CN114746551A - 大肠癌诊断用标志物、辅助大肠癌的诊断的方法、收集数据以用于大肠癌诊断的方法、大肠癌的诊断试剂盒、大肠癌治疗药物、大肠癌的治疗方法、大肠癌的诊断方法 - Google Patents

大肠癌诊断用标志物、辅助大肠癌的诊断的方法、收集数据以用于大肠癌诊断的方法、大肠癌的诊断试剂盒、大肠癌治疗药物、大肠癌的治疗方法、大肠癌的诊断方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种能够高精度地判别有无罹患大肠癌且高灵敏度地检测早期的大肠癌的大肠癌诊断用标志物；测定所述大肠癌诊断用标志物的表达量的辅助大肠癌的诊断的方法、收集数据以用于大肠癌诊断的方法、大肠癌的诊断方法、大肠癌的治疗方法；具备与所述大肠癌诊断用标志物特异性的引物的大肠癌的诊断试剂盒；包含所述大肠癌诊断用标志物的抑制剂的大肠癌治疗药物。本发明的大肠癌诊断用标志物是选自由hsa‑miR‑129‑1‑3p、hsa‑miR‑566及hsa‑miR‑598‑5p构成的组中的至少一种微小RNA。

Description

大肠癌诊断用标志物、辅助大肠癌的诊断的方法、收集数据以 用于大肠癌诊断的方法、大肠癌的诊断试剂盒、大肠癌治疗药 物、大肠癌的治疗方法、大肠癌的诊断方法
技术领域
本发明涉及一种大肠癌诊断用标志物、辅助大肠癌的诊断的方法、收集数据以用于大肠癌诊断的方法、大肠癌的诊断试剂盒、大肠癌治疗药物、大肠癌的治疗方法、大肠癌的诊断方法。
本申请基于2019年8月16日在日本申请的日本特愿2019-149338号主张优先权，其内容引用于本文中。
背景技术
作为调查有无罹患大肠癌的方法，已知有下消化道内镜检查、大便潜血检查(例如，非专利文献1、2)。下消化道内镜检查耗时长，侵袭性高，检查所需费用也较高。因而，下消化道内镜检查并不推荐用于健康者的检诊、筛查。
根据以上可知，在大肠癌的检诊等中，多进行大便潜血检查。
另外，作为大肠癌的生物标志物，已知有CEA(carcinoembryonicantigen，癌胚抗原)、CA19-9(carbohydrate antigen 19-9，糖类抗原)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：国家癌症中心“癌症信息服务”(URL：https：//ganjoho.jp/med_pro/pre_scr/screening/screening_colon.html，访问日期：2019年07月12日)
非专利文献2：医学书院“医学周报，第2940号，2011年08月08日”(URL：http：//www.igaku-shoin.co.jp/paperDetail.do？id＝PA02940_05，访问日期：2019年07月12日)
发明内容
然而，大便潜血反应错误判别健康检测者罹患了大肠癌的几率、即假阳性的几率很高。因而，大便潜血反应准确判别有无罹患大肠癌时的精度不充分。
此外，非专利文献2中记载了，在早期的大肠癌中，免疫学潜血反应的大肠癌检测率为30～40％。如此一来，即使在实际临床中也存在检测灵敏度非常低的问题。
即使CEA、CA19-9等现有的生物标志物，其大肠癌的检测率也较低，检测灵敏度不充分。
本发明提供一种可以高精度地判别有无罹患大肠癌、且高灵敏度地检测早期的大肠癌的大肠癌诊断用标志物。
本发明的第一种方案具有下述的[1]～[13]中记载的方案。
[1]一种大肠癌诊断用标志物，所述大肠癌诊断用标志物为选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA。
[2]根据[1]的大肠癌诊断用标志物，其中，所述微小RNA为hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的组合。
[3]根据[1]或[2]的大肠癌诊断用标志物，其中，所述大肠癌诊断用标志物包含于人的体液。
[4]一种辅助大肠癌的诊断的方法，测定从检查者采集的样品中[1]～[3]中任一项的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将所述表达量与标准值进行比较。
[5]根据[4]的方法，其中，为了将所述表达量与标准值进行比较，将所述样品中的下述miRNA作为标准化因子来将所述表达量标准化：
miRNA：hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p中的任意一者或两者。
[6]根据[4]或[5]的方法，其中，所述大肠癌的进展程度为0期或I期。
[7]一种收集数据以用于大肠癌诊断的方法，测定从检查者采集的样品中[1]～[3]中任一项的大肠癌诊断用标志物的表达量。
[8]根据[7]的方法，其中，测定所述表达量之后，将所述样品中的下述miRNA作为标准化因子来将所述表达量标准化：
miRNA：hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p中的任意一者或两者。
[9]根据[7]或[8]的方法，其中，所述大肠癌的进展程度为0期或I期。
[10]一种大肠癌的诊断试剂盒，用于诊断大肠癌，具备与[1]～[3]中任一项的大肠癌诊断用标志物特异性的引物。
[11]根据[10]的大肠癌的诊断试剂盒，其中，进一步具备选自由从样品中提取所述微小RNA的提取试剂、合成所述微小RNA的cDNA的cDNA合成试剂、样品采集容器、与作为标准化因子的miRNA特异性的标准化用引物、逆转录酶、DNA聚合酶及操作说明构成的组中的至少一种。
[12]根据[10]或[11]的大肠癌的诊断试剂盒，其中，所述大肠癌的进展程度为0期或I期。
[13]一种大肠癌治疗药物，包含选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA的抑制剂。
本发明的第二方案除所述[1]～[13]所述的方案之外，进一步具有下述《1》～＜＜23》所述的方案。
＜＜1》一种大肠癌诊断用标志物，所述大肠癌诊断用标志物为选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA。
《2》根据《1》的大肠癌诊断用标志物，其中，所述微小RNA为hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的组合。
《3》根据《1》或《2》的大肠癌诊断用标志物，其中，所述大肠癌诊断用标志物包含于人的体液。
《4》一种诊断大肠癌的方法，测定从检查者采集的样品中《1》～《3》中任一项的大肠癌诊断用标志物的表达量，将所述表达量与标准值进行比较。
《5》根据《4》的大肠癌的诊断方法，其中，为了将所述表达量与标准值进行比较，将所述样品中的miRNA作为标准化因子来将所述表达量标准化。
《6》根据《5》的大肠癌的诊断方法，其中，所述miRNA为hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p中的任意一者或两者。
《7》根据《4》～《6》中任一项的大肠癌的诊断方法，其中，所述大肠癌的进展程度为0期或I期。
《8》一种治疗大肠癌的方法，使用《4》～《7》中任一项的大肠癌的诊断方法诊断检查者，在诊断所述检查者罹患了大肠癌的情况下，向所述检查者给药大肠癌的治疗药物。
《9》一种治疗大肠癌的方法，使用《4》～《7》中任一项的大肠癌的诊断方法诊断检查者，在诊断所述检查者罹患了大肠癌的情况下，对所述检查者进行手术。
《10》一种判定有无罹患大肠癌的方法，测定从检查者采集的样品中《1》～《3》中任一项的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将所述表达量与标准值进行比较。
《11》根据《10》的大肠癌的判定方法，其中，为了将所述表达量与标准值进行比较，将所述样品中的miRNA作为标准化因子来将所述表达量标准化。
《12》根据《11》的大肠癌的判定方法，其中，所述miRNA为hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p中的任意一者或两者。
《13》根据《10》～《12》中任一项的大肠癌的判定方法，其中，所述大肠癌的进展程度为0期或I期。
《14》一种治疗大肠癌的方法，使用《10》～《13》中任一项的大肠癌的判定方法判定检查者有无罹患大肠癌，在判定所述检查者罹患了大肠癌的情况下，向所述检查者给药大肠癌的治疗药物。
《15》一种治疗大肠癌，使用《10》～《13》中任一项的大肠癌的判定方法判定检查者有无罹患大肠癌，在判定所述检查者罹患了大肠癌的情况下，对所述检查者进行手术。
《16》一种测试有无罹患大肠癌的方法，测定从检查者采集的样品中《1》～《3》中任一项的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将所述表达量与标准值进行比较。
《17》根据《16》的大肠癌的测试方法，其中，为了将所述表达量与标准值进行比较，将所述样品中的miRNA作为标准化因子来将所述表达量标准化，。
《18》根据《17》的大肠癌的测试方法，其中，所述miRNA为hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p中的任意一者或两者。
《19》根据《16》～《18》中任一项的大肠癌的测试方法，其中，所述大肠癌的进展程度为0期或I期。
《20》一种治疗大肠癌的方法，使用《16》～《19》中任一项的大肠癌的测试方法测试检查者有无罹患大肠癌，在判断所述检查者罹患了大肠癌的情况下，向所述检查者给药大肠癌的治疗药物。
《21》一种治疗大肠癌的方法，使用《16》～《19》中任一项的大肠癌的测试方法测试检查者有无罹患大肠癌，在诊断所述检查者罹患了大肠癌的情况下，对所述检查者进行手术。
《22》一种大肠癌治疗药物，包含选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA的抑制剂。
《23》一种大肠癌的治疗方法，抑制选自由检查者的hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA。
根据本发明，提供一种可以高精度地判别有无罹患大肠癌、且高灵敏度地检测早期的大肠癌的大肠癌诊断用标志物。
附图说明
图1是示出实施例的验证的概述的图。
图2是示出群组1中的miRNA阵列分析的结果的图。
图3是示出群组2中的各大肠癌诊断用标志物的ROC曲线的图。
图4是示出群组3中的各大肠癌诊断用标志物的ROC曲线的图。
图5是在健康者和0期或I期的大肠癌患者中比较并示出群组4中的hsa-miR-129-1-3p的表达量的图。
图6是在健康者和0期或I期的大肠癌患者中比较并示出群组4中的hsa-miR-566的表达量的图。
图7是示出群组4中的各大肠癌诊断用标志物的ROC曲线的图。
图8是在使用福尔马林固定石蜡包埋的分析中比较并示出正常组织和大肠癌组织中hsa-miR-129-1-3p的表达量的图。
图9是在使用福尔马林固定石蜡包埋的分析中比较并示出正常组织和大肠癌组织中hsa-miR-566的表达量的图。
图10是针对SW480及HCT116将(i)培养液中的外泌体、(ii)培养液、(iii)细胞本体中的hsa-miR-129-1-3p的表达量(2-△Ct)绘制为纵轴，将hsa-miR-566的表达量(2-△Ct)绘制为横轴而得到的图。
图11是用于评价SW480、HCT116的细胞动力的照片。
图12是用于评价SW480、HCT116的细胞动力的图表。
图13是示出Gene ontology分析的结果的图。
图14是示出Gene ontology分析的结果的图。
具体实施方式
本说明书及权利要求书中的以下术语的含义如本段落所述。
“hsa-miR-129-1-3p”为序列号1中记载的hsa-miR-129-1-3p基因(miRBaseAccession No.MIMAT0004548)，包括人以外的物种的同源物或直系同源物。
“hsa-miR-566”为序列号2中记载的hsa-miR-566基因(miRBase AccessionNo.MIMAT0003230)，包括人以外的物种的同源物或直系同源物。
“hsa-miR-598-5p”为序列号3中记载的hsa-miR-598-5p基因(miRBase AccessionNo.MIMAT0026620)，包括人以外的物种的同源物或直系同源物。
“hsa-miR-4669”为序列号4中记载的hsa-miR-4669基因(miRBase AccessionNo.MIMAT0019749)，包括人以外的物种的同源物或直系同源物。
“hsa-miR-6756-5p”为序列号5中记载的hsa-miR-6756-5p基因(miRBaseAccession No.MIMAT0027412)，包括人以外的物种的同源物或直系同源物。
“引物”表示与DNA及RNA中的任意一者或两者形成互补对的核苷酸。
本说明书中的以下的术语的意味如本段落所述。
“变异体”表示由多态性、突变等产生的天然的变异体；包含一个或两个以上碱基的缺失、替换、追加或插入的变异体。
“衍生物”表示由荧光基团、放射性同位素等产生的标记衍生物；具有有机官能团的修饰核苷酸；进行了碱基的重建、双键的饱和、脱氨基化、氧分子向硫分子替换等的核苷酸等。但是，衍生物并不限定于这些示例。
“检查者”表示人、黑猩猩等灵长类；小鼠、大鼠等啮齿类等哺乳类；犬、猫等宠物；牛、马、绵羊、山羊等家畜。
“检测者”表示作为检查者的人。
“健康体”及“健康者”为检查者，表示未罹患大肠癌的生物。
“精度”表示((真阳性的数量)+(真阴性的数量))/(总样本数)的值。
“灵敏度”表示(真阳性的数量)/((真阳性的数量)+(假阴性的数量))的值。灵敏度越高，越容易较早发现大肠癌，有助于完全切除癌症患处、降低复发率。
“特异度”表示(真阴性的数量)/((真阴性的数量)+(假阳性的数量))。特异度越高，越容易防止将健康体错误判别为大肠癌患者，防止实施无用的追加检查，有助于减轻患者的负担，减少医疗费用。
“检查”、“评价”及“测试”各术语规定的行为在日本及医疗行为从专利对象中排除的国家不包括由医生实行的医疗行为(例如，诊断人的疾病的行为、治疗人的疾病的行为等)。
表示数值范围的“～”表示包含其前后所记载的数值作为下限值及上限值。
<大肠癌诊断用标志物>
本发明的大肠癌诊断用标志物为选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA。即，本发明的大肠癌诊断用标志物为选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的一个微小RNA或两个以上微小RNA的组合。
只要在不损害本发明的效果的范围，则微小RNA可以进一步包含选自由hsa-miR-129-1-3p的变异体及衍生物、hsa-miR-566的变异体及衍生物、hsa-miR-598-5p的变异体及衍生物构成的组中的至少一种以上。
作为微小RNA的组合，从进一步提高判别有无罹患大肠癌时的精度、灵敏度及特异度方面出发，优选hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的组合。此外，若微小RNA的组合为hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的组合，则即使在大肠癌为0期或I期的情况下，也能够获得判别有无罹患大肠癌时的灵敏度及特异度优异这一显著的效果。
hsa-miR-129-1-3p能够通过例如RNA.9：175-179(2003).中记载的方法来确定。作为hsa-miR-129-1-3p的前体，已知有hsa-miR-129-1stem-loop(miRBase AccessionNo.MI0000252，序列号6)。hsa-miR-129-1stem-loop具有茎-环结构。
hsa-miR-566能够通过例如Proc Natl Acad Sci USA.103：3687-3692(2006).中记载的方法来确定。作为hsa-miR-566的前体，已知有hsa-miR-566stem-loop(miRBaseAccession No.MI0003572，序列号7)。hsa-miR-566stem-loop具有茎-环结构。
hsa-miR-598-5p能够通过例如，Proc Natl Acad Sci USA.103：3687-3692(2006).中记载的方法来确定。作为hsa-miR-598-5p的前体，已知有hsa-miR-598stem-loop(miRBase Accession No.MI0003610，序列号8)。hsa-miR-598-5p stem-loop具有茎-环结构。
本发明的大肠癌诊断用标志物优选包含于人的体液。若大肠癌诊断用标志物包含于人的体液，则检查无侵袭性，较为简便。此外，具有即使在自己家中等除医疗机构以外的场所也能够进行大肠癌的检查。
作为体液的具体例，可列举：血液、乳汁、尿、唾液、淋巴液、脑脊液、羊水、眼泪、汗、鼻涕、便液等体液。但是，体液并不限定于这些示例。
其中，尿采集简便，故优选作为体液。体液也可以为进行了从所述各体液中除去不需要的成分等预处理的处理液；培养所述各体液中所含的细胞而得到的培养液。
(作用机理)
如后述的实施例所示，以上说明的本发明的大肠癌诊断用标志物与健康者相比在大肠癌患者中显著高表达。因而，通过测定从检查者采集的样品中的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将该测定值与标准值比较评价大小，能够判别检查者是否罹患了大肠癌。
此外，如后述的实施例所示，本发明的大肠癌诊断用标志物即使在0期或I期的早期的大肠癌患者群中也具有显著高表达的倾向。因而，根据本发明的大肠癌诊断用标志物，即使在大肠癌的进展程度为0期或I期的情况下，也能够以优异的灵敏度及特异度判别有无罹患大肠癌。
(用途)
以上说明的本发明的大肠癌诊断用标志物能够应用于例如后述的辅助大肠癌的诊断的方法、评价罹患大肠癌的可能性的方法、用于诊断大肠癌的方法、大肠癌的检查方法、测试罹患大肠癌的可能性的方法、收集数据以用于大肠癌诊断的方法、用于辅助大肠癌的诊断的体外方法、大肠癌的诊断试剂盒。
除所述的各用途之外，本发明的大肠癌诊断用标志物也可以应用于大肠癌的诊断方法、大肠癌的判定方法、大肠癌的测试方法、大肠癌的治疗方法。
发明的大肠癌诊断用标志物的用途的详细内容将在后述的<辅助大肠癌的诊断的方法>项目中详细说明。
<辅助大肠癌的诊断的方法>
本发明的辅助大肠癌的诊断的方法提供辅助诊断检查者是否罹患了大肠癌的判断材料。可以基于该判断材料进行大肠癌的诊断。
在本发明的辅助大肠癌的诊断的方法中，测定从检查者采集的样品中本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量。接着，将大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值进行比较。
从检查者采集样品的方法不受特别限定。例如只要为在上述的<大肠癌诊断用标志物>的项目中所述的能够采集各种体液的方法，则不受特别限定。例如，在使用尿作为体液的情况下，可以为通常尿检中使用的方法。在使用其它体液的情况下，也可以使用普通检查中所使用的方法。
本发明的发明人发现，如后述的实施例所示，本发明的大肠癌诊断用标志物即特定的微小RNA在大肠癌患者中与健康者相比显著高表达。
由此，通过评价本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量是否高于某一标准值，能够检测大肠癌，并判别检查者是否罹患了大肠癌。
大肠癌诊断用标志物的表达量能够通过例如定量RT(Reverse Transcription，逆转录)-PCR测定。
大肠癌诊断用标志物的定量RT-PCR能够按照例如下述的方法(1)来进行。
·方法(1)：进行大肠癌诊断用标志物的逆转录反应，接着，使用通过逆转录反应得到的模板DNA(1)进行定量PCR。
在方法(1)中，首先，进行从检查者采集的样品中的微小RNA即大肠癌诊断用标志物的逆转录。在此，微小RNA为选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种。这些微小RNA为进行了处理后的成熟微小RNA(Mature miRNA)。
因而，在大肠癌诊断用标志物的逆转录中，优选使用以下的引物A1。
·引物A1：对大肠癌诊断用标志物特异的Looped RT Primer(环状RT引物)。
引物A1只要为与选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种特异性结合并形成茎-环结构的引物，则不受特别限定。
引物A1具有环结构。引物A1通过与大肠癌诊断用标志物结合而形成茎-环结构。逆转录酶识别该茎-环结构，进行大肠癌诊断用标志物的逆转录反应。通过逆转录反应合成大肠癌诊断用标志物的模板DNA(1)。
用于逆转录反应的逆转录酶不受特别限定。能够使用通常实验室中所用的逆转录酶。作为逆转录酶，也可以使用重组蛋白。
接着，使用通过大肠癌诊断用标志物的逆转录反应得到的大肠癌诊断用标志物的模板DNA(1)进行定量PCR。在定量PCR中，优选使用以下的两种引物A2、引物A3。
·引物A2：与模板DNA(1)特异性结合的正向引物。
·引物A3：与模板DNA(1)特异性结合的反向引物。
通过使用这些引物A2、A3进行定量PCR，能够根据大肠癌诊断用标志物的模板DNA(1)来测定大肠癌诊断用标志物的表达量。
用于定量PCR的DNA聚合酶不受特别限定。能够使用通常实验室所用的DNA聚合酶。作为DNA聚合酶，也可以使用重组蛋白。
引物A1、引物A2、引物A3能够通过普通的核酸合成、核苷酸合成来准备。例如也可以从承接核酸委托合成的企业获得。另外，作为用于检测大肠癌诊断用标志物的市售的试剂盒还能够使用TaqMan Advanced MicroRNA Assay(Thermo Fisher Scientific，USA)。因此，本领域技术人员可以通过通常方法获得引物A1、引物A2、引物A3，不会有很大负担，从而能够确认大肠癌诊断用标志物的表达量。
例如，包含下述的引物A11、引物A21、引物A31的TaqMan Advanced MicroRNAAssay的目录编号为A25576，其Assay ID为480873_mir。
·引物A11：与hsa-miR-129-1-3p特异性结合的Looped RT Primer。
·引物A21：与hsa-miR-129-1-3p的模板DNA(1)特异性结合的正向引物。
·引物A31：与hsa-miR-129-1-3p的模板DNA(1)特异性结合的反向引物。
例如，包含下述的引物A12、引物A22、引物A32的TaqMan Advanced MicroRNAAssay的目录编号为A25576，其Assay ID为479373_mir。
·引物A12：与hsa-miR-566特异性结合的Looped RT Primer。
·引物A22：与hsa-miR-566的模板DNA(1)特异性结合的正向引物。
·引物A32：与hsa-miR-566的模板DNA(1)特异性结合的反向引物。
例如，包含下述的引物A13、引物A23、引物A33的TaqMan Advanced MicroRNAAssay的目录编号为A25576，其Assay ID为479080_mir。
·引物A13：与hsa-miR-598-5p特异性结合的Looped RT Primer。
·引物A23：与hsa-miR-598-5p的模板DNA(1)特异性结合的正向引物。
·引物A33：与hsa-miR-598-5p的模板DNA(1)特异性结合的反向引物。
在本发明的辅助大肠癌的诊断的方法中，能够基于定量PCR中的循环数的截止值来计算微小RNA的表达量。
在定量PCR中，若样品中待测定核酸的量相对较多，则核酸的扩增量达到某一定值之前的循环数相对较短。另一方面，若样品中待测定的核酸的量相对较多，则核酸的扩增量到达某一定的值之前的循环数变长，截止值增大。将该核酸的扩增量达到某一定的阈值之前的循环数作为截止值，通过校准曲线计算待测定的核酸的量。
参与确定截止值的核酸的扩增量的阈值可以根据检查者的年龄、性别、采集的样品中的总RNA量、使用的大肠癌诊断用标志物的种类、采集方法、样本的种类等条件适当设置。
在本发明的辅助大肠癌的诊断的方法中，为了将大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值进行比较，优选将样品中的miRNA作为标准化因子来将大肠癌诊断用标志物的表达量标准化。通过将大肠癌诊断用标志物的表达量标准化，能够更准确地判断大肠癌诊断用标志物的表达量的相对大小，进而能够以更高精度判别有无罹患大肠癌。
作为用作标准化因子的miRNA，优选hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p中的任意一者或两者，更优选hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p的组合。
本发明的发明人发现，hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p在人等物种的尿中持续表达，且表达量稳定。如此一来，由于hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p的表达量稳定，因此它们可以作为从检查者采集的体液中所含的本发明的大肠癌诊断用标志物的标准化因子。
此外，hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p也可以作为从检查者采集的体液中所含的任意的miRNA的标准化因子。
只要不损害本发明的效果，则作为标准化因子的hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p可以进一步包含选自hsa-miR-4669的变异体及衍生物、hsa-miR-6756-5p的变异体及衍生物构成的组中的至少一种以上。
hsa-miR-4669能够通过例如Cancer Res.71：78-86(2011).中记载的方法来确定。作为hsa-miR-4669的前体，已知有hsa-miR-4669stem-loop(miRBase AccessionNo.MI0017300，序列号9)。hsa-miR-4669stem-loop具有茎-环结构。
hsa-miR-6756-5p能够通过例如Genome Res.22：1634-1645(2012).中记载的方法来确定。作为hsa-miR-6756-5p的前体，已知有hsa-miR-6756stem-loop(miRBaseAccession No.MI0022601，序列号10)。hsa-miR-6756stem-loop具有茎-环结构。
在本发明的辅助大肠癌的诊断的方法中将样品中的miRNA作为标准化因子来将大肠癌诊断用标志物的表达量标准化的情况下，也可以基于下述的△Ct来计算大肠癌诊断用标志物的表达量。通过使用△Ct，能够将大肠癌诊断用标志物的表达量数值化为2-△Ct。
△Ct：从大肠癌诊断用标志物的截止值中减去标准化因子的截止值而得到的值。
通过使用△Ct值，能够将△Ct值用于每种样本的大肠癌诊断用标志物的表达量的评价。具体而言，通过将2-△Ct用作各大肠癌诊断用标志物的表达量的测定值，并将2-△Ct与标准值进行比较，能够容易地判别检查者是否罹患了大肠癌。
在此，由于在大肠癌患者中大肠癌诊断用标志物相对高表达，因此，-△Ct值相对较大，2-△Ct的值相对变大。另一方面，在健康体中，-△Ct值相对较小，2-△Ct的值相对减小。
在该情况下，如果健康体中的作为指标的△Ct是已知的，则能够将健康体中的2-△Ct用作标准值。
△Ct值中的标准化因子的截止值能够采用从检查者采集的样品中的hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p的截止值的平均值。
用作标准化因子的miRNA的表达量能够通过例如定量PCR来测定。具体而言，例如，hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p各自的表达量能够基于标准化因子的定量PCR中的循环数的截止值来计算。
标准化因子的定量PCR能够按照例如下述的方法(2)来进行。
·方法(2)：进行标准化因子的逆转录反应，接着，使用通过逆转录反应得到的模板DNA(2)进行定量PCR。
在方法(2)中，首先，进行从检查者采集的样品中的miRNA即标准化因子的逆转录。在此，miRNA为选自由hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p构成的组中的至少一种。这些miRNA为进行处理后的成熟miRNA(Mature miRNA)。
因而，在标准化因子的逆转录中，优选使用以下的引物B1。
·引物B1：对标准化因子特异的Looped RT Primer。
引物B1只要为与选自由hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p构成的组中的至少一种特异性结合而形成茎-环结构的引物，则不受特别限定。
引物B1具有环结构。通过引物B1与标准化因子结合而形成茎-环结构。逆转录酶识别该茎-环结构，进行标准化因子的逆转录反应。通过逆转录反应合成标准化因子的模板DNA(2)。
用于逆转录反应的逆转录酶不受特别限定。能够使用通常实验室所用的逆转录酶。作为逆转录酶，也可以使用重组蛋白。
接着，使用通过标准化因子的逆转录反应得到的标准化因子的模板DNA(2)进行定量PCR。在定量PCR中，优选使用以下的两种引物B2、引物B3。
·引物B2：与模板DNA(2)特异性结合的正向引物。
·引物B3：与模板DNA(2)特异性结合的反向引物。
通过使用这些引物B2、B3进行定量PCR，能够根据标准化因子的模板DNA(2)测定标准化因子的表达量。
用于定量PCR的DNA聚合酶不受特别限定。能够使用通常实验室所用的DNA聚合酶。作为DNA聚合酶，也可以使用重组蛋白。
引物B1、引物B2、引物B3能够通过普通的核酸合成、核苷酸合成来准备。例如也可以从承接核酸委托合成的企业获得。另外，作为用于检测标准化因子的市售的试剂盒，还能够使用TaqMan Advanced MicroRNA Assay。因此，本领域技术人员可以通过通常方法获得引物B1、引物B2、引物B3，不会有很大负担，从而能够确认标准化因子的表达量。
例如，包含下述的引物B11、引物B21、引物B31的TaqMan Advanced MicroRNAAssay的目录编号为A25576，其Assay ID为478925_mir。
·引物B11：与hsa-miR-4669特异性结合的Looped RT Primer。
·引物B21：与hsa-miR-4669的模板DNA(2)特异性结合的正向引物。
·引物B31：与hsa-miR-4669的模板DNA(2)特异性结合的反向引物。
例如，包含下述的引物B12、引物B22、引物B32的TaqMan Advanced MicroRNAAssay的目录编号为A25576，其Assay ID为480284_mir。
·引物B12：与hsa-miR-6756-5p特异性结合的Looped RT Primer。
·引物B22：与hsa-miR-6756-5p的模板DNA(2)特异性结合的正向引物。
·引物B32：与hsa-miR-6756-5p的模板DNA(2)特异性结合的反向引物。
接着，在本发明的辅助大肠癌的诊断的方法中，将大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值进行比较。通过将大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值进行比较，能够判别检查者是否罹患了大肠癌。
在样品中的大肠癌诊断用标志物的表达量与健康体中的大肠癌诊断用标志物的表达量相比相对高的情况下，能够判定检查者罹患了大肠癌。
作为所述标准值，可以考虑使用若为该值以上则怀疑罹患大肠癌的标准值。在制定标准值时，可以参考健康体中的大肠癌诊断用标志物的表达量。通常，标准值为健康体中的大肠癌诊断用标志物的表达量。
在测定得到的大肠癌诊断用标志物的表达量高于标准值的情况下，判别检查者罹患了大肠癌。另一方面，在测定得到的大肠癌诊断用标志物的表达量低于标准值的情况下，判别检查者未罹患大肠癌。
判别时所使用的标准值可以根据检查者的年龄、性别、使用的大肠癌诊断用标志物的种类、采集方法、样本的种类等条件适当设置。
确定标准值时，优选将从健康者采集的样品中的miRNA作为标准化因子来将健康体中的大肠癌诊断用标志物的表达量标准化，并将健康体中的大肠癌诊断用标志物的表达量标准化而得到的值作为标准值。
通过将健康体中的大肠癌诊断用标志物的表达量标准化而得到的值作为标准值，在大肠癌的检查中容易更准确地判断大肠癌诊断用标志物的表达量的相对大小，能够以更高精度判别有无罹患大肠癌。
健康体中的大肠癌诊断用标志物能够与上述的方法(1)相同地测定。另外，健康体中的标准化因子的表达量能够与上述的方法(2)相同地测定。并且，标准值能够基于下述的△Ct’设置为2-△Ct’。
-△Ct’：从健康体中的大肠癌诊断用标志物的截止值中减去健康体中的标准化因子的截止值而得到的值。
如此一来，在本发明的辅助大肠癌的诊断的方法中，将本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值进行比较。并且，如后述的实施例所示，根据本发明的大肠癌诊断用标志物，能够高精度地分离0期或I期的早期的大肠癌患者与健康体。
因此，根据本发明的辅助大肠癌的诊断的方法，即使在大肠癌的进展程度为0期或I期的情况下，判别有无罹患大肠癌时的检查精度、检查灵敏度及特异度也很优异。
<评价罹患了大肠癌的可能性的方法>
在本发明的评价罹患了大肠癌的可能性的方法中，测定从检查者采集的样品中本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将所述表达量与标准值进行比较。
本发明的评价罹患了大肠癌的可能性的方法能够提供用于诊断检查者是否罹患了大肠癌的判断材料作为可能性。可以基于该判断材料进行大肠癌的诊断。
大肠癌诊断用标志物的表达量的测定的详细内容及优选方案可以与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
标准值的具体的内容、大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值的比较的详细内容及优选方案可以与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
在本发明的评价罹患了大肠癌的可能性的方法中，将本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值进行比较。并且，如后述的实施例所示，根据本发明的大肠癌诊断用标志物，能够高精度地分离0期或I期的早期的大肠癌患者与健康体。
因此，根据本发明的评价罹患了大肠癌的可能性的方法，即使在大肠癌的进展程度为0期或I期的情况下，也能够高精度地评价罹患了大肠癌的可能性。
<用于诊断大肠癌的方法>
在本发明的用于诊断大肠癌的方法中，测定从检查者采集的样品中本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将所述表达量与标准值进行比较。
本发明的用于诊断大肠癌的方法能够提供用于诊断检查者是否罹患了大肠癌的判断材料。可以基于该判断材料进行大肠癌的诊断。
大肠癌诊断用标志物的表达量的测定的详细内容及优选方案可以与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
标准值的具体的内容、大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值的比较的详细内容及优选方案可以与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
在本发明的用于诊断大肠癌的方法中，将本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值进行比较。并且，如后述的实施例所示，根据本发明的大肠癌诊断用标志物，能够高精度地分离0期或I期的早期的大肠癌患者与健康体。
因此，根据本发明的用于诊断大肠癌的方法，即使在大肠癌的进展程度为0期或I期的情况下，也能够提供有利于高精度地诊断大肠癌的判断材料。
<大肠癌的检查方法>
在本发明的大肠癌的检查方法中，测定从检查者采集的样品中本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将所述表达量与标准值进行比较。
本发明的大肠癌的检查方法能够提供辅助诊断检查者是否罹患了大肠癌的判断材料。可以基于该判断材料进行大肠癌的诊断。
大肠癌诊断用标志物的表达量的测定的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
标准值的具体的内容、大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值的比较的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
在本发明的大肠癌的检查方法中，将本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值进行比较。并且，如后述的实施例所示，根据本发明的大肠癌诊断用标志物，能够高精度地分离0期或I期的早期的大肠癌患者与健康体。
因此，根据本发明的大肠癌的检查方法，即使在大肠癌的进展程度为0期或I期的情况下，也能够提供有利于高精度地诊断大肠癌的判断材料。
<测试罹患大肠癌的可能性的方法>
在本发明的测试罹患大肠癌的可能性的方法中，测定从检查者采集的样品中本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将所述表达量与标准值进行比较。
本发明的测试罹患大肠癌的可能性的方法能够提供用于诊断检查者是否罹患了大肠癌的判断材料作为可能性。可以基于该判断材料进行大肠癌的诊断。
大肠癌诊断用标志物的表达量的测定的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
标准值的具体的内容、大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值的比较的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
在本发明的测试罹患大肠癌的可能性的方法中，将本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值进行比较。并且，如后述的实施例所示，根据本发明的大肠癌诊断用标志物，能够高精度地分离0期或I期的早期的大肠癌患者与健康体。
因此，根据本发明的测试罹患大肠癌的可能性的方法，即使在大肠癌的进展程度为0期或I期的情况下，也能够高精度地测试检查者罹患了大肠癌的可能性。
<收集数据以用于大肠癌诊断的方法>
在本发明的收集数据以用于大肠癌诊断的方法中，测定从检查者采集的样品中本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量。
大肠癌诊断用标志物的表达量的测定的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
根据本发明的收集数据以用于大肠癌诊断的方法，能够获得用于高精度地诊断大肠癌的信息。
通过本发明的收集数据以用于大肠癌诊断的方法得到的信息能够用于与标准值进行比较。如此一来，该信息能够可以用于提供判断材料以诊断大肠癌。
标准值的具体的内容、大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值的比较的详细内容及优选方案可以与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
如后述的实施例所示，根据本发明的大肠癌诊断用标志物，能够高精度地分离0期或I期的早期的大肠癌患者与健康体。
因此，根据本发明的收集数据以用于大肠癌诊断的方法，由于其测定大肠癌诊断用标志物的表达量，因此即使在大肠癌的进展程度为0期或I期的情况下，也能够获得有利于用于高精度地诊断大肠癌的信息。
<用于辅助大肠癌的诊断的体外方法>
在本发明的用于辅助大肠癌的诊断的体外方法中，测定从检查者采集的样品中本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量。
大肠癌诊断用标志物的表达量的测定的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
根据本发明的用于辅助大肠癌的诊断的体外方法，能够获得用于高精度地诊断大肠癌的信息。
通过本发明的用于辅助大肠癌的诊断的体外方法得到的信息能够用于与标准值进行比较。如此一来，该信息可以用于提供判断材料以诊断大肠癌。
标准值的具体的内容、大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值的比较的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
如后述的实施例所示，根据本发明的大肠癌诊断用标志物，能够高精度地分离0期或I期的早期的大肠癌患者与健康体。
因此，根据本发明的用于辅助大肠癌的诊断的体外方法，由于测定大肠癌诊断用标志物的表达量，因此即使在大肠癌的进展程度为0期或I期的情况下，也能够获得有利于高精度地诊断大肠癌的信息。
<大肠癌的诊断方法>
在本发明的大肠癌的诊断方法中，测定从检查者采集的样品中本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将所述表达量与标准值进行比较。
本发明的大肠癌的诊断方法是诊断检查者是否罹患了大肠癌的方法。
大肠癌诊断用标志物的表达量的测定的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
标准值的具体的内容、大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值的比较的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
在本发明的大肠癌的诊断方法中，将本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值进行比较。并且，如后述的实施例所示，根据本发明的大肠癌诊断用标志物，能够高精度地分离0期或I期的早期的大肠癌患者与健康体。
因此，根据本发明的大肠癌的诊断方法，即使在大肠癌的进展程度为0期或I期的情况下，能够高精度地诊断大肠癌。
<大肠癌的判定方法>
在本发明的大肠癌的判定方法中，测定从检查者采集的样品中本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将所述表达量与标准值进行比较。
本发明的大肠癌的判定方法是判定检查者有无罹患大肠癌的方法。
大肠癌诊断用标志物的表达量的测定的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
标准值的具体的内容、大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值的比较的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
在本发明的大肠癌的判定方法中，将本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值进行比较。并且，如后述的实施例所示，根据本发明的大肠癌诊断用标志物，能够高精度地分离0期或I期的早期的大肠癌患者与健康体。
因此，根据本发明的大肠癌的判定方法，即使在大肠癌的进展程度为0期或I期的情况下，也能够高精度地判定大肠癌。
<大肠癌的测试方法>
在本发明的大肠癌的测试方法中，测定从检查者采集的样品中本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将所述表达量与标准值进行比较。
本发明的大肠癌的测试方法是测试检查者有无罹患大肠癌的方法。
大肠癌诊断用标志物的表达量的测定的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
标准值的具体的内容、大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值的比较的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
在本发明的大肠癌的测试方法中，将本发明的大肠癌诊断用标志物的表达量与标准值进行比较。并且，如后述的实施例所示，根据本发明的大肠癌诊断用标志物，能够高精度地分离0期或I期的早期的大肠癌患者与健康体。
因此，根据本发明的大肠癌的测试方法，即使在大肠癌的进展程度为0期或I期的情况下，也能够高精度地测试是否罹患了大肠癌。
<大肠癌的诊断试剂盒>
本发明的大肠癌的诊断试剂盒是用于检查有无罹患大肠癌的试剂盒。本发明的大肠癌的诊断试剂盒具备与本发明的大肠癌诊断用标志物特异性的引物。
作为本发明的大肠癌的诊断试剂盒中的引物，可列举上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的引物A1、引物A2、引物A3。大肠癌的诊断试剂盒中的引物能够与本发明的大肠癌诊断用标志物特异性地形成互补对。
引物A1、引物A2、引物A3的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
本发明的大肠癌的诊断试剂盒可以进一步具备选自由从样品中提取大肠癌诊断用标志物即微小RNA的提取试剂、合成微小RNA的cDNA的cDNA合成试剂、样品采集容器、与作为标准化因子的miRNA特异性的引物，逆转录酶及操作说明构成的组中的至少一种。
作为提取试剂，可列举普通的RNA提取试剂。作为市售的RNA提取试剂的具体例，可列举例如miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen，USA)。但是，提取试剂并不限定于这些示例。
cDNA合成试剂是用于合成大肠癌诊断用标志物即微小RNA的cDNA的试剂。作为市售的cDNA合成试剂，可列举例如TaqMan Advanced MicroRNA cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher Scientific，USA)。但是，cDNA合成试剂并不限定于该示例。
cDNA合成试剂可以用于合成用作标准化因子的miRNA的cDNA。
样品采集容器只要为可以收容检查者的体液的容器，则不受特别限定。例如，在体液为尿的情况下，样品采集容器可以为普通的尿检用容器。
作为标准化用引物，可列举上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的引物B1、引物B2、引物B3。标准化用引物能够与作为标准化因子的miRNA特异性地形成互补对。
引物B1、引物B2的详细内容及优选方案与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的内容相同。
逆转录酶、DNA聚合酶是用于通过RT-PCR来定量大肠癌诊断用标志物即微小RNA的试剂。定量大肠癌诊断用标志物时，能够使用上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>的项目中所述的方法(1)。逆转录酶只要为可以逆转录本发明的大肠癌诊断用标志物，且可以定量大肠癌诊断用标志物的酶，则不受特别限定。
逆转录酶可以用于用作标准化因子的miRNA的逆转录及定量。逆转录酶只要能够用于通常的定量PCR，则不受特别限定。
本发明的大肠癌的诊断试剂盒的操作说明是记载有本发明的大肠癌的诊断试剂盒的使用方法的书面记录。
操作说明中可以进一步记载使用时的注意事项、故障排除、联系信息等信息。操作说明中记载的信息并不限定于这些示例。如此一来，操作说明只要最少具备足以得到本发明的效果的信息即可，记载事项不受特别限定。
本发明的大肠癌的诊断试剂盒的使用方法可以与上述的<辅助大肠癌的诊断的方法>中所述的内容相同。可以考虑例如下述等使用方法：使用本发明的大肠癌的诊断试剂盒中的引物进行定量PCR，定量大肠癌诊断用标志物即微小RNA，并其测定值与标准值进行比较。但是，本发明的大肠癌的诊断试剂盒的使用方法并不限定于该示例。
<大肠癌的治疗方法>
在本发明的大肠癌的治疗方法中，使用选自由上述的本发明的辅助大肠癌的诊断的方法、评价罹患了大肠癌的可能性的方法、用于诊断大肠癌的方法、大肠癌的检查方法、测试罹患大肠癌的可能性的方法、收集数据以用于大肠癌诊断的方法、用于辅助大肠癌的诊断的体外方法、大肠癌的诊断试剂盒、大肠癌的诊断方法、大肠癌的判定方法及大肠癌的测试方法构成的组中的至少一种以上来进行检查者的诊断等。
在本发明的大肠癌的治疗方法的一种方案中，在诊断检查者罹患了大肠癌的情况下，向检查者给药大肠癌的治疗药物。
在本发明的大肠癌的治疗方法的一种方案中，在诊断检查者罹患了大肠癌的情况下，对检查者进行手术。
在本发明的大肠癌的治疗方法的一种方案中，抑制选自由检查者的hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA。
在本发明的大肠癌的治疗方法中，检查者的诊断可以为判定检查者有无罹患大肠癌，也可以为测试检查者有无罹患大肠癌。
大肠癌的治疗药物不受特别限定。作为大肠癌的治疗药物，优选临床上已确认效能、药效的药物。
大肠癌的治疗药物可以为后述的本发明的大肠癌治疗药物，也可以为抗癌剂，还可以为分子靶向治疗药物。但是，大肠癌的治疗药物并不限定于这些示例。
作为抗癌剂，可列举：氟尿嘧啶、替加氟-尿嘧啶组合剂、替加氟-吉美拉西-奥替拉西钾组合剂、卡培他滨、依立替康、奥沙利铂、曲氟尿苷-盐酸替吡嘧啶等。但是，抗癌剂并不限定于这些示例。本申请的申请日尚未市售但将来可能市售的抗癌剂也可以用于本发明的大肠癌的治疗方法。
作为分子靶向治疗药物，可列举：西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、雷莫芦单抗、阿柏西普、瑞戈非尼等。但是，分子靶向治疗药物并不限定于这些示例。本申请的申请日尚未市售但将来可以市售的分子靶向治疗药物也可以用于本发明的大肠癌的治疗方法。
在检查者为人以外的生物的情况下，大肠癌的治疗药物可以为研究阶段的药剂物质，也可以为开发阶段的药剂物质，还可以为临床试验阶段的药剂物质。
药剂的给药方法不受特别限定。通常选择内服、点滴等。但是，药剂的给药方法并不限定于这些示例。
对检查者进行的手术不受特别限定。通常选择内窥镜手术、手术切除、放射治疗法等。但是，对检查者进行的手术并不限定于这些示例。本申请的申请日尚未普及但将来可能会实施的手术、治疗法也能够用于本发明的大肠癌的治疗方法。
在本发明的大肠癌的治疗方法中，使用选自由上述的本发明的辅助大肠癌的诊断的方法、评价罹患了大肠癌的可能性的方法、用于诊断大肠癌的方法、大肠癌的检查方法、测试罹患大肠癌的可能性的方法、收集数据以用于大肠癌诊断的方法、用于辅助大肠癌的诊断的体外方法、大肠癌的诊断试剂盒、大肠癌的诊断方法、大肠癌的判定方法及大肠癌的测试方法构成的组中的至少一种以上。
因而，根据本发明的大肠癌的治疗方法，可以基于高精度的诊断结果来治疗检查者。因此，能够防止实施无用的治疗行为，能够减轻患者的负担，减少医疗费用。
<大肠癌治疗药物>
本发明的大肠癌治疗药物包含选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA的抑制剂。
作为hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566、hsa-miR-598-5p的抑制剂，可列举例如miRNA inhibitor。miRNA inhibitor为微小RNA的反义的核苷酸。miRNA inhibitor与作为正义链的微小RNA结合，抑制该微小RNA的功能。
作为miRNA inhibitor，能够使用市售的试剂盒。作为这样的市售的试剂盒，可列举例如mirVana miRNA inhibitor(Thermo Fisher Scientific，USA)。例如，包含hsa-miR-129-1-3p的miRNA inhibitor的mirVana miRNA inhibitor的目录编号为4464084，其AssayID为MH12962。另外，包含hsa-miR-566的miRNA inhibitor的mirVana miRNA inhibitor的目录编号为4464084，其Assay ID为MH11490。
此外，作为hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566、hsa-miR-598-5p的抑制剂，可列举RNAi试剂。但是，抑制剂并不限定于这些示例。即使在在本申请的申请日尚未普及的抑制剂，只要其为能够抑制hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566、hsa-miR-598-5p的表达的分子，则可能能够用于本发明的大肠癌治疗药物。
(作用机理)
以上说明的本发明的大肠癌治疗药物包含选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA的抑制剂。如后述的实施例所示，若抑制选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA的表达量，则大肠癌细胞的细胞动力降低。因而显示，hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566、hsa-miR-598-5p各微小RNA的抑制剂可能也可以用作大肠癌的治疗药物候选。
综上所述，根据本发明的大肠癌治疗药物，可能会得到治愈大肠癌的效果。另外，包含选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA的抑制剂的本发明的大肠癌治疗药物也可以认为是大肠癌细胞的动力的抑制剂。同理，阻碍选自由检查者的hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA的方案的大肠癌的治疗方法也可以认为是大肠癌细胞的动力的抑制方法。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明不受以下的记载限定。
<缩写的说明>
qRT-PCR：定量RT-PCR
median：中值
IQR：四分位距(interquartile range)
Healthy：健康者
CRC：大肠癌(colorectal cancer)患者
stage 0/I CRC：0期或I期的早期大肠癌患者
n：样本数
P value：p值
AUC：Area Under the ROC Curve，ROC曲线下面积
95％CI：95％置信区间
表中，“E”表示10的幂运算。例如，“1.90E-04”表示1.90×10-4。
<群组的构建>
首先，由健康者299例及大肠癌患者223例构成的总群组522例中提取将年龄及性别随机匹配的415例，将415例的群组随机分为以下的三个群组，即群组1、群组2、群组3。
群组1：由健康者6例及大肠癌患者3例构成的9例。
群组2：由健康者140例及大肠癌患者140例构成的280例。
群组3：由健康者63例及大肠癌患者63例构成的126例。
在此，群组2及群组3中的健康者的合计数为203例。另外，在群组2及群组3中的大肠癌患者中，进展程度为0期或I期的病例数合计64例。
因而，进一步构建下述的群组4，通过群组4的分析来确认早期大肠癌的检测灵敏度、精度及特异度。
群组4：由健康者203例及0期或I期的大肠癌患者64例构成的267例。
<RNA的提取>
在各群组中，提取从尿中采集到的样品中的RNA。
将采集之后立刻在-80℃下冷冻保存的尿200μL作为样品，使用miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen，USA)，按照添加的协议中记载的条件提取样品中的miRNA。
<cDNA的合成>
将提取的miRNA作为模板合成cDNA。使用TaqMan Advanced MicroRNA cDNASynthesis Kit(ThermoFisher Scientific，USA)，按照添加的协议中记载的条件合成cDNA。
<qRT-PCR>
使用合成的cDNA进行qRT-PCR。qRT-PCR使用TaqMan Advanced MicroRNA Assay及7500 Fast real-time PCR system(ThermoFisher Scientific，USA)。
将qRT-PCR的热循环及反应条件示于表1，将Assay ID及目标miRNA的一览表及各碱基序列示于表2。
[表1]
Figure BDA0003505675610000311
[表2]
目标miRNA Assay ID miRNA序列
hsa-miR-129-1-3p 480873_mir 5'-AAGCCCUUACCCCAAAAAGUAU-3'
hsa-miR-4669 478925_mir 5'-UGUGUCCGGGAAGUGGAGGAGG-3'
hsa-miR-566 479373_mir 5'-GGGCGCCUGUGAUCCCAAC-3'
hsa-miR-598-5p 479080_mir 5'-GCGGUGAUCCCGAUGGUGUGAGC-3'
hsa-miR-6756-5p 480284_mir 5'-AGGGUGGGGCUGGAGGUGGGGCU-3'
图1是示出本实施例的验证的概述的流程图。
群组1中，进行miRNA阵列分析，选定或鉴定在大肠癌患者的尿中异常表达的多个miRNA(参见图2)。群组1为全面分析群组(图1中，Discovery cohort)。
群组2中，在群组1中通过miRNA阵列分析鉴定的各miRNA中，针对作为本发明的大肠癌诊断用标志物的三种miRNA，通过qRT-PCR法测定各自的表达量。并通过测定结果的多变量分析提取显著的大肠癌诊断用标志物，构建基因诊断小组。群组2为训练群组(图2中，Training set)。
群组3中，验证群组2中构建的基因诊断小组的精度。群组3为校验群组(图3中，Validation set)。
群组4中，主要分析早期大肠癌的检测精度。
以下，依次对本实施例中进行的群组1、群组2、群组3、群组4的分析的具体的内容及分析结果进行说明。
<群组1的分析>
使用群组1中提取的miRNA，通过SurePrint miRNAmicroarray(Agilent，USA)进行分析。数据的分析中使用GeneSpringGX(Agilent)。
miRNA阵列分析后，鉴定除大肠癌患者的尿中显著升高或降低的11种miRNA。
<群组2的分析>
用qRT-PCR法测定群组1中选定的11种miRNA。表3示出针对11种miRNA中的hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566、hsa-miR-598-5p这三种测得的各miRNA的表达量。
[表3]
Figure BDA0003505675610000331
如表3所示，在hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566、hsa-miR-598-5p中，2-△Ct的值即以上各基因的表达量的测定值在大肠癌患者(CRC)中均比健康者(Healthy)更大。
群组2中，对hsa-miR-566、hsa-miR-598-5p这三种微小RNA各自的表达量的测定结果进行单变量分析及多变量分析，并验证健康者与大肠癌患者之间的显著差。将结果示于表4及图3。
图3是示出群组2中的各大肠癌诊断用标志物的ROC曲线的图。图3中，在横轴上绘制“1-特异度”，在纵轴上绘制“灵敏度”。
[表4]
Figure BDA0003505675610000332
如表4所示，在hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566、hsa-miR-598-5p这三种微小RNA中，P值也低于0.001。由此确认，针对hsa-miR-566、hsa-miR-598-5p这三种所测得的各微小RNA与健康者相比在大肠癌患者的尿中显著高表达。
此外，根据多变量分析的结果，提取miR-129-1-3p和miR-566分别作为独立的大肠癌标志物。
[表5]
微小RNA AUC(95％CI)
hsa-miR-129-1-3p及has-miR-566的组合 0.811(0.762-0.861)
hsa-miR-129-1-3p单独 0.790(0.738-0.841)
hsa-miR-566单独 0.724(0.666-0.783)
hsa-miR-598-5p单独 0.640(0.573-0.707)
表5表示图3所示的各ROC曲线的AUC及95％CI。
如表5所示确认，通过将hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566、hsa-miR-598-5p分别作为大肠癌诊断用标志物所组成的基因诊断小组能够良好地分离健康者与大肠癌患者。
如表5所示，在将hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的组合作为大肠癌诊断用标志物所组成的基因诊断小组中，ROC曲线(图3)的AUC为0.811，结果特别良好。
<群组3的分析>
群组3的分析中，针对hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566这两种测定各微小RNA的表达量。接着，对各微小RNA的表达量的测定结果进行单变量分析及多变量分析，验证健康者和大肠癌患者之间的显著差。将结果示于表6。
图4是示出群组3中的各大肠癌诊断用标志物的ROC曲线的图。表7示出图4所示的各ROC曲线的AUC及95％CI。图4中，在横轴上绘制“1-特异度”，在纵轴上绘制“灵敏度”。
[表6]
Figure BDA0003505675610000351
如表6所示，在群组3中，hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566的2-△Ct的值即以上各基因的表达量的测定值在大肠癌患者中均大于健康者。
另外，如表6所示，单变量分析后，P值低于0.001。由此确认，hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566与健康者相比在大肠癌患者的尿中显著高表达。
[表7]
微小RNA AUC(95％CI)
hsa-miR-129-1-3p及miR-566的组合 0.868(0.806-0.931)
hsa-miR-129-1-3p单独 0.856(0.789-0.924)
hsa-miR-566单独 0.809(0.733-0.885)
如表7所示，在各微小RNA的ROC曲线(图4)中，AUC均超过0.80。由此判断，根据将各微小RNA作为大肠癌诊断用标志物所组成的基因诊断小组，能够高精度地分离健康者与大肠癌患者。
特别是，在将hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的组合作为大肠癌诊断用标志物所组成的基因诊断小组中，ROC曲线(图4)的AUC为0.868。由此判断，能够特别高精度地分离健康者与大肠癌患者，得到特别良好的结果。
群组3是与群组1及群组2相独立的病例组。由此，以上的群组3的分析结果显示，hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566可以用作独立的大肠癌诊断用标志物。
<群组4的分析>
在群组4的分析中，针对hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566测定各微小RNA的表达量。将结果示于表8。
[表8]
Figure BDA0003505675610000361
如表8所示，在群组4中，hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的2-△Ct的值即以上各基因的表达量的测定值在大肠癌患者中均大于健康者。
接着，对各微小RNA的表达量的测定结果进行单变量分析及多变量分析，验证健康者和大肠癌患者之间的显著差。将结果示于图5、图6、图7、表9。
[表9]
Figure BDA0003505675610000362
如表9所示，在单变量分析及多变量分析中，p值均低于0.001。由此确认，hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566与健康者相比在大肠癌患者的尿中显著高表达。
图5是在健康者和0期或I期的大肠癌患者中比较并示出群组4中的hsa-miR-129-1-3p的表达量的图。
图6是在健康者和0期或I期的大肠癌患者中比较并示出群组4中的hsa-miR-566的表达量的图。
如图5、图6所示，在hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566中，各大肠癌诊断用标志物在0期或I期的大肠癌患者中与健康者相比均显著高表达。
图7是示出群组4中的各大肠癌诊断用标志物的ROC曲线的图。表10示出群组4中获得的ROC曲线的AUC及95％CI。图7中，在横轴上绘制“1-特异度”，在纵轴上绘制“灵敏度”。
[表10]
微小RNA AUC(95％CI)
hsa-miR-129-1-3p及miR-566的组合 0.845(0.798-0.893)
hsa-miR-129-1-3p单独 0.832(0.782-0.882)
hsa-miR-566单独 0.755(0.692-0.819)
hsa-miR-598-5p单独 0.698(0.608-0.747)
如表10所示，在将微小RNA设为hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的组合的ROC曲线(图7)中，AUC为0.845。由此判断，根据将hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的组合作为大肠癌诊断用标志物所组成的基因诊断小组，即使大肠癌的进展程度为0期或I期的早期的大肠癌患者，也能够高精度地分离健康者与早期的大肠癌患者。
<ROC曲线上的截止值、灵敏度及特异度的一例>
将ROC曲线上的截止值、灵敏度及特异度的一例示于以下的记载及表11。
在将hsa-miR-598-5p单独用作大肠癌诊断用标志物的情况下，ROC曲线上的截止值为0.177以上。在该情况下，灵敏度为80.9％，特异度为67.9％(表11)。
在将hsa-miR-566单独用作大肠癌诊断用标志物的情况下，ROC曲线上的截止值为0.054。在该情况下，灵敏度为87.5％，特异度为53.5％(表11)。
在将hsa-miR-129-1-3p单独用作大肠癌诊断用标志物的情况下，ROC曲线上的截止值为0.00499以上。在该情况下，灵敏度为95.3％，特异度为54.2％(表11)。
在将hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的组合用作大肠癌诊断用标志物的情况下，ROC曲线上的截止值为0.152以上。在该情况下，灵敏度为90.6％，特异度为65.5％(表11)。
[表11]
微小RNA 灵敏度[％] 特异度[％]
hsa-miR-598-5p单独 80.9 67.9
hsa-miR-566单独 87.5 53.5
hsa-miR-129-1-3p单独 95.3 54.2
hsa-miR-129-1-3p及miR-566的组合 90.6 65.5
根据将hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的组合作为大肠癌诊断用标志物所组成的基因诊断小组，在健康者与0期或I期的大肠癌患者的识别中，AUC为0.845，特别良好(表10)。基于多变量分析，根据使用hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566表达的模型公式，能够以灵敏度：90.6％、特异度：65.5％判别0期或I期的大肠癌(表11)。
<使用福尔马林固定石蜡包埋的分析>
利用大肠癌20例的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片，比较hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566的表达量。FFPE使用通过内窥镜检查或外科手术切除得到的切片。
从大肠癌组织和其周围的正常组织中分别提取miRNA，测定hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566的表达量。另外，基于测定结果进行单变量分析，并计算p值。将分析结果示于表12、图8、9。
[表12]
Figure BDA0003505675610000391
如表12、图8所示，在大肠癌组织中，与相邻的正常组织相比，hsa-miR-129-1-3p显著高表达。
另一方面，如表12、图9所示，针对hsa-miR-566，虽然没有显著差，但可见与hsa-miR-129-1-3p相同的倾向。针对hsa-miR-566，未见表达量的显著差，考虑其原因在于样本数太少，仅有20。
<使用大肠癌细胞株进行分析>
利用大肠癌细胞株分析hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566的表达量。作为大肠癌细胞株，使用两种大肠癌细胞株，即SW480、HCT116。具体而言，培养SW480、HCT116，并从(i)培养液中的外泌体、(ii)培养液、(iii)细胞本体三者中分别采集样品。针对这些样品，测定hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566的表达量(2-△Ct)。将hsa-miR-129-1-3p的表达量(2-△Ct)绘制为纵轴，将hsa-miR-566的表达量(2-△Ct)绘制为横轴，并示于图10。
图10中，(i)表示外泌体中的表达量，(ii)表示培养液中的表达量，(iii)表示细胞中的表达量。
如图10所示，从所述(i)～(iii)的样品均可以检测到hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566。此外，所述(i)～(iii)的样品中，hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566均示出类似的表达倾向。
以上的分析结果显示，hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566、hsa-miR-598-5p可以用作大肠癌诊断用标志物。此外还显示，如果将hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的组合作为大肠癌诊断用标志物，即使在进展程度为早期的大肠癌的情况下，也能够高灵敏度地检测，并能够与健康体分离的可能性。
<关于大肠癌诊断用标志物的抑制>
向SW480、HCT116给药hsa-miR-566的抑制剂。在此，作为hsa-miR-566的抑制剂，使用mirVana miRNA inhibitor(目录编号：4464084，Assay ID：MH11490，Thermo FisherScientific，USA)。另外，作为阴性对照，使用Anti-miR miRNA Inhibitor NegativeControl#1(目录编号：AM17010，Thermo Fisher Scientific，USA)。然后，施行migrationassay，评价SW480、HCT116的细胞动力。将结果示于图11、12。
如图11、12所示，在SW480和HCT116两者中，在给药hsa-miR-566的抑制剂的情况下，细胞动力均显著降低。
在此，利用miRTarBase(http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)的miRNA的目标候选的数量据进行Gene ontology分析。结果示于图13、14。
图13、14中记载了前10个。用下划线表示两个miRNA共有的Gene ontology term。如图13、14所示，hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566在目标基因的功能上很多方面相同。如此一来显示，hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566可能具备彼此类似的分子生物学功能(图13、14)。
因此，通过抑制hsa-miR-129-1-3p，同样细胞动力也可能显著降低，因此，hsa-miR-129-1-3p的抑制剂也可以用作大肠癌治疗药物。
工业适用性
根据本发明，能够高精度地判别有无罹患大肠癌且高灵敏度地检测早期的大肠癌的。
序列表
<110> 名古屋市立大学
<120> 大肠癌诊断的生物标志物、辅助大肠癌诊断的方法、收集数据以诊断大肠癌的方法、大肠癌诊断试剂盒
<130> P1916
<160> 10
<170> 专利版本 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-129-1-3p的成熟miRNA序列
<400> 1
aagcccuuac cccaaaaagu au 22
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-566的成熟miRNA序列
<400> 2
gggcgccugu gaucccaac 19
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_feature
<223> hsa-miR-598-5p的成熟miRNA序列
<400> 3
gcggugaucc cgauggugug agc 23
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
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<220>
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<223> hsa-miR-4669的成熟miRNA序列
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uguguccggg aaguggagga gg 22
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<212> RNA
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<223> hsa-miR-6756-5p的成熟miRNA序列
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<211> 94
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
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<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 63
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
acccuagggu ggggcuggag guggggcuga ggcugagucu uccuccccuu ccucccugcc 60
cag 63

Claims (20)

1.一种大肠癌诊断用标志物，所述大肠癌诊断用标志物为选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA。
2.根据权利要求1所述的大肠癌诊断用标志物，其中，
所述微小RNA为hsa-miR-129-1-3p及hsa-miR-566的组合。
3.根据权利要求1或2所述的大肠癌诊断用标志物，其中，
所述大肠癌诊断用标志物包含于人的体液。
4.一种辅助大肠癌的诊断的方法，
测定从检查者采集的样品中权利要求1～3中任一项所述的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将所述表达量与标准值进行比较。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，
为了将所述表达量与标准值进行比较，将所述样品中的下述miRNA作为标准化因子来将所述表达量标准化：
miRNA：hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p中的任意一者或两者。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，
所述大肠癌的进展程度为0期或I期。
7.一种收集数据以用于大肠癌的诊断的方法，
测定从检查者采集的样品中权利要求1～3中任一项所述的大肠癌诊断用标志物的表达量。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，
测定所述表达量之后，将所述样品中的下述miRNA作为标准化因子来将所述表达量标准化：
miRNA：hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p中的任意一者或两者。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，
所述大肠癌的进展程度为0期或I期。
10.一种大肠癌的诊断试剂盒，
是用于诊断大肠癌的试剂盒，所述试剂盒具备与权利要求1～3中任一项所述的大肠癌诊断用标志物特异性的引物。
11.根据权利要求10所述的大肠癌的诊断试剂盒，其中，
所述诊断试剂盒进一步具备选自由从样品提取所述微小RNA的提取试剂、合成所述微小RNA的cDNA的cDNA合成试剂、样品采集容器、与作为标准化因子的miRNA特异性的标准化用引物、逆转录酶、DNA聚合酶及操作说明构成的组中的至少一种。
12.根据权利要求10或11所述的大肠癌的诊断试剂盒，其中，
所述大肠癌的进展程度为0期或I期。
13.一种大肠癌治疗药物，所述大肠癌治疗药物包含选自由hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA的抑制剂。
14.一种大肠癌的治疗方法，抑制选自由检查者的hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-566及hsa-miR-598-5p构成的组中的至少一种微小RNA。
15.一种大肠癌的诊断方法，是诊断大肠癌的方法，测定从检查者采集的样品中权利要求1～3中任一项所述的大肠癌诊断用标志物的表达量，并将所述表达量与标准值进行比较。
16.根据权利要求15所述的大肠癌的诊断方法，其中，
为了将所述表达量与标准值进行比较，将所述样品中的miRNA作为标准化因子来将所述表达量标准化。
17.根据权利要求16所述的大肠癌的诊断方法，其中，
所述miRNA为hsa-miR-4669及hsa-miR-6756-5p中的任意一者或两者。
18.根据权利要求15所述的大肠癌的诊断方法，其中，
所述大肠癌的进展程度为0期或I期。
19.一种大肠癌的治疗方法，是治疗大肠癌的方法，使用权利要求15所述的大肠癌的诊断方法诊断检查者，在诊断所述检查者罹患了大肠癌的情况下，向所述检查者给药大肠癌的治疗药物。
20.一种大肠癌的治疗方法，是治疗大肠癌的方法，使用权利要求15所述的大肠癌的诊断方法诊断检查者，在诊断所述检查者罹患了大肠癌的情况下，对所述检查者进行手术。
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