CN108424960B - 一种LncRNA作为深静脉血栓形成诊断标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了血清中LncRNA ENST00000513368作为深静脉血栓形成诊断标志物的应用，并以LncRNA ENST00000513368作为诊断深静脉血栓形成的诊断标志物，开发了相应的检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高、特异性高、检测方便，满足诊断深静脉血栓形成病人的检测需求，经临床验证诊断准确率高。

Description

一种LncRNA作为深静脉血栓形成诊断标志物的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及血清中LncRNA ENST00000513368作为深静脉血栓形成诊断标志物的应用。
背景技术
深静脉血栓形成(DVT)是常见的周围血管疾病，年发病率约1.6‰，且45岁之后发病率迅速增长。DVT急性期肺栓塞并发症是常见急性致死原因，慢性期则多见静脉瓣膜破坏所导致的患肢肿胀、淤积性皮炎、顽固性小腿溃疡等后遗症，严重危害患者生命与健康，因此对DVT进行快速、准确的诊断具有重要的临床意义。但是DVT的临床症状和体征缺乏特异性，根据这些诊断或排除DVT已被证实不准确。D-二聚体(D-dimer)是目前临床用于诊断DVT的主要生物学指标，但并不是血栓栓塞性疾病的特异性血清学指标，在感染、外伤、肿瘤等疾病中D-dimer表达均可升高。超声影像检查对于DVT的诊断有重要意义，但存在价格偏于昂贵、受仪器设备限制、对检查医生专业能力要求高等因素影响。因此，寻找特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作方便的生物学指标对DVT临床诊断与治疗具有重要的意义。
随着深度测序技术的发展和多个基因组计划的完成，大量非编码RNA被鉴定出来，越来越多的研究发现这些曾经因不能编码蛋白质而被称为基因组中的“暗物质”或“垃圾RNA”在许多生命活动过程中扮演了重要角色。非编码RNA表观遗传研究是近期最热的生物学课题之一，层出不穷的研究结果不断地刷新着人们对非编码RNA的认识。circRNA是继microRNA之后新近确认的一类特殊的非编码RNA分子，是RNA家族一颗冉冉升起的极具发展潜力的新星，虽然大规模研究时间不长，但相关论文陆续发表在NCS等重量级期刊杂志上。LncRNA是指长度大于200个核苷酸的RNA，不具有编码蛋白质的开放阅读框，大多是由RNA聚合酶II编码、剪接生成，并且聚腺苷酸化。LncRNA可通对靶基因mRNAs进行转录后调控或翻译后修饰等机制，发挥表观遗传学调控作用，在细胞生长发育中具有重要做用，参与了疾病的发生与发展。相较于编码RNA，非编码RNA在疾病诊断中具有无可比拟的优势。编码RNA在转录翻译过程中会受到各种调控，不能准确反映最终功能产物，即蛋白质的水平。而非编码RNA不编码蛋白质，所受的调控相对较少，灵敏度、特异性和稳定性更高，可以作为更有效的诊断生物学指标。
综上所述，目前有必要探寻新的有效的非编码RNA作为深静脉血栓形成临床诊断、治疗和预后检测的标记物，为诊断、治疗深静脉血栓形成和研发相关药物提供依据。
发明内容
针对以上现有技术，发明人经过大量的技术研究和长期的临床实践，提供了一种诊断深静脉血栓形成的相关产品，以及提供LncRNA ENST00000513368作为深静脉血栓形成标志物的应用。
在本发明的第一个方面，提供了LncRNA ENST00000513368作为深静脉血栓形成诊断标志物在制备用于诊断深静脉血栓形成产品中的应用。
其中，所述LncRNA ENST00000513368的核酸序列如下：
GTTTAAGTCACTGGTGCCAGTTCCTGCTACTTGTTTCACTTTTTATTTGTTCACTTTTCAGACATCACACATGTTCCGTAAAATTTAAGCTTCCTTTAAAAACATACCATACTACCATTTTCTTTATCTCTTTTTTCAACTCTTTTGTTTTTTTTTAAAGGGAGCTTGTATTTTGAATATGCTCAAGGATTTTCTGGGTGAGGAGAAATTCCAGAAAGGAATAATTCAGTACTTAAAGAAGTTCAGCTATAGAAATGCTAAGAATGATGACTTGTGGAGCAGTCTGTCAAATAGTTGTTTAGAAAGTGATTTTACATCTGGTGGAGTTTGTCATTCGGATCCCAAGATGACAAGTAACATGGTAAGGATAAAGAGAGTCACAGAGTAGAAGAGATCTGTGGAATAGCCTGACCT
进一步的，所述LncRNA ENST00000513368为血清样本中的LncRNAENST00000513368。
本发明的第二个方面，提供了检测LncRNA ENST00000513368的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断深静脉血栓形成产品中的应用。
进一步的，所述试剂盒至少包括针对LncRNA ENST00000513368的正向引物5'-TCAGACATCACACATGTTCCGT-3'和反向引物5'-TCACCCAGAAAATCCTTGAGCA-3'。
进一步的，所述基因芯片至少包括与LncRNA ENST00000513368的核酸序列杂交的探针。
进一步的，所述产品能够通过检测血清中LncRNA ENST00000513368表达水平来诊断患者是否患有深静脉血栓形成，LncRNA ENST00000513368低表达与深静脉血栓形成的发生发展相关。
更进一步的，所述检测LncRNA ENST00000513368的表达水平的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片或基因测序检测LncRNA ENST00000513368的表达水平以诊断深静脉血栓形成的产品。
本发明的第三个方面，提供了一种用于诊断深静脉血栓形成的产品，该产品的特点是：所述产品能够通过检测血清中的LncRNA ENST00000513368表达水平来诊断深静脉血栓形成，高通量检测结果显示LncRNA ENST00000513368在DVT组表达较正常人显著降低。
进一步的，所述产品为芯片或检测试剂盒；其中芯片包括与LncRNAENST00000513368的核酸序列杂交的探针。
进一步的，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制qPCR反应体系的试剂。
本发明的第四个方面，提供LncRNA ENST00000513368在制备治疗深静脉血栓形成的药物中的应用。
进一步的，所述药物为LncRNA ENST00000513368的激动剂。
与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果是：
(1)本发明经过高通量深度测序及扩大临床样本表达验证，筛选得到LncRNAENST00000513368能够作为诊断深静脉血栓形成的标志物，其诊断效率较高。
(2)本发明为将来研制提高LncRNA ENST00000513368表达水平的药物提供了依据。
(3)本发明以LncRNA ENST00000513368作为诊断深静脉血栓形成的诊断标志物，开发了相应的检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高、特异性高、检测方便，满足诊断深静脉血栓形成病人的检测需求，经临床验证诊断准确率高。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：差异LncRNA筛选。
图2：LncRNA ENST00000513368表达验证。
图3：ROC Curve图，A为LncRNA ENST00000513368ROC曲线图，B为D-dimerROC曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
术语解释：
LncRNA ENST00000513368：长链非编码核糖核酸ENST00000513368，核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
正如背景技术所介绍的，现有技术中采用D-二聚体等作为诊断深静脉血栓形成存在一定的不足，为了解决如上的技术问题，本发明通过高通量深度测序，筛选得到LncRNAENST00000513368能够作为深静脉血栓形成诊断标志物。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述LncRNA ENST00000513368为血清样本中的LncRNA ENST00000513368。
在本发明的一个具体实施例中，涉及的具体技术方案包括：
(1)收集DVT患者及健康人静脉血(每组各6例)，分离单个核细胞，高通量测序筛选差异LncRNA。
(2)扩大样本量(每组各50例)，荧光实时定量PCR(qPCR)验证筛选差异LncRNA表达。
(3)临床资料(年龄、性别)分析。
(4)Logistic回归模型分析。
(5)ROC曲线分析检验效能及最佳cutoff值。
在本发明的一个典型实施方式中，提供了检测LncRNAENST0000051336的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断深静脉血栓形成产品中的应用。
在本发明的一个具体实施方式中，所述试剂盒至少包括针对LncRNAENST00000513368的正向引物5'-TCAGACATCACACATGTTCCGT-3'和反向引物5'-TCACCCAGAAAATCCTTGAGCA-3'。
在本发明一个具体实施方式中，所述基因芯片至少包括与LncRNAENST00000513368的核酸序列杂交的探针。
在本发明的一个具体实施方式中，所述产品能够通过检测血清中LncRNAENST00000513368表达水平来诊断患者是否患有深静脉血栓形成，LncRNAENST00000513368低表达与深静脉血栓形成的发生发展相关。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述检测血清中LncRNA ENST00000513368的表达水平的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片或基因测序检测LncRNA ENST00000513368的表达水平以诊断深静脉血栓形成的产品。
其中，所述基因测序能够检测基因表达水平的相对变化，例如Illumina测序。Illumina平台是一种基于边合成边测序技术(Sequencing-By-Synthesis，SBS)的测序方法。由于可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息。高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列，称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储。利用hisat2将Clean Reads与指定的参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息。一个基因表达水平的直接体现就是其转录本的丰度情况，转录本丰度程度越高，则基因表达水平越高。在转录组测序分析中，可以通过定位到转录本外显子区的测序序列(reads)的计数来估计基因的表达水平。转录本表达量的计算使用FPKM法(Fragments Per kb Per MillionReads)，是每百万fragments中来自某一转录本每千碱基长度的fragments数目。FPKM同时考虑了测序深度和转录本长度对fragments计数的影响，是目前最为常用的转录本表达水平估算方法。FPKM计算公式如下：
Figure BDA0001667693200000051
在本发明的一个典型实施方式中，提供了一种用于诊断深静脉血栓形成的产品，该产品的特点是：所述产品能够通过检测血清中的LncRNA ENST00000513368表达水平来诊断深静脉血栓形成，高通量检测结果显示LncRNA ENST00000513368在DVT组表达较正常人显著降低。
在本发明的一个具体实施方式中，所述产品为芯片或检测试剂盒；其中芯片包括与LncRNA ENST00000513368的核酸序列杂交的探针。
在本发明的一个具体实施方式中，对于检测试剂盒，检测体系包括反转录反应体系和qPCR反应体系，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制qPCR反应体系的试剂。
在本发明的一个具体实施例中，用于配制反转录反应体系的试剂至少包括反转录缓冲液(MLV-5×buffer)、dNTP混合液、RNA酶蛋白质抑制剂(RNAsin)、反转录酶液(M-MLV)和多聚胸腺嘧啶(OligodT)。
在本发明的一个具体实施例中，用于配制qPCR反应体系的试剂至少包括针对LncRNA ENST00000513368的正向引物液和反向引物液，还包括SYBR Green混合液、无核酸酶纯水。
在本发明的一个典型的实施方式中，提供LncRNA ENST00000513368在制备治疗深静脉血栓形成的药物中的应用。
在本发明的一个具体实施方式中，所述药物为LncRNA ENST00000513368的激动剂，所述LncRNA ENST00000513368的激动剂是指能够提高LncRNA ENST00000513368表达水平的产品，该产品包括：LncRNA ENST00000513368过表达载体、LncRNA ENST00000513368转录激活型Cas9-VP64-sgRNA共表达载体和提高LncRNA ENST00000513368表达水平的化合物、组合物或试剂等。其中，LncRNA过表达载体(例如慢病毒表达载体、腺病毒表达载体)和转录激活型Cas9-VP64-sgRNA共表达载体已经商业化，也可通过常规的技术手段制备得到。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
1.实验对象纳入与排除标准：
(一)病例来源
全部病例均来源于2016年06月至2017年12月山东中医药大学附属医院周围血管病科住院与门诊病人，共50例。正常对照组血样均来自于山东中医药大学附属医院健康查体者，为无心、脑、肺、肝、肾疾病和血栓性疾病，无已知影响研究指标疾病，共50例。
(二)诊断标准
下肢深静脉血栓形成诊断标准
(1)患肢胀痛或剧痛，股三角区或小腿有明显压痛；患肢皮肤呈暗红色，温度升高。
(2)多有卧床、手术、创伤、恶性肿瘤、旅行、血栓倾向、既往静脉血栓栓塞史、妊娠等DVT危险因素。
(3)超声多普勒、静脉血流图和静脉造影等可以明确诊断。
(三)病例选择标准
1).纳入病例标准
(1)20～80岁患者。
(2)单纯下肢深静脉血栓形成者。
2).排除病例标准
(1)年龄小于20岁或者大于80岁者。
(2)合并心、脑、肺疾病及肝、肾功能异常等严重并发症者。
(3)精神病患者。
(4)排除急性动脉栓塞、急性淋巴管炎、原发性盆腔肿瘤、小腿损伤性血肿、小腿肌纤维组织炎等疾病。
2.高通量检测
收集DVT及健康人外周血，Illumina Hiseq Xten高通量测序平台检测转录组表达；Feature Extraction软件和Genespring软件对数据进行标准化分析，筛选差异circRNA和LncRNA。
3.qPCR验证差异LncRNA表达：
(1)细胞提取RNA
取5×106～1×107个细胞，加入1ml Trizon，充分混匀，室温静置5-10min；加入200μl/1mlTrizon氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15s；4℃离心：12000rpm×10min，取上层水相于一新的EP管中；加入等体积异丙醇，温和颠倒混匀，室温放置10min；4℃离心：12000rpm×10min；弃上清，加入1ml 75(v/v)％乙醇(无水乙醇：DNase/RDase-free water＝3:1)，轻轻混匀；4℃离心：12000rpm×5min；弃上清，加入1ml无水乙醇；4℃离心，12000rpm×5min；弃上清(尽量将残余液体除去)，室温或真空干燥10～20min；根据RNA沉淀量加入适量DNase/RDase-free water(通常为30-50μl)溶解RNA；混匀后测浓度并记录，进行逆转录。
(2)RT实验
取0.2mlEP管标记样本名称和日期，将RNA、DNase/RDase-free water、OligodT按要求加入到标记好的EP管中；运行RT-1程序，70℃，5min(表1)；按体系配制好的MLV-5×buffer、dNTP、RNAsin、M-MLV的MIX加入到上述EP管中，运行RT-2程序，42℃，1h，得到cDNA，进行PCR实验(表2)。
表1.RNA与OligodT
体系体积 20μl
RNA 11μl
DNase/RDase-free water 11-V1
OligodT 1μl
RNA使用体积V1 2000ng/C1
表2.逆转录反应体系
Figure BDA0001667693200000071
Figure BDA0001667693200000081
(3)qPCR实验：SYBR、引物及cDNA溶解后，瞬时离心，混匀，置于冰上；DNase/RDase-free water。
表3.PCR反应体系(20μl)
反应体系 20μl
引物F(10μm) 1.2μl
引物R(10μm) 1.2μl
SYBR 10μl
cDNA 2μl
DNase/RDase-free water 5.6μl
瞬时离心；运行7500程序，条件按下表设置。
表4.PCR程序
Figure BDA0001667693200000082
表5.LncRNA ENST00000513368引物序列
Figure BDA0001667693200000083
Figure BDA0001667693200000091
4.统计学分析：
采用SPSS22.0软件(SPSS Inc.,USA)。连续变量采用中位数(Median)和平均值±标准差(
Figure BDA0001667693200000093
)表示；计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线和计算相应的曲线下面积(AUC)来判断诊断能力。最佳cutoff值选取为灵敏度和特异性之和最大所对应的值。采用medcale10.4.7.0软件比较曲线下面积AUC差异性。P<0.05(双侧)为有统计学差异。采用R软件分析检验效能及样本大小，R≥0.8为具有检验效能。
结果
1.高通量检测结果
高通量结果显示，circ_0021132、circ_0005396、LncRNA ENST00000513368、LncRNA NONHSAT175366在DVT组表达较正常对照组显著不同，其中，如图1所示，LncRNAENST00000513368在DVT组表达较正常对照组显著降低，P<0.05。而关于circ_0021132、circ_0005396和LncRNA NONHSAT175366的具体技术方案，本专利申请人已经作为其他专利申请进行保护。
2.qPCR验证LncRNA ENST00000513368表达：
如图2所示，与正常对照组比较，DVT组LncRNA ENST00000513368表达显著降低(P<0.05)。
3.两组临床资料分析
(1)性别：正常对照组男性23例，女性27例；DVT患者男性21例，女性29例，具体组间性别分布见表6，组间性别比较差异无显著性(P>0.05)，有可比性(见表6)。
表6.组间性别比较
Figure BDA0001667693200000092
注：组间性别分布经χ2检验，P>0.05。
(2)年龄：组间年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性(见表7)。
表7.组间年龄比较
Figure BDA0001667693200000101
Figure BDA0001667693200000102
注：两组间年龄间比较应用t检验，P>0.05。
4.Logistic回归分析：见表8。
表8.Logistic回归分析
Figure BDA0001667693200000103
Model1:以ENST00000513368为自变量、以DVT诊断为因变量构建单因素Logistic回归模型；
Model2:以年龄、ENST00000513368为自变量、以DVT诊断为因变量构建多因素Logistic回归模型；
Model3:以性别、ENST00000513368为自变量、以DVT诊断为因变量构建多因素Logistic回归模型；
Model4:以性别、年龄、ENST00000513368为自变量、以DVT诊断为因变量构建多因素Logistic回归模型。
以ENST00000513368为自变量构建单因素Logistic回归模型和分别校正年龄、性别及同时校正年龄和性别后所构建的多因素Logistic回归模型结果显示，校正和不校正所得到的统计学结果是一致的，因此确定ENST00000513368具有诊断DVT的潜力。
5.ROC曲线分析检验效能及最佳cutoff值
结果如图3显示，ENST00000513368ROC曲线下面积为0.945，高于D-dimer(0.816),p<0.05。ENST00000513368相对表达量低于1.82，诊断为DVT；相对表达量高于1.82，不诊断为DVT；诊断效率为94.50％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东中医药大学附属医院
<120> 一种LncRNA作为深静脉血栓形成诊断标志物的应用
<130> 2018
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 414
<212> RNA
<213> LncRNA ENST00000513368
<400> 1
guuuaaguca cuggugccag uuccugcuac uuguuucacu uuuuauuugu ucacuuuuca 60
gacaucacac auguuccgua aaauuuaagc uuccuuuaaa aacauaccau acuaccauuu 120
ucuuuaucuc uuuuuucaac ucuuuuguuu uuuuuuaaag ggagcuugua uuuugaauau 180
gcucaaggau uuucugggug aggagaaauu ccagaaagga auaauucagu acuuaaagaa 240
guucagcuau agaaaugcua agaaugauga cuuguggagc agucugucaa auaguuguuu 300
agaaagugau uuuacaucug guggaguuug ucauucggau cccaagauga caaguaacau 360
gguaaggaua aagagaguca cagaguagaa gagaucugug gaauagccug accu 414
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcagacatca cacatgttcc gt 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcacccagaa aatccttgag ca 22

Claims (3)

1.检测LncRNA ENST00000513368表达量的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断下肢深静脉血栓形成产品中的应用，其特征是：所述LncRNA ENST00000513368核酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述试剂盒包括针对LncRNA ENST00000513368的正向引物5'- TCAGACATCACACATGTTCCGT -3'和反向引物5'- TCACCCAGAAAATCCTTGAGCA-3'。
3.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述基因芯片包括与LncRNA ENST00000513368杂交的探针。
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