KR102627788B1 - 위암 바이오마커 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
실용성이 높은 위암에 특이적이면서 저침습인 바이오마커를 제공하는 것을 과제로 한다. hsa-miR-6807-5p, hsa-miR-6856-5p 및 hsa-miR-575가 위암 바이오마커로 동정되었다. 이들 마이크로 RNA의 발현 레벨을 지표로 하여 위암의 이환을 판정한다.
Description
본 발명은 위암의 검사/진단에 유용한 지표 및 그 용도에 관한 것이다. 상세하게는 위암 바이오마커 및 이를 이용한 검사 방법 등에 관한 것이다. 본 출원은 2018년 6월 21일에 출원된 일본 특허 출원 제2018-118340호에 기초한 우선권을 주장하는 것이며, 해당 특허 출원의 전체 내용은 참조로 원용된다.
위암 진단의 골드 스탠더드는 상부소화관 내시경검사와 이에 따른 조직 진단이지만, 고침습이며 고가이기 때문에 건강한 사람을 대상으로 한 검진 등의 스크리닝 검사로는 권장하지 않는다. 한편, 위암 검진의 현장에는 상부소화관 조영술 검사가 현재 널리 도입되어 있지만, 해당 검사를 통해 위암 사망률이 감소하는 것은 과학적으로 증명되지 않았다. 또한, 소화관 조영술 검사는 피검자에게 바륨을 복용시킨 후 체위를 변환시켜 바륨 저류에 의한 위벽의 변형이나 확장의 정도, 바륨 부착 상황에 따라 소화관 병변을 찾아내는 것으로, 종양 성분이 위벽의 표층에 머무르는 조기 암을 발견하기는 어렵다.
혈액 검사에서는 CEA나 CA19-9 등의 혈청 종양 마커가 이용되고 있지만, 이들 분자에 대해서는 감도가 낮기 때문에(위암 진단의 감도는 CEA에서 24.0%, CA19-9에서 27.0%로 보고되었다) 진단 마커로 사용하는 것은 권장되지 않는다. 또한, 위암에 특이적인 바이오마커의 개발이 진행되고 있지만(예를 들어, 특허문헌 1, 2), 임상에 응용된 예는 없다. 그리고 본 발명의 바이오마커를 구성하는 분자에 관한 문헌을 이하에 열거한다(특허문헌 3 ~ 7, 비특허문헌 1).
https://doi.org/10.3892/mmr_00000199(Title: MicroRNA profiling of human gastric cancer. Published in Molecular Medicine Reports, November 2009. DOI: 10.3892/mmr_00000199)
상기한 바와 같이 위암 진단에 유용한 바이오마커가 없는 것이 현재 상황이다. 이에 본 발명은 실용성이 높은 위암에 특이적이면서 저침습 바이오마커를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 저침습이면서 간편한 검사가 가능해지는 것을 중시하면서 위암에 특이적인 바이오마커의 창출을 목표로 연구를 진행했다. 구체적으로는, 소변에서 위암에 특이적인 바이오마커를 동정(同定)하는 것을 시도했다. 300례 이상의 검체를 사용하여 상세하면서도 종합적인 분석을 실시한 결과, 특정 마이크로 RNA가 높은 특이도 및 감도로 위암 판정을 가능하게 하는 것이 판명되었다. 즉, 위암의 진단 능력에 뛰어난 바이오마커를 동정하는 것에 성공했다. 또한, 검토 과정에서 위암 판정에 유용한 기준이나 임상에 응용할 때에 유용한 정보 등도 얻을 수 있었다. 한편, 한층 더 검토한 결과, 소변뿐만이 아니라 혈청에서도 동정된 마이크로 RNA가 위암 바이오마커로 기능하며 해당 바이오마커를 검출할 때의 검체로 각종 체액을 이용할 수 있다는 점(즉, 범용성의 높이)이 밝혀졌다. 또한, 중요한 지견으로, 동정된 마이크로 RNA가 조기(스테이지 I) 위암의 검출 및 진단에 유용하다는 것이 판명되었다. 한편, 동정된 마이크로 RNA가 위암 치료의 완치도를 매우 잘 반영하는 것이 밝혀졌다. 이 사실은 해당 마이크로 RNA가 위암 치료의 완치도를 판정하는 것은 물론, 완치도와 밀접한 관계가 있는 "위암 재발의 예측"에 유용한 바이오마커로도 기능할 수 있다는 것을 나타낸다.
이상의 결과 및 고찰을 바탕으로 이하의 발명이 제공된다.
[1] hsa-miR-6807-5p, hsa-miR-6856-5p 및 hsa-miR-575로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 마이크로 RNA 또는 둘 이상의 마이크로 RNA의 조합으로 이루어진 위암 바이오마커.
[2] 소변 검체 또는 혈액 검체에서 검출되는 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 위암 바이오마커.
[3] [1] 또는 [2]에 기재된 위암 바이오마커의 발현 레벨을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 위암의 검사 방법.
[4] hsa-miR-6807-5p 또는 hsa-miR-6856-5p, 혹은 hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p의 조합으로 이루어지며, 조기 위암의 검출용인 [1] 또는 [2]에 기재된 위암 바이오마커.
[5] [4]에 기재된 위암 바이오마커의 발현 레벨을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 조기 위암의 검사 방법.
[6] hsa-miR-6807-5p 또는 hsa-miR-6856-5p, 혹은 hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p의 조합으로 이루어지며, 위암 치료의 완치도 판정용 또는 위암 재발 예측용인 [1] 또는 [2]에 기재된 위암 바이오마커.
[7] 이하의 단계 (1) ~ (3)을 포함하는 [3]에 기재된 방법 :
(1) 피험자로부터 채취한 검체의 상기 위암 바이오마커를 검출하고, 발현 레벨을 결정하는 단계;
(2) 피험자의 피로리균 감염 검사의 결과를 준비하는 단계;
(3) 단계 (1)에서 결정한 발현 레벨과 단계 (2)에서 준비한 피로리균 감염 검사의 결과를 바탕으로 위암의 이환을 판정하는 단계.
[8] 단계 (1)에서 검출하는 위암 바이오마커가 hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p이며, hsa-miR-3610 및 hsa-miR-4669를 표준화 인자로 한 표준화에 의해 위암 바이오마커의 발현 레벨이 결정되는 [7]에 기재된 방법.
[9] 단계 (1)에서 검출하는 위암 바이오마커가 hsa-miR-575이며, hsa-miR-3610, hsa-miR-4669 및 hsa-miR-6803-5p를 표준화 인자로 한 표준화에 의해 위암 바이오마커의 발현 레벨이 결정되는 [7]에 기재된 방법.
[10] 상기 위암 바이오마커의 레벨은 위암 이환과 양의 상관을 나타내는 [7] ~ [9] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[11] 상기 위암 바이오마커가 qRT-PCR법으로 검출되는 [7] ~ [10] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[12] 상기 위암 바이오마커의 Ct치에서 표준화 인자 Ct치를 뺀 값(ΔCt치)를 구한 후, 피검자가 피로리균 감염 양성인 경우와 피로리균 감염 음성인 경우로 구분하여 설정된 ΔCt치를 변수로 한 두 개의 수식을 이용하여 위암의 이환을 판정하는 [11]에 기재된 방법.
[13] 이하의 단계 (1) ~ (3)을 포함하는 [5]에 기재된 방법 :
(1) 피험자로부터 채취한 검체의 상기 위암 바이오마커를 검출하고, 발현 레벨을 결정하는 단계;
(2) 피험자의 피로리균 감염 검사의 결과를 준비하는 단계;
(3) 단계 (1)에서 결정한 발현 레벨과 단계 (2)에서 준비한 피로리균 감염 검사의 결과를 바탕으로 조기 위암의 이환을 판정하는 단계.
[14] 단계 (1)에서 검출하는 위암 바이오마커가 hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p이며, hsa-miR-3610 및 hsa-miR-4669를 표준화 인자로 한 표준화에 의해 위암 바이오마커의 발현 레벨이 결정되는 [13]에 기재된 방법.
[15] 상기 위암 바이오마커의 레벨은 위암의 병기과 양의 상관을 나타내는 [13] 또는 [14]에 기재된 방법.
[16] 상기 위암 바이오마커가 qRT-PCR법으로 검출되는 [13] ~ [15] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[17] 상기 위암 바이오마커의 Ct치에서 표준화 인자 Ct치를 뺀 값(ΔCt치)를 구한 후, 피검자가 피로리균 감염 양성인 경우와 피로리균 감염 음성인 경우로 구분하여 설정된 ΔCt치를 변수로 한 두 개의 수식을 이용하여 조기 위암의 이환을 판정하는 [16]에 기재된 방법.
[18] 검체가 소변 또는 혈액인 [7] ~ [17] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[19] [1]에 기재된 위암 바이오마커를 검출하기 위한 시약과 취급설명서를 포함하는 위암 검사용 키트.
[20] [4] 또는 [6]에 기재된 위암 바이오마커를 검출하기 위한 시약과 취급설명서를 포함하는 위암 검사용 키트.
[21] 상기 시약이 hsa-miR-6807-5p 검출용 시약과 hsa-miR-6856-5p 검출용 시약의 조합인 [19] 또는 [20]에 기재된 위암 검사용 키트.
[22] 상기 시약이 hsa-miR-575 검출용 시약인 [19]에 기재된 위암 검사용 키트.
[23] 마이크로 RNA 추출용 시약, 표준화 인자 특이적 프라이머, DNA폴리메라제, 역전사효소, dNTP, 소변 검체 채취 용기, 반응장치 및 검출장치로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 요소를 더 포함하는 [19] ~ [22] 중 어느 한 항에 기재된 위암 검출용 키트.
도 1은 연구·분석 스킴이다.
도 2는 분석 코호트 내역이다.
도 3은 종합적인 분석(miRNA 어레이)의 결과이다.
도 4는 종합적인 분석(miRNA 어레이)의 결과이다.
도 5는 트레이닝 세트 분석(miR-3610+miR-4669로 표준화)의 결과이다. 오즈비의 산출에는 2-ΔCt의 100배를 사용했다.
도 6은 트레이닝 세트의 ROC 곡선(소변의 miRNA 진단 패널)이다.
도 7은 밸리데이션 세트 분석(miR-3610+miR-4669로 표준화)의 결과이다. 오즈비의 산출에는 2-ΔCt의 100배를 사용했다.
도 8은 밸리데이션 세트의 ROC 곡선(소변의 miRNA 진단 패널)이다.
도 9는 모델식(-1.471+1.7486×(HP)+63.424×2-ΔCt(miR-6807-5p)+7.8641×2-ΔCt(miR-6856-5p))(단, 식 중 HP는 피로리균 감염 양성인 경우는 1, 피로리균 감염 음성인 경우는 0)를 이용한 위암의 리스크 판정이다. 위암 유병률은 0.2%로 하여 계산했다.
도 10은 트레이닝 세트 분석(miR-3610+miR-4669+miR-6803-5p로 표준화)의 결과이다. 오즈비의 산출에는 2-ΔCt의 100배를 사용했다.
도 11은 트레이닝 세트의 ROC 곡선(소변의 miRNA 진단 패널)이다.
도 12는 밸리데이션 세트 분석(miR-3610+miR-4669+miR-6803-5p로 표준화)의 결과이다. 오즈비의 산출에는 2-ΔCt의 100배를 사용했다.
도 13은 밸리데이션 세트의 ROC 곡선(소변의 miRNA 진단 패널)이다.
도 14는 모델식(-1.2062+2.2727×(HP)+18.4419×2-ΔCt(miR-575)) (단, 식 중 HP는 피로리균 감염 양성인 경우는 1, 피로리균 감염 음성인 경우는 0)를 이용한 위암의 리스크 판정이다. 위암 유병률은 0.2%로 하여 계산했다.
도 15는 혈청 miRNA를 바이오마커로 한 검증 실험의 결과이다. miR-3610+miR-4669로 표준화하고, 건강한 사람과 위암 환자 간의 바이오마커의 발현을 비교했다.
도 16은 혈청 miRNA를 바이오마커로 한 검증 실험의 결과이다. miR-3610+miR-4669로 표준화한 경우의 ROC 곡선(혈청 miRNA 진단 패널)이다.
도 17은 혈청 miRNA를 바이오마커로 한 검증 실험의 결과이다. miR-3610+miR-4669+miR-6803-5p로 표준화하고, 건강한 사람과 위암 환자 간의 바이오마커의 발현을 비교했다.
도 18은 혈청 miRNA를 바이오마커로 한 검증 실험의 결과이다. miR-3610+miR-4669+miR-6803-5p로 표준화한 경우의 ROC 곡선(혈청 miRNA 진단 패널)이다.
도 19는 건강한 사람(149례)와 조기(스테이지 I) 위암 증례(95례)의 비교 검토 결과이다.
도 20은 건강한 사람(149례)와 조기(스테이지 I) 위암 증례(95례)의 ROC 곡선이다.
도 21은 miR-6807-5p 발현 레벨(좌) 및 miR-6856-5p 발현 레벨(우)와 임상 병기와의 상관이다.
도 22는 위암 조직의 miR-6807-5p/miR-6856-5p miRNA 발현 레벨이다.
도 23은 위암 절제 전후의 소변의 miRNA의 추이이다.
도 2는 분석 코호트 내역이다.
도 3은 종합적인 분석(miRNA 어레이)의 결과이다.
도 4는 종합적인 분석(miRNA 어레이)의 결과이다.
도 5는 트레이닝 세트 분석(miR-3610+miR-4669로 표준화)의 결과이다. 오즈비의 산출에는 2-ΔCt의 100배를 사용했다.
도 6은 트레이닝 세트의 ROC 곡선(소변의 miRNA 진단 패널)이다.
도 7은 밸리데이션 세트 분석(miR-3610+miR-4669로 표준화)의 결과이다. 오즈비의 산출에는 2-ΔCt의 100배를 사용했다.
도 8은 밸리데이션 세트의 ROC 곡선(소변의 miRNA 진단 패널)이다.
도 9는 모델식(-1.471+1.7486×(HP)+63.424×2-ΔCt(miR-6807-5p)+7.8641×2-ΔCt(miR-6856-5p))(단, 식 중 HP는 피로리균 감염 양성인 경우는 1, 피로리균 감염 음성인 경우는 0)를 이용한 위암의 리스크 판정이다. 위암 유병률은 0.2%로 하여 계산했다.
도 10은 트레이닝 세트 분석(miR-3610+miR-4669+miR-6803-5p로 표준화)의 결과이다. 오즈비의 산출에는 2-ΔCt의 100배를 사용했다.
도 11은 트레이닝 세트의 ROC 곡선(소변의 miRNA 진단 패널)이다.
도 12는 밸리데이션 세트 분석(miR-3610+miR-4669+miR-6803-5p로 표준화)의 결과이다. 오즈비의 산출에는 2-ΔCt의 100배를 사용했다.
도 13은 밸리데이션 세트의 ROC 곡선(소변의 miRNA 진단 패널)이다.
도 14는 모델식(-1.2062+2.2727×(HP)+18.4419×2-ΔCt(miR-575)) (단, 식 중 HP는 피로리균 감염 양성인 경우는 1, 피로리균 감염 음성인 경우는 0)를 이용한 위암의 리스크 판정이다. 위암 유병률은 0.2%로 하여 계산했다.
도 15는 혈청 miRNA를 바이오마커로 한 검증 실험의 결과이다. miR-3610+miR-4669로 표준화하고, 건강한 사람과 위암 환자 간의 바이오마커의 발현을 비교했다.
도 16은 혈청 miRNA를 바이오마커로 한 검증 실험의 결과이다. miR-3610+miR-4669로 표준화한 경우의 ROC 곡선(혈청 miRNA 진단 패널)이다.
도 17은 혈청 miRNA를 바이오마커로 한 검증 실험의 결과이다. miR-3610+miR-4669+miR-6803-5p로 표준화하고, 건강한 사람과 위암 환자 간의 바이오마커의 발현을 비교했다.
도 18은 혈청 miRNA를 바이오마커로 한 검증 실험의 결과이다. miR-3610+miR-4669+miR-6803-5p로 표준화한 경우의 ROC 곡선(혈청 miRNA 진단 패널)이다.
도 19는 건강한 사람(149례)와 조기(스테이지 I) 위암 증례(95례)의 비교 검토 결과이다.
도 20은 건강한 사람(149례)와 조기(스테이지 I) 위암 증례(95례)의 ROC 곡선이다.
도 21은 miR-6807-5p 발현 레벨(좌) 및 miR-6856-5p 발현 레벨(우)와 임상 병기와의 상관이다.
도 22는 위암 조직의 miR-6807-5p/miR-6856-5p miRNA 발현 레벨이다.
도 23은 위암 절제 전후의 소변의 miRNA의 추이이다.
1. 위암 바이오마커
본 발명의 제1 국면은 위암 바이오마커에 관한 것이다. 본 명세서에서 "위암 바이오마커"는 위암 이환의 지표가 되는 생체 분자를 말한다. 본 발명의 바이오마커는 위암의 검출(위암에 이환된 것을 파악), 특히 조기 위암의 검출에 유용하다. 또한, 위암 치료의 완치도 판정 및 위암 재발 예측에도 이용될 수 있다. 즉, 치료 효과의 평가에도 이용될 수 있다.
위암은 위에 발생하는 상피성 악성 종양의 총칭이며, 조직형, 병기(스테이지) 등에 의해 세세하게 분류된다. 초기 위암은 자각 증상이 나타나는 경우가 적고 또한 상당히 진행되어도 무증상인 경우도 있기 때문에, 조기에 위암을 발견하기 위해서 정기적인 위암 검진이 권장된다. 위암 진단에는 혈액검사, 위X선검사, 내시경검사, 병리검사, 초음파검사, CT검사, 주장검사(irrigoscopy) 등이 실시된다.
본 명세서에서 "생체 분자"는 생체 내에서 발견되는 분자(화합물)를 말한다. 본 발명에서는 생체 분자인 마이크로 RNA를 바이오마커로 이용하지만, 이를 이용(일반적으로는 검사 방법에 적용)할 때에서는 생체에서 분리된 검체(시료) 중의 해당 분자를 이용하게 된다. 검체로는 소변, 혈액(혈청, 혈장 또는 전혈), 타액, 땀, 소화액 등의 사람의 체액이 사용되지만, 바람직하게는 소변 또는 혈액을 검체로 사용한다. 즉, 바람직한 양태에서는 소변 또는 혈중의 마이크로 RNA가 본 발명의 바이오마커가 된다.
마이크로 RNA는 생체 내에 존재하는 22염기 정도의 소분자 RNA이다. 마이크로 RNA는 3'비번역 영역(3'UTR)에 부분 상보적 서열을 갖는 표적 유전자에 결합하여 mRNA의 불안정화나 번역을 억제함으로써 단백질 생산을 억제한다. 이 마이크로 RNA의 기능은 유전자의 전사 후 발현 제어로 중요한 기구의 일부를 구성한다.
본 발명의 바이오마커는 특정 마이크로 RNA, 즉, hsa-miR-6807-5p, hsa-miR-6856-5p 또는 hsa-miR-575, 혹은 이들 중 둘 이상의 조합으로 이루어진다. 조합은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p의 조합이 채용된다. hsa-miR-6807-5p 또는 hsa-miR-6856-5p, 혹은 hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p의 조합을 채용한 경우, 조기 위암의 검출에 특히 유용한 바이오마커가 된다. 위암의 병기는 스테이지 I, II, III 및 IV로 크게 분류된다. 특별히 언급하지 않는 경우, 본 발명에서의 "조기 위암"은 스테이지 I(I기) 위암이다. 본 발명의 바이오마커를 위암 치료의 완치도 판정 또는 위암 재발 예측에 이용하는 경우에도 hsa-miR-6807-5p 또는 hsa-miR-6856-5p, 혹은 hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p의 조합이 채용된다.
hsa-miR-6807-5p는 서열 GUGAGCCAGUGGAAUGGAGAGG(서열번호 11)로 이루어진 마이크로 RNA이다. 마찬가지로, hsa-miR-6856-5p는 서열 AAGAGAGGAGCAGUGGUGCUGUGG(서열번호 12)로 이루어진 마이크로 RNA이며, hsa-miR-575는 서열 GAGCCAGUUGGACAGGAGC(서열번호 1)로 이루어진 마이크로 RNA이다.
또한, 설명의 편의상, 본 명세서에서는 마이크로 RNA의 명칭 중 "hsa-"를 생략할 수 있다.
2. 위암 바이오마커를 이용한 검사
본 발명의 제2 국면은 본 발명의 바이오마커의 용도에 관한 것이며, 위암의 검사 방법(이하, "본 발명의 검사 방법"이라고도 함)을 제공한다. 본 발명의 검사 방법은 위암을 간편하게 검출하는 수단으로서 유용하다. 본 발명의 검사 방법에 따르면, 위암에 이환되었는지 아닌지(이환 유무)의 판정을 가능하게 하는 객관적인 근거가 제공된다. 또한, 본 발명의 검사 방법의 일 양태는 조기 위암의 검출에 유용하며, 해당 양태의 경우, 조기 위암에 이환되었는지 아닌지의 판정에 유용한 객관적 근거를 얻을 수 있게 된다. 본 발명의 검사 방법으로 얻은 정보(검사 결과)는, 생체 내의 상태 내지 변화를 반영한 바이오마커(생체 분자)라는 객관적인 지표에 근거한 것이며, 그 자체로 위암 판정이 가능하지만, 이것을 보조적으로 이용하고 필요에 따라 그 외의 지표도 고려하여 최종적인 판단(일반적으로는 확정 진단)을 해도 된다. 또한, 의사의 판단을 포함한 진단과의 구별을 보다 명확하게 하기 위해서, 본 발명의 검사 방법을 "위암 검사를 보조하는 방법"이라고 칭할 수도 있다. 본 발명은 의사의 판단에 따른 것이 아니라 객관적 (지표)를 이용함으로써 위암 진단에 유용한 정보를 얻는다.
본 발명의 검사 방법에서는, 피검자 유래 검체에서의 본 발명의 바이오마커의 발현 레벨을 지표로 이용한다. 여기서 "레벨"은 일반적으로는 "양" 내지 "농도"를 의미한다. 단, 관례 및 기술 상식에 따라 검출 대상의 분자를 검출할 수 있을지 없을지(즉, 외관상의 존재 여부)를 나타내는 경우에도 용어 "레벨"이 사용된다.
일반적으로, 본 발명의 검사 방법에서는 이하의 단계 (1) ~ (3)을 실시한다.
(1) 피험자로부터 채취한 검체의 상기 위암 바이오마커를 검출하고, 발현 레벨을 결정하는 단계
(2) 피험자의 피로리균 감염 검사의 결과를 준비하는 단계
(3) 단계 (1)에서 결정한 발현 레벨과 단계 (2)에서 준비한 피로리균 감염 검사의 결과를 바탕으로 위암의 이환을 판정하는 단계
단계 (1)
단계 (1)에서는, 피검자로부터 채취한 검체를 준비하고, 본 발명의 바이오마커(위암 바이오마커)를 검출하여 발현 레벨을 결정한다. 조기 위암의 검출을 목적으로 하는 경우는 바이오마커로 hsa-miR-6807-5p 또는 hsa-miR-6856-5p, 혹은 hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p의 조합이 채용된다. 피검자는 특별히 한정되지 않는다. 즉, 위암의 이환 유무의 판정이 필요한 사람에게 널리 본 발명을 적용할 수 있다. 예를 들어, 위암의 징후나 위암에 특징적인 증상이 확인되는 사람 등, 위암에 이환되었을 가능성/의심이 되는 사람 이외에 자각 증상이 없는 사람(건강한 사람을 포함함)도 피검자가 될 수 있다.
검체는 본 발명을 실시하기 전에 채취해 둔다. 소변, 혈액(혈청, 혈장 또는 전혈), 타액, 땀, 소화액 등 각종 체액을 검체로 사용할 수 있다. 바람직한 양태에서는 소변, 혈청 또는 혈장을 검체로 사용한다. 또한, 검체는 통상적인 방법으로 채취, 조제하면 된다.
이 단계에서는, 검체의 바이오마커를 검출하지만, 바이오마커의 발현 레벨을 엄밀하게 정량하는 것은 필수가 아니다. 즉, 후속 단계 (3)에서 위암의 이환을 판정할 수 있을 정도로 바이오마커를 검출할 수 있으면 된다. 예를 들어, 검체의 바이오마커 레벨이 소정 기준치를 초과하는지 아닌지를 판별할 수 있도록 검출을 실시할 수도 있다.
바이오마커의 검출 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, qRT-PCR법으로 대표되는 핵산증폭반응을 이용한 방법, 마이크로 어레이를 통해 검출 가능하다. 핵산증폭반응으로는 PCR (Polymerase chain reaction)법 또는 그 변법 이외에 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)법 (Tsugunori Notomi et al. Nucleic Acids Research, Vol.28, No.12, e63, 2000; Kentaro Nagamine, Keiko Watanabe et al. Clinical Chemistry, Vol.47, No.9, 1742-1743, 2001), ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)법 (특허 제3433929호, 특허 제3883476호), NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)법, LCR(Ligase Chain Reaction)법, 3SR(Self-sustained Sequence Replication)법, SDA(Standard Displacement Amplification)법, TMA(Transcription Mediated Amplification)법, RCA(Rolling Circle Amplification) 등을 채용할 수 있다.
검출 결과로부터 바이오마커의 발현 레벨이 결정된다. 발현 레벨을 결정할 때에는 정확성과 객관성 등을 높이기 위해 통상적으로 표준화가 진행된다. 표준화에는 항상 발현이 확인되는 마이크로 RNA의 검출 결과를 이용한다. 예를 들어, hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p의 조합을 바이오마커로 한 경우에는 바람직하게는 hsa-miR-3610과 hsa-miR-4669를 표준화 인자로 사용한다. 즉, hsa-miR-3610과 hsa-miR-4669의 검출 결과로 hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p의 검출 결과를 보정하여 단계 (3)의 판정에 이용하는 발현 레벨로 한다. 마찬가지로 hsa-miR-575를 바이오마커로 한 경우에는 바람직하게는 hsa-miR-3610, hsa-miR-4669 및 hsa-miR-6803-5p를 표준화 인자에 이용하고 표준화된 발현 레벨을 결정한다.
qRT-PCR법으로 바이오마커를 측정하는 경우라면 발현 레벨의 결정에 Ct치(Threshold Cycle)을 이용하면 좋다. 이 경우, 예를 들어 바이오마커의 Ct치에서 표준화 인자의 Ct치(표준화 인자 Ct치)를 뺀 값(ΔCt치)를 구해서, ΔCt치를 단계 (3)의 판정에 이용하는 발현 레벨로 한다.
단계 (2)
단계 (2)에서는 피검자의 피로리균 감염 검사의 결과를 준비한다. 피로리균 감염 검사는 본 발명의 실시 전에 이루어진다. 피로리균 감염 검사의 종류, 방법 등은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 요소 호기 시험, 대변 항원 검사, 혈중 또는 소변의 항피로리균 IgG 항체 검사, 내시경검사, 병리조직학적 검사, 신속 우레아제 시험, 배양법 등으로 검사하면 된다. 또한, 단계 (2)와 상기 단계 (1)의 순서는 상관 없다. 즉, 어느 하나를 먼저 실시해도 되고, 또는 병행하여 실시해도 된다.
단계 (3)
단계 (3)에서는 단계 (1)에서 결정한 발현 레벨과 단계 (2)에서 준비한 피로리균 감염 검사의 결과를 바탕으로 위암의 이환을 판정한다. 조기 위암의 검출을 목적으로 하는 경우에는 조기 위암의 이환이 판정되게 된다. 정확도가 좋은 판정을 가능하게 하기 위해서, 예를 들어, 단계 (1)에서 얻은 발현 레벨을 컨트롤(대조 검체)의 발현 레벨과 비교하면서, 혹은 컨트롤의 발현 레벨에 근거하여 설정된 기준에 비추어 판정하면 된다. 컨트롤에는 예를 들어, 건강한 사람의 바이오마커 발현 레벨 및/또는 위암 환자의 바이오마커 발현 레벨, 혹은 조기(스테이지 I) 위암 환자의 바이오마커 발현 레벨(조기 위암의 검출을 목적으로 하는 경우)를 사용할 수 있다.
후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바이오마커가 되는 hsa-miR-6807-5p, hsa-miR-6856-5p 및 hsa-miR-575는 모두 위암 증례에서 유의한 발현 상승이 확인되었다. 즉, 본 발명의 바이오마커의 발현 레벨은 위암 이환과 양의 상관을 나타낸다. 따라서, 바이오마커의 발현 레벨에 대해서는 이것이 높다는 것이 위암에 이환되었다는 기본적인 지표(판정기준)가 된다. 한편, hsa-miR-6807-5p 및 hsa-miR-6856-5p에 대해서는 조기(스테이지 I) 위암 증례에서 유의한 발현 상승이 확인되었다. 따라서, 이들 바이오마커의 발현 레벨이 높다는 것은 조기 위암에 이환되었다는 지표(판정 기준)가 된다.
단계 (3)에서의 판정은, 정성적, 반정량적, 정량적으로 모두 가능하다. 정성적 판정과 정량적 판정의 예를 이하에 나타낸다. 이하의 예는 위암의 이환을 판정하는 경우의 예이지만, 조기 위암의 이환 판정에 대해서도 동일하다. 판정 구분의 수, 각 판정 구분에 관련된 바이오마커의 발현 레벨, 판정 결과 등은 이하의 예에 관계없이 예비 실험 등을 통해서 임의로 설정할 수 있다. 또한, 판정에 사용하는 기준치나 컷오프치는 예를 들어, 사용하는 검체, 요구되는 정확도(신뢰도) 등을 고려하여 설정하면 된다. 기준치나 컷오프치를 설정함에 있어서는 다수의 검체를 사용한 통계적 분석을 이용하면 좋다. 두 개의 마이크로 RNA의 조합(예를 들어, hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p의 조합)을 바이오마커로 한 경우에는 각각에 대해서 기준치나 컷오프치가 설정된다. 혹은 조합에 대한 판별식을 작성하고, 해당 판별식에 대한 기준치나 컷오프치를 설정해도 된다. 또한, 여기서 판정은 그 판단 기준으로부터 명확히 알 수 있듯이, 의사나 검사기사 등 전문 지식을 가진 자의 판단에 의하지 않고도 자동적 내지 기계적으로 할 수 있다.
(정성적인 판정의 예)
피로리균 감염 양성이면서 바이오마커 발현 레벨이 기준치 A보다 높은 경우, 또는 피로리균 감염 음성이면서 바이오마커 발현 레벨이 기준치 B보다 높을 경우에, "위암에 이환됨"으로 판정하고, 피로리균 감염 양성이면서 바이오마커 발현 레벨이 기준치 A 이하일 때, 또는 피로리균 감염 음성이면서 바이오마커 발현 레벨이 기준치 B 이하인 경우에, "위암에 이환되지 않음"으로 판정한다.
(정량적인 판정의 예)
이하에 나타낸 바와 같이, 피로리균 감염 양성과 피로리균 감염 음성의 각각에 대해 발현 레벨의 범위별로 이환되었을 가능성(%)을 미리 설정해두고, 이환되었을 가능성(%)을 판정한다.
(i) 피로리균 감염 양성
a < 발현 레벨: 위암에 이환되었을 가능성이 80%보다 큼
b < 발현 레벨 ≤ a: 위암에 이환되었을 가능성이 20% ~ 80%
발현 레벨 < b: 위암에 이환되었을 가능성이 20% 미만
(ii) 피로리균 감염 음성
c < 발현 레벨: 위암에 이환되었을 가능성이 20%보다 큼
d < 발현 레벨 ≤ c: 위암에 이환되었을 가능성이 5% ~ 20%
발현 레벨 < d: 위암에 이환되었을 가능성이 5% 미만
상기와 같이, 단계 (1)에서 바이오마커의 검출에 qRT-PCR법을 이용하는 경우, 바람직하게는 바이오마커의 Ct치에서 표준화 인자 Ct치를 뺀 값(ΔCt치)를 바이오마커 발현 레벨로 해서 단계 (3)의 판정을 실시한다. 판정 시에는 피검자가 피로리균 감염 양성인 경우와 피로리균 감염 음성인 경우로 구분하여 설정된 ΔCt치를 변수로 한 두 개의 수식을 이용하면 된다. 예를 들어, hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p의 조합을 바이오마커로 한 경우에는 hsa-miR-6807-5p의 ΔCt치(ΔCt(miR-6807-5p)로 표기한다)와 hsa-miR-6856-5p의 ΔCt치(ΔCt(miR-6856-5p)로 표기한다)를 변수로 한 두 개의 수식(피로리균 감염 양성인 경우의 수식 1과 피로리균 감염 음성인 경우의 수식 2)를 설정하고 계산치(피검자가 피로리균 감염 양성이면 수식 1에 의해 계산되고, 피검자가 피로리균 감염 음성이면 수식 2에 의해 계산되게 된다)가 기준치 이상이면 "위암에 이환됨" 또는 "위암에 이환되었을 가능성이 높음"으로 판정하고, 계산치가 기준치보다 낮으면 "위암에 이환되지 않음" 또는 "위암에 이환되었을 가능성이 낮음"으로 판정한다("판정예 1"이라 함). 한편, hsa-miR-6807-5p, hsa-miR-6856-5p 및 hsa-miR-575 중 하나를 바이오마커로 한 경우에는 ΔCt치를 변수로 한 두 개의 수식(피로리균 감염 양성인 경우의 수식 3과 피로리균 감염 음성인 경우의 수식 4)으로 이루어진 조건을 사용하고, 해당 조건을 충족하는 경우에 "위암에 이환됨" 또는 "위암에 이환되었을 가능성이 높음"으로 판정하고, 해당 조건을 충족하지 않는 경우에 "위암에 이환되지 않음" 또는 "위암에 이환되었을 가능성이 낮음"으로 판정한다("판정예 2"라 함). 이하, 판정예 1과 판정예 2에 사용되는 수식의 예를 나타낸다. 또한, 판정예 2는 hsa-miR-575를 바이오마커로 했을 때에 특히 유효하다.
<판정예 1>
피로리균 감염 양성인 경우(수식 1): a×2-ΔCt(miR-6807-5p)+b×2-ΔCt(miR-6856-5p)
피로리균 감염 음성인 경우(수식 2): c×2-ΔCt(miR-6807-5p)+d×2-ΔCt(miR-6856-5p)
단, 식 중 a ~ d는 상수이다. 상수 a ~ d의 구체예는 a=65, b=14, c=63, d=5이다 (상세한 내용은 후술하는 실시예를 참조).
<판정예 2>
피로리균 감염 양성인 경우(수식 3): 2-ΔCt > e
피로리균 감염 음성인 경우(수식 4): 2-ΔCt > f
단, 식 중 e, f는 상수이다. 상수 e, f의 구체예는 e=0.03446916, f=0.02673549이다(상세한 내용은 후술하는 실시예를 참조).
단계 (3)의 판정 결과는 위암의 진단에 유용한 정보이며, 위암의 진단은 물론 위암의 조기 발견, 보다 적절한 치료 방침의 결정(효과적인 치료법의 선택 등) 등에 도움이 된다. 또한, 상세한 검사(예를 들면, 이차 검진)을 받는 계기가 될 수도 있다.
또한, 상기한 바와 같이, 본 발명의 바이오마커는 위암 치료의 완치도 판정 및 위암 재발 예측에도 이용될 수 있다. 이 용도의 경우에는, 예를 들어, 피험자로부터 채취한 검체의 바이오마커를 검출하여 발현 레벨을 결정하는 단계 (i)을 실시한 후, 단계 (i)에서 결정된 발현 레벨을 바탕으로 위암 치료의 완치도 또는 위암이 재발할 가능성(리스크)를 판정한다(단계 (ii)). 단계 (i)은 상기 단계 (1)과 동일하다. 단, 위암 치료의 완치도 또는 위암 재발 판정이 필요한 사람, 즉, 위암에 이환되어 치료를 받은 사람(치료 경험자)가 피검자가 된다. 여기에서 치료는 완치적 요법으로써의 치료 효과를 기대할 수 있는 한 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로는 외과적 치료(통상적으로 스테이지나 병태 등을 고려하여 내시경 종양 절제술, 복강경 수술, 축소 수술, 정형 수술 또는 확대 수술이 선택된다. 또한 필요에 따라 림프절 곽청이 행해짐)가 해당된다. 단계 (ii)의 판정에서는 위암 절제 후의 모든 증례에서 바이오마커(hsa-miR-6807-5p, hsa-miR-6856-5p)의 유의하면서 현저한 발현 저하를 확인한 사실에 근거하여 바이오마커의 발현 레벨이 낮은 것이 위암 치료의 완치도가 높음(위암 치료의 완치도를 판정하는 경우), 및 위암 재발 가능성(리스크)가 낮음(위암 재발을 예측하는 경우)의 지표(판정 기준)가 된다. 판정이 정성적, 반정량적, 정량적으로 모두 가능하다는 점이나 판정에 이용하는 기준치나 컷오프치 등에 관해서는 상기 단계 (3)에 준한다.
3. 위암 검사용 키트
본 발명은 위암 검사용 키트도 제공한다. 본 발명의 키트는 본 발명의 바이오마커를 검출하기 위한 시약(바이오마커 검출용 시약)을 필수 요소로 포함한다. 바이오마커 검출용 시약의 예는 바이어마커 특이적 프라이머이다.
바람직한 일 양태에서는 바이오마커 검출용 시약으로 hsa-miR-6807-5p 검출용 시약(예를 들어 hsa-miR-6807-5p 특이적 프라이머)와 hsa-miR-6856-5p 검출용 시약(예를 들어 hsa-miR-6856-5p 특이적 프라이머)의 조합이 키트에 포함된다. 이 양태의 경우, 표준화 인자로써의 hsa-miR-3610 및 hsa-miR-4669를 검출하기 위한 시약, 즉, hsa-miR-3610 검출용 시약(예를 들어 hsa-miR-3610 특이적 프라이머)와 hsa-miR-4669 검출용 시약(예를 들어 hsa-miR-4669 특이적 프라이머)도 키트에 포함하는 것이 바람직하다.
다른 바람직한 일 양태에서는 hsa-miR-575 검출용 시약(예를 들어 hsa-miR-575 특이적 프라이머)가 키트에 포함된다. 이 양태의 경우, 표준화 인자로써의 hsa-miR-3610, hsa-miR-4669 및 hsa-miR-6803-5p를 검출하기 위한 시약, 즉, hsa-miR-3610 검출용 시약(예를 들어 hsa-miR-3610 특이적 프라이머), hsa-miR-4669 검출용 시약(예를 들어 hsa-miR-4669 특이적 프라이머) 및 hsa-miR-6803-5p 검출용 시약(예를 들어 hsa-miR-6803-5p 특이적 프라이머)도 키트에 포함시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 키트에는 통상적으로 취급설명서가 첨부된다. 위암 검사 방법을 실시할 때 사용하는 그 외의 시약(마이크로 RNA 추출용 시약, DNA폴리메라제, 역전사효소, dNTP 등), 장비 내지 기구(소변 검체 채취 용기, 반응장치, 검출장치 등)을 키트에 포함시킬 수 있다.
실시예
위암 특이적 바이오마커(위암 바이오마커)를 발견하기 위해 이하의 검토를 실시했다.
1. 방법
(1) 실험 스킴·대상·임상 검체
우선, 전체 코호트 372례(건강한 사람 : 197례, 위암 환자 : 175례)에서 나이, 성별을 무작위로 매칭시킨 306례를 추출하고, 이들을 무작위로 (i) 종합적 분석 코호트 8례( 건강한 사람 · 위암 환자 : 각 4례), (ii) 트레이닝 세트 190례(건강한 사람 · 위암 환자 : 각 95례), (iii) 밸리데이션 세트 108례(건강한 사람 · 위암 환자 : 각 54례)의 3개의 그룹으로 분류했다(도 1, 2).
먼저, (i)의 종합적 분석 코호트 8례를 이용하여 miRNA 어레이 분석을 실시하여 위암 증례의 소변에서 유의하게 상승 또는 저하된 miRNA를 추출했다. 이어서, (ii)의 트레이닝 세트 190례에서 (i)에서 추출한 각 miRNA를 qPCR법으로 측정하고 다변량 분석을 통해 유의한 위암 바이오마커를 추출하여 진단 패널을 구축했다. 마지막으로, 독립된 (iii) 밸리데이션 세트 108례를 이용하여 (ii)에서 수립한 진단 패널의 정확도를 검증했다.
(2) RNA 추출·cDNA 합성
채취 직후부터 -80℃에서 동결 보존되었던 소변 검체 200μl에서 miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 프로토콜에 따라 miRNA를 추출했다. 추출한 miRNA를 주형으로 하여 TaqMan Advanced MicroRNA cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)를 사용하여 프로토콜대로 cDNA를 합성했다.
(3) 마이크로 어레이 분석
추출한 miRNA를 이용하여 SurePrint miRNA microarray(Agilent, Santa Clara, USA)로 분석을 실시했다. 데이터 분석에는 GeneSpringGX(Agilent)를 사용하였다.
(4) qPCR
합성된 cDNA를 이용하여 TaqMan Advanced MicroRNA Assay를 사용하여 7500 Fast real-time PCR system(ThermoFisher Scientific, Watham, USA)를 사용하여 qRT-PCR을 실시했다. 열사이클 및 사용한 프라이머의 서열은 이하의 표(표 1,2)에 기재한다.
qRT-PCR의 열사이클
| 단계 | 온도 | 시간 | 사이클수 |
| 효소활성화 | 95℃ | 20초 | 1 |
| 변성 | 95℃ | 3초 | 40 |
| 어닐/신장 | 60℃ | 30초 |
사용한 TaqMan Advanced MicroRNA Assays
| 분석명 (표적 마이크로 RNA) |
분석 ID | Context Sequence |
| hsa-miR-575 | 479056_mir | GAGCCAGUUGGACAGGAGC (서열번호 1) |
| hsa-miR-3610 | 478053_mir | GAAUCGGAAAGGAGGCGCCG (서열번호 2) |
| hsa-miR-3938 | 479757_mir | AAUUCCCUUGUAGAUAACCCGG (서열번호 3) |
| hsa-miR-4476 | 478903_mir | CAGGAAGGAUUUAGGGACAGGC (서열번호 4) |
| hsa-miR-4669 | 478925_mir | UGUGUCCGGGAAGUGGAGGAGG (서열번호 5) |
| hsa-miR-5003-3p | 480076_mir | UACUUUUCUAGGUUGUUGGGG (서열번호 6) |
| hsa-miR-5189-5p | 480104_mir | UCUGGGCACAGGCGGAUGGACAGG (서열번호 7) |
| hsa-miR-6500-5p | 480192_mir | AGGAGCUAUCCACUCCAGGUGUCC (서열번호 8) |
| hsa-miR-6511a-5p | 480208_mir | CAGGCAGAAGUGGGGCUGACAGG (서열번호 9) |
| hsa-miR-6803-5p | 480373_mir | CUGGGGGUGGGGGGCUGGGCGU (서열번호 10) |
| hsa-miR-6807-5p | 480380_mir | GUGAGCCAGUGGAAUGGAGAGG (서열번호 11) |
| hsa-miR-6856-5p | 480468_mir | AAGAGAGGAGCAGUGGUGCUGUGG (서열번호 12) |
| hsa-miR-6875-5p | 480501_mir | UGAGGGACCCAGGACAGGAGA (서열번호 13) |
2. 결과
(1) miR-3610 및 miR-4669를 표준화 인자로 한 분석
종합적 분석 코호트 8례를 이용하여 miRNA 어레이 분석을 실시한 결과, 위암 증례의 소변에서 유의하게 상승 또는 저하된 miRNA가 다수 추출되었다(도 3, 4).
다음으로, 트레이닝 세트 190례에서 추출된 각 miRNA를 qPCR법으로 측정한 결과, miR-3610, miR-4669를 표준화 인자로 한 다변량 분석을 통해 miR-6807-5p, miR-6856-5p가 유의한 위암 바이오마커로 동정되었다(도 5). 위암 바이오마커(miR-6807-5p, miR-6856-5p)와 피로리균 감염 상태(양성)을 이용하여 진단 패널 "피로리균 감염 상태(양성)과 소변의 바이오마커(miR-6807-5p, miR-6856-5p)의 발현에 의한 바이오마커 패널"을 구축했다(도 6).
마지막으로, 트레이닝 세트에서 수립한 진단 패널의 정확성을 밸리데이션 세트 108례에서 검토한 결과(도 7), AUC가 0.885(95% 신뢰구간: 0.825-0.948)로 매우 양호한 결과였다(도 8).
피로리균 감염 상태(양성)과 소변 바이오마커(miR-6807-5p, miR-6856-5p)의 발현을 이용한 판정 방법의 일례로, 다변량 분석(로지스틱 분석)의 결과를 고려하면서 하기의 간이 모델식을 작성했다. 피로리균 감염 양성인 경우와 피로리균 감염 음성인 경우 모두에서, 계산식의 값이 0.68 이상을 위암이라 하면 "감도: 72.4%, 특이도: 60.8%"의 판정 결과를 얻었다. 또한, 식 중의 ΔCt(miR-6807-5p)는 miR-6807-5p의 ΔCt치, ΔCt(miR-6856-5p)는 miR-6856-5p의 ΔCt치를 각각 나타낸다.
피로리균 감염 양성인 경우 : 65×2-ΔCt(miR-6807-5p)+14×2-ΔCt(miR-6856-5p)
피로리균 감염 음성인 경우 : 63×2-ΔCt(miR-6807-5p)+5×2-ΔCt(miR-6856-5p)
한편, 다변량 분석(로지스틱 분석)의 결과로부터 모델식(-1.471+1.7486×(HP)+63.424×2-ΔCt(miR-6807-5p)+7.8641×2-ΔCt(miR-6856-5p)) (단, 식 중 HP는 피로리균 감염 양성인 경우는 1, 피로리균 감염 음성인 경우는 0)을 작성하고, 과거의 통계를 바탕으로 60세 이상의 일본 위암 유병률을 0.2%로 가정하면, 해당 모델식을 통해 A(위암 리스크 낮음), B(위암 리스크 평균적), C(위암 리스크 높음)의 3개의 그룹으로 리스크 분류할 수 있고(도 9), C그룹은 2차 정밀검사가 필요하다는 등의 판단에도 이용 가능할 것으로 생각된다.
(2) miR-3610, miR-4669 및 miR-6803-5p를 표준화 요인으로 한 분석
miR-3610, miR-4669에 다음 후보인 miR-6803-5p를 추가한 3개의 miRNA를 표준화에 사용했을 때에는 트레이닝 세트를 이용한 분석에서 피로리균 감염 상태(양성)과 miR-575가 유의한 바이오마커로 추출되었다(도 10, 11).
"피로리균 감염 상태(양성)과 소변의 바이오마커 miR-575의 발현에 의한 바이오마커 패널"의 정확도를 밸리데이션 세트 108례로 검토한 결과, AUC가 0.830(95% 신뢰구간 : 0.752-0.907)로 매우 양호한 결과였다(도 12, 13).
판정 방법의 일례로, miR-6807-5p와 miR-6856-5p를 바이오마커로 사용한 경우(상기)와 마찬가지로 다변량 분석(로지스틱 분석)의 결과를 고려하면서 하기의 조건을 작정한 결과, "감도: 67.1%, 특이도: 51.7%"로 판정 가능했다. 또한, 식 중 ΔCt(miR-575)는 miR-575의 ΔCt치를 나타낸다.
<조건> 하기 수식을 만족하는 경우에 "위암에 이환됨"으로 판정한다.
피로리균 감염 양성인 경우: 2-ΔCt(miR-575) > 0.03446916
피로리균 감염 음성인 경우: 2-ΔCt(miR-575) > 0.02673549
한편, 다변량 분석(로지스틱 분석)의 결과로부터 모델식(-1.2062+2.2727×(HP)+18.4419×2-ΔCt(miR-575)) (단, 식 중 HP는 피로리균 감염 양성인 경우는 1, 피로리균 감염 음성인 경우는 0)을 작성하고, 과거의 통계를 바탕으로 60세 이상의 일본 위암 유병률을 0.2%로 가정하면, 해당 모델식을 통해 A(위암 리스크 낮음), B(위암 리스크 평균적), C(위암 리스크 높음)의 3개의 그룹으로 리스크 분류할 수 있고(도 14), C그룹은 2차 정밀검사가 필요하다는 등의 판단에도 이용 가능할 것으로 생각된다.
(3) 다른 체액에서의 바이오마커 검출
위암 환자의 소변에서 유의하게 상승한 miR-6807-5p, miR-6856-5p 및 miR-575 3종류의 miRNA는 혈청 등 다른 체액을 검체로 한 경우에도 바이오마커로 사용 가능할 것으로 추정된다. 이에 이하의 검증 실험을 실시했다.
나이, 성별을 매칭시킨 64례(위암·건강한 사람: 각 32례)의 혈청을 사용하여 miR-6807-5p, miR-6856-5p 및 miR-575의 발현을 qPCR로 측정했다. 또한, 측정 방법은 상기 실험에 준한다.
2종류의 miRNA(miR-3610, miR-4669)를 이용한 표준화, 3종류의 miRNA(miR-3610, miR-4669, miR-6803-5p)를 이용한 표준화 모두에서, miR-6807-5p, miR-6856-5p 및 miR-575는 건강한 사람과 비교하여 위암 환자의 혈청에서 유의하게 높은 발현이 확인되었다(도 15 ~ 18). 이 결과는 소변에 한정되지 않으며 혈청, 혹은 다른 체액 검체에서도 3종류의 miRNA(miR-6807-5p, miR-6856-5p, miR-575)가 위암 특이적 바이오마커로 유용하다는 것을 시사한다. 또한, 표준화 인자로 사용한 miR-3610, miR-4669 및 miR-6803-5p는 소변이나 혈청 등에 항상 안정적으로 발현하기 때문에 체액의 miRNA의 표준화 인자로 유용하다 .
(4) 조기 위암의 검출·진단, 위암 치료의 완치도 판정
바이오마커(miR-6807-5p, miR-6856-5p)가 조기 위암의 검출·진단에 유효한지를 검증하기 위해, 소변 검체를 이용하여 트레이팅 세트·밸리데이션 세트 중의 건강한 사람(149례)와 스테이지 I의 조기 위암 증례(95례)를 비교 검토한 결과, miR-6807-5p, miR-6856-5p 모두 건강한 사람과 비교하여 스테이지 I의 조기 위암 환자의 소변에서 높은 발현을 확인했다(도 19). 또한 ROC 분석에서도 "피로리 감염 양성과 소변의 miR-6807-5p·miR-6856-5p 발현에 의한 바이오마커 패널"은 AUC=0.748(95% 신뢰구간: 0.683-0.812)로, 건강한 사람과 조기 위암 환자를 양호하게 식별했다(도 20). 또한, 2종류의 소변의 바이오마커(miR-6807-5p, miR-6856-5p)의 발현 레벨은 모두 임상 병기와 유의한 양의 상관을 나타내었다(도 21). 2종류의 바이오마커(miR-6807-5p, miR-6856-5p) 조직에서의 발현 레벨 분석에서, miR-6807-5p는 정상 조직과 비교하여 위암 조직에서 유의하게 높은 발현을 나타내며, 증례가 적어 유의하지는 않지만 miR-6856-5p도 정상부와 비교하여 위암 조직에서 고발현의 경향을 보였다(도 22). 나아가, 위암 절제 전후의 소변의 miRNA 발현을 분석한 결과, 소변의 바이오마커(miR-6807-5p, miR-6856-5p)는 모두 위암 절제 후에는 유의하면서 현저하게 발현 저하가 확인되어(도 23), 위암 치료의 완치도를 매우 잘 반영하는 것이 시사되었다.
본 발명은 위암 진단에 유용한 바이오마커를 제공한다. 본 발명의 바이오마커는 소변이나 혈청 등의 검체에서 검출 가능하며, 저침습이면서 간편한 검사를 가능하게 한다. 특히, 소변을 검체로 이용하는 경우에는 "침습 없이", "간단하게", "집에서도" 검사·진단이 가능하며, 예를 들어 검진 1차 스크리닝 현장에서 매우 유용하다. 또한, 본 발명의 바이오마커를 이용하면 정확도가 높은 검사가 가능해진다.
본 발명은, 예를 들어 병원, 보건소, 검진 차량 등에서 이루어지는 건강 진단에서 소변 검사의 한 항목으로 실시할 수 있다. 또한, 소변을 검체로 이용한 경우에는 집에서 채취한 소변을 검사 기관에 송부하여 검사하는 새로운 스타일의 검사도 가능해진다.
이 발명은 상기 발명의 실시형태 및 실시예의 설명에 한정되는 것은 아니다. 특허 청구 범위의 기재를 벗어나지 않고, 당업자가 용이하게 생각해 낼 수 있는 범위에서 다양한 변형 양태도 본 발명에 포함된다. 본 명세서에 명시한 논문, 공개특허공보 및 특허공보 등의 내용은 그 전체 내용을 원용하여 인용하기로 한다.
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<213> Homo sapiens
<400> 1
gagccaguug gacaggagc 19
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gaaucggaaa ggaggcgccg 20
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
aauucccuug uagauaaccc gg 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
caggaaggau uuagggacag gc 22
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
uguguccggg aaguggagga gg 22
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
uacuuuucua gguuguuggg g 21
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ucugggcaca ggcggaugga cagg 24
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<213> Homo sapiens
<400> 8
aggagcuauc cacuccaggu gucc 24
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
caggcagaag uggggcugac aggcaggcag aaguggggcu gacagg 46
<210> 10
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<212> RNA
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<400> 10
cugggggugg ggggcugggc gu 22
<210> 11
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gugagccagu ggaauggaga gg 22
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<211> 24
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aagagaggag caguggugcu gugg 24
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
ugagggaccc aggacaggag a 21
Claims (23)
- hsa-miR-6807-5p; hsa-miR-6856-5p; hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p의 조합; hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-575의 조합; hsa-miR-6856-5p와 hsa-miR-575의 조합; 및 hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p와 hsa-miR-575의 조합;으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 마이크로 RNA 또는 둘 이상의 마이크로 RNA의 조합을 포함하는,
위암 검출용, 위암치료의 완치도 판정용 또는 위암 재발 예측용 위암 바이오마커 조성물. - 제1항에 있어서,
소변 검체 또는 혈액 검체에서 검출되는 것을 특징으로 하는 위암 바이오마커 조성물. - 삭제
- (1) 피험자로부터 채취한 검체의 위암 바이오마커를 검출하는 단계;
(2) 피험자의 피로리균 감염 검사 결과를 준비하는 단계;
(3) 단계 (1)에 따라 결정된 상기 위암 바이오마커의 발현 레벨과 단계 (2)에서 준비한 피로리균 감염 검사의 결과를 기초로 위암과 관련된 정보를 획득하는 단계;를 포함하고,
상기 위암 바이오마커는,
hsa-miR-6807-5p; hsa-miR-6856-5p; hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p의 조합; hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-575의 조합; hsa-miR-6856-5p와 hsa-miR-575의 조합; 및 hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p와 hsa-miR-575의 조합;으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 마이크로 RNA 또는 둘 이상의 마이크로 RNA의 조합을 포함하는, 위암의 검사를 위한 정보 제공 방법. - 제4항에 있어서, 상기 위암 바이오마커는,
hsa-miR-6807-5p와 hsa-miR-6856-5p이며,
상기 위암 바이오마커의 발현 레벨은,
상기 위암 바이오마커의 검출 결과를 표준화 인자인 hsa-miR-3610 및 hsa-miR-4669의 검출 결과를 이용하여 보정함으로써 결정되는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 위암 바이오마커의 레벨은 위암 병기와 양의 상관을 나타내는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 위암 바이오마커가 qRT-PCR법으로 검출되는 방법. - 제7항에 있어서, 상기 위암 바이오마커의 발현 레벨은,
상기 위암 바이오마커의 Ct치(Threshold Cycle)에서 표준화 인자의 Ct치를 뺀 값(ΔCt치)를 기초로 결정되는 방법. - 제4항에 있어서,
검체가 소변 또는 혈액인 방법. - 제1항에 기재된 위암 바이오마커를 검출하기 위한 시약과 취급설명서를 포함하는 위암 검사용 키트.
- 제10항에 있어서,
상기 시약이 hsa-miR-6807-5p 검출용 시약과 hsa-miR-6856-5p 검출용 시약의 조합인 위암 검사용 키트. - 제10항 또는 제11항에 있어서,
마이크로 RNA 추출용 시약, 표준화 인자 특이적 프라이머, DNA폴리메라제, 역전사효소, dNTP, 소변 검체 채취 용기, 반응장치 및 검출장치로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 요소를 추가로 포함하는 위암 검사용 키트. - 삭제
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
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