WO2021033605A1 - 大腸癌診断用マーカー、大腸癌の診断を補助する方法、大腸癌の診断のためにデータを収集する方法、大腸癌の診断用キット、大腸癌治療薬、大腸癌の治療方法、大腸癌の診断方法 - Google Patents

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colorectal cancer
mir
hsa
diagnosis
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貴也 志村
弘靖 岩崎
洋望 片岡
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公立大学法人名古屋市立大学
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Definitions

  • the present invention is a marker for diagnosing colorectal cancer, a method for assisting the diagnosis of colorectal cancer, a method for collecting data for diagnosing colorectal cancer, a kit for diagnosing colorectal cancer, a therapeutic agent for colorectal cancer, a method for treating colorectal cancer, Regarding the diagnostic method of colorectal cancer.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-149338 filed in Japan on August 16, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Lower gastrointestinal endoscopy and fecal occult blood test are known as methods for examining the presence or absence of colorectal cancer (for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Lower gastrointestinal endoscopy requires a long time, is highly invasive, and is expensive. Therefore, lower gastrointestinal endoscopy is not recommended for screening and screening tests for healthy subjects.
  • fecal occult blood test is often performed in colorectal cancer screening and the like.
  • biomarkers for colorectal cancer CEA (carcinoembryonicatingen) and CA19-9 (carcinoembryonic antigen 19-9) are known.
  • Non-Patent Document 2 describes that in early-stage colorectal cancer, the detection rate of colorectal cancer by immunological occult blood reaction is 30 to 40%. As described above, there is a problem that the detection sensitivity is extremely low even in actual clinical practice. Even with conventional biomarkers such as CEA and CA19-9, the detection rate of colorectal cancer is low and the detection sensitivity is not sufficient.
  • the present invention provides a marker for colorectal cancer diagnosis that enables highly accurate determination of the presence or absence of colorectal cancer and detection of early colorectal cancer with high sensitivity.
  • the first aspect of the present invention has the aspects described in the following [1] to [13].
  • a marker for diagnosing colorectal cancer which is at least one microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-129-1--3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p.
  • [4] A method for assisting the diagnosis of colorectal cancer, the expression level of any of the markers for colorectal cancer diagnosis of [1] to [3] in the sample collected from the subject is measured, and the expression level is described. How to compare with the reference value.
  • [5] The method of [4], wherein the expression level is standardized using the following miRNA in the sample as a standardizing factor in order to compare the expression level with the reference value. miRNA: One or both of hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p.
  • [6] The method of [4] or [5], wherein the degree of progression of the colorectal cancer is stage 0 or stage I.
  • [7] A method of collecting data for the diagnosis of colorectal cancer, in which the expression level of any of the markers for colorectal cancer diagnosis of [1] to [3] is measured in a sample collected from a subject. ,Method.
  • [8] The method of [7], wherein after measuring the expression level, the expression level is standardized using the following miRNA in the sample as a standardizing factor. miRNA: One or both of hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p.
  • a kit used for diagnosing colorectal cancer which comprises the marker for diagnosing colorectal cancer according to any one of [1] to [3] and a specific primer.
  • An extraction reagent for extracting the microRNA from a sample a cDNA synthesis reagent for synthesizing the cDNA of the microRNA, a sample collection container, a standardizing factor miRNA and a specific standardizing primer, and a reverse transcriptase.
  • a kit for diagnosing colorectal cancer further comprising at least one selected from the group consisting of DNA polymerase and an instruction manual.
  • a therapeutic agent for colorectal cancer which comprises an inhibitor of at least one microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-129-1--3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p.
  • the second aspect of the present invention further has the aspects described in ⁇ 1 >> to ⁇ 23 >> below in addition to the aspects described in the above [1] to [13].
  • ⁇ 1 A marker for diagnosing colorectal cancer, which is at least one microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-129-1--3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p.
  • ⁇ 2 A marker for diagnosing colorectal cancer according to ⁇ 1 >>, wherein the microRNA is a combination of hsa-miR-129-1-3p and hsa-miR-566.
  • ⁇ 3 A marker for diagnosing colorectal cancer of ⁇ 1 >> or ⁇ 2 >> contained in human body fluid.
  • ⁇ 4 A method for diagnosing colorectal cancer. The expression level of any of the markers for colorectal cancer diagnosis of ⁇ 1 >> to ⁇ 3 >> in a sample collected from a subject is measured, and the expression level is used as a reference. A method of diagnosing colorectal cancer to compare with the value.
  • ⁇ 5 The method for diagnosing colorectal cancer of ⁇ 4 >>, wherein the expression level is standardized using miRNA in the sample as a standardizing factor in order to compare the expression level with a reference value.
  • ⁇ 6 The method for diagnosing colorectal cancer of ⁇ 5 >>, wherein the miRNA is one or both of hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p.
  • ⁇ 7 A method for diagnosing colorectal cancer according to any one of ⁇ 4 >> to ⁇ 6 >>, wherein the degree of progression of the colorectal cancer is stage 0 or stage I.
  • ⁇ 8 A method for treating colorectal cancer, in which a subject is diagnosed using any of the methods for diagnosing colorectal cancer ⁇ 4 >> to ⁇ 7 >>, and the subject suffers from colorectal cancer.
  • ⁇ 9 A method for treating colorectal cancer, in which a subject is diagnosed using any of the methods for diagnosing colorectal cancer of ⁇ 4 >> to ⁇ 7 >>, and the subject suffers from colorectal cancer.
  • a method for treating colorectal cancer in which surgery is performed on the subject.
  • ⁇ 10 A method for determining the presence or absence of colorectal cancer, in which the expression level of any of the markers for colorectal cancer diagnosis of ⁇ 1 >> to ⁇ 3 >> in the sample collected from the subject is measured and described above.
  • a method for determining colorectal cancer by comparing the expression level with a reference value.
  • ⁇ 11 The method for determining colorectal cancer of ⁇ 10 >>, wherein the expression level is standardized using miRNA in the sample as a standardizing factor in order to compare the expression level with the reference value.
  • ⁇ 12 The method for determining colorectal cancer of ⁇ 11 >>, wherein the miRNA is one or both of hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p.
  • ⁇ 13 >> A method for determining colorectal cancer according to any one of ⁇ 10 >> to ⁇ 12 >>, wherein the degree of progression of the colorectal cancer is stage 0 or stage I.
  • ⁇ 14 A method for treating colorectal cancer, in which the presence or absence of colorectal cancer in a subject is determined using any of the methods for determining colorectal cancer in ⁇ 10 >> to ⁇ 13 >>.
  • a method for treating colorectal cancer in which a therapeutic agent for colorectal cancer is administered to the subject when it is determined that the patient has colorectal cancer.
  • ⁇ 15 A method for treating colorectal cancer, in which the presence or absence of colorectal cancer in a subject is determined using any of the methods for determining colorectal cancer in ⁇ 10 >> to ⁇ 13 >>.
  • a method for treating colorectal cancer in which surgery is performed on the subject when it is determined that the subject has colorectal cancer.
  • ⁇ 16 A method for testing the presence or absence of colorectal cancer.
  • the expression level of any of the markers for colorectal cancer diagnosis of ⁇ 1 >> to ⁇ 3 >> in a sample collected from a subject is measured, and the above-mentioned A test method for colorectal cancer that compares the expression level with a reference value.
  • ⁇ 17 The method for testing colorectal cancer according to ⁇ 16 >>, wherein the expression level is standardized using miRNA in the sample as a standardizing factor in order to compare the expression level with the reference value.
  • ⁇ 18 The method for testing colorectal cancer according to ⁇ 17 >>, wherein the miRNA is one or both of hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p.
  • ⁇ 19 A method for testing colorectal cancer according to any one of ⁇ 16 >> to ⁇ 18 >>, wherein the degree of progression of the colorectal cancer is stage 0 or stage I.
  • ⁇ 20 A method for treating colorectal cancer, in which the presence or absence of colorectal cancer in a subject is tested using any of the colorectal cancer test methods of ⁇ 16 >> to ⁇ 19 >>, and the subject is A method for treating colorectal cancer, in which a therapeutic agent for colorectal cancer is administered to the subject when it is determined that the patient has colorectal cancer.
  • ⁇ 21 A method for treating colorectal cancer, in which the presence or absence of colorectal cancer in a subject is tested using any of the colorectal cancer test methods of ⁇ 16 >> to ⁇ 19 >>, and the subject is A method for treating colorectal cancer, in which surgery is performed on the subject when it is determined that the subject has colorectal cancer.
  • ⁇ 22 A therapeutic agent for colorectal cancer, which comprises an inhibitor of at least one microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-129-1--3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p.
  • ⁇ 23 A method for treating colorectal cancer, which inhibits at least one microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p of a subject.
  • a marker for diagnosing colorectal cancer that can determine the presence or absence of colorectal cancer with high accuracy and detect early colorectal cancer with high sensitivity.
  • Hsa-miR-129-1-3p is the hsa-miR-129-1--3p gene (miRBase Accession No. MIMAT0004548) set forth in SEQ ID NO: 1, and includes homologs or orthologs of non-human species.
  • Hsa-miR-566 is the hsa-miR-566 gene (miRBase Accession No. MIMAT0003230) set forth in SEQ ID NO: 2, and includes homologs or orthologs of non-human species.
  • “Hsa-miR-598-5p” is the hsa-miR-598-5p gene (miRBase Accession No. MIMAT0026620) set forth in SEQ ID NO: 3, and includes homologs or orthologs of non-human species.
  • “Hsa-miR-4669” is the hsa-miR-4669 gene (miRBase Accession No. MIMAT0019749) set forth in SEQ ID NO: 4, and includes homologs or orthologs of non-human species.
  • “Hsa-miR-6756-5p” is the hsa-miR-6756-5p gene (miRBase Accession No. MIMAT0027412) set forth in SEQ ID NO: 5, and includes homologs or orthologs of non-human species.
  • “primer” is meant a nucleotide that forms a complementary pair with either or both of DNA and RNA.
  • mutant is meant a naturally occurring variant due to polymorphism, mutation, etc .; a variant comprising deletion, substitution, addition or insertion of one or more bases.
  • derivatives are labeled derivatives with phosphors, radioactive isotopes, etc .; modified nucleotides having organic functional groups; base reconstruction, double bond saturation, deaminoization, substitution of oxygen molecules with sulfur molecules, etc. It means a nucleotide or the like that has received. However, the derivatives are not limited to these examples.
  • Subject means primates such as humans and chimpanzees; mammals such as rodents such as mice and rats; pets such as dogs and cats; domestic animals such as cows, horses, sheep and goats.
  • Subject means a human as a subject.
  • Healthy body and “healthy person” mean an organism that is a subject and does not suffer from colorectal cancer.
  • Accuracy means the value of ((number of true positives) + (number of true negatives)) / (total number of samples).
  • Spensitivity means a value of (number of true positives) / ((number of true positives) + (number of false negatives)).
  • “Specificity” means (number of true negatives) / ((number of true negatives) + (number of false positives)). The higher the specificity, the easier it is to prevent a healthy body from being erroneously identified as a colorectal cancer patient, prevent unnecessary additional tests from being performed, and contribute to reducing the burden on the patient and reducing medical costs.
  • the actions specified by the terms “examination,””evaluation,” and “examination” refer to medical practice by a doctor (eg, human illness) in Japan and in countries where medical practice is exempt from patents. Does not include the act of diagnosing, the act of treating human illness, etc.). “ ⁇ ” Indicates a numerical range means that the numerical values described before and after the numerical range are included as the lower limit value and the upper limit value.
  • the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention is at least one microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p. That is, the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention is one microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-129-1--3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p, or two or more micros. It is a combination of RNA.
  • the microRNA is a mutant and derivative of hsa-miR-129-1--3p, a mutant and derivative of hsa-miR-566, and hsa-miR-598-5p as long as the effects of the present invention are not impaired. It may further comprise at least one selected from the group consisting of variants and derivatives.
  • the combination of microRNAs the combination of hsa-miR-129-1-3p and hsa-miR-566 is preferable because the accuracy, sensitivity and specificity for determining the presence or absence of colorectal cancer are further improved. ..
  • the combination of microRNAs is a combination of hsa-miR-129-1-3p and hsa-miR-566, it is determined whether or not colorectal cancer is present even when the colorectal cancer is stage 0 or stage I. A remarkable effect of excellent sensitivity and specificity can be obtained.
  • Hsa-miR-129-1-3p is, for example, RNA. 9: 175-179 (2003). It can be identified by the method described in.
  • hsa-miR-129-1-3p As a precursor of hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-129-1 stem-loop (miRBase Accession No. MI00000252, SEQ ID NO: 6) is known.
  • the hsa-miR-129-1 stem-loop has a stem-loop structure.
  • the hsa-miR-566 is, for example, Proc Natl Acad Sci USA. 103: 3687-3692 (2006). It can be identified by the method described in.
  • hsa-miR-566 stem-loop (miRBase Accession No. MI0003572, SEQ ID NO: 7) is known.
  • the hsa-miR-566 stem-loop has a stem-loop structure.
  • Hsa-miR-598-5p is, for example, Proc Natl Acad Sci USA. 103: 3687-3692 (2006). It can be identified by the method described in.
  • hsa-miR-598 stem-loop (miRBase Accession No. MI0003610, SEQ ID NO: 8) is known.
  • the hsa-miR-598-5p stem-loop has a stem-loop structure.
  • the marker for diagnosing colorectal cancer of the present invention is preferably contained in human body fluid.
  • a marker for diagnosing colorectal cancer is contained in human body fluid, the test is non-invasive and convenient.
  • colorectal cancer can be tested at a place other than a medical institution such as home.
  • body fluids include body fluids such as blood, milk, urine, saliva, lymph, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, tears, sweat, nasal leaks, and stool juice.
  • body fluids are not limited to these examples.
  • urine is preferable as the body fluid because it is easy to collect.
  • the body fluid may be a treatment solution obtained by performing pretreatment such as removing unnecessary components from each of the above-mentioned body fluids; a culture solution obtained by culturing cells contained in each of the above-mentioned body fluids.
  • the marker for diagnosing colorectal cancer of the present invention described above is significantly highly expressed in colorectal cancer patients as compared with healthy subjects, as shown in Examples described later. Therefore, by measuring the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis in the sample collected from the subject and evaluating the magnitude by comparing the measured value with the reference value, is the subject suffering from colorectal cancer? Whether or not it can be determined.
  • the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention tends to be significantly highly expressed even in the early stage 0 or stage I colorectal cancer patient group, as shown in Examples described later. Therefore, according to the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention, even when the degree of progression of colorectal cancer is stage 0 or stage I, the presence or absence of colorectal cancer can be discriminated with excellent sensitivity and specificity.
  • the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention described above may be, for example, a method for assisting the diagnosis of colorectal cancer described later, a method for evaluating the possibility of suffering from colorectal cancer, a method for diagnosing colorectal cancer, and a colorectal cancer. How to test for cancer, how to test the likelihood of developing colorectal cancer, how to collect data for diagnosing colorectal cancer, in vitro methods to assist in diagnosing colorectal cancer, kits for diagnosing colorectal cancer Applicable.
  • the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention can also be applied to a method for diagnosing colorectal cancer, a method for determining colorectal cancer, a method for testing colorectal cancer, and a method for treating colorectal cancer.
  • the details of the use of the marker for diagnosing colorectal cancer of the present invention will be described in detail in the item ⁇ Method of assisting the diagnosis of colorectal cancer> described later.
  • the method for assisting the diagnosis of colorectal cancer of the present invention provides a judgment material for assisting the diagnosis of whether or not the subject has colorectal cancer. Colorectal cancer may be diagnosed based on the judgment material.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention is measured in the sample collected from the subject. Next, the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis is compared with the reference value.
  • the method of collecting a sample from the subject is not particularly limited.
  • the method is not particularly limited as long as it is a method capable of collecting various body fluids described in the above item ⁇ Marker for diagnosing colorectal cancer>.
  • the method used in a general urinalysis may be used.
  • the method used in general tests may be used.
  • a specific microRNA which is a marker for diagnosing colorectal cancer of the present invention, is significantly highly expressed in colorectal cancer patients as compared with healthy subjects. I found it. Therefore, by evaluating whether or not the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention is higher than a certain reference value, it is possible to detect colorectal cancer and determine whether or not the subject has colorectal cancer. ..
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis can be measured by, for example, quantitative RT (Reverse Translation) -PCR.
  • Quantitative RT-PCR of markers for diagnosing colorectal cancer can be performed, for example, according to the following method (1).
  • -Method (1) Perform a reverse transcription reaction of a marker for diagnosing colorectal cancer, and then perform quantitative PCR using the template DNA (1) obtained by the reverse transcription reaction.
  • the microRNA is at least one selected from the group consisting of hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p.
  • These microRNAs are mature microRNAs (Mature miRNAs) that have undergone processing. Therefore, it is preferable to use the following primer A1 in the reverse transcription of the marker for colorectal cancer diagnosis.
  • Primer A1 A Looped RT Primer specific for a marker for diagnosing colorectal cancer.
  • Primer A1 specifically binds to at least one selected from the group consisting of hsa-miR-129-1--3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p to form a stem-loop structure. If so, it is not particularly limited.
  • Primer A1 has a loop structure.
  • the binding of primer A1 to a marker for diagnosing colorectal cancer forms a stem-loop structure.
  • This stem-loop structure is recognized by reverse transcriptase, and the reverse transcription reaction of the marker for diagnosing colorectal cancer proceeds.
  • template DNA (1) which is a marker for diagnosing colorectal cancer, is synthesized.
  • the reverse transcriptase used for the reverse transcription reaction is not particularly limited. Reverse transcriptase, commonly used in the laboratory, can be used. A recombinant protein may be used as the reverse transcriptase.
  • the DNA polymerase used for quantitative PCR is not particularly limited. DNA polymerases commonly used in the laboratory can be used. Recombinant protein may be used as the DNA polymerase.
  • Primer A1, primer A2, and primer A3 can be prepared by general nucleic acid synthesis and nucleotide synthesis. For example, it can be obtained from a company that undertakes contract synthesis of nucleic acids. Further, as a commercially available kit for detecting a marker for colorectal cancer diagnosis, TaqMan Advanced MicroRNA Assay (Thermo Fisher Scientific, USA) can also be used. Therefore, a person skilled in the art can obtain Primer A1, Primer A2, and Primer A3 by a conventional method without undue burden, and can confirm the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis.
  • the catalog number of the TaqMan Advanced MicroRNA Assay containing the following primers A11, A21, and Primer A31 is A25576, and its Assay ID is 480873_mir.
  • Primer A11 A Looped RT Primer that specifically binds to hsa-miR-129-1-3p.
  • Primer A21 a forward primer that specifically binds to the template DNA (1) of hsa-miR-129-1-3p.
  • Primer A31 A reverse primer that specifically binds to the template DNA (1) of hsa-miR-129-1-3p.
  • the catalog number of the TaqMan Advanced MicroRNA Assay containing the following primers A12, A22, and Primer A32 is A25576, and its Assay ID is 479373_mir.
  • Primer A12 A Looped RT Primer that specifically binds to hsa-miR-566.
  • Primer A22 A forward primer that specifically binds to the template DNA (1) of hsa-miR-566.
  • Primer A32 A reverse primer that specifically binds to the template DNA (1) of hsa-miR-566.
  • the catalog number of the TaqMan Advanced MicroRNA Assay containing the following primers A13, A23, and A33 is A25576, and the Assay ID is 479080_mir.
  • Primer A13 A Looped RT Primer that specifically binds to hsa-miR-598-5p.
  • Primer A23 a forward primer that specifically binds to the template DNA (1) of hsa-miR-598-5p.
  • Primer A33 A reverse primer that specifically binds to the template DNA (1) of hsa-miR-598-5p.
  • the expression level of microRNA can be calculated based on the cutoff value of the number of cycles in quantitative PCR.
  • quantitative PCR when the amount of nucleic acid to be measured is relatively large in the sample, the number of cycles until the amount of nucleic acid amplification reaches a certain value is relatively short. On the other hand, if the amount of nucleic acid to be measured is relatively small in the sample, the number of cycles until the amount of nucleic acid amplification reaches a certain value becomes long, and the cutoff value becomes large.
  • the amount of nucleic acid to be measured is calculated by a calibration curve, with the number of cycles until the amplified amount of this nucleic acid reaches a certain threshold value as a cutoff value.
  • the thresholds for the amount of nucleic acid amplification involved in determining the cutoff value are the age and sex of the subject, the total amount of RNA in the sample to be collected, the type of marker for colorectal cancer diagnosis to be used, the collection method, the type of sample, etc. It can be set appropriately according to the conditions of.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis is standardized using miRNA in the sample as a standardizing factor. Is preferable.
  • hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p are preferable, and a combination of hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p is more preferable.
  • the inventor of the present invention has found that hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p are constitutively expressed in the urine of species such as humans, and their expression levels are stable.
  • hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p are stable, the standardization of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention contained in the body fluid collected from the subject is standardized. Useful as a factor.
  • hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p are also useful as standardizing factors for any miRNA contained in body fluids collected from the subject.
  • Hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p as standardizing factors are the variants and derivatives of hsa-miR-4669, hsa-miR-6756-5p, as long as the effects of the present invention are not impaired. It may further comprise at least one selected from the group consisting of variants and derivatives.
  • hsa-miR-4669 is described in, for example, Cancer Res. 71: 78-86 (2011). It can be identified by the method described in.
  • hsa-miR-4669 stem-loop (miRBase Accession No. MI0017300, SEQ ID NO: 9) is known.
  • the hsa-miR-4669 stem-loop has a stem-loop structure.
  • hsa-miR-6756-5p is described in, for example, Genome Res. 22: 1634-1645 (2012). It can be identified by the method described in.
  • hsa-miR-6756 stem-loop (miRBase Accession No. MI0022601, SEQ ID NO: 10) is known.
  • the hsa-miR-6756 stem-loop has a stem-loop structure.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis is calculated based on the following ⁇ Ct. You may.
  • ⁇ Ct the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis can be quantified as 2- ⁇ Ct.
  • ⁇ Ct A value obtained by subtracting the cutoff value of the standardizing factor from the cutoff value of the marker for colorectal cancer diagnosis.
  • the ⁇ Ct value can be used for evaluating the expression level of the marker for diagnosing colorectal cancer in each sample. Specifically, 2 - ⁇ The Ct was used as a measure of expression level of each colon cancer diagnostic markers, 2 - ⁇ Ct is compared with a reference value, whether suffering subject to colon cancer Can be easily determined.
  • the ⁇ ⁇ Ct value is relatively large, and the 2- ⁇ Ct value is relatively large.
  • the ⁇ Ct value is relatively small, and the 2- ⁇ Ct value is relatively small. In this case, if ⁇ Ct, which is an index in a healthy body, is known, 2- ⁇ Ct in a healthy body can be used as a reference value.
  • the cutoff value of the standardizing factor in the ⁇ Ct value can be the average value of the cutoff values of hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p in the sample collected from the subject.
  • the expression level of miRNA used as a standardizing factor can be measured, for example, by quantitative PCR. Specifically, for example, the expression levels of hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p can be calculated based on the cutoff value of the number of cycles in the quantitative PCR of the standardizing factor.
  • Quantitative PCR of the standardizing factor can be performed, for example, according to the following method (2).
  • -Method (2) Perform a reverse transcription reaction of the standardizing factor, and then perform quantitative PCR using the template DNA (2) obtained by the reverse transcription reaction.
  • method (2) first, reverse transcription of miRNA, that is, a standardizing factor, in a sample collected from a subject is performed.
  • the miRNA is at least one selected from the group consisting of hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p. These miRNAs are mature miRNAs (Mature miRNAs) that have undergone processing. Therefore, it is preferable to use the following primer B1 in the reverse transcription of the standardization factor.
  • Primer B1 A Looped RT Primer specific for the standardizing factor.
  • Primer B1 is not particularly limited as long as it specifically binds to at least one selected from the group consisting of hsa-miR-4669 and hsa-miR-6756-5p to form a stem-loop structure.
  • Primer B1 has a loop structure.
  • the binding of primer B1 to the standardizing factor forms a stem-loop structure.
  • This stem-loop structure is recognized by reverse transcriptase, and the reverse transcription reaction of the standardizing factor proceeds.
  • the reverse transcription reaction synthesizes the standardized factor template DNA (2).
  • the reverse transcriptase used for the reverse transcription reaction is not particularly limited. Reverse transcriptase, commonly used in the laboratory, can be used. A recombinant protein may be used as the reverse transcriptase.
  • PCR quantitative PCR is performed using the standardized factor template DNA (2) obtained by the reverse transcription reaction of the standardized factor.
  • -Primer B2 A forward primer that specifically binds to the template DNA (2).
  • -Primer B3 A reverse primer that specifically binds to the template DNA (2).
  • the DNA polymerase used for quantitative PCR is not particularly limited. DNA polymerases commonly used in the laboratory can be used. Recombinant protein may be used as the DNA polymerase.
  • Primer B1, primer B2, and primer B3 can be prepared by general nucleic acid synthesis and nucleotide synthesis. For example, it can be obtained from a company that undertakes contract synthesis of nucleic acids. In addition, TaqMan Advanced MicroRNA Assay can also be used as a commercially available kit for detecting a standardizing factor. Therefore, a person skilled in the art can obtain Primer B1, Primer B2, and Primer B3 by a conventional method without undue burden, and can confirm the expression level of the standardizing factor.
  • the catalog number of the TaqMan Advanced MicroRNA Assay containing the following primers B11, B21, and Primer B31 is A25576, and its Assay ID is 478925_mir.
  • Primer B11 A Looped RT Primer that specifically binds to hsa-miR-4669.
  • Primer B21 a forward primer that specifically binds to the template DNA (2) of hsa-miR-4669.
  • Primer B31 A reverse primer that specifically binds to the template DNA (2) of hsa-miR-4669.
  • the catalog number of the TaqMan Advanced MicroRNA Assay containing the following primers B12, B22, and B32 is A25576, and its Assay ID is 480284_mir.
  • Primer B12 A Looped RT Primer that specifically binds to hsa-miR-6756-5p.
  • Primer B22 a forward primer that specifically binds to the template DNA (2) of hsa-miR-6756-5p.
  • Primer B32 reverse primer that specifically binds to the template DNA (2) of hsa-miR-6756-5p.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis is compared with the reference value.
  • the reference value if it is equal to or higher than this value, a reference value suspected of being affected by colorectal cancer can be considered.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis in a healthy body may be referred to.
  • the reference value is the expression level of a marker for diagnosing colorectal cancer in a healthy body.
  • the reference value used for discrimination can be appropriately set according to conditions such as the age and sex of the subject, the type of marker for colorectal cancer diagnosis to be used, the collection method, and the type of sample.
  • the expression level of colorectal cancer diagnostic markers in healthy subjects was standardized using miRNA in samples collected from healthy subjects as a standardizing factor, and the expression level of colorectal cancer diagnostic markers in healthy subjects was standardized. Is preferably used as the reference value.
  • the standardized value of the expression level of the colorectal cancer diagnostic marker in a healthy body as the reference value, it becomes easier to more accurately determine the relative magnitude of the expression level of the colorectal cancer diagnostic marker in the colorectal cancer test.
  • the presence or absence of colorectal cancer can be determined with even higher accuracy.
  • the marker for diagnosing colorectal cancer in a healthy body can be measured in the same manner as in the above method (1).
  • the expression level of the standardizing factor in a healthy body can be measured in the same manner as in the above method (2). Then, the reference value can be set as 2- ⁇ Ct'based on the following ⁇ Ct'. - ⁇ Ct': A value obtained by subtracting the cutoff value of the standardizing factor in the healthy body from the cutoff value of the marker for diagnosing colorectal cancer in the healthy body.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention is compared with the reference value. Then, as shown in Examples described later, according to the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention, a healthy body can be separated from a colorectal cancer patient at an early stage 0 or stage I with high accuracy. Therefore, according to the method of assisting the diagnosis of colorectal cancer of the present invention, even when the degree of progression of colorectal cancer is stage 0 or stage I, the test accuracy, test sensitivity, and test sensitivity for determining the presence or absence of colorectal cancer. Excellent specificity.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention is measured in a sample collected from a subject, and the expression level is used as a reference value. Compare.
  • the method for evaluating the possibility of suffering from colorectal cancer of the present invention can potentially provide a judgment material for diagnosing whether or not a subject has colorectal cancer. Colorectal cancer may be diagnosed based on the judgment material.
  • the details and preferred embodiment of the measurement of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis can be the same as the contents described in the above-mentioned item ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>.
  • the specific contents of the reference value, the details of the comparison with the reference value of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis, and the preferred embodiment are the same as the contents described in the above-mentioned ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>. can do.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention is compared with the reference value. Then, as shown in Examples described later, according to the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention, a healthy body can be separated from a colorectal cancer patient at an early stage 0 or stage I with high accuracy. Therefore, according to the method for evaluating the possibility of suffering from colorectal cancer of the present invention, the possibility of suffering from colorectal cancer is highly accurate even when the degree of progression of colorectal cancer is stage 0 or stage I. Can be evaluated with.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention in a sample collected from a subject is measured, and the expression level is compared with a reference value.
  • the method for diagnosing colorectal cancer of the present invention can provide a judgment material for diagnosing whether or not a subject has colorectal cancer. Colorectal cancer may be diagnosed based on the judgment material.
  • the details and preferred embodiment of the measurement of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis can be the same as the contents described in the above-mentioned item ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>.
  • the expression level of the marker for diagnosing colorectal cancer of the present invention is compared with a reference value. Then, as shown in Examples described later, according to the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention, a healthy body can be separated from a colorectal cancer patient at an early stage 0 or stage I with high accuracy. Therefore, according to the method for diagnosing colorectal cancer of the present invention, it is possible to provide a powerful judgment material for diagnosing colorectal cancer with high accuracy even when the degree of progression of colorectal cancer is stage 0 or stage I. ..
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention in a sample collected from a subject is measured, and the expression level is compared with a reference value.
  • the method for testing colorectal cancer of the present invention can provide a judgment material that assists in diagnosing whether or not a subject has colorectal cancer. Colorectal cancer may be diagnosed based on the judgment material.
  • the details and preferred embodiment of the measurement of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis can be the same as the contents described in the above-mentioned item ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>.
  • the expression level of the marker for diagnosing colorectal cancer of the present invention is compared with a reference value. Then, as shown in Examples described later, according to the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention, a healthy body can be separated from a colorectal cancer patient at an early stage 0 or stage I with high accuracy. Therefore, according to the colorectal cancer testing method of the present invention, even when the degree of progression of colorectal cancer is stage 0 or stage I, it is possible to provide a powerful judgment material for diagnosing colorectal cancer with high accuracy.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention is measured in a sample collected from a subject, and the expression level is compared with a reference value. ..
  • the method of testing the likelihood of colorectal cancer of the present invention can potentially provide a judgment material for diagnosing whether or not a subject has colorectal cancer. Colorectal cancer may be diagnosed based on the judgment material.
  • the details and preferred embodiment of the measurement of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis can be the same as the contents described in the above-mentioned item ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>.
  • the specific contents of the reference value, the details of the comparison with the reference value of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis, and the preferred embodiment are the same as the contents described in the above-mentioned ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>. can do.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention is compared with the reference value. Then, as shown in Examples described later, according to the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention, a healthy body can be separated from a colorectal cancer patient at an early stage 0 or stage I with high accuracy. Therefore, according to the method of testing the possibility of developing colorectal cancer of the present invention, it is highly possible that the subject has colorectal cancer even when the degree of progression of colorectal cancer is stage 0 or stage I. Can be tested with accuracy.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention is measured in the sample collected from the subject.
  • the details and preferred embodiment of the measurement of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis can be the same as the contents described in the above-mentioned item ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>.
  • the method of collecting data for diagnosing colorectal cancer of the present invention information for diagnosing colorectal cancer with high accuracy can be obtained.
  • the information obtained by the method of collecting data for the diagnosis of colorectal cancer of the present invention can be used for comparison with the reference value.
  • the information is useful for providing a judgment material for diagnosing colorectal cancer.
  • the specific contents of the reference value, the details of the comparison with the reference value of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis, and the preferred embodiment are the same as the contents described in the above-mentioned ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>. can do.
  • the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention As shown in Examples described later, according to the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention, a healthy body can be separated from a colorectal cancer patient in the early stage 0 or stage I with high accuracy. Therefore, according to the method of collecting data for the diagnosis of colorectal cancer of the present invention, the colorectal cancer is measured even when the degree of progression of the colorectal cancer is stage 0 or stage I in order to measure the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis. It is possible to obtain powerful information for diagnosing cancer with high accuracy.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention is measured in the sample collected from the subject.
  • the details and preferred embodiment of the measurement of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis can be the same as the contents described in the above-mentioned item ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>.
  • the in vitro method for assisting the diagnosis of colorectal cancer of the present invention information for diagnosing colorectal cancer with high accuracy can be obtained.
  • the information obtained by the in vitro method for assisting the diagnosis of colorectal cancer of the present invention can be used for comparison with the reference value.
  • the information is useful for providing a judgment material for diagnosing colorectal cancer.
  • the specific contents of the reference value, the details of the comparison with the reference value of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis, and the preferred embodiment are the same as the contents described in the above-mentioned ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>. can do.
  • the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention As shown in Examples described later, according to the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention, a healthy body can be separated from a colorectal cancer patient in the early stage 0 or stage I with high accuracy. Therefore, according to the in vitro method for assisting the diagnosis of colorectal cancer of the present invention, the colorectal cancer is measured even when the degree of progression of colorectal cancer is stage 0 or stage I in order to measure the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis. It is possible to obtain powerful information for diagnosing cancer with high accuracy.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention in a sample collected from a subject is measured, and the expression level is compared with a reference value.
  • the method for diagnosing colorectal cancer of the present invention is a method for diagnosing whether or not a subject has colorectal cancer.
  • the details and preferred embodiment of the measurement of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis can be the same as the contents described in the above-mentioned item ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>.
  • the expression level of the marker for diagnosing colorectal cancer of the present invention is compared with a reference value. Then, as shown in Examples described later, according to the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention, a healthy body can be separated from a colorectal cancer patient at an early stage 0 or stage I with high accuracy. Therefore, according to the method for diagnosing colorectal cancer of the present invention, colorectal cancer can be diagnosed with high accuracy even when the degree of progression of colorectal cancer is stage 0 or stage I.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention in a sample collected from a subject is measured, and the expression level is compared with a reference value.
  • the method for determining colorectal cancer of the present invention is a method for determining whether or not a subject has colorectal cancer.
  • the details and preferred embodiment of the measurement of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis can be the same as the contents described in the above-mentioned item ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>.
  • the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention is compared with a reference value. Then, as shown in Examples described later, according to the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention, a healthy body can be separated from a colorectal cancer patient at an early stage 0 or stage I with high accuracy. Therefore, according to the method for determining colorectal cancer of the present invention, colorectal cancer can be determined with high accuracy even when the degree of progression of colorectal cancer is stage 0 or stage I.
  • the expression level of the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention in a sample collected from a subject is measured, and the expression level is compared with a reference value.
  • the colorectal cancer test method of the present invention is a method for testing the presence or absence of colorectal cancer in a subject.
  • the details and preferred embodiment of the measurement of the expression level of the marker for colorectal cancer diagnosis can be the same as the contents described in the above-mentioned item ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>.
  • the expression level of the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention is compared with the reference value. Then, as shown in Examples described later, according to the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention, a healthy body can be separated from a colorectal cancer patient at an early stage 0 or stage I with high accuracy. Therefore, according to the colorectal cancer test method of the present invention, it is possible to test with high accuracy whether or not a person has colorectal cancer even when the degree of progression of the colorectal cancer is stage 0 or stage I.
  • the colorectal cancer diagnostic kit of the present invention is a kit used for examining the presence or absence of colorectal cancer.
  • the colorectal cancer diagnostic kit of the present invention includes the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention and specific primers.
  • Examples of the primer in the colorectal cancer diagnostic kit of the present invention include the primers A1, the primer A2, and the primer A3 described in the above-mentioned ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>.
  • the primer in the colorectal cancer diagnostic kit can specifically form a complementary pair with the colorectal cancer diagnostic marker of the present invention.
  • the details and preferred embodiments of Primer A1, Primer A2, and Primer A3 can be the same as those described in the above item ⁇ Method for assisting diagnosis of colorectal cancer>.
  • the colorectal cancer diagnostic kit of the present invention serves as an extraction reagent for extracting microRNA, which is a marker for colorectal cancer diagnosis, from a sample, a cDNA synthesis reagent for synthesizing cDNA of microRNA, a sample collection container, and a standardizing factor. It may further comprise at least one selected from the group consisting of miRNA and specific primers, reverse transcriptase and instruction manual.
  • the extraction reagent examples include general RNA extraction reagents. Specific examples of commercially available RNA extraction reagents include miRNeasy Serum / Plasma Kit (Qiagen, USA). However, the extraction reagent is not limited to these examples.
  • the cDNA synthesis reagent is a reagent for synthesizing the cDNA of microRNA, which is a marker for diagnosing colorectal cancer.
  • Examples of commercially available reagents for cDNA synthesis include TaqMan Advanced MicroRNA cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, USA).
  • the reagent for cDNA synthesis is not limited to this example.
  • the cDNA synthesis reagent may be used for the synthesis of the cDNA of miRNA used as a standardizing factor.
  • the sample collection container is not particularly limited as long as it can contain the body fluid of the subject.
  • the sample collection container may be a general urinalysis container.
  • the standardizing primer include the primers B1, the primer B2, and the primer B3 described in the above-mentioned ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>.
  • the standardizing primer can form a complementary pair specifically with the miRNA which is a standardizing factor.
  • the details and preferred embodiments of Primer B1 and Primer B2 can be the same as those described in the above item ⁇ Method for assisting diagnosis of colorectal cancer>.
  • Reverse transcriptase and DNA polymerase are reagents for quantifying microRNA, which is a marker for diagnosing colorectal cancer, by RT-PCR.
  • the method (1) described in the above-mentioned ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer> can be used.
  • the reverse transcriptase is not particularly limited as long as it can reverse-transcribe the marker for colorectal cancer diagnosis of the present invention and can quantify the marker for colorectal cancer diagnosis.
  • Reverse transcriptase may be used for reverse transcription and quantification of miRNAs used as standardizing factors.
  • the reverse transcriptase is not particularly limited as long as it can be used for ordinary quantitative PCR.
  • the instruction manual for the colorectal cancer diagnostic kit of the present invention is a document that describes how to use the colorectal cancer diagnostic kit of the present invention.
  • the instruction manual may further include information such as precautions for use, troubleshooting, and contact information.
  • the information contained in the instruction manual is not limited to these examples. As described above, the instruction manual needs to have at least enough information to obtain the effect of the present invention, and the items to be described are not particularly limited.
  • the method of using the colorectal cancer diagnostic kit of the present invention can be the same as the content described in the above-mentioned ⁇ Method for assisting the diagnosis of colorectal cancer>.
  • using the primers in the colorectal cancer diagnostic kit of the present invention quantitative PCR is performed, microRNA, which is a marker for colorectal cancer diagnosis, is quantified, and the measured value is compared with a reference value.
  • microRNA which is a marker for colorectal cancer diagnosis
  • the measured value is compared with a reference value.
  • the method of using the colorectal cancer diagnostic kit of the present invention is not limited to this example.
  • ⁇ Treatment method for colorectal cancer> In the method for treating colorectal cancer of the present invention, the above-mentioned method for assisting the diagnosis of colorectal cancer of the present invention, a method for evaluating the possibility of suffering from colorectal cancer, a method for diagnosing colorectal cancer, and colorectal cancer How to test for colorectal cancer, how to test the likelihood of developing colorectal cancer, how to collect data for diagnosing colorectal cancer, in vitro methods to assist in diagnosing colorectal cancer, colorectal cancer diagnostic kits, colorectal cancer A subject is diagnosed using at least one selected from the group consisting of a method for diagnosing cancer, a method for determining colorectal cancer, and a method for testing colorectal cancer.
  • a therapeutic agent for colorectal cancer is administered to the subject.
  • a subject when a subject is diagnosed as having colorectal cancer, surgery is performed on the subject.
  • the diagnosis of the subject may be a determination of the presence or absence of colorectal cancer of the subject, or a test of the presence or absence of colorectal cancer of the subject.
  • the therapeutic agent for colorectal cancer is not particularly limited.
  • a therapeutic drug for colorectal cancer a drug whose efficacy and drug efficacy have been clinically confirmed is preferable.
  • the therapeutic agent for colorectal cancer may be the therapeutic agent for colorectal cancer of the present invention described later, an anticancer agent, or a molecular targeted therapeutic agent.
  • therapeutic agents for colorectal cancer are not limited to these examples.
  • anticancer agent examples include fluorouracil, tegafur / uracil combination drug, tegafur / gimeracil / oteracil potassium combination drug, capecitabine, irinotecan, oxaliplatin, trifluridine / tipiracil hydrochloride and the like.
  • anticancer agents are not limited to these examples. Even an anticancer drug that is not commercially available on the filing date of the present application and may be commercially available in the future may be used in the method for treating colorectal cancer of the present invention. is there.
  • Molecular-targeted therapeutic agents include cetuximab, panitumumab, bevacizumab, ramucirumab, aflibercept, regorafenib and the like.
  • molecular-targeted therapeutic agents are not limited to these examples. Even molecular-targeted therapeutic agents that are not commercially available on the filing date of the present application and may be commercially available in the future may be used in the method for treating colorectal cancer of the present invention. is there.
  • the therapeutic agent for colorectal cancer may be a drug substance in the research stage, a drug substance in the development stage, or a drug substance in the clinical trial stage.
  • the method of administering the drug is not particularly limited. Usually, oral administration, intravenous drip, etc. are selected. However, the method of administering the drug is not limited to these examples.
  • the surgery performed on the subject is not particularly limited. Usually, endoscopic surgery, surgical resection, radiation therapy, etc. are selected. However, the surgery performed on the subject is not limited to these examples. Surgery and treatment methods that are not common on the filing date of the present application and that may be performed in the future can be used in the treatment method for colorectal cancer of the present invention. There is sex.
  • the above-mentioned method for assisting the diagnosis of colorectal cancer of the present invention a method for evaluating the possibility of suffering from colorectal cancer, a method for diagnosing colorectal cancer, and colorectal cancer How to test for colorectal cancer, how to test the likelihood of developing colorectal cancer, how to collect data for diagnosing colorectal cancer, in vitro methods to assist in diagnosing colorectal cancer, colorectal cancer diagnostic kits, colorectal cancer Use at least one selected from the group consisting of a method for diagnosing cancer, a method for determining colorectal cancer, and a method for testing colorectal cancer. Therefore, according to the method for treating colorectal cancer of the present invention, the subject can be treated based on a highly accurate diagnosis result. Therefore, it is possible to prevent unnecessary treatment, reduce the burden on the patient, and reduce medical expenses.
  • the colorectal cancer therapeutic agent of the present invention comprises an inhibitor of at least one microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p.
  • Examples of the inhibitor of hsa-miR-129-1--3p, hsa-miR-566, and hsa-miR-598-5p include miRNA inhibitor.
  • a miRNA inhibitor is an antisense nucleotide of microRNA. The miRNA inhibitor binds to the microRNA that serves as the sense strand and inhibits the function of the microRNA.
  • a commercially available kit can be used as the miRNA inhibitor. Examples of such a commercially available kit include mirVana miRNA inhibitor (Thermo Fisher Scientific, USA).
  • the catalog number of the mirVana miRNA inhibitor containing the hsa-miR-129-1-3p miRNA inhibitor is 4464084, and its Assay ID is MH12962.
  • the catalog number of the mirVana miRNA inhibitor containing the hsa-miR-566 miRNA inhibitor is 4464084, and its Assay ID is MH11490.
  • RNAi reagents can be mentioned as inhibitors of hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-566, and hsa-miR-598-5p.
  • the inhibitor is not limited to these examples. Even if it is an inhibitor that is not common on the filing date of the present application, any molecule that can inhibit the expression of hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-566, and hsa-miR-598-5p can be used. It may be used as a therapeutic agent for colorectal cancer of the present invention.
  • the therapeutic agent for colorectal cancer of the present invention described above comprises an inhibitor of at least one microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p. Including. Inhibiting the expression level of at least one microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-129-1--3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p, as shown in Examples below. The cell motility of colorectal cancer cells is reduced.
  • the inhibitors of each microRNA of hsa-miR-129-1--3p, hsa-miR-566, and hsa-miR-598-5p may be useful as therapeutic drug candidates for colorectal cancer. ing. From the above, according to the therapeutic agent for colorectal cancer of the present invention, there is a possibility that a curative effect of colorectal cancer can be obtained.
  • the therapeutic agent for colorectal cancer of the present invention comprising an inhibitor of at least one microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p.
  • a method for treating colorectal cancer in an embodiment that inhibits at least one microRNA selected from the group consisting of hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p of a subject. can be said to be a method for suppressing the motility of colon cancer cells.
  • qRT-PCR Quantitative RT-PCR median: median IQR: interquartile range Health: Healthy person CRC: Colorectal cancer patient stage 0 / I CRC: Stage 0 or stage I early colorectal cancer patient n: Number of samples P value: p-value AUC: Area Under the ROC Curve 95% CI: 95% confidence interval
  • E means a power of 10.
  • 1.90E-04 means 1.90 x 10 -4 .
  • a total cohort consisting of 299 healthy subjects and 223 colorectal cancer patients From 522 patients, 415 patients whose age and gender were randomly matched were extracted, and the 415 cohorts were divided into the following three cohorts 1 and 2 cohorts. , Cohort 3 at random.
  • Cohort 1 9 cases consisting of 6 healthy subjects and 3 colorectal cancer patients.
  • Cohort 2 280 cases consisting of 140 healthy subjects and 140 colorectal cancer patients.
  • Cohort 3 126 cases consisting of 63 healthy subjects and 63 colorectal cancer patients.
  • the total number of healthy subjects in cohort 2 and cohort 3 is 203 cases.
  • the total number of cases with stage 0 or stage I progression was 64 cases. Therefore, the following cohort 4 was further constructed, and the detection sensitivity, accuracy, and specificity of early-stage colorectal cancer were confirmed by analysis of the cohort 4.
  • Cohort 4 267 patients consisting of 203 healthy subjects and 64 stage 0 or stage I colorectal cancer patients.
  • RNA in samples taken from urine was extracted. Immediately after collection, urine stored frozen at -80 ° C: 200 ⁇ L was used as a sample, and miRNA in the sample was extracted using miRNeasy Serum / Plasma Kit (Qiagen, USA) according to the conditions described in the attached protocol. did.
  • CDNA was synthesized using the extracted miRNA as a template.
  • TaqMan Advanced MicroRNA cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) was used to synthesize cDNA according to the conditions described in the attached protocol.
  • QRT-PCR was performed using the synthesized cDNA.
  • qRT-PCR TaqMan Advanced MicroRNA Assay and; 7500 Fast real-time PCR system (Thermo Fisher Scientific, USA) were used.
  • Table 1 shows the thermal cycle and reaction conditions of qRT-PCR
  • Table 2 shows a list of Assay IDs and target miRNAs and their nucleotide sequences.
  • FIG. 1 is a flow chart showing an outline of verification of this embodiment.
  • miRNA array analysis was performed to select or identify multiple miRNAs abnormally expressed in the urine of colorectal cancer patients (see FIG. 2).
  • Cohort 1 is a comprehensive analysis cohort (Discovery cohort in FIG. 1).
  • cohort 2 among the miRNAs identified by the miRNA array analysis in cohort 1, the expression levels of each of the three miRNAs used as markers for diagnosing colorectal cancer of the present invention were measured by the qRT-PCR method.
  • Significant colorectal cancer diagnostic markers were extracted by multivariate analysis of measurement results, and a genetic diagnostic panel was constructed.
  • Cohort 2 is a training cohort (Training set in FIG. 2).
  • cohort 3 the accuracy of the genetic diagnosis panel constructed in cohort 2 was verified.
  • Cohort 3 is a validation cohort (Validation set in FIG. 3).
  • Cohort 4 the detection accuracy of early colorectal cancer was mainly analyzed.
  • the specific contents and analysis results of the analysis of cohort 1, cohort 2, cohort 3, and cohort 4 performed in this embodiment will be described in order.
  • hsa-miR-129-1-3p in any of hsa-miR-566, hsa- miR-598-5p, 2 - ⁇ Ct value, i.e., the expression of each of these genes
  • CRC colorectal cancer patients
  • Healthy healthy subjects
  • FIG. 3 is a diagram showing ROC curves of each colorectal cancer diagnostic marker in cohort 2.
  • "1-specificity” is plotted on the horizontal axis and "sensitivity” is plotted on the vertical axis.
  • the P value was also less than 0.001 in the three types of microRNAs hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-566, and hsa-miR-598-5p. From this, it can be seen that each microRNA measured for the three types of hsa-miR-566 and hsa-miR-598-5p is significantly highly expressed in the urine of colorectal cancer patients as compared with healthy subjects. It could be confirmed. In addition, from the results of multivariate analysis, miR-129-1-3p and miR-566 were extracted as independent colorectal cancer markers.
  • Table 5 shows the AUC and 95% CI of each ROC curve shown in FIG.
  • healthy subjects and large intestines were prepared by genetic diagnosis panels prepared by using hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-566, and hsa-miR-598-5p as markers for colorectal cancer diagnosis. It was confirmed that cancer patients could be separated well.
  • the AUC of the ROC curve (FIG. 3) was 0. It was 811 and was a particularly good result.
  • FIG. 4 is a diagram showing ROC curves of each colorectal cancer diagnostic marker in cohort 3.
  • Table 7 shows the AUC and 95% CI of each ROC curve shown in FIG. In FIG. 4, "1-specificity” is plotted on the horizontal axis, and "sensitivity” is plotted on the vertical axis.
  • the AUC of the ROC curve (FIG. 4) was 0.868. From this, it was found that healthy subjects and colorectal cancer patients could be separated with particularly high accuracy, and particularly good results were obtained.
  • Cohort 3 is a group of cases independent of cohort 1 and cohort 2. Therefore, the analysis results of the above cohort 3 suggest that hsa-miR-129-1-3p and hsa-miR-566 are useful as independent markers for colorectal cancer diagnosis.
  • FIG. 5 is a diagram showing the expression level of hsa-miR-129-1-3p in cohort 4 in comparison with healthy subjects and stage 0 or stage I colorectal cancer patients.
  • FIG. 6 is a diagram showing the expression level of hsa-miR-566 in cohort 4 in comparison with a healthy subject and a stage 0 or stage I colorectal cancer patient. As shown in FIGS. 5 and 6, in both hsa-miR-129-1-3p and hsa-miR-566, each colorectal cancer diagnostic marker is a healthy person in a stage 0 or stage I colorectal cancer patient. It was significantly higher expressed in comparison.
  • FIG. 7 is a diagram showing ROC curves of each colorectal cancer diagnostic marker in cohort 4.
  • Table 10 shows the AUC and 95% CI of the ROC curve obtained in Cohort 4.
  • “1-specificity” is plotted on the horizontal axis
  • “sensitivity” is plotted on the vertical axis.
  • the AUC was 0.845 in the ROC curve (FIG. 7) in which the microRNA was a combination of hsa-miR-129-1-3p and hsa-miR-566. From this, according to the genetic diagnosis panel prepared by using the combination of hsa-miR-129-1-3p and hsa-miR-566 as a marker for colorectal cancer diagnosis, the degree of progression of colorectal cancer is stage 0 or stage I. It was found that even in the case of early-stage colorectal cancer patients, healthy subjects and early-stage colorectal cancer patients can be separated with high accuracy.
  • the cutoff value in the ROC curve was 0.00499 or more. In this case, the sensitivity was 95.3% and the specificity was 54.2% (Table 11).
  • the cutoff value in the ROC curve was 0.152 or more. In this case, the sensitivity was 90.6% and the specificity was 65.5% (Table 11).
  • AUC can distinguish between healthy subjects and stage 0 or stage I colorectal cancer patients. It was 0.845, which was particularly good (Table 10). Based on multivariate analysis, model formulas using hsa-miR-129-1-3p and hsa-miR-566 expression show stage 0 or stage I colorectal cancer with sensitivity: 90.6%, specificity. : It was found that the discrimination was possible at 65.5% (Table 11).
  • hsa-miR-129-1--3p was significantly highly expressed in the colon cancer tissue as compared with the neighboring normal tissue.
  • hsa-miR-566 also showed the same tendency as hsa-miR-129-1-3p, although there was no significant difference. The fact that no significant difference in the expression level of hsa-miR-566 was observed is considered to be due to the small number of samples of 20.
  • ⁇ Analysis using colorectal cancer cell line> The expression levels of hsa-miR-129-1-3p and hsa-miR-566 were analyzed using a colon cancer cell line.
  • the expression level of hsa-miR-566 - in FIG. 10 shows a plot of (2 ⁇ Ct) on the horizontal axis.
  • (i) shows the expression level in exosomes
  • (ii) shows the expression level in the culture medium
  • (iii) shows the expression level in cells.
  • hsa-miR-129-1--3p and hsa-miR-566 were detectable from any of the samples (i) to (iii).
  • hsa-miR-129-1--3p and hsa-miR-566 showed similar expression tendencies in all of the samples (i) to (iii).
  • hsa-miR-129-1-3p, hsa-miR-566, and hsa-miR-598-5p are useful as markers for diagnosing colorectal cancer.
  • hsa-miR-129-1-3p and hsa-miR-566 is used as a marker for diagnosing colorectal cancer, it can be detected with high sensitivity even in the case of early-stage colorectal cancer, and is a healthy body. It was suggested that it could be separated from.
  • An inhibitor of hsa-miR-566 was administered to SW480 and HCT116.
  • mirVana miRNA inhibitor catalog number: 4464084, Assay ID: MH11490, Thermo Fisher Scientific, USA
  • Anti-miR miRNA Inhibitor Negative Control # 1 (catalog number: AM17010, Thermo Fisher Scientific, USA) was used as a negative control.
  • a evaluation assay was performed to evaluate the cell motility of SW480 and HCT116. The results are shown in FIGS. 11 and 12. As shown in FIGS.
  • hsa-miR-129-1--3p and hsa-miR-566 may have similar molecular biological functions to each other (FIGS. 13 and 14). Therefore, inhibition of hsa-miR-129-1-3p may also significantly reduce cell motility. Therefore, inhibitors of hsa-miR-129-1-3p are also colorectal cancer. May be useful as a therapeutic agent.
  • the presence or absence of colorectal cancer can be determined with high accuracy, and early colorectal cancer can be detected with high sensitivity.

Abstract

本発明は、大腸癌の罹患の有無を高精度で判別し、かつ、早期の大腸癌を高感度で検出できる大腸癌診断用マーカー；前記大腸癌診断用マーカーの発現量を測定する、大腸癌の診断を補助する方法、大腸癌の診断のためにデータを収集する方法、大腸癌の診断方法、大腸癌の治療方法；前記大腸癌診断用マーカーと特異的なプライマーを備える大腸癌の診断用キット；前記大腸癌診断用マーカーの阻害剤を含む大腸癌治療薬を提供する。　本発明の大腸癌診断用マーカーは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡである。

Description

大腸癌診断用マーカー、大腸癌の診断を補助する方法、大腸癌の診断のためにデータを収集する方法、大腸癌の診断用キット、大腸癌治療薬、大腸癌の治療方法、大腸癌の診断方法
　本発明は、大腸癌診断用マーカー、大腸癌の診断を補助する方法、大腸癌の診断のためにデータを収集する方法、大腸癌の診断用キット、大腸癌治療薬、大腸癌の治療方法、大腸癌の診断方法に関する。
　本願は、２０１９年８月１６日に、日本国に出願された特願２０１９－１４９３３８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　大腸癌の罹患の有無を調べる方法として、下部消化管内視鏡検査、便潜血検査が知られている（例えば、非特許文献１、２）。下部消化管内視鏡検査は、検査に長時間を要し、高侵襲性であり、検査に要する費用も高い。そのため、下部消化管内視鏡検査は健常者を対象とする検診、スクリーニング検査には推奨されない。
　以上のことから、大腸癌の検診等においては、便潜血検査が行われることが多い。
　また、大腸癌のバイオマーカーとして、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＡ１９－９（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ １９－９）が知られている。
国立がん研究センター「がん情報サービス」（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｇａｎｊｏｈｏ．ｊｐ／ｍｅｄ＿ｐｒｏ／ｐｒｅ＿ｓｃｒ／ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ／ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ＿ｃｏｌｏｎ．ｈｔｍｌ、アクセス日：２０１９年０７月１２日） 医学書院「週刊医学界新聞、第２９４０号、２０１１年０８月０８日」（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｇａｋｕ－ｓｈｏｉｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｐａｐｅｒＤｅｔａｉｌ．ｄｏ？ｉｄ＝ＰＡ０２９４０＿０５、アクセス日：２０１９年０７月１２日）
　しかしながら便潜血反応は、健常な被検者を大腸癌に罹患していると誤って判別してしまう確率、すなわち偽陽性の確率が高い。そのため、便潜血反応では大腸癌の罹患の有無を正確に判別する際の精度が不充分である。
　加えて、非特許文献２には早期の大腸癌においては免疫学的潜血反応による大腸癌検出率が３０～４０％であると記載されている。このように、実臨床においても検出感度が極めて低いという問題がある。
　ＣＥＡ、ＣＡ１９－９等の従来のバイオマーカーにおいても、大腸癌の検出率は低く、検出感度が充分ではない。
　本発明は、大腸癌の罹患の有無を高精度で判別し、かつ、早期の大腸癌を高感度で検出することが可能となる大腸癌診断用マーカーを提供する。
　本発明の第１の態様は、下記の［１］～［１３］に記載の態様を有する。
［１］　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡである、大腸癌診断用マーカー。
［２］　前記マイクロＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の組み合わせである、［１］の大腸癌診断用マーカー。
［３］　ヒトの体液に含まれている、［１］又は［２］の大腸癌診断用マーカー。
［４］　大腸癌の診断を補助する方法であって、被検体から採取したサンプル中の、［１］～［３］のいずれかの大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、前記発現量を基準値と比較する、方法。
［５］　前記発現量を基準値と比較するために、前記サンプル中の下記ｍｉＲＮＡを標準化因子として前記発現量を標準化する、［４］の方法。
　ｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐのいずれか一方又は両方。
［６］　前記大腸癌の進行度が、ステージ０又はステージＩである、［４］又は［５］の方法。
［７］　大腸癌の診断のためにデータを収集する方法であって、被検体から採取したサンプル中の、［１］～［３］のいずれかの大腸癌診断用マーカーの発現量を測定する、方法。
［８］　前記発現量を測定した後に、前記サンプル中の下記ｍｉＲＮＡを標準化因子として前記発現量を標準化する、［７］の方法。
　ｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐのいずれか一方又は両方。
［９］　前記大腸癌の進行度が、ステージ０又はステージＩである、［７］又は［８］の方法。
［１０］　大腸癌の診断のために使用するキットであって、［１］～［３］のいずれかの大腸癌診断用マーカーと特異的なプライマーを備える、大腸癌の診断用キット。
［１１］　前記マイクロＲＮＡをサンプルから抽出する抽出用試薬、前記マイクロＲＮＡのｃＤＮＡを合成するｃＤＮＡ合成用試薬、サンプル採取用容器、標準化因子となるｍｉＲＮＡと特異的な標準化用プライマー、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び取扱説明書からなる群から選ばれる少なくとも一つをさらに備える、［１０］の大腸癌の診断用キット。
［１２］　前記大腸癌の進行度が、ステージ０又はステージＩである、［１０］又は［１１］の大腸癌の診断用キット。
［１３］　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡの阻害剤を含む、大腸癌治療薬。
　本発明の第２の態様は、前記［１］～［１３］に記載の態様に加えて、下記の≪１≫～≪２３≫に記載の態様をさらに有する。
≪１≫　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡである、大腸癌診断用マーカー。
≪２≫　前記マイクロＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の組み合わせである、≪１≫の大腸癌診断用マーカー。
≪３≫　ヒトの体液に含まれている、≪１≫又は≪２≫の大腸癌診断用マーカー。
≪４≫　大腸癌を診断する方法であって、被検体から採取したサンプル中の、≪１≫～≪３≫のいずれかの大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、前記発現量を基準値と比較する、大腸癌の診断方法。
≪５≫　前記発現量を基準値と比較するために、前記サンプル中のｍｉＲＮＡを標準化因子として前記発現量を標準化する、≪４≫の大腸癌の診断方法。
≪６≫　前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐのいずれか一方又は両方である、≪５≫の大腸癌の診断方法。
≪７≫　前記大腸癌の進行度が、ステージ０又はステージＩである、≪４≫～≪６≫のいずれかの大腸癌の診断方法。
≪８≫　大腸癌を治療する方法であって、≪４≫～≪７≫のいずれかの大腸癌の診断方法を使用して被検体を診断し、前記被検体が大腸癌に罹患していると診断した場合、大腸癌の治療薬を前記被検体に投与する、大腸癌の治療方法。
≪９≫　大腸癌を治療する方法であって、≪４≫～≪７≫のいずれかの大腸癌の診断方法を使用して被検体を診断し、前記被検体が大腸癌に罹患していると診断した場合、前記被検体に対して手術を行う、大腸癌の治療方法。
≪１０≫　大腸癌の罹患の有無を判定する方法であって、被検体から採取したサンプル中の、≪１≫～≪３≫のいずれかの大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、前記発現量を基準値と比較する、大腸癌の判定方法。
≪１１≫　前記発現量を基準値と比較するために、前記サンプル中のｍｉＲＮＡを標準化因子として前記発現量を標準化する、≪１０≫の大腸癌の判定方法。
≪１２≫　前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐのいずれか一方又は両方である、≪１１≫の大腸癌の判定方法。
≪１３≫　前記大腸癌の進行度が、ステージ０又はステージＩである、≪１０≫～≪１２≫のいずれかの大腸癌の判定方法。
≪１４≫　大腸癌を治療する方法であって、≪１０≫～≪１３≫のいずれかの大腸癌の判定方法を使用して被検体の大腸癌の罹患の有無を判定し、前記被検体が大腸癌に罹患していると判定した場合、大腸癌の治療薬を前記被検体に投与する、大腸癌の治療方法。
≪１５≫　大腸癌を治療する方法であって、≪１０≫～≪１３≫のいずれかの大腸癌の判定方法を使用して被検体の大腸癌の罹患の有無を判定し、前記被検体が大腸癌に罹患していると判定した場合、前記被検体に対して手術を行う、大腸癌の治療方法。
≪１６≫　大腸癌の罹患の有無を試験する方法であって、被検体から採取したサンプル中の、≪１≫～≪３≫のいずれかの大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、前記発現量を基準値と比較する、大腸癌の試験方法。
≪１７≫　前記発現量を基準値と比較するために、前記サンプル中のｍｉＲＮＡを標準化因子として前記発現量を標準化する、≪１６≫の大腸癌の試験方法。
≪１８≫　前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐのいずれか一方又は両方である、≪１７≫の大腸癌の試験方法。
≪１９≫　前記大腸癌の進行度が、ステージ０又はステージＩである、≪１６≫～≪１８≫のいずれかの大腸癌の試験方法。
≪２０≫　大腸癌を治療する方法であって、≪１６≫～≪１９≫のいずれかの大腸癌の試験方法を使用して被検体の大腸癌の罹患の有無を試験し、前記被検体が大腸癌に罹患していると判断した場合、大腸癌の治療薬を前記被検体に投与する、大腸癌の治療方法。
≪２１≫　大腸癌を治療する方法であって、≪１６≫～≪１９≫のいずれかの大腸癌の試験方法を使用して被検体の大腸癌の罹患の有無を試験し、前記被検体が大腸癌に罹患していると判断した場合、前記被検体に対して手術を行う、大腸癌の治療方法。
≪２２≫　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡの阻害剤を含む、大腸癌治療薬。
≪２３≫　被検体のｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡを阻害する、大腸癌の治療方法。
　本発明によれば、大腸癌の罹患の有無を高精度で判別し、かつ、早期の大腸癌を高感度で検出することが可能となる大腸癌診断用マーカーが提供される。
実施例の検証の概要を示す図である。 コホート１におけるｍｉＲＮＡアレイ解析の結果を示す図である。 コホート２における各大腸癌診断用マーカーのＲＯＣ曲線を示す図である。 コホート３における各大腸癌診断用マーカーのＲＯＣ曲線を示す図である。 コホート４におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐの発現量を健常者とステージ０又はステージＩの大腸癌患者において比較して示す図である。 コホート４におけるｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の発現量を健常者とステージ０又はステージＩの大腸癌患者において比較して示す図である。 コホート４における各大腸癌診断用マーカーのＲＯＣ曲線を示す図である。 ホルマリン固定パラフィン包埋を用いた分析においてｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐの発現量を正常組織と大腸癌組織において比較して示す図である。 ホルマリン固定パラフィン包埋を用いた分析においてｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の発現量を正常組織と大腸癌組織において比較して示す図である。 ＳＷ４８０及びＨＣＴ１１６について、（ｉ）培養液中のエクソソーム、（ｉｉ）培養液、（ｉｉｉ）細胞本体中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐの発現量（２－△Ｃｔ）を縦軸に、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の発現量（２－△Ｃｔ）を横軸にプロットした図である。 ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６の細胞運動能の評価に使用した写真である。 ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６の細胞運動能の評価に使用したグラフである。 Ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ解析の結果を示す図である。 Ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ解析の結果を示す図である。
　本明細書及び特許請求の範囲における以下の用語の意味は、本段落に記載の通りである。
　「ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ」は、配列番号１に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００４５４８）であり、ヒト以外の生物種のホモログ又はオーソログを包含する。
　「ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６」は、配列番号２に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－５６６遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００３２３０）であり、ヒト以外の生物種のホモログ又はオーソログを包含する。
　「ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐ」は、配列番号３に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００２６６２０）であり、ヒト以外の生物種のホモログ又はオーソログを包含する。
　「ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９」は、配列番号４に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００１９７４９）であり、ヒト以外の生物種のホモログ又はオーソログを包含する。
　「ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐ」は、配列番号５に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００２７４１２）であり、ヒト以外の生物種のホモログ又はオーソログを包含する。
　「プライマー」とは、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれか一方又は両方と相補対を形成するヌクレオチドを意味する。
　本明細書における以下の用語の意味は、本段落に記載の通りである。
　「変異体」とは、多型性、突然変異等に起因した天然の変異体；１又は２以上の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体を意味する。
　「誘導体」とは、蛍光団、放射性同位元素等によるラベル化誘導体；有機官能基を有する修飾ヌクレオチド；塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換等を受けたヌクレオチド等を意味する。ただし、誘導体はこれらの例示に限定されない。
　「被検体」は、ヒト、チンパンジー等の霊長類；マウス、ラット等の齧歯類等の哺乳類；イヌ、ネコ等のペット；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜を意味する。
　「被検者」は、被検体としてのヒトを意味する。
　「健常体」及び「健常者」は、被検体であって、大腸癌に罹患していない生物を意味する。
　「精度」は（（真陽性の数）＋（真陰性の数））／（全検体数）の値を意味する。
　「感度」は、（真陽性の数）／（（真陽性の数）＋（偽陰性の数））の値を意味する。感度が高いほど大腸癌を早期に発見しやすくなり、がん罹患部の完全切除、再発率の低下に寄与する。
　「特異度」は、（真陰性の数）／（（真陰性の数）＋（偽陽性の数））を意味する。特異度が高いほど健常体を大腸癌患者として誤って判別することを防ぎやすくなり、無駄な追加検査の実施を防ぎ、患者の負担の軽減、医療費の削減に寄与する。
　「検査」、「評価」及び「試験」の各用語で特定される行為は、日本国及び医療行為が特許の対象から除外されている国においては、医師による医療行為（例えば、ヒトの病気を診断する行為、ヒトの病気を治療する行為等）を含まない。
　数値範囲を示す「～」は、その前後に記載された数値を下限値及び上限値として含むことを意味する。
＜大腸癌診断用マーカー＞
　本発明の大腸癌診断用マーカーは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡである。すなわち、本発明の大腸癌診断用マーカーは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる一つのマイクロＲＮＡ又は二以上のマイクロＲＮＡの組み合わせである。
　マイクロＲＮＡは、本発明の効果を損なわない範囲であれば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐの変異体及び誘導体、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の変異体及び誘導体、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐの変異体及び誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上をさらに含んでもよい。
　マイクロＲＮＡの組み合わせとしては、大腸癌の罹患の有無を判別する際の精度、感度及び特異度がさらに向上することから、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の組み合わせが好ましい。加えて、マイクロＲＮＡの組み合わせがｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の組み合わせであると、大腸癌がステージ０又はステージＩである場合でも大腸癌の罹患の有無を判別する際の感度及び特異度に優れるという顕著な効果が得られる。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐは、例えば、ＲＮＡ．９：１７５－１７９（２００３）．に記載される方法によって特定できる。ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐの前駆体としては、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ００００２５２、配列番号６）が、知られている。ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐは、ステム－ループ構造を有する。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６は、例えば、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０３：３６８７－３６９２（２００６）．に記載される方法によって特定できる。ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の前駆体としては、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ０００３５７２、配列番号７）が、知られている。ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐは、ステム－ループ構造を有する。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐは、例えば、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０３：３６８７－３６９２（２００６）．に記載される方法によって特定できる。ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐの前駆体としては、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ０００３６１０、配列番号８）が、知られている。ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐは、ステム－ループ構造を有する。
　本発明の大腸癌診断用マーカーはヒトの体液に含まれていると好ましい。大腸癌診断用マーカーがヒトの体液に含まれていると、検査が無侵襲であり、簡便である。加えて、自宅等の医療機関以外の場所でも大腸癌の検査を行うことができるという利点がある。
　体液の具体例としては、血液、乳汁、尿、唾液、リンパ液、髄液、羊水、涙液、汗、鼻漏、便汁等の体液が挙げられる。ただし、体液は、これらの例示に限定されない。
　これらの中でも、採取が簡便であることから体液としては尿が好ましい。体液としては、前記の各体液から不要成分を除去する等の前処理を行った処理液；前記の各体液に含まれる細胞を培養して得られた培養液でもよい。
（作用機序）
　以上説明した本発明の大腸癌診断用マーカーは、後述の実施例に示すように、大腸癌患者において健常者と比較して有意に高発現している。そのため、被検体から採取されるサンプル中の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、その測定値を基準値と比較して大小を評価することで、被検体が大腸癌に罹患しているか否かを判別できる。
　加えて、本発明の大腸癌診断用マーカーは、後述の実施例に示すように、ステージ０又はステージＩの早期の大腸癌患者群においても、有意に高発現している傾向がある。そのため、本発明の大腸癌診断用マーカーによれば、大腸癌の進行度がステージ０又はステージＩである場合でも、大腸癌の罹患の有無を優れた感度及び特異度で判別できる。
（用途）
　以上説明した本発明の大腸癌診断用マーカーは、例えば、後述の大腸癌の診断を補助する方法、大腸癌に罹患している可能性を評価する方法、大腸癌の診断のための方法、大腸癌の検査方法、大腸癌の罹患の可能性を試験する方法、大腸癌の診断のためにデータを収集する方法、大腸癌の診断を補助するためのインビトロの方法、大腸癌の診断用キットに適用できる。
　前記の各用途に加えて、本発明の大腸癌診断用マーカーは、大腸癌の診断方法、大腸癌の判定方法、大腸癌の試験方法、大腸癌の治療方法にも適用できる。
　発明の大腸癌診断用マーカーの用途の詳細は、後述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において詳細に説明する。
＜大腸癌の診断を補助する方法＞
　本発明の大腸癌の診断を補助する方法は、被検体が大腸癌に罹患しているか否かの診断の補助となる判断材料を提供するものである。当該判断材料に基づいて、大腸癌の診断を行ってもよい。
　本発明の大腸癌の診断を補助する方法においては、被検体から採取したサンプル中の、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定する。次いで、大腸癌診断用マーカーの発現量を基準値と比較する。
　被検体からサンプルを採取する方法は特に限定されない。例えば、上述の＜大腸癌診断用マーカー＞の項目において述べた各種体液を採取できる方法であれば特に限定されない。例えば、体液として尿を使用する場合、一般的な尿検査で使用される方法でもよい。その他の体液を使用する場合も、一般的な検査で使用される方法でよい。
　本発明の発明者は、後述の実施例で示すように、本発明の大腸癌診断用マーカーである特定のマイクロＲＮＡが大腸癌患者において健常者と比較して有意に高発現していることを見出した。
　よって、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量が、ある基準値より高いか否かを評価することで、大腸癌を検出でき、被検体が大腸癌に罹患しているか否かを判別できる。
　大腸癌診断用マーカーの発現量は、例えば、定量ＲＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）－ＰＣＲによって測定できる。
　大腸癌診断用マーカーの定量ＲＴ－ＰＣＲは、例えば、下記の方法（１）にしたがって行うことができる。
・方法（１）：大腸癌診断用マーカーの逆転写反応を行い、次いで、逆転写反応によって得られた鋳型ＤＮＡ（１）を用いて、定量的ＰＣＲを行う。
　方法（１）においては、まず、被検体から採取されたサンプル中のマイクロＲＮＡ、すなわち、大腸癌診断用マーカーの逆転写を行う。ここで、マイクロＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つである。これらのマイクロＲＮＡは、プロセッシングを受けた後の成熟マイクロＲＮＡ（Ｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡ）である。
　そのため、大腸癌診断用マーカーの逆転写においては、以下のプライマーＡ１を用いることが好ましい。
・プライマーＡ１：大腸癌診断用マーカーに特異的なＬｏｏｐｅｄ ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ。
　プライマーＡ１は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つと特異的に結合してステム－ループ構造を形成するものであれば特に限定されない。
　プライマーＡ１は、ループ構造を有する。プライマーＡ１が大腸癌診断用マーカーに結合することで、ステム－ループ構造が形成される。このステム－ループ構造を、逆転写酵素が認識し、大腸癌診断用マーカーの逆転写反応が進行する。逆転写反応により、大腸癌診断用マーカーの鋳型ＤＮＡ（１）が合成される。
　逆転写反応に使用する逆転写酵素は、特に限定されない。一般的に実験室で使用される逆転写酵素を用いることができる。逆転写酵素として、リコンビナントタンパク質を使用してもよい。
　次いで、大腸癌診断用マーカーの逆転写反応により得られた大腸癌診断用マーカーの鋳型ＤＮＡ（１）を用いて、定量的ＰＣＲを行う。定量的ＰＣＲにおいては、以下の２種類のプライマーＡ２、プライマーＡ３を用いることが好ましい。
・プライマーＡ２：鋳型ＤＮＡ（１）と特異的に結合するｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ。
・プライマーＡ３：鋳型ＤＮＡ（１）と特異的に結合するｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ。
　これらのプライマーＡ２、Ａ３を用いて定量的ＰＣＲを行うことで、大腸癌診断用マーカーの鋳型ＤＮＡ（１）から、大腸癌診断用マーカーの発現量を測定できる。
　定量的ＰＣＲに使用するＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されない。一般的に実験室で使用されるＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。ＤＮＡポリメラーゼとして、リコンビナントタンパク質を使用してもよい。
　プライマーＡ１、プライマーＡ２、プライマーＡ３は、一般的な核酸合成、ヌクレオチド合成により用意できる。例えば、核酸の受託合成を請け負う企業から入手することも可能である。また、大腸癌診断用マーカーを検出するための市販のキットとして、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いることもできる。したがって、本技術分野における当業者であれば、常法により、過度の負担なく、プライマーＡ１、プライマーＡ２、プライマーＡ３を入手することができ、大腸癌診断用マーカーの発現量を確認できる。
　例えば、下記のプライマーＡ１１、プライマーＡ２１、プライマーＡ３１を含むＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙのカタログ番号は、Ａ２５５７６であり、そのＡｓｓａｙ ＩＤは、４８０８７３＿ｍｉｒである。
・プライマーＡ１１：ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐと特異的に結合するＬｏｏｐｅｄ ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ。
・プライマーＡ２１：ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐの鋳型ＤＮＡ（１）と特異的に結合するｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ。
・プライマーＡ３１：ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐの鋳型ＤＮＡ（１）と特異的に結合するｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ。
　例えば、下記のプライマーＡ１２、プライマーＡ２２、プライマーＡ３２を含むＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙのカタログ番号は、Ａ２５５７６であり、そのＡｓｓａｙ ＩＤは、４７９３７３＿ｍｉｒである。
・プライマーＡ１２：ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６と特異的に結合するＬｏｏｐｅｄ ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ。
・プライマーＡ２２：ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の鋳型ＤＮＡ（１）と特異的に結合するｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ。
・プライマーＡ３２：ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の鋳型ＤＮＡ（１）と特異的に結合するｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ。
　例えば、下記のプライマーＡ１３、プライマーＡ２３、プライマーＡ３３を含むＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙのカタログ番号は、Ａ２５５７６であり、そのＡｓｓａｙ ＩＤは、４７９０８０＿ｍｉｒである。
・プライマーＡ１３：ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐと特異的に結合するＬｏｏｐｅｄ ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ。
・プライマーＡ２３：ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐの鋳型ＤＮＡ（１）と特異的に結合するｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ。
・プライマーＡ３３：ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐの鋳型ＤＮＡ（１）と特異的に結合するｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ。
　本発明の大腸癌の診断を補助する方法においては、マイクロＲＮＡの発現量を定量的ＰＣＲにおけるサイクル数のカットオフ値に基づいて算出できる。
　定量的ＰＣＲにおいては、サンプル中において測定対象の核酸の量が相対的に多いと、核酸の増幅量がある一定の値に到達するまでのサイクル数が相対的に短い。一方で、サンプル中において測定対象の核酸の量が相対的に少ないと、核酸の増幅量がある一定の値に到達するまでのサイクル数が長くなり、カットオフ値が大きくなる。この核酸の増幅量がある一定の閾値に到達するまでのサイクル数をカットオフ値として、測定対象の核酸の量を検量線により算出することが行われている。
　カットオフ値の決定に関与する核酸の増幅量の閾値は、被検体の年齢、性別、採取されるサンプル中の全ＲＮＡ量、使用する大腸癌診断用マーカーの種類、採取方法、検体の種類等の条件に応じて適宜設定できる。
　本発明の大腸癌の診断を補助する方法において、大腸癌診断用マーカーの発現量を基準値と比較するために、サンプル中のｍｉＲＮＡを標準化因子として大腸癌診断用マーカーの発現量を標準化することが好ましい。大腸癌診断用マーカーの発現量を標準化することにより、大腸癌診断用マーカーの発現量の相対的な大小をさらに正確に判断でき、大腸癌の罹患の有無をさらに高精度で判別できる。
　標準化因子として使用するｍｉＲＮＡとしては、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐのいずれか一方又は両方が好ましく、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐの組み合わせがより好ましい。
　本発明の発明者は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐは、ヒト等の生物種の尿中において恒常的に発現し、発現量が安定していることを見出した。このように、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐは、発現量が安定していることから、被検体から採取される体液中に含まれる本発明の大腸癌診断用マーカーの標準化因子として有用である。
　加えて、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐは、被検体から採取される体液中に含まれる任意のｍｉＲＮＡの標準化因子としても有用である。
　標準化因子としてのｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐは、本発明の効果を損なわない範囲であれば、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９の変異体及び誘導体、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐの変異体及び誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上をさらに含んでもよい。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９は、例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１：７８－８６（２０１１）．に記載される方法によって特定できる。ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９の前駆体としては、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ００１７３００、配列番号９）が、知られている。ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐは、ステム－ループ構造を有する。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐは、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２２：１６３４－１６４５（２０１２）．に記載される方法によって特定できる。ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐの前駆体としては、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ００２２６０１、配列番号１０）が、知られている。ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐは、ステム－ループ構造を有する。
　本発明の大腸癌の診断を補助する方法においてサンプル中のｍｉＲＮＡを標準化因子として大腸癌診断用マーカーの発現量を標準化する場合、下記の△Ｃｔに基づいて大腸癌診断用マーカーの発現量を算出してもよい。△Ｃｔを用いることで、大腸癌診断用マーカーの発現量を２－△Ｃｔとして数値化することができる。
　△Ｃｔ：大腸癌診断用マーカーのカットオフ値から標準化因子のカットオフ値を減じた値。
　△Ｃｔ値を用いることで、△Ｃｔ値をそれぞれの検体の大腸癌診断用マーカーの発現量の評価に使用できる。具体的には、２－△Ｃｔを各大腸癌診断用マーカーの発現量の測定値として使用し、２－△Ｃｔを基準値と比較することで、被検体が大腸癌に罹患しているか否かを容易に判別できる。
　ここで、大腸癌患者においては、大腸癌診断用マーカーが相対的に高発現していることから、－△Ｃｔ値が相対的に大きく、２－△Ｃｔの値が相対的に大きくなる。一方、健常体においては、－△Ｃｔ値が相対的に小さく、２－△Ｃｔの値が相対的に小さくなる。
　この場合、健常体における指標となる△Ｃｔが既知であれば、健常体における２－△Ｃｔを基準値として使用できる。
　△Ｃｔ値における標準化因子のカットオフ値は、被検体から採取されたサンプル中のｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐのカットオフ値の平均値とすることができる。
　標準化因子として使用するｍｉＲＮＡの発現量は、例えば、定量的ＰＣＲによって測定できる。具体的には、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐの各発現量は、標準化因子の定量的ＰＣＲにおけるサイクル数のカットオフ値に基づいて算出できる。
　標準化因子の定量的ＰＣＲは、例えば、下記の方法（２）にしたがって行うことができる。
・方法（２）：標準化因子の逆転写反応を行い、次いで、逆転写反応によって得られた鋳型ＤＮＡ（２）を用いて、定量的ＰＣＲを行う。
　方法（２）においては、まず、被検体から採取されたサンプル中のｍｉＲＮＡ、すなわち、標準化因子の逆転写を行う。ここで、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つである。これらのｍｉＲＮＡは、プロセッシングを受けた後の成熟ｍｉＲＮＡ（Ｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡ）である。
　そのため、標準化因子の逆転写においては、以下のプライマーＢ１を用いることが好ましい。
・プライマーＢ１：標準化因子に特異的なＬｏｏｐｅｄ ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ。
　プライマーＢ１は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つと特異的に結合してステム－ループ構造を形成するものであれば特に限定されない。
　プライマーＢ１は、ループ構造を有する。プライマーＢ１が標準化因子に結合することで、ステム－ループ構造が形成される。このステム－ループ構造を、逆転写酵素が認識し、標準化因子の逆転写反応が進行する。逆転写反応により、標準化因子の鋳型ＤＮＡ（２）が合成される。
　逆転写反応に使用する逆転写酵素は、特に限定されない。一般的に実験室で使用される逆転写酵素を用いることができる。逆転写酵素として、リコンビナントタンパク質を使用してもよい。
　次いで、標準化因子の逆転写反応により得られた標準化因子の鋳型ＤＮＡ（２）を用いて、定量的ＰＣＲを行う。定量的ＰＣＲにおいては、以下の２種類のプライマーＢ２、プライマーＢ３を用いることが好ましい。
・プライマーＢ２：鋳型ＤＮＡ（２）と特異的に結合するｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ。
・プライマーＢ３：鋳型ＤＮＡ（２）と特異的に結合するｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ。
　これらのプライマーＢ２、Ｂ３を用いて、定量的ＰＣＲを行うことで、標準化因子の鋳型ＤＮＡ（２）から、標準化因子の発現量を測定できる。
　定量的ＰＣＲに使用するＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されない。一般的に実験室で使用されるＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。ＤＮＡポリメラーゼとして、リコンビナントタンパク質を使用してもよい。
　プライマーＢ１、プライマーＢ２、プライマーＢ３は、一般的な核酸合成、ヌクレオチド合成により用意できる。例えば、核酸の受託合成を請け負う企業から入手することも可能である。また、標準化因子を検出するための市販のキットとして、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙを用いることもできる。したがって、本技術分野における当業者であれば、常法により、過度の負担なく、プライマーＢ１、プライマーＢ２、プライマーＢ３を入手することができ、標準化因子の発現量を確認できる。
　例えば、下記のプライマーＢ１１、プライマーＢ２１、プライマーＢ３１を含むＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙのカタログ番号は、Ａ２５５７６であり、そのＡｓｓａｙ ＩＤは、４７８９２５＿ｍｉｒである。
・プライマーＢ１１：ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９と特異的に結合するＬｏｏｐｅｄ ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ。
・プライマーＢ２１：ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９の鋳型ＤＮＡ（２）と特異的に結合するｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ。
・プライマーＢ３１：ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９の鋳型ＤＮＡ（２）と特異的に結合するｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ。
　例えば、下記のプライマーＢ１２、プライマーＢ２２、プライマーＢ３２を含むＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙのカタログ番号は、Ａ２５５７６であり、そのＡｓｓａｙ ＩＤは、４８０２８４＿ｍｉｒである。
・プライマーＢ１２：ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐと特異的に結合するＬｏｏｐｅｄ ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ。
・プライマーＢ２２：ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐの鋳型ＤＮＡ（２）と特異的に結合するｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ。
・プライマーＢ３２：ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐの鋳型ＤＮＡ（２）と特異的に結合するｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ。
　次いで、本発明の大腸癌の診断を補助する方法においては、大腸癌診断用マーカーの発現量を基準値と比較する。大腸癌診断用マーカーの発現量を基準値と比較することで、被検体が大腸癌に罹患しているか否かを判別できる。
　サンプル中の大腸癌診断用マーカーの発現量が、健常体における大腸癌診断用マーカーの発現量に対して相対的に高い場合、被検体が大腸癌に罹患していると判断できる。
　前記基準値としては、この値以上であると大腸癌への罹患が疑われる基準値が考えられる。基準値を定めるに際しては、健常体における大腸癌診断用マーカーの発現量を参考にしてもよい。通常、基準値は健常体における大腸癌診断用マーカーの発現量である。
　測定によって得られた大腸癌診断用マーカーの発現量が基準値より高い場合、被検体が大腸癌に罹患していると判別する。一方、測定によって得られた大腸癌診断用マーカーの発現量が基準値より低い場合、被検体が大腸癌に罹患していないと判別する。
　判別に際して使用する基準値は、被検体の年齢、性別、使用する大腸癌診断用マーカーの種類、採取方法、検体の種類等の条件に応じて適宜設定できる。
　基準値の決定に際しては、健常者から採取したサンプル中のｍｉＲＮＡを標準化因子として健常体における大腸癌診断用マーカーの発現量を標準化し、健常体における大腸癌診断用マーカーの発現量を標準化した値を基準値とすることが好ましい。
　健常体における大腸癌診断用マーカーの発現量を標準化した値を基準値とすることにより、大腸癌の検査において大腸癌診断用マーカーの発現量の相対的な大小をさらに正確に判断しやすくなり、大腸癌の罹患の有無をさらに高精度で判別できる。
　健常体における大腸癌診断用マーカーは、上述の方法（１）と同様にして測定できる。また、健常体における標準化因子の発現量は、上述の方法（２）と同様にして測定できる。そして、基準値は下記の△Ｃｔ’に基づいて、２－△Ｃｔ’として設定できる。
　－△Ｃｔ’：健常体における大腸癌診断用マーカーのカットオフ値から健常体における標準化因子のカットオフ値を減じた値。
　このように、本発明の大腸癌の診断を補助する方法においては、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を基準値と比較する。そして、後述の実施例に示すように、本発明の大腸癌診断用マーカーによれば、ステージ０又はステージＩの早期の大腸癌患者と健常体とを高精度で分離できる。
　したがって、本発明の大腸癌の診断を補助する方法によれば、大腸癌の進行度がステージ０又はステージＩである場合でも、大腸癌の罹患の有無を判別する際の検査精度、検査感度及び特異度が優れる。
＜大腸癌に罹患している可能性を評価する方法＞
　本発明の大腸癌に罹患している可能性を評価する方法においては、被検体から採取したサンプル中の、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、前記発現量を基準値と比較する。
　本発明の大腸癌に罹患している可能性を評価する方法は、被検体が大腸癌に罹患しているか否かを診断するための判断材料を可能性として提供できる。当該判断材料に基づいて、大腸癌の診断を行ってもよい。
　大腸癌診断用マーカーの発現量の測定の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　基準値の具体的内容、大腸癌診断用マーカーの発現量の基準値との比較の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　本発明の大腸癌に罹患している可能性を評価する方法においては、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を基準値と比較する。そして、後述の実施例に示すように、本発明の大腸癌診断用マーカーによれば、ステージ０又はステージＩの早期の大腸癌患者と健常体とを高精度で分離できる。
　したがって、本発明の大腸癌に罹患している可能性を評価する方法によれば、大腸癌の進行度がステージ０又はステージＩである場合でも、大腸癌に罹患している可能性を高精度で評価できる。
＜大腸癌の診断のための方法＞
　本発明の大腸癌の診断のための方法においては、被検体から採取したサンプル中の、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、前記発現量を基準値と比較する。
　本発明の大腸癌の診断のための方法は、被検体が大腸癌に罹患しているか否かを診断するための判断材料を提供できる。当該判断材料に基づいて、大腸癌の診断を行ってもよい。
　大腸癌診断用マーカーの発現量の測定の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　基準値の具体的内容、大腸癌診断用マーカーの発現量の基準値との比較の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　本発明の大腸癌の診断のための方法においては、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を基準値と比較する。そして、後述の実施例に示すように、本発明の大腸癌診断用マーカーによれば、ステージ０又はステージＩの早期の大腸癌患者と健常体とを高精度で分離できる。
　したがって、本発明の大腸癌の診断のための方法によれば、大腸癌の進行度がステージ０又はステージＩである場合でも、大腸癌を高精度で診断するために有力な判断材料を提供できる。
＜大腸癌の検査方法＞
　本発明の大腸癌の検査方法においては、被検体から採取したサンプル中の、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、前記発現量を基準値と比較する。
　本発明の大腸癌の検査方法は、被検体が大腸癌に罹患しているか否かの診断の補助となる判断材料を提供できる。当該判断材料に基づいて、大腸癌の診断を行ってもよい。
　大腸癌診断用マーカーの発現量の測定の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　基準値の具体的内容、大腸癌診断用マーカーの発現量の基準値との比較の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　本発明の大腸癌の検査方法においては、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を基準値と比較する。そして、後述の実施例に示すように、本発明の大腸癌診断用マーカーによれば、ステージ０又はステージＩの早期の大腸癌患者と健常体とを高精度で分離できる。
　したがって、本発明の大腸癌の検査方法によれば、大腸癌の進行度がステージ０又はステージＩである場合でも、大腸癌を高精度で診断するために有力な判断材料を提供できる。
＜大腸癌の罹患の可能性を試験する方法＞
　本発明の大腸癌の罹患の可能性を試験する方法においては、被検体から採取したサンプル中の、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、前記発現量を基準値と比較する。
　本発明の大腸癌の罹患の可能性を試験する方法は、被検体が大腸癌に罹患しているか否かを診断するための判断材料を可能性として提供できる。当該判断材料に基づいて、大腸癌の診断を行ってもよい。
　大腸癌診断用マーカーの発現量の測定の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　基準値の具体的内容、大腸癌診断用マーカーの発現量の基準値との比較の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　本発明の大腸癌の罹患の可能性を試験する方法においては、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を基準値と比較する。そして、後述の実施例に示すように、本発明の大腸癌診断用マーカーによれば、ステージ０又はステージＩの早期の大腸癌患者と健常体とを高精度で分離できる。
　したがって、本発明の大腸癌の罹患の可能性を試験する方法によれば、大腸癌の進行度がステージ０又はステージＩである場合でも、被検体が大腸癌に罹患している可能性を高精度で試験できる。
＜大腸癌の診断のためにデータを収集する方法＞
　本発明の大腸癌の診断のためにデータを収集する方法においては、被検体から採取したサンプル中の、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定する。
　大腸癌診断用マーカーの発現量の測定の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　本発明の大腸癌の診断のためにデータを収集する方法によれば、大腸癌を高精度で診断するための情報を取得できる。
　本発明の大腸癌の診断のためにデータを収集する方法によって得られた情報は、基準値との比較に使用できる。このように当該情報は、大腸癌を診断するため判断材料の提供に有用である。
　基準値の具体的内容、大腸癌診断用マーカーの発現量の基準値との比較の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　後述の実施例に示すように、本発明の大腸癌診断用マーカーによれば、ステージ０又はステージＩの早期の大腸癌患者と健常体とを高精度で分離できる。
　したがって、本発明の大腸癌の診断のためにデータを収集する方法によれば、大腸癌診断用マーカーの発現量を測定するため大腸癌の進行度がステージ０又はステージＩである場合でも、大腸癌を高精度で診断するために有力な情報を取得できる。
＜大腸癌の診断を補助するためのインビトロの方法＞
　本発明の大腸癌の診断を補助するためのインビトロの方法においては、被検体から採取したサンプル中の、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定する。
　大腸癌診断用マーカーの発現量の測定の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　本発明の大腸癌の診断を補助するためのインビトロの方法によれば、大腸癌を高精度で診断するための情報を取得できる。
　本発明の大腸癌の診断を補助するためのインビトロの方法によって得られた情報は、基準値との比較に使用できる。このように当該情報は、大腸癌を診断するため判断材料の提供に有用である。
　基準値の具体的内容、大腸癌診断用マーカーの発現量の基準値との比較の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　後述の実施例に示すように、本発明の大腸癌診断用マーカーによれば、ステージ０又はステージＩの早期の大腸癌患者と健常体とを高精度で分離できる。
　したがって、本発明の大腸癌の診断を補助するためのインビトロの方法によれば、大腸癌診断用マーカーの発現量を測定するため大腸癌の進行度がステージ０又はステージＩである場合でも、大腸癌を高精度で診断するために有力な情報を取得できる。
＜大腸癌の診断方法＞
　本発明の大腸癌の診断方法においては、被検体から採取したサンプル中の、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、前記発現量を基準値と比較する。
　本発明の大腸癌の診断方法は、被検体が大腸癌に罹患しているか否かを診断する方法である。
　大腸癌診断用マーカーの発現量の測定の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　基準値の具体的内容、大腸癌診断用マーカーの発現量の基準値との比較の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　本発明の大腸癌の診断方法においては、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を基準値と比較する。そして、後述の実施例に示すように、本発明の大腸癌診断用マーカーによれば、ステージ０又はステージＩの早期の大腸癌患者と健常体とを高精度で分離できる。
　したがって、本発明の大腸癌の診断方法によれば、大腸癌の進行度がステージ０又はステージＩである場合でも、大腸癌を高精度で診断できる。
＜大腸癌の判定方法＞
　本発明の大腸癌の判定方法においては、被検体から採取したサンプル中の、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、前記発現量を基準値と比較する。
　本発明の大腸癌の判定方法は、被検体における大腸癌の罹患の有無を判定する方法である。
　大腸癌診断用マーカーの発現量の測定の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　基準値の具体的内容、大腸癌診断用マーカーの発現量の基準値との比較の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　本発明の大腸癌の判定方法においては、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を基準値と比較する。そして、後述の実施例に示すように、本発明の大腸癌診断用マーカーによれば、ステージ０又はステージＩの早期の大腸癌患者と健常体とを高精度で分離できる。
　したがって、本発明の大腸癌の判定方法によれば、大腸癌の進行度がステージ０又はステージＩである場合でも、大腸癌を高精度で判定できる。
＜大腸癌の試験方法＞
　本発明の大腸癌の試験方法においては、被検体から採取したサンプル中の、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、前記発現量を基準値と比較する。
　本発明の大腸癌の試験方法は、被検体における大腸癌の罹患の有無を試験する方法である。
　大腸癌診断用マーカーの発現量の測定の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　基準値の具体的内容、大腸癌診断用マーカーの発現量の基準値との比較の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　本発明の大腸癌の試験方法においては、本発明の大腸癌診断用マーカーの発現量を基準値と比較する。そして、後述の実施例に示すように、本発明の大腸癌診断用マーカーによれば、ステージ０又はステージＩの早期の大腸癌患者と健常体とを高精度で分離できる。
　したがって、本発明の大腸癌の試験方法によれば、大腸癌の進行度がステージ０又はステージＩである場合でも、大腸癌に罹患しているか否かを高精度で試験できる。
＜大腸癌の診断用キット＞
　本発明の大腸癌の診断用キットは、大腸癌の罹患の有無を検査するために使用するキットである。本発明の大腸癌の診断用キットは、本発明の大腸癌診断用マーカーと特異的なプライマーを備える。
　本発明の大腸癌の診断用キットにおけるプライマーとしては、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べたプライマーＡ１、プライマーＡ２、プライマーＡ３が挙げられる。大腸癌の診断用キットにおけるプライマーは、本発明の大腸癌診断用マーカーと特異的に相補対を形成できる。
　プライマーＡ１、プライマーＡ２、プライマーＡ３の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　本発明の大腸癌の診断用キットは、大腸癌診断用マーカーであるマイクロＲＮＡをサンプルから抽出する抽出用試薬、マイクロＲＮＡのｃＤＮＡを合成するｃＤＮＡ合成用試薬、サンプル採取用容器、標準化因子となるｍｉＲＮＡと特異的なプライマー、逆転写酵素及び取扱説明書からなる群から選ばれる少なくとも一つをさらに備えてもよい。
　抽出用試薬としては、一般的なＲＮＡ抽出用試薬が挙げられる。市販のＲＮＡ抽出用試薬の具体例としては、例えば、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）が挙げられる。ただし、抽出用試薬はこれらの例示に限定されない。
　ｃＤＮＡ合成用試薬は、大腸癌診断用マーカーであるマイクロＲＮＡのｃＤＮＡを合成するための試薬である。市販のｃＤＮＡ合成用試薬としては、例えば、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）が挙げられる。ただし、ｃＤＮＡ合成用試薬はこの例示に限定されない。
　ｃＤＮＡ合成用試薬は、標準化因子として使用するｍｉＲＮＡのｃＤＮＡの合成に使用してもよい。
　サンプル採取用容器は、被検体の体液を収容可能な容器であれば特に限定されない。例えば、体液が尿である場合、サンプル採取用容器は一般的な尿検査用容器でよい。
　標準化用プライマーとしては、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べたプライマーＢ１、プライマーＢ２、プライマーＢ３が挙げられる。標準化用プライマーは、標準化因子となるｍｉＲＮＡと特異的に相補対を形成できる。
　プライマーＢ１、プライマーＢ２の詳細及び好ましい態様は、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた内容と同内容とすることができる。
　逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼは、大腸癌診断用マーカーであるマイクロＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲによって定量するための試薬である。大腸癌診断用マーカーの定量に際しては、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞の項目において述べた方法（１）を使用できる。逆転写酵素は、本発明の大腸癌診断用マーカーの逆転写が可能であり、大腸癌診断用マーカーの定量が可能なものであれば特に限定されない。
　逆転写酵素は、標準化因子として使用するｍｉＲＮＡの逆転写及び定量に使用してもよい。逆転写酵素は、通常の定量的ＰＣＲに使用できるものであれば特に限定されない。
　本発明の大腸癌の診断用キットにおける取扱説明書は、本発明の大腸癌の診断用キットの使用方法が記載されている書面である。
　取扱説明書には、使用に際しての注意事項、トラブルシューティング、問い合わせ先等の情報がさらに記載されていてもよい。取扱説明書に記載される情報は、これらの例示に限定されない。このように、取扱説明書は本発明の効果が得られる程度の情報を最低限備えればよく、記載事項は特に限定されない。
　本発明の大腸癌の診断用キットの使用方法としては、上述の＜大腸癌の診断を補助する方法＞において述べた内容と同内容とすることができる。例えば、本発明の大腸癌の診断用キットにおけるプライマーを使用して、定量的ＰＣＲを行い、大腸癌診断用マーカーであるマイクロＲＮＡを定量し、その測定値を基準値と比較する等の使用方法が考えられる。ただし、本発明の大腸癌の診断用キットの使用方法はこの例示に限定されない。
＜大腸癌の治療方法＞
　本発明の大腸癌の治療方法においては、上述の本発明の大腸癌の診断を補助する方法、大腸癌に罹患している可能性を評価する方法、大腸癌の診断のための方法、大腸癌の検査方法、大腸癌の罹患の可能性を試験する方法、大腸癌の診断のためにデータを収集する方法、大腸癌の診断を補助するためのインビトロの方法、大腸癌の診断用キット、大腸癌の診断方法、大腸癌の判定方法及び大腸癌の試験方法からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上を使用して被検体を診断等する。
　本発明の大腸癌の治療方法の一態様においては、被検体が大腸癌に罹患していると診断した場合、大腸癌の治療薬を被検体に投与する。
　本発明の大腸癌の治療方法の一態様においては、被検体が大腸癌に罹患していると診断した場合、被検体に対して手術を行う。
　本発明の大腸癌の治療方法の一態様においては、被検体のｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡを阻害する。
　本発明の大腸癌の治療方法においては、被検体の診断は、被検体の大腸癌の罹患の有無の判定でもよく、被検体の大腸癌の罹患の有無の試験でもよい。
　大腸癌の治療薬は特に限定されない。大腸癌の治療薬としては、効能、薬効が臨床的に確認されている薬が好ましい。
　大腸癌の治療薬は、後述の本発明の大腸癌治療薬でもよく、抗がん剤でもよく、分子標的治療薬でもよい。ただし、大腸癌の治療薬はこれらの例示に限定されない。
　抗がん剤としては、フルオロウラシル、テガフール・ウラシル配合剤、テガフール・ギメラシル・オテラシウムカリウム配合剤、カペシタビン、イリノテカン、オキサリプラチン、トリフルリジン・チピラシル塩酸塩等が挙げられる。ただし、抗がん剤はこれらの例示に限定されない。本願の出願日において市販されていない抗がん剤であって、将来的に市販される可能性のある抗がん剤であっても、本発明の大腸癌の治療方法に使用できる可能性がある。
　分子標的治療薬としては、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、ラムシルマブ、アフリベルセプト、レゴラフェニブ等が挙げられる。ただし、分子標的治療薬はこれらの例示に限定されない。本願の出願日において市販されていない分子標的治療薬であって、将来的に市販される可能性のある分子標的治療薬であっても、本発明の大腸癌の治療方法に使用できる可能性がある。
　被検体がヒト以外の生物である場合においては、大腸癌の治療薬は、研究段階の薬剤物質でもよく、開発段階の薬剤物質でもよく、治験段階の薬剤物質でもよい。
　薬剤の投与方法は、特に限定されない。通常は、内服、点滴等が選択される。ただし、薬剤の投与方法はこれらの例示に限定されない。
　被検体に対して行う手術は、特に限定されない。通常は、内視鏡手術、外科的切除、放射線療法等が選択される。ただし、被検体に対して行う手術はこれらの例示に限定されない。本願の出願日において一般的ではない手術、治療法であって、将来的に行われるようになる可能性のある手術、治療法であっても、本発明の大腸癌の治療方法に使用できる可能性がある。
　本発明の大腸癌の治療方法においては、上述の本発明の大腸癌の診断を補助する方法、大腸癌に罹患している可能性を評価する方法、大腸癌の診断のための方法、大腸癌の検査方法、大腸癌の罹患の可能性を試験する方法、大腸癌の診断のためにデータを収集する方法、大腸癌の診断を補助するためのインビトロの方法、大腸癌の診断用キット、大腸癌の診断方法、大腸癌の判定方法及び大腸癌の試験方法からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上を使用する。
　そのため、本発明の大腸癌の治療方法によれば、高精度な診断結果に基づいて被検体を治療可能である。したがって、無駄な治療行為の実施を防ぐことができ、患者の負担を軽減でき、医療費を削減できる。
＜大腸癌治療薬＞
　本発明の大腸癌治療薬は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡの阻害剤を含む。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐの阻害剤としては、例えば、ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒが挙げられる。ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、マイクロＲＮＡのアンチセンスのヌクレオチドである。ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、センス鎖となるマイクロＲＮＡに結合し、当該マイクロＲＮＡの機能を阻害する。
　ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして、市販のキットを用いることができる。このような市販のキットとしては、例えば、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）が挙げられる。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐのｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含むｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒのカタログ番号は、４４６４０８４であり、そのＡｓｓａｙ ＩＤは、ＭＨ１２９６２である。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６のｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含むｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒのカタログ番号は、４４６４０８４であり、そのＡｓｓａｙ ＩＤは、ＭＨ１１４９０である。
　その他にも、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐの阻害剤としては、ＲＮＡｉ試薬が挙げられる。ただし、阻害剤は、これらの例示に限定されない。本願の出願日において一般的ではない阻害剤であっても、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐの発現を阻害できる分子であれば、本発明の大腸癌治療薬に使用できる可能性がある。
（作用機序）
　以上説明した本発明の大腸癌治療薬は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡの阻害剤を含む。後述の実施例に示すように、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡの発現量を阻害すると、大腸癌細胞の細胞運動能が低下する。そのため、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐの各マイクロＲＮＡの阻害剤は、大腸癌の治療薬候補としても有用である可能性が示唆されている。
　以上より、本発明の大腸癌治療薬によれば、大腸癌の治癒効果が得られる可能性がある。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡの阻害剤を含む、本発明の大腸癌治療薬は、大腸癌細胞の運動能の抑制剤であるとも言える。同様に、被検体のｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡを阻害する態様の大腸癌の治療方法は、大腸癌細胞の運動能の抑制方法であるとも言える。
　以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の記載によって限定されない。
＜略語の説明＞
　ｑＲＴ－ＰＣＲ：定量ＲＴ－ＰＣＲ
　ｍｅｄｉａｎ：中央値
　ＩＱＲ：四分位範囲（ｉｎｔｅｒｑｕａｒｔｉｌｅ ｒａｎｇｅ）
　Ｈｅａｌｔｈｙ：健常者
　ＣＲＣ：大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）患者
　ｓｔａｇｅ ０／Ｉ ＣＲＣ：ステージ０又はステージＩの早期大腸癌患者
　ｎ：検体数
　Ｐ　ｖａｌｕｅ：ｐ値
　ＡＵＣ：Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ＲＯＣ Ｃｕｒｖｅ
　９５％ＣＩ：９５％信頼区間
　表中、「Ｅ」は１０のべき乗を意味する。例えば、「１．９０Ｅ－０４」は、１．９０×１０－４を意味する。
＜コホートの構築＞
　まず、健常者２９９例及び大腸癌患者２２３例からなる全コホート：５２２例から、年齢及び性別をランダムにマッチさせた４１５例を抽出し、４１５例のコホートを以下の３つのコホート１、コホート２、コホート３に無作為に分類した。
　コホート１：健常者６例、及び、大腸癌患者３例からなる９例。
　コホート２：健常者１４０例、及び、大腸癌患者１４０例からなる２８０例。
　コホート３：健常者６３例、及び、大腸癌患者６３例からなる１２６例。
　ここで、コホート２及びコホート３における健常者の合計数は、２０３例である。また、コホート２及びコホート３における大腸癌患者において、進行度がステージ０又はステージＩである症例数の合計は６４例であった。
　そこで、下記のコホート４をさらに構築し、コホート４の解析により、早期大腸癌の検出感度、精度及び特異度を確認した。
　コホート４：健常者２０３例、及び、ステージ０又はステージＩの大腸癌患者６４例からなる２６７例。
＜ＲＮＡの抽出＞
　各コホートにおいて、尿から採取したサンプル中のＲＮＡを抽出した。
　採取直後より－８０℃にて凍結保存されていた尿：２００μＬをサンプルとし、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いて、添付のプロトコールに記載の条件にしたがって、サンプル中のｍｉＲＮＡを抽出した。
＜ｃＤＮＡの合成＞
　抽出したｍｉＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成した。ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて、添付のプロトコールに記載の条件にしたがって、ｃＤＮＡを合成した。
＜ｑＲＴ－ＰＣＲ＞
　合成したｃＤＮＡを用いてｑＲＴ－ＰＣＲを行った。ｑＲＴ－ＰＣＲにはＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ及び；７５００ Ｆａｓｔ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用した。
　ｑＲＴ－ＰＣＲのサーマルサイクル及び反応条件を表１に示し、Ａｓｓａｙ ＩＤ及び標的ｍｉＲＮＡの一覧及び各塩基配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図１は、本実施例の検証の概要を示すフロー図である。
　コホート１においては、ｍｉＲＮＡアレイ解析を行い、大腸癌患者の尿中で異常発現しているｍｉＲＮＡを複数、選定又は同定した（図２参照）。コホート１は網羅的解析コホートである（図１中、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｃｏｈｏｒｔ）。
　コホート２においては、コホート１におけるｍｉＲＮＡアレイ解析で同定された各ｍｉＲＮＡのうち、本発明の大腸癌診断用マーカーとなる３種のｍｉＲＮＡについて、それぞれの発現量をｑＲＴ－ＰＣＲ法で測定した。測定結果の多変量解析により有意な大腸癌診断マーカーを抽出し、遺伝子診断パネルを構築した。コホート２はトレーニングコホートである（図２中、Ｔｒａｉｎｉｎｇ ｓｅｔ）。
　コホート３においては、コホート２で構築した遺伝子診断パネルの精度を検証した。コホート３はバリデーションコホートである（図３中、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｅｔ）。
　コホート４においては、早期大腸癌の検出精度を主に解析した。
　以下、本実施例で行ったコホート１、コホート２、コホート３、コホート４の解析の具体的内容及び解析結果について順に説明する。
＜コホート１の解析＞
　コホート１において抽出されたｍｉＲＮＡを用いて、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ ｍｉＲＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）にて解析を行った。データの解析にはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いた。
　ｍｉＲＮＡアレイ解析の結果、大腸癌患者の尿中で有意に上昇又は低下している１１種類のｍｉＲＮＡを同定した。
＜コホート２の解析＞
　コホート１で選定した１１種類のｍｉＲＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲ法で測定した。表３は、１１種類のｍｉＲＮＡのうち、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐの３種類について測定した各ｍｉＲＮＡの発現量を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐのいずれにおいても、２－△Ｃｔの値、すなわち、これらの各遺伝子の発現量の測定値が大腸癌患者（ＣＲＣ）では健常者（Ｈｅａｌｔｈｙ）に比して大きかった。
　コホート２においては、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐの３種類の各マイクロＲＮＡの発現量の測定結果に対して単変量解析及び多変量解析を行って、健常者と大腸癌患者との間の有意差を検証した。結果を表４及び図３に示す。
　図３は、コホート２における各大腸癌診断用マーカーのＲＯＣ曲線を示す図である。図３においては、横軸に「１－特異度」をプロットし、縦軸に「感度」をプロットした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐの３種類のマイクロＲＮＡにおいても、Ｐ値が０．００１未満であった。このことから、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐの３種類について測定した各マイクロＲＮＡが、健常者と比較して大腸癌患者の尿中で有意に高発現していることを確認できた。
　加えて、多変量解析の結果から、ｍｉＲ－１２９－１－３ｐとｍｉＲ－５６６が、それぞれ独立した大腸癌マーカーとして抽出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５は、図３に示す各ＲＯＣ曲線のＡＵＣ及び９５％ＣＩを示す。
　表５に示すように、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐのそれぞれを大腸癌診断用マーカーとして作成した遺伝子診断パネルにより、健常者と大腸癌患者を良好に分離できることを確認した。
　表５に示すように、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の組み合わせを大腸癌診断用マーカーとして作成した遺伝子診断パネルにおいては、ＲＯＣ曲線（図３）のＡＵＣが０．８１１であり、特に良好な結果であった。
＜コホート３の解析＞
　コホート３の解析においては、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の２種類について各マイクロＲＮＡの発現量を測定した。次いで、各マイクロＲＮＡの発現量の測定結果に対して、単変量解析及び多変量解析を行って、健常者と大腸癌患者との間の有意差を検証した。結果を表６に示す。
　図４は、コホート３における各大腸癌診断用マーカーのＲＯＣ曲線を示す図である。表７は、図４に示す各ＲＯＣ曲線のＡＵＣ及び９５％ＣＩを示す。図４においては、横軸に「１－特異度」をプロットし、縦軸に「感度」をプロットした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、コホート３においても、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６のいずれにおいても、２－△Ｃｔの値、すなわち、これらの各遺伝子の発現量の測定値が大腸癌患者では健常者に比して大きかった。
　また、表６に示すように単変量解析の結果、Ｐ値が０．００１未満であった。このことから、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６が、健常者と比較して大腸癌患者の尿中で有意に高発現していることを確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、各マイクロＲＮＡのＲＯＣ曲線（図４）において、ＡＵＣがいずれも０．８０を超えた。このことから、各マイクロＲＮＡを大腸癌診断用マーカーとして作成した遺伝子診断パネルによれば、健常者と大腸癌患者を高い精度で分離できることが判った。
　特に、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の組み合わせを大腸癌診断用マーカーとして作成した遺伝子診断パネルにおいては、ＲＯＣ曲線（図４）のＡＵＣが０．８６８であった。このことから、健常者と大腸癌患者を特に高精度で分離でき、特に良好な結果が得られたことが判った。
　コホート３は、コホート１及びコホート２と独立した症例群である。よって、以上のコホート３の解析結果から、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６が、独立した大腸癌診断用マーカーとして有用であることが示唆された。
＜コホート４の解析＞
　コホート４の解析においては、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６について、各マイクロＲＮＡの発現量を測定した。結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８に示すように、コホート４においても、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６のいずれにおいても、２－△Ｃｔの値、すなわち、これらの各遺伝子の発現量の測定値が大腸癌患者においては健常者に比して大きかった。
　次いで、各マイクロＲＮＡの発現量の測定結果に対して単変量解析及び多変量解析を行って、健常者と大腸癌患者との間の有意差を検証した。結果を図５、図６、図７、表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示すように単変量解析及び多変量解析において、ｐ値がいずれも０．００１未満であった。このことから、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６が、健常者と比較して大腸癌患者の尿中で有意に高発現していることを確認できた。
　図５は、コホート４におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐの発現量を健常者とステージ０又はステージＩの大腸癌患者において比較して示す図である。
　図６は、コホート４におけるｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の発現量を健常者とステージ０又はステージＩの大腸癌患者において比較して示す図である。
　図５、図６に示すように、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６のいずれにおいても、各大腸癌診断用マーカーがステージ０又はステージＩの大腸癌患者において健常者と比較して有意に高発現していた。
　図７は、コホート４における各大腸癌診断用マーカーのＲＯＣ曲線を示す図である。表１０は、コホート４で取得したＲＯＣ曲線のＡＵＣ及び９５％ＣＩを示す。図７においては、横軸に「１－特異度」をプロットし、縦軸に「感度」をプロットした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示すように、マイクロＲＮＡをｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の組み合わせとしたＲＯＣ曲線（図７）において、ＡＵＣが０．８４５であった。このことから、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の組み合わせを大腸癌診断用マーカーとして作成した遺伝子診断パネルによれば、大腸癌の進行度がステージ０又はステージＩである早期の大腸癌患者の場合でも、健常者と早期の大腸癌患者を高精度で分離できることが判った。
＜ＲＯＣ曲線におけるカットオフ値、感度及び特異度の一例＞
　ＲＯＣ曲線におけるカットオフ値、感度及び特異度の一例を以下の記載及び表１１に示す。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐを単独で大腸癌診断用マーカーとして使用した場合、ＲＯＣ曲線におけるカットオフ値は、０．１７７以上とした。この場合、感度が８０．９％であり、特異度が６７．９％であった（表１１）。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６を単独で大腸癌診断用マーカーとして使用した場合、ＲＯＣ曲線におけるカットオフ値は、０．０５４とした。この場合、感度が８７．５％であり、特異度が５３．５％であった（表１１）。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐを単独で大腸癌診断用マーカーとして使用した場合、ＲＯＣ曲線におけるカットオフ値は、０．００４９９以上とした。この場合、感度が９５．３％であり、特異度が５４．２％であった（表１１）。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の組み合わせを大腸癌診断用マーカーとして使用した場合、ＲＯＣ曲線におけるカットオフ値は、０．１５２以上とした。この場合、感度が９０．６％であり、特異度が６５．５％であった（表１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の組み合わせを大腸癌診断用マーカーとして作成した遺伝子診断パネルによれば、健常者とステージ０又はステージＩの大腸癌患者の識別においてＡＵＣが０．８４５であり、特に良好であった（表１０）。多変量解析に基づいて、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６発現を使用したモデル式によれば、ステージ０又はステージＩの大腸癌を感度：９０．６％、特異度：６５．５％で判別できたことが判った（表１１）。
＜ホルマリン固定パラフィン包埋を用いた分析＞
　大腸癌２０例のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片を利用して、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の発現量を比較した。ＦＦＰＥは、内視鏡検査または外科手術により切除して得られたものを使用した。
　大腸癌組織とその周囲の正常組織からそれぞれｍｉＲＮＡを抽出し、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の発現量を測定した。また、測定結果に基づいて、単変量解析を行い、ｐ値を算出した。分析結果を表１２、図８、９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２、図８に示すように、大腸癌組織においては、近隣の正常組織と比較して、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐは有意に高発現していた。
　一方、表１２、図９に示すように、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６についても、有意差はないものの、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐと同様の傾向が認められた。ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６について、発現量の有意差が認められなかったことについては、検体数が２０と少ないことが原因であると考えられる。
＜大腸癌細胞株を用いた分析＞
　大腸癌細胞株を利用して、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の発現量を分析した。大腸癌細胞株として、２種類の大腸癌細胞株、すなわち、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６を用いた。具体的には、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６を培養し、（ｉ）培養液中のエクソソーム、（ｉｉ）培養液、（ｉｉｉ）細胞本体の３つからそれぞれサンプルを採取した。これらのサンプルについて、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の発現量（２－△Ｃｔ）を測定した。ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐの発現量（２－△Ｃｔ）を縦軸に、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の発現量（２－△Ｃｔ）を横軸にプロットしたものを図１０に示す。
　図１０中、（ｉ）はエクソソーム中の発現量、（ｉｉ）は培養液中の発現量、（ｉｉｉ）は細胞中の発現量を示す。
　図１０に示すように、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６は、前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれのサンプルからも検出可能であった。加えて前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれのサンプルにおいても、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６は、類似した発現傾向を示した。
　以上の解析結果から、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐは、大腸癌診断用マーカーとして有用であることが示唆された。加えて、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の組み合わせを大腸癌診断用マーカーとすれば、進行度が早期の大腸癌である場合においても高感度に検出でき、健常体と分離できる可能性が示唆された。
＜大腸癌診断用マーカーの阻害について＞
　ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６にｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の阻害剤を投与した。ここで、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の阻害剤として、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（カタログ番号：４４６４０８４、Ａｓｓａｙ ＩＤ：ＭＨ１１４９０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用した。また、ネガティブコントロールとして、Ａｎｔｉ－ｍｉＲ ｍｉＲＮＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ＃１（カタログ番号：ＡＭ１７０１０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用した。その後、ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙを施行し、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６の細胞運動能を評価した。結果を図１１、１２に示す。
　図１１、１２に示すように、ＳＷ４８０とＨＣＴ１１６の両方において、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の阻害剤を投与する場合、細胞運動能が有意に低下していた。
　ここで、ｍｉＲＴａｒＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｔａｒｂａｓｅ．ｍｂｃ．ｎｃｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ／）のｍｉＲＮＡのターゲット候補のデータを利用し、Ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ解析を行った。結果を図１３、１４で示す。
　図１３、１４中、上位１０個を記載した。両ｍｉＲＮＡに共通するＧｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ　ｔｅｒｍを下線で示した。図１３、１４に示すように、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６はターゲット遺伝子の機能に共通した点が多い。このように、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６は、互いに類似した分子生物学的機能を具備する可能性が示唆された（図１３、１４）。
　したがって、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐを阻害することでも、同様に細胞運動能が有意に低下する可能性があることから、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐの阻害剤も、大腸癌治療薬として有用である可能性がある。
　本発明によれば、大腸癌の罹患の有無を高精度で判別し、かつ、早期の大腸癌を高感度で検出できる。

Claims (20)

  1. 　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡである、大腸癌診断用マーカー。
  2. 　前記マイクロＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－５６６の組み合わせである、請求項１に記載の大腸癌診断用マーカー。
  3. 　ヒトの体液に含まれている、請求項１又は２に記載の大腸癌診断用マーカー。
  4. 　大腸癌の診断を補助する方法であって、
    　被検体から採取したサンプル中の、請求項１～３のいずれか一項に記載の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、
    　前記発現量を基準値と比較する、方法。
  5. 　前記発現量を基準値と比較するために、前記サンプル中の下記ｍｉＲＮＡを標準化因子として前記発現量を標準化する、請求項４に記載の方法。
    　ｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐのいずれか一方又は両方。
  6. 　前記大腸癌の進行度が、ステージ０又はステージＩである、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 　大腸癌の診断のためにデータを収集する方法であって、
    　被検体から採取したサンプル中の、請求項１～３のいずれか一項に記載の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定する、方法。
  8. 　前記発現量を測定した後に、前記サンプル中の下記ｍｉＲＮＡを標準化因子として前記発現量を標準化する、請求項７に記載の方法。
    　ｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐのいずれか一方又は両方。
  9. 　前記大腸癌の進行度が、ステージ０又はステージＩである、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 　大腸癌の診断のために使用するキットであって、
    　請求項１～３のいずれか一項に記載の大腸癌診断用マーカーと特異的なプライマーを備える、大腸癌の診断用キット。
  11. 　前記マイクロＲＮＡをサンプルから抽出する抽出用試薬、前記マイクロＲＮＡのｃＤＮＡを合成するｃＤＮＡ合成用試薬、サンプル採取用容器、標準化因子となるｍｉＲＮＡと特異的な標準化用プライマー、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及び取扱説明書からなる群から選ばれる少なくとも一つをさらに備える、請求項１０に記載の大腸癌の診断用キット。
  12. 　前記大腸癌の進行度が、ステージ０又はステージＩである、請求項１０又は１１に記載の大腸癌の診断用キット。
  13. 　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡの阻害剤を含む、大腸癌治療薬。
  14. 　被検体のｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６及びｈｓａ－ｍｉＲ－５９８－５ｐからなる群から選ばれる少なくとも一つのマイクロＲＮＡを阻害する、大腸癌の治療方法。
  15. 　大腸癌を診断する方法であって、被検体から採取したサンプル中の、請求項１～３のいずれか一項に記載の大腸癌診断用マーカーの発現量を測定し、前記発現量を基準値と比較する、大腸癌の診断方法。
  16. 　前記発現量を基準値と比較するために、前記サンプル中のｍｉＲＮＡを標準化因子として前記発現量を標準化する、請求項１５に記載の大腸癌の診断方法。
  17. 　前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６６９及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７５６－５ｐのいずれか一方又は両方である、請求項１６に記載の大腸癌の診断方法。
  18. 　前記大腸癌の進行度が、ステージ０又はステージＩである、請求項１５に記載の大腸癌の診断方法。
  19. 　大腸癌を治療する方法であって、請求項１５に記載の大腸癌の診断方法を使用して被検体を診断し、前記被検体が大腸癌に罹患していると診断した場合、大腸癌の治療薬を前記被検体に投与する、大腸癌の治療方法。
  20. 　大腸癌を治療する方法であって、請求項１５に記載の大腸癌の診断方法を使用して被検体を診断し、前記被検体が大腸癌に罹患していると診断した場合、前記被検体に対して手術を行う、大腸癌の治療方法。
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