's disease than those in healthy individuals, and the miRNAs of SEQ ID NOS: 23 to 65 and 72 to 85 are Alzheimer's The abundance in diseased patients is less than in healthy individuals.
  • miRNAs of SEQ ID NOs: 1, 3, 11, 12, 2, 4 to 10, 46 to 65, 84, 85, etc. have an absolute value of log FC of 1.5 or more, and an index with particularly high sensitivity. And is preferred.
  • the area under the ROC (AUC (Area Under Curve)) is used as an index indicating the accuracy of the biomarker, and it is generally said that an AUC of 0.7 or more is effective as a biomarker.
  • An AUC of 0.90 or more is high accuracy, 0.97 or higher is very high accuracy, 0.98 or higher is extremely high accuracy, and 1.00 is perfect (there is no false positive or false negative). Therefore, also in the present invention, the AUC is preferably 0.90, more preferably 0.97 or more, still more preferably 0.98 or more, and most preferably 0.99 or more.
  • the miRNAs and the like of SEQ ID NOs: 1, 3, 11 and 12 are preferably AUC 0.97 or more, among them, the miRNAs of SEQ ID NOs: 1 and 3 are more preferably AUC 0.98 or more, and the miRNA of SEQ ID NO: 1 is most preferably AUC 1.00. preferable.
  • the test sample is not particularly limited as long as it is a body fluid containing miRNA, but in general, a blood sample (including plasma, serum and whole blood) is preferably used. It is convenient and preferable to use serum or plasma as a test sample.
  • the measurement (quantification) of the abundance of each miRNA or the like is preferably performed using a next-generation sequencer.
  • a next-generation sequencer There is no limitation on the type of device as long as it is a device that reads an array like a next-generation sequencer.
  • miRNAs etc. to be quantified are, for example, missing one or more bases from the 5 'end and / or the 3' end of a normal mature miRNA. Since it is necessary to distinguish and quantify the isomiR that has only been lost or added from the basic miRNA, from the viewpoint of accuracy, quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) widely used for quantification of miRNA is required. Is also preferably performed using a next-generation sequencer.
  • this quantitative method can be performed, for example, as follows.
  • the number of reads read in the next generation sequencing analysis using them converting human-derived sequences into 1,000,000 reads, per 1,000,000 reads
  • the number of leads of each isomiR or mature miRNA is taken as the measurement value.
  • miRNAs with less variation in abundance in serum and plasma may be used.
  • let-7g-5p miR-425-3p and miR-425-5p, which are miRNAs with less variation in the amount in serum and plasma It is preferable to use at least one selected miRNA as an internal standard.
  • the cutoff value of the abundance of each miRNA etc. used for determination is a statistically significant difference (p ⁇ 0.05, preferably p ⁇ 0.01, preferably It is preferable to be based on the presence or absence of 0.001). Specifically, preferably, for example, the log 2 read number (cutoff value) at the plot point where the false positive rate is the best value (the lowest value) can be set for each miRNA etc. Cutoff values (log 2 read numbers) for each miRNA etc. are as shown in Table 2. The cut-off values shown in Table 2 are merely examples, and other values can be adopted as cut-off values as long as a statistically significant difference occurs. Also, different patients and healthy populations from which data are collected will have different best cutoff values. However, in general, the cutoff value can be set within a range of ⁇ 20% of the cutoff value shown in Table 2, particularly within a range of ⁇ 10%.
  • the abundance of miRNA and various isomiRs differ between patients and healthy individuals. Therefore, it is possible to measure miRNAs and isomiRs of the same basic type in one patient, and to aid in detection of Alzheimer's disease based on the ratio.
  • qRT-PCR next-generation sequencer rather than PCR
  • Each of the miRNAs described above has a statistically significant difference between Alzheimer's disease patients and healthy individuals, so it can be used alone as an indicator, but a combination of multiple miRNAs may also be used as an indicator. In that case, it will be possible to aid in more accurate detection of Alzheimer's disease.
  • a miRNA having a base sequence in a test sample of a human suspected of having Alzheimer's disease or suffering from Alzheimer's disease is any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 11, 12, 2, 4, 10, 13 to 85, isomiR
  • a method for detecting the abundance of at least one of miRNA precursor, ncRNA, transfer RNA fragment, LincRNA or MiscRNA is any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 11, 12, 2, 4, 10, 13 to 85, isomiR
  • a method for detecting the abundance of at least one of miRNA precursor, ncRNA, transfer RNA fragment, LincRNA or MiscRNA is any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 11, 12, 2, 4, 10, 13 to 85, isomiR
  • a method for detecting the abundance of at least one of miRNA precursor, ncRNA, transfer RNA fragment, LincRNA or MiscRNA is any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 11, 12, 2, 4, 10, 13 to 85, isomiR
  • Alzheimer's disease when Alzheimer's disease is detected by the above-described method of the present invention, Alzheimer's disease can be treated by administering an effective amount of a therapeutic agent for Alzheimer's disease to a patient in which Alzheimer's disease is detected.
  • a therapeutic agent for Alzheimer's disease donepezil, rivastigmine, galantamine, memantine and the like can be mentioned.
  • RNA extraction control 10 ⁇ L of 0.05 nM cel-miR-39 was added as a control RNA, mixed by pipetting, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • step 8) until all the solution of 7) is passed through the column to adsorb all RNA to the filter.
  • 650 ⁇ L of Buffer RWT was added to the column and centrifuged at 8000 xg for 15 seconds at room temperature. The solution passed from the column was discarded.
  • 500 ⁇ L of Buffer RPE was added to the column and centrifuged at 8000 xg for 15 seconds at room temperature. The solution passed from the column was discarded.
  • To wash the RNA adsorbed to the filter 500 ⁇ L of Buffer RPE was added to the column and centrifuged at 8000 xg for 2 minutes at room temperature.
  • the solution passed from the column was discarded. 13) To completely remove the solution attached to the filter, transfer the column to a new 2 mL collection tube and centrifuge at 10000 xg for 1 minute at room temperature. 14) The column was transferred to a 1.5 mL tube, 50 ⁇ L of RNase-free water was added, and allowed to stand at room temperature for 1 minute. 15) Centrifuge at 8000 xg for 1 minute at room temperature to elute the RNA adsorbed on the filter. The eluted RNA was used as it was in the next experiment, and the rest was stored at -80 ° C.
  • RNA is purified by the same method using extracellular vesicles (including exosomes) recovered by the same method, and a cDNA library is prepared for next-generation sequencing The analysis was done.
  • the next-generation sequence analysis is not limited as long as it is a device that reads an array.
  • the miRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 22 and 66 to 71 have a significantly higher abundance in patients with Alzheimer's disease than in healthy individuals, and SEQ ID NO: 23
  • the amount of miRNAs of ⁇ 65, 72-85, etc. was significantly less in patients with Alzheimer's disease than in healthy individuals.
  • the p-values of the t-tests of Examples 1 to 85 were all less than 0.05, which was shown to be effective for detection of Alzheimer's disease.

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Abstract

要約　アルツハイマー病を高精度に検出することを補助する、アルツハイマー病の検出を補助する方法が開示されている。アルツハイマー病の検出を補助する方法は、生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１～８５のいずれかで示されるmiRNA等の少なくとも１種の存在量を指標とする。塩基配列が配列番号１～２２、６６～７１のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA等の存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２３～６５、７２～８５のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA等の存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病を発症している可能性が大きいことを示す。

Description

アルツハイマー病の検出を補助する方法
　本発明は、アルツハイマー病の検出を補助する方法に関する。
　アルツハイマー病は、認知症の過半数を占める代表的な認知症であり、今後の高齢化社会において患者数は益々増えると考えられている。アルツハイマー病は、進行性であり、現在の医学では、完治させたり進行を完全に食い止めることはできないが、進行を遅らせる医薬や療法は存在する。したがって、アルツハイマー病をできるだけ早期に検出することが望まれる。現在、アルツハイマー病の診断は、問診や脳のMRI画像等により行われているが、早期のアルツハイマー病を検出することは容易ではない。
　早期にアルツハイマー病を検出すべく、血液中のマイクロRNA（以下、「miRNA」）の存在量を指標とする方法が提案されている（特許文献１～４、非特許文献１～３）。
特開2014-132863号公報 特表2014-520529号公報 EP 2733219 A1 WO2016/148073
Pavan Kumar et al., PLOS ONE, July 2013, Volume 8, Issue 7, e69807, pp.1-10 Petra Leindinger et al., Genome Biology 2013, 14:R78 Wang-Xia Wang et al., The Journal of Neuroscience, January 30, 2008, 28(5) 1213-1223
　上記の通り、種々のmiRNAが、アルツハイマー病検出のための指標として提案されているが、より正確にアルツハイマー病を検出することができれば有利であることは言うまでもない。
　したがって、本発明の目的は、アルツハイマー病を高精度に検出することを補助する、アルツハイマー病の検出を補助する方法を提供することである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、アルツハイマー病において存在量が増大又は減少するmiRNA、そのアイソフォーム (isomiR）、非コードRNA(ncRNA)、転移ＲＮＡ断片(tRF)、LincRNA及びMiscRNAを新たに見出し、これらを指標とすることにより、高精度にアルツハイマー病が可能になることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１、３、１２、２、４～１１、１３～８５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とするアルツハイマー病の検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号１～２２、６６～７１のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２３～６５、７２～８５のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病を発症している可能性が大きいことを示す、方法。
(2)塩基配列が配列番号１、３、１２、２、４～１１、１３～６５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA又はMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする、(1)記載の方法。
(3)塩基配列が配列番号配列番号１、３、１２、２、４～１１、４６～６５、８４、８５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、LincRNA又はMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする(1)記載の方法。
(4)塩基配列が配列番号配列番号１、３、１２、２、４～１１、４６～６５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片又はMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする(3)記載の方法。
(5)塩基配列が配列番号１、３、１２、１１のいずれかで示されるmiRNA、isomiR又はmiRNA前駆体の少なくとも１種の存在量を指標とする(1)記載の方法。
　本発明の方法によれば、高精度に、かつ、それでいて簡便にアルツハイマー病を検出することが可能であるので、アルツハイマー病の検出に大いに寄与する。
　上記の通り、本発明の方法では、生体から分離された被検試料中に含まれる特定のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA又はMiscRNA（以下、便宜的に「miRNA等」と呼ぶことがある）の存在量を指標とする。これらのmiRNA等（以下、便宜上、例えば「塩基配列が配列番号１で示されるmiRNA等」を単に「配列番号１のmiRNA等」や「配列番号１のもの」と呼ぶことがある）自体は公知であり、その塩基配列は配列表に示すとおりである。本発明の方法に用いるmiRNA等の一覧を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　下記表２に示されるように、これらのmiRNA等のほとんどは、アルツハイマー病患者の血清中の存在量と、健常者の血清中の存在量との比の対数（底が２の対数で「log FC」（FCは、fold change)と呼ばれる）の絶対値が1.0超のものであり（すなわち、比が２倍以上又は２分の１以下）、統計学的に有意(t検定でp<0.05)のものである。
　配列番号１～２２、６６～７１のmiRNA等は、アルツハイマー病患者中の存在量が健常者中の存在量よりも多いものであり、配列番号２３～６５、７２～８５のmiRNA等は、アルツハイマー病患者中の存在量が健常者中の存在量よりも少ないものである。
　これらの中でも、配列番号１、３、１１、１２、２、４～１０、４６～６５、８４、８５のmiRNA等は、log FCの絶対値が1.5以上のものであり、特に感度の高い指標となるものであり、好ましい。
　バイオマーカーの精度を示す指標としてROC曲線下面積(AUC(Area Under Curve))が用いられており、一般的にAUCが0.7以上のものがバイオマーカーとして有効であると言われている。AUCが0.90以上のものは高精度であり、0.97以上は非常に高精度、0.98以上は極めて高精度、1.00で完璧（偽陽性及び偽陰性が全くない）である。したがって、本発明においても、AUCが0.90のものが好ましく、さらに0.97以上のものが好ましく、さらに0.98以上のものが好ましく、さらに0.99以上のものが最も好ましい。配列番号１、３、１１、１２のmiRNA等がAUC 0.97以上で好ましく、これらのうち、配列番号１、３のmiRNA等がAUC0.98以上でさらに好ましく、配列番号１のmiRNAがAUC 1.00で最も好ましい。
　被検試料としては、miRNAを含む体液であれば特に限定されないが、通常、血液試料（血漿、血清及び全血を包含する）が好ましく用いられる。血清又は血漿を被検試料とすることが簡便で好ましい。
　各miRNA等の存在量の測定（定量）は、次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。次世代シーケンサーのように配列を読む機器であれば、機種は限定されない。下記実施例に具体的に記載されるように、本発明の方法では、定量するmiRNA等には、例えば、通常の成熟型miRNAの5'末端及び／又は3'末端からわずか１塩基以上が欠失又は付加されているだけのisomiRを、基本となるmiRNAと区別して定量する必要があるので、精度の観点から、miRNAの定量に広く用いられている定量的逆転写ＰＣＲ(qRT-PCR)よりも次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。具体的には下記実施例において詳細に記載するが、簡単に述べると、この定量方法は、例えば次のようにしておこなうことができる。血清又は血漿中に存在するRNAが一定である場合、それらを用いた次世代シークエンス解析において読まれたリード数のうち、ヒト由来のシーケンスを100万リード数に換算して、100万リード数当たりのそれぞれのisomiRや成熟型miRNAのリード数を測定値とする。疾患によって健常人に比較して血清中または血漿中のRNAが変化する場合は、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAを用いる場合がある。なお、血清又は血漿中のmiRNA等を定量する場合には、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAであるlet-7g-5p、miR-425-3p及びmiR-425-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のmiRNAを内部標準として用いることが好ましい。
　判定に用いる、各miRNA等の存在量のカットオフ値としては、各miRNA等について、健常者に対する統計学的有意差(t検定で、p<0.05、好ましくはp<0.01、さらに好ましくはp<0.001)の有無を基準とすることが好ましい。具体的には、好ましくは、例えば、偽陽性率が最良の値（最も低くなる値）なるプロット点におけるlog2リード数（カットオフ値）を各miRNA等について設定することができ、例えば、いくつかの各miRNA等におけるカットオフ値(log2リード数)は表２に示すとおりである。なお、表２に示されるカットオフ値は、単なる例に過ぎず、統計学的有意差が出る限り、他の値をカットオフ値として採用することができる。また、データを採取する患者及び健常者の集団が異なれば、最良のカットオフ値も異なる。もっとも、通常、表２に示されるカットオフ値の±２０％の範囲内、特には±１０％の範囲内でカットオフ値を設定することができる。
　また、基本型が同一のmiRNA等であっても、miRNAと各種isomiRとでは、患者と健常者の間で存在量が異なる。したがって、一人の患者における、基本型が同一のmiRNAやisomiRを測定し、その比に基づいてアルツハイマー病の検出を補助することができる。なお、このように、あるmiRNA及びそのisomiRの存在量を測定する場合には、微妙な塩基配列の違いを的確に区別する必要があるため、通常miRNAの定量に用いられている定量的逆転写ＰＣＲ(qRT-PCR)よりも次世代シーケンサーを用いて行うことが好ましい。
　なお、上記した各miRNA等は、アルツハイマー病患者と健常者の間でそれぞれ統計学的有意差を持つので、単独で指標として用いることもできるが、複数のmiRNA等を組み合わせて指標としてもよく、その場合にはさらに正確なアルツハイマー病検出の補助が可能になる。
　また、アルツハイマー病が疑われるか又はアルツハイマー病に罹患するヒトの被検試料中のmiRNA等の存在量を検出する方法も提供される。すなわち、
　アルツハイマー病が疑われるか又はアルツハイマー病に罹患するヒトの被検試料中の塩基配列が配列番号１、３、１１、１２、２、４～１０、１３～８５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの少なくとも１種の存在量を検出する方法であって、
　ヒトから血液試料を得る工程、及び
　次世代シーケンサーまたはqRT-PCRを用いて、前記血液試料内のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量を測定する工程を含み、
　ここで、塩基配列が配列番号１～２２、６６～７１のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量が健常者よりも多い、又は塩基配列が配列番号２３～６５、７２～８５のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量が健常者よりも少ない、方法、も提供される。
　また、上記した本願発明の方法により、アルツハイマー病が検出された場合、アルツハイマー病が検出された患者に有効量のアルツハイマー病治療薬を投与することにより、アルツハイマー病を治療することができる。アルツハイマー病治療薬としては、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチン等を挙げることができる。
　以下、本発明を実施例及び比較例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１～８５
１．　材料及び方法
(1)　臨床検体
　アルツハイマー病患者４３例、健常者３２例の血漿を用いた。
(2)　血清中のＲＮＡの抽出
　血清中 RNA の抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。
1) 凍結した血清サンプルを融解し、10000 rpm で 5 分間、室温で遠心し、凝集タンパク質や血球成分を沈殿させた。
2) 上清 200 μＬ を新しい 1.5 mL チューブ に移した。
3) 1000 μＬ の QIAzol Lysis Reagent を加えて十分に混和し、タンパク質成分を変性した。
4) RNA 抽出のコントロール RNA として 0.05 nM cel-miR-39 を 10 μＬ 加え、ピペッティングで混和した後、室温で 5 分間静置した。
5) 水層と有機溶媒層の分離促進のため、200μＬのクロロホルムを加え、十分に混和し、室温で 3 分間静置した。
6) 12000 xg、15分間、4℃で遠心し、上層の水層650μＬを新しい2mLチューブ に移した。
7) RNA を析出させるため、975μＬの 100% エタノールを加え、ピペッティングで混和した。
8) 650 μＬ の 7) を miRNeasy Mini spin column (以下、カラム) に移し、室温で 1 分間静置後、8000 xg、15 秒間、室温で遠心し、RNA をカラムのフィルターに吸着させた。カラムから通過した溶液は廃棄した。
9) 7) の溶液を全てカラムに通すまで 8) を繰り返し、全ての RNA をフィルターに吸着させた。
10) フィルターに付着した夾雑物の除去のため、650 μＬ の Buffer RWT をカラムに加え、 8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
11) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
12) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、2 分間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
13) フィルターに付着している溶液を完全に除去するため、カラムを新しい 2 mL collection チューブ に移し、10000 xg、1 分間、室温で遠心した。
14) カラムを 1.5 mL チューブ に移し、50 μＬ の RNase-free water を加え、室温で 1 分間静置した。
15) 8000 xg、1 分間、室温で遠心し、フィルターに吸着した RNA を溶出した。溶出した RNAは、そのまま次の実験に用い、残りは -80 ℃ で保存した。
(4)　miRNA等の定量
　miRNA等の定量は、次のようにして行った。二群等でmiRNA等の定量を行う場合は、同様の方法で回収した細胞外小胞(エクソソームを含む)を用いて同様の方法でRNAを精製してcDNAライブラリーを作成して次世代シークエンス解析を行った。なお、次世代シークエンス解析は、配列を読む機器であれば機器は限定されない。
２．　結果
　結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　これらの結果からわかるように、これらの配列のうち、配列番号１～２２、６６～７１のmiRNA等はアルツハイマー病患者中の存在量が健常者中の存在量よりも有意に多く、配列番号２３～６５、７２～８５のmiRNA等は、アルツハイマー病患者中の存在量が健常者中の存在量よりも有意に少なかった。また、実施例１～８５のt検定によるp値はいずれも0.05未満であり、アルツハイマー病の検出に有効であることが示された。

Claims (5)

  1. 　生体から分離された被検試料中に含まれる、塩基配列が配列番号１、３、１２、２、４～１１、１３～８５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とするアルツハイマー病の検出を補助する方法であって、塩基配列が配列番号１～２２、６６～７１のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量が健常者よりも多いこと、又は塩基配列が配列番号２３～６５、７２～８５のいずれかで示される少なくとも１種のmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA若しくはMiscRNAの存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病を発症している可能性が大きいことを示す、方法。
  2. 　塩基配列が配列番号１、３、１２、２、４～１１、１３～６５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、ncRNA、転移RNA断片、LincRNA又はMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする、請求項１記載の方法。
  3. 　塩基配列が配列番号１、３、１２、２、４～１１、４６～６５、８４、８５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片、LincRNA又はMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする請求項１記載の方法。
  4. 　塩基配列が配列番号１、３、１２、２、４～１１、４６～６５のいずれかで示されるmiRNA、isomiR、miRNA前駆体、転移RNA断片又はMiscRNAの少なくとも１種の存在量を指標とする請求項２記載の方法。
  5. 　塩基配列が配列番号１、３、１２、１１のいずれかで示されるmiRNA、isomiR又はmiRNA前駆体の少なくとも１種の存在量を指標とする請求項４記載の方法。
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