CN111826444B - 一种与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物、探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物及其应用。该标志物为tRF‑Pro‑AGG‑004和/或tRF‑Leu‑CAG‑002。本发明筛选出的tsRNA对胰腺癌病人检测的特异性和灵敏度显著高于目前临床上使用的蛋白标志物，大大提高了诊断的准确性。该标志物可用于制备诊断试剂盒，用于胰腺癌的辅助早期诊断。

Description

一种与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物、探针及其应用

发明领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物、探针及其应用。

背景技术

胰腺癌俗称“癌中之王”，是恶性程度最高的消化道肿瘤类型之一，死亡率高居世界第三。据统计，2018年全球新发胰腺癌病例达45.9万，死亡病例达43.2万。胰腺癌预后较差，5年存活率仅5％左右,中位生存期低于6个月，严重威胁人类健康，是亟待解决的重大问题。

胰腺癌早期诊断比较困难。目前，CT、超声内镜、MRI/磁共振胰胆管造影(MRCP)是胰腺癌常用的诊断方式，但绝大部分(80-90％)病人一经诊断就处于晚期，发生了肿瘤转移等情况，失去了早期手术治疗的机会，且晚期病人对放疗和化疗不敏感。因此，筛选敏感有效的生物标志物，在早期对胰腺癌进行诊断检测，是提高胰腺癌患者治疗效果、延长患者生存期的有效途径。

非编码小RNA是近年来肿瘤分子生物学研究领域的热点，RNA高通量测序技术的发展帮助人们发现和鉴定了多种新型非编码小RNA，其中一类被命名为tRNA来源的小RNA(tRNA-derived small RNAs，tsRNAs)。tsRNA长约18-40nt,来源于tRNA成熟体或前体。近期研究发现tsRNA参与调节多种生理、病理功能，包括应激、翻译调控、神经系统疾病、病毒感染、表观遗传等等。研究发现，tsRNA与肿瘤发生发展密切相关，已经有报道发现tsRNA在肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌和急性髓细胞白血病中异常表达，与肿瘤的发生发展密切相关。

近年来，大量研究发现体液中稳定存在的非编码小RNA可作为疾病诊断的分子标志物，且比传统的特异性蛋白标记方法更加有效。近期有研究发现tsRNAs在血清中也能稳定存在且含量丰富，但是，tsRNA与胰腺癌方面的相关研究目前尚未见报道，如果能筛选到胰腺癌中异常表达的血清/血浆tsRNAs作为生物标志物，并研发相应的诊断试剂盒，对胰腺癌的诊断现状将会有大大的推动。

发明内容

本发明的主要目的是针对上述问题，提出一种与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物、以及该血清/血浆tsRNA标志物在制备胰腺癌诊断试剂盒中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物，所述的血清/血浆tsRNA标志物为以下序列中的中的任意一种或组合：

tRF-Pro-AGG-004：SEQ ID No.1；

tRF-Leu-CAG-002：SEQ ID No.2。

本发明提供了一种探针，所述探针能特异性捕获包括上述的与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物。该探针是由Applied Biosystems公司定制合成的TaqMan tsRNA探针。

本发明提供了上述的血清/血浆tsRNA标志物、探针在胰腺癌诊断试剂盒制备中的应用。

本发明提供了一种胰腺癌诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血清/血浆中的上述的tsRNA标志物的一种或多种的表达量。

进一步的技术方案，所述的试剂盒中包括上述的探针。

进一步的技术方案，所述的试剂盒还包括PCR反应常用的试剂和酶。

进一步的技术方案，所述的试剂盒包括dNTP/AMV逆转录酶及缓冲液、MgCl2、DEPC水和Taq酶等。

本发明的有益效果：

本发明提供的血清/血浆tsRNAs标志物作为胰腺癌诊断的标志物的优势在于：

(1)与传统蛋白生物标志物不同，血清/血浆tsRNAs是一种新型生物标志物，表达稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，有助于胰腺癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供参考。

(2)本发明系统的研究了血清/血浆tsRNAs在胰腺癌诊断中的作用，揭示了其对胰腺癌筛查和诊断的临床价值。因此，本发明获得了胰腺癌血清/血浆tsRNAs标志物；通过血清/血浆tsRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得胰腺癌的诊断更加方便易行，为临床治疗提供基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

(3)血清/血浆tsRNAs试剂盒是一种全面系统的诊断和监测试剂盒，可用于胰腺癌患者的辅助早期诊断，有助于反映胰腺癌患者的疾病状态，为临床治疗提供更好的支持。

(4)本发明采用严密的设计和评价体系，初期采用高通量测序技术对血清/血浆tsRNAs进行直接测序，并通过qRT-PCR对大样本进行了多阶段验证，采用了两种不同分析方法(绝对定量和相对定量)进行验证；保证了血清/血浆tsRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

附图说明

图1为胰腺癌病人组与健康对照组血清中表达差异最显著的26种tsRNA的测序热图。

图2为2种tsRNA标志物在胰腺癌病人组与健康对照组血清的表达水平。

图3为2种tsRNA标志物分别对胰腺癌病人和健康对照组的诊断效果的ROC图。

图4为与CA19-9、CEA对比，联合2种tsRNA组合物对胰腺癌病人与健康对照组的诊断效果的ROC图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例

一种与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物，所述的血清/血浆tsRNA标志物为以下序列中的中的任意一种或组合：

tRF-Pro-AGG-004：SEQ ID No.1；

tRF-Leu-CAG-002：SEQ ID No.2。

一种探针，所述探针能特异性捕获包括上述的与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA标志物。该探针是由Applied Biosystems公司定制合成的TaqMan tsRNA探针。

上述的血清/血浆tsRNA标志物、探针在胰腺癌诊断试剂盒制备中的应用。

一种胰腺癌诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血清/血浆中的上述的tsRNA标志物的一种或多种的表达量。

所述的试剂盒中包括上述的探针。所述的试剂盒还包括PCR反应常用的试剂和酶。所述的试剂盒包括dNTP/AMV逆转录酶及缓冲液、MgCl2、DEPC水和Taq酶等。

本发明首先分离了胰腺癌病人及与病人年龄性别等信息匹配的健康对照的血清/血浆样本，提取RNA进行tsRNA测序分析，经过初步筛选后通过大样本进行验证，进而筛选出一组与胰腺癌高度相关的且具有较高敏感性和特异性的tsRNA标志物，并基于此研发出可应用于胰腺癌临床诊断的试剂盒，为胰腺癌的筛查和早期诊断提供基础。

本发明解决问题的技术方案包括：

(1)以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血样，系统收集完整的临床病例信息资料。

(2)血清/血浆tsRNA差异表达谱筛选分析：筛选胰腺癌患者、与胰腺癌患者年龄性别相匹配的健康人对照，分离血清/血浆，通过测序分析血清/血浆tsRNA表达谱，筛选出差异表达的tsRNAs并通过大样本进行多阶段验证。

(3)对前面筛选到的差异表达的血清/血浆tsRNAs进行定量分析，明确与胰腺癌发病相关的血清/血浆tsRNAs。

(4)基于以上筛选到的血清/血浆tsRNA，研发诊断试剂盒。

本发明按照SOP收集符合标准的血样，收集完整的病理学资料(包括年龄、性别、病理类型、WHO分级、TMN分期等)，接着采用小RNA高通量测序、Real-timePCR等方法进行检测。

具体来说包括以下几个部分：

(1)收集病人样本：①经影像学诊断、病理学确认的胰腺癌病例；②所有样本为术前，未经放化疗和新辅助治疗的；③健康对照为与病人年龄性别匹配的正常人。本发明共采用204例符合标准的胰腺癌病人血清/血浆样本进行研究。

(2)使用Trizol(Invitrogen life technologies)法提取血清/血浆总RNA。

(3)RNA质量检测：通过变性琼脂糖凝胶电泳检测28S和18S核糖体RNA条带。

(4)小RNA高通量测序：

①将以上提取的总RNA进行PAGE电泳回收；

②tsRNAs被大量的RNA修饰，会干扰小RNA seq文库的构建。在对总RNA样本进行文库准备之前，先进行以下处理：将链接引物(adaptor prime)酶联在小RNA分子的3′与5′端：所有sRNA文库构建和深度测序均由Aksomics(中国上海)完成。测序文库的大小选择用于RNA生物类型测序使用自动凝胶切割器。利用安捷伦生物分析仪2100对这些文库进行了严格的定量分析。根据安捷伦生物分析仪2100构建sRNA文库。Illumina NextSeq仪器标准小RNA测序，测序类型为50bp单读。

③进行RT-PCR反应后进行测序

④数据分析与处理

(5)qRT-PCR方法

①提取血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；

②使用Applied Biosystems公司的TaqMan tsRNA茎环引物进行逆转，合成cDNA；

③使用Applied Biosystems公司的TaqMan tsRNA荧光探针进行PCR反应；

④检测比较胰腺癌患者与健康正常对照血清/血浆样本中tsRNA的表达变化。

(6)制备胰腺癌tsRNA诊断试剂盒

①前期通过小RNA高通量测序检测胰腺癌患者和正常对照之间的拷贝差异和表达差异的tsRNA，通过qRT-PCR技术进一步对胰腺癌患者和健康对照中差异较显著的血清/血浆tsRNA进行检测，作为辅助胰腺癌诊断的指标。最后筛选到与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA组成诊断标志物(tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002)。在此基础上研发胰腺癌诊断试剂盒，该试剂盒包括两个tsRNA的探针，寄AMV逆转录酶、Taq酶、MgCl2，DEPC水和dNTP等试剂。

(7)数据分析

所有统计检验均使用GraphPad Prism软件7(圣地亚哥，CA)进行。数据以平均值±SEMs表示。P<0.05为差异有统计学意义。组间样本的正态性和等方差分别用Shapiro-Wilk检验和Brown-Forsythe检验进行评估。当样本组间达到正态性和方差相等时，采用单因素方差分析(随后采用Bonferroni多重比较检验)、双因素方差分析(随后采用Bonferroni多重比较检验)或t检验。

以下是本发明进一步的说明：

在探索阶段，发明人分别对30例胰腺癌血清和30例健康对照血清，运用小RNA高通量测序，通过筛选发现有26种tsRNAs(细胞质的tsRNAs来自GtRNAdb数据库；线粒体的tsRNA由tRANscan-SE软件预测产生)在胰腺癌血清样本中发生显著变化(变化倍数>10)，结果如图1所示。

根据测序结果，发明人选择了在胰腺癌患者中表达升高的tsRNAs进行分析(升高倍数>10)，共10种符合要求，考虑到长度等限制因素，其中有6种tsRNA可以由AppliedBiosystems公司定制合成相应的的TaqMan探针进行检测，包括：tRF-Pro-AGG-004、tRF-Leu-CAG-002、tRF-Ile-AAT-019、tRF-Gly-CCC-045、tRF-Pro-AGG-005和tRF-Leu-CAA-001。

分别采用两种分析方法对以上6种tsRNAs进行检测，基于以下两种方法，对有统计学显著差异的tsRNAs在另外24例胰腺癌病例和24例对照中进行进一步进行一一验证，进而观察本研究结果的稳定程度。

(1)绝对定量分析:合成相应的tsRNA标准品，制作标准曲线，分别提取100uL血清样本中的RNA，通过QRT-PCR检测，得到样本CT值，通过标曲计算得到绝对浓度。

(2)相对定量分析：在每一个血清样本(100uL)提取时加入植物来源的MIR2911作为外参，tsRNAs检测的表达水平以2^-ΔCt表示，其中ΔCt＝CT样本-CT外参，计算相对表达量。

绝对定量法和相对定量分析方法结果显示，同时满足上述两种筛选条件的tsRNAs包括两种：tRF-Pro-AGG-004，序列如SEQ ID No.1所示；和tRF-Leu-CAG-002，序列如SEQ IDNo.2，二者在胰腺癌病例组和健康对照组中的表达存在显著差异。

根据以上结果，接着在另外100例健康对照和150例胰腺癌患者血清中对上述两种tsRNA进行进一步检测验证，结果显示，tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002在胰腺癌样本中显著升高，结果如图2所示。

进一步分析上述两种tsRNAs用于胰腺癌诊断的效果，ROC曲线(ReceiverOperatingCharacteristicCurve，受试者工作特征曲线)分析发现tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002对胰腺癌有较好的诊断效果，结果如图3所示。

进一步分析显示，两种tsRNA组合对胰腺癌发病诊断的AUC【Area Under the ROCCurve，ROC曲线下面积】与单个tsRNA相比增加。将上述两种tsRNA组合与现有的胰腺癌诊断标志物CEA和CA19-9进行对比分析，结果显示，tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002组合标志物对胰腺癌诊断呈现更高的敏感性和特异性，结果如图4所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京大学

<120> 一种与胰腺癌相关的血清/血浆tsRNA 标志物、探针及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgc 30

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atcccactcc tgacacca 18

Claims (2)

1.血清/血浆tsRNA 标志物在胰腺癌诊断试剂盒制备中的应用，其特征在于，所述的血清/血浆tsRNA 标志物为以下序列中的任意一种或组合：

tRF-Pro-AGG-004：SEQ ID No.1；

tRF-Leu-CAG-002：SEQ ID No.2。

2.一种探针在胰腺癌诊断试剂盒制备中的应用，其特征在于，所述探针能特异性捕获权利要求1中的所述的血清/血浆tsRNA 标志物。

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