CN116083583A - miRNA-483-5p在制备胰腺癌肝转移诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

miRNA-483-5p在制备胰腺癌肝转移诊断试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体是miRNA‑483‑5p在制备胰腺癌肝转移诊断试剂盒中的应用。本发明中的miRNA‑483‑5p或其与CA125及糖尿病病史联合，针对胰腺癌患者是否发生肝转移进行早期诊断，其可发现目前临床上使用的CT和MRI等影像学检查手段无法明确探知肝转移灶的情况下(隐匿性/微小肝转移)，对胰腺癌是否发生了肝转移进行诊断，不仅提高了诊断的准确性，而且为肝转移的临床前发现提供了依据，对于肝转移灶的早期诊断和医疗成本的节约都具有重要意义。

Description

miRNA-483-5p在制备胰腺癌肝转移诊断试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地说，是miRNA-483-5p在制备胰腺癌肝转移诊断试剂盒中的应用。
背景技术
胰腺癌恶性程度高，早期诊断困难，预后极差。约80％-85％的患者在疾病晚期或者出现转移相关症状后才获得诊治。其中，绝大多数患者在诊断时已发生了肝转移，失去了手术切除的最佳时期。此外，超过60％的患者在肿瘤切除术后的两年内复发并伴有肝转移。可见肝转移在胰腺癌患者中很常见，是导致患者预后差的关键因素。
尽管如此，目前临床上对微小性，尤其是隐匿性肝转移灶的准确诊断仍存在很大困难。影像学检查(如MRI、增强CT)是目前判断胰腺癌肝转移最为常用的方式，但上述手段对微小转移灶的敏感性欠佳，对于隐匿性肝转移更是无从判定。造成很多已发生肝脏转移的患者出现漏诊，仅能在临床随访后发现，无法为临床治疗方式的选择提供依据，导致治疗效果不佳。
因此，临床上迫切需要高敏感性的检测手段来早期判断胰腺癌肝转移，例如，采用高通量测序的方法检测组织中的基因组，开发潜在的分子生物标志物，以克服影像学诊断方法的缺陷，在疾病早期评价胰腺癌患者发生肝转移的风险，提高肝转移的早诊率，以便尽早干预治疗，改善患者预后。
多项研究认为胰腺癌的预后与microRNA(miRNA)相关，其异常表达在胰腺癌细胞的起始、增殖、转移和化学耐药性中发挥重要作用，提示了miRNA可能作为胰腺癌肝转移的诊断标志物。由于miRNA具有很强的抗降解能力，在组织、血浆和体液(如血清、尿液和母乳)中均可检测到miRNA的稳定表达，因此它们被认为是一种强大的诊断工具，但其在胰腺癌肝转移中的作用尚未得到研究。对miRNA相关基因组学的分析研究或许能为胰腺癌伴肝转移患者的诊断提供更加便捷高效的新方法。
就技术而言，miRNA的检测本质上是一种组织RNA的qPCR检测，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点，现今已越来越多地被应用于临床检验技术中。
miRNA-483-5p(miRBase编号：MIMAT0004761)，其序列如下所示：AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG(SEQ ID NO:1)，该miRNA在人、小鼠、犬、牛等多种物种中广泛存在，具有很强的保守性。目前尚无人类miRNA-483-5p与胰腺癌肝转移相关性的研究报道。
糖尿病是一组因胰岛素绝对或相对不足引起血糖升高的代谢异常疾病群。早在120多年前，胰腺癌与糖尿病的密切关系即已被关注。糖尿病与胰腺癌具有双向的相互作用，关系较为复杂，一方面糖尿病可能促进胰腺癌发生，另一方面胰腺癌也可能诱发糖尿病。有研究表明：提示高血糖可能通过增强肿瘤的侵袭性和转移能力而参与胰腺癌的恶性进展。
CA125是1981年由Bast等从上皮性卵巢癌抗原检测出可被单克隆抗体OC125结合的一种糖蛋白，来源于胚胎发育期体腔上皮，在正常卵巢组织中不存在，因此最常见于上皮性卵巢肿瘤(浆液性肿瘤)患者的血清中，其诊断的敏感性较高，但特异性较差。黏液性卵巢肿瘤中不存在。近年来，有研究发现CA125与胰腺癌的转移情况相关，血清中CA125高表达，预示着胰腺癌患者存在转移的可能性。
目前为止，尚未见胰腺癌组织miRNA联合糖尿病史及CA125情况进行胰腺癌肝转移预测情况的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于提供胰腺癌肝转移诊断标志物，也在于提供miR-483-5p的新用途，即作为胰腺癌肝转移诊断标志物在制备胰腺癌肝转移诊断试剂盒中的应用。
本发明的主要技术方案如下：
本发明在前期临床研究中证实，miR-483-5p在胰腺癌组织中的高表达具有肝转移特征特异性。即在未发生肝转移的胰腺癌穿刺样本中，miR-483-5p的表达量较低；而在已经发生肝转移的胰腺癌穿刺样本中，miR-483-5p的表达量较高。
为了寻找胰腺癌肝转移早期诊断相关的miRNA标志物，本发明前期收集20例在超声内镜引导下细针穿刺抽吸术(EUS-FNA)获得的胰腺癌组织作为本研究的发现队列，其中10例伴有肝转移，10例不伴肝转移，进行高通量Small RNA测序，筛选在胰腺癌肝转移组中，显著上调的miRNA(图1)。随后收集胰腺癌伴有和不伴有肝转移的患者EUS-FNA穿刺样本，对上述miRNA进行了Real-Time PCR验证。结果发现：miR-6734、miR-483-5p、miR-548q、miR-548ar四种miRNA在胰腺癌伴肝转移的胰腺癌组织中的表达量显著上调(以未发生肝转移组胰腺癌组织中的上述miRNA表达量作为对照)。通过与一系列临床病理特征参数(包括：性别、年龄、饮酒史、吸烟史、CA125、CA199、CEA、糖尿病史、高血压史、高血脂史、黄疸情况、腹水情况、肿瘤部位等)进行多元logistic回归分析统计分析，发现miR-483-5p与CA125以及糖尿病史进行联合分析(后续构建了一个基于miR-483-5p、CA125、糖尿病史三个指标的风险因子——Cmi)，对胰腺癌肝转移状况具有很好的诊断效能，提示Cmi可作为胰腺癌肝转移诊断的标志物。
本发明是基于miRNA定量PCR检测，与CA125及糖尿病史联合分析的胰腺癌肝转移诊断试剂盒，可以通过定量PCR技术准确计算胰腺占位穿刺组织中miR-483-5p的含量，进而与CA125及糖尿病史联合分析，可预测胰腺癌肝转移情况。
本发明的第一方面，提供miR-483-5p作为诊断标志物在制备胰腺癌肝转移早期诊断试剂盒中的应用，所述的miR-483-5p的序列如SEQ ID NO:1所示(表1)：
表1
Figure BDA0004060894730000031
本发明通过Small RNA测序，筛选出特定miRNA，并进行了临床样本的采集和验证，发现hsa-miR-483-5p在胰腺癌肝转移组织中的含量较其他未发生肝转移患者胰腺癌组织中是显著升高的，且具有明显的统计学意义。说明上述miRNA在胰腺癌组织中的变化，可以作为胰腺癌肝转移诊断的分子标记。
所述的早期诊断是指在胰腺癌已发生肝转移等微转移灶，但是CT/MR等手段难以发现转移灶时的诊断。
进一步的，所述的应用，具体是指检测生物样品中miR-483-5p的表达量的试剂在制备胰腺癌肝转移早期诊断试剂盒中的应用。
进一步的，所述的生物样品选自：经过超声内镜穿刺所获得的胰腺癌组织。
进一步的，所述的试剂盒包括：对miR-483-5p具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物等。
本发明还提供用于检测上述miR-483-5p的寡聚核苷酸，所述的寡聚核苷酸包括：反转录引物、PCR上游引物、PCR下游引物。
在本发明的一个优选实施例中，检测上述miR-483-5p及内参U6表达量的寡聚核苷酸的具体序列如表2所示：
表2
Figure BDA0004060894730000041
本发明反转录引物、PCR上游引物、PCR下游引物是根据已知的microRNAs库(http://www.mirbase.org/)检索到的成熟体序列进行引物设计的。
本发明还提供一种利用上述寡聚核苷酸检测所述miR-483-5p表达量的方法，也即所述的早期诊断胰腺癌肝转移试剂盒的具体检测方法，包括如下步骤：
取EUS-FNA穿刺样本中的总RNA，加入特异性反转录引物、5×PrimeScript Buffer(for Real Time)、PrimeScript RT Enzyme Mix I、RNase Free dH2O(TAKARA公司)反转录成cDNA，以所反转录的cDNA为模板向反应体系中加入PCR上游引物、PCR下游引物，通过反转录联合聚合酶链式反应(RT-PCR)检测miR-483-5p的表达量。确认miR-483-5p的表达量是否发生上调，若发生上调，即可初步确定该受试者为已发生肝转移的胰腺癌患者。所述样本，优选人的通过EUS-FNA穿刺所获得的胰腺癌样本。
本发明的第二方面，提供一种胰腺癌肝转移早期诊断试剂盒，所述的试剂盒为检测生物样品中hsa-miR-483-5p表达量的试剂盒，所述的试剂盒包含上述表2中寡聚核苷酸的组合(A1)：SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:4。
进一步的，所述的试剂盒还包含进行内参U6的进行检测的寡核苷酸组合(A2)：SEQID NO:5-SEQ ID NO:7。
更进一步的，所述的试剂盒包含以下组分：
A.反转录引物，1管10uM浓度，100uL；
B.Real-Time PCR扩增上游引物，1管10uM浓度，100uL/管；
C.Real-Time PCR扩增下游引物，1管10uM浓度，100uL/管。
本发明的第三方面，提供miR-483-5p、CA125和糖尿病史在制备胰腺癌肝转移早期诊断试剂盒中的应用。
进一步的，所述的试剂盒中，所述的miR-483-5p表达水平，可以与CA125及糖尿病史联合，计算得到胰腺癌肝转移诊断的风险因子Cmi，其计算公式为：
Cmi＝-1.869+1.253*糖尿病史+0.004*CA125+0.918*hsa-miR-483-5p
其中诊断界值为-0.6968，CA125为血清ELISA法得到的具体检测数值(单位为U/L)，糖尿病史根据有无赋值为1或者0；hsa-miR-483-5p为受试人群的胰腺占位组织进行总microRNAs抽提、反转录和PCR扩增，与U6的Ct值作为对照，计算得到的-△Ct值。计算Cmi的具体数值高于-0.6968，诊断为已发生肝转移，低于-0.6968则未发生肝转移。
所述的“胰腺癌肝转移阳性”，其诊断标准为：(1)基于EUS获得组织标本且病理学诊断恶性肿瘤。(2)6个月内患者出现临床症状的快速恶化且新的影像学检查提示病情进展，如发现远处转移病灶、肿块包绕大血管、PET-CT检查提示恶性淋巴结等。(3)发生了肿瘤相关的死亡。所述的“胰腺癌肝转移阴性”，其诊断标准为：随访6个月未出现上述任何情况。
本发明的第四方面，提供一种胰腺癌肝转移早期诊断试剂盒，所述的试剂盒包含检测胰腺癌组织中hsa-miR-483-5p表达水平、血清中的CA125表达量以及糖尿病史的试剂。
使用本发明的试剂盒可以早期诊断尚未发生明显影像学改变的隐匿性/微小肝转移胰腺癌病例。
本发明可用于对胰腺癌肝转移患者进行早期诊断，本发明通过检测hsa-miR-483-5p，对相应胰腺癌人群中胰腺病变组织中miR-483-5p含量的检测，结合患者血清CA125水平及糖尿病史，早期诊断胰腺癌患者肝转移的状况，以期及早进行干预或治疗，最大限度的延长患者生存期，降低死亡率。
本发明还提供一种利用上述试剂盒进行胰腺癌肝转移早期诊断的方法，包括如下步骤：
将EUS-FNA穿刺获取的胰腺占位组织，以miRNA kit抽提总microRNAs，利用试剂盒中的反转录引物反转录后，测定受试者穿刺组织中hsa-miR-483-5p的含量，以U6的Ct值作为内参，计算-△Ct值，进而与CA125及糖尿病史结合计算Cmi，与-0.6968进行比较，鉴定是否发生上调。
进一步的，取任意受试人群的胰腺占位组织进行总microRNAs抽提、反转录和PCR扩增，与U6的Ct值作为对照，计算-△Ct值，与CA125及糖尿病史进行联合分析，计算风险因子Cmi的具体数值(Cmi＝-1.869+1.253*糖尿病史+0.004*CA125+0.918*hsa-miR-483-5p)，以-0.6968作为界值，计算Cmi的具体数值高于-0.6968，即可初步确定为已发生肝转移的胰腺癌患者，低于-0.6968则未发生肝转移，进一步可通过影像学进行监测，便于对受试者进行早期干预。
本发明优点在于：
本发明中的miRNA与CA125及糖尿病史联合，针对胰腺癌患者是否发生肝转移进行早期诊断，其可发现目前临床上使用的CT和MRI等影像学检查手段无法明确探知肝转移灶的情况下(隐匿性/微小肝转移)，对胰腺癌是否发生了肝转移进行诊断，不仅提高了诊断的准确性，而且为肝转移的临床前发现提供了依据，对于肝转移灶的早期诊断和医疗成本的节约都具有重要意义。该miRNA或其与CA125及糖尿病病史的组合，可在制备诊断肝转移的试剂或工具中应用。可对于胰腺癌患者是否发生肝转移进行早期诊断。
附图说明
图1.通过Small RNA测序，筛选在肝转移胰腺癌组织中显著上调的miRNA，共纳入20个胰腺癌组织样本，其中伴有肝转移和不伴有肝转移的样本各10例。通过筛选发现，miR-483-5p是log2FC>2，且p＜0.05的miRNA之一。
图2.通过实时定量PCR分析，确证miR-483-5p在伴有肝转移组胰腺癌组织中显著高表达(P＝0.0018)。
图3.通过实时定量PCR分析，有肝转移胰腺癌组织中hsa-miR-483-5p的-△Ct值，显著高于非肝转移组。
图4.以-0.6968为Cmi的界值，对伴有和不伴有肝转移的胰腺癌组织进行区分，敏感性为93.85％，特异性为67.24％。
图5.伴有隐匿性肝转移(即进行组织采集时未发现肝转移，但后期3个月内进行影像学检查，发现肝转移的患者)组的12例胰腺癌患者的胰腺癌组织中，Cmi的数值均高于前期实验设定的界值(-0.6968)，提示基于Cmi标志物组合的检测对于隐匿性胰腺癌肝转移仍具有良好的诊断和预测效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：伴有肝转移胰腺癌患者胰腺癌组织中高表达miRNA的筛选
为寻找伴有肝转移的胰腺癌患者胰腺癌组织中，高表达的miRNA，本发明人前期收集10例胰腺癌肝转移患者和10例胰腺癌非肝转移患者的胰腺癌组织，利用Small RNA测序技术，筛选出潜在的显著变化的miRNAs(见图1)。
经过Real-Time PCR验证，发现hsa-miR-483-5p的表达改变与测序结果一致。随后在对临床上伴有肝转移和不伴有肝转移的胰腺癌组织中检测后发现，hsa-miR-483-5p在伴有肝转移胰腺癌组织中表达量显著上调(见图2)。
实施例2：本发明试剂盒的制备
本发明试剂盒组成成分为：
A.特异性反转录引物2管10uM浓度，200uL；
B.Real-Time PCR扩增上游引物(见表2)2管(A1、A2)10uM浓度，200uL/管；Real-Time PCR扩增下游引物(见表2)1管10uM浓度2mL/管；
该microRNA特异性反转录引物为根据成熟microRNA序列添加固定Loop(环结构)片段，再由美国invitrogen公司进行合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用DEPC H2O溶解，终浓度为10μM。
特异性的microRNA上下游引物：根据成熟microRNAs特异性序列添加经验序列并通过软件调节GC含量使Tm值与下游引物一致。下游引物为反转录引物上的固定序列，引物全部由美国invitrogen公司合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用DEPC H2O溶解，终浓度为10μM。
实施例3：本发明试剂盒的检测方法
(一)、采集胰腺癌组织样本、抽提microRNAs与反转录：
验证用胰腺癌组织样本从上海长海医院消化内科采集，其中，65例伴有肝转移的胰腺癌组织(通过EUS-FNA穿刺获得)作为病例组，58例未发生肝转移的胰腺癌组织(通过EUS-FNA穿刺获得)作为对照组。提取组织总microRNAs后检测一系列芯片结果中提示上调的microRNAs，其中，hsa-miR-483-5p显示出在肝转移组胰腺癌组织中明显升高的趋势，即在伴有肝转移的胰腺癌组织中，表达量显著上调，表现为伴有肝转移胰腺癌组织中hsa-miR-483-5p的-△Ct值，显著高于非肝转移组(图3)。
纳入标准：
1、受试者年龄18-75岁，男女不限
2、影像学检查(B超、CT或MRI)诊断或怀疑胰腺实性占位
3、病灶大于1cm
4、需要行EUS-FNA穿刺
5、受试者自愿签署书面患者知情同意书
排除标准：
必须对受试者按以下排除标准进行筛查。若受试者“符合”以下任一条排除标准，则为不合格，受试者不能参加本研究。
1.妊娠期妇女
2.胰腺囊性病变
3.不能暂停抗凝/抗血小板治疗
4.不能或拒绝签署知情同意书
5.存在凝血障碍(PLT<50×103/μL,INR>1.5)
6.严重心肺功能障碍，不能耐受静脉麻醉风险
7.有精神疾病史
8.有其它不适合FNA穿刺的医学情况
对符合上述标准的患者进行EUS-FNA穿刺，采集胰腺胰腺占位组织，置于液氮中，备后续进行总microRNAs抽提。
应用QIAGEN的microRNA kit提供的标准实验步骤提取组织中的总小片段RNA。
将抽提出的小片段RNA反转成cDNA：10×PrimeScriptTMBuffer(for Real Time)1.5μL、PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 0.5μL(TaKaRa)、反转录引物A/B2μL、前述步骤中富集的总小片段RNA 10uL、DEPC H2O 1μL补足总体积达到15μL。反转录步骤：37℃ 20min，85℃5min。
(二)、目的基因的Real-Time PCR扩增：
采用TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTM试剂和Applied Biosystems的：实时定量PCR仪，进行PCR反应：
Figure BDA0004060894730000091
主要实验条件为：退火温度56℃，40个cycles(循环)
本试剂盒采用检测样本的抽提miRNA进行PCR扩增，每一个样品均进行3复孔重复，以U6作为内参进行校对，通过-△Ct法计算出检测样品中hsa-miR-483-5p表达水平的相对定量值。并通过t检验的方法计算该检测样品中的hsa-miR-483-5p是否存在异常表达(图2)。
实施例4：伴有或不伴有肝转移胰腺癌患者胰腺癌组织中Cmi水平检测
根据前述实验方法，选取123例胰腺癌患者(其中，65例伴有肝转移，58例未发生肝转移)的EUS-FNA穿刺胰腺癌组织，通过与一系列临床病理特征参数(包括：性别、年龄、饮酒史、吸烟史、CA125、CA199、CEA、糖尿病史、高血压史、高血脂史、黄疸情况、腹水情况、肿瘤部位等)进行多元logistic回归分析统计分析，发现miR-483-5p与CA125以及糖尿病史进行联合分析(后续构建了一个基于miR-483-5p、CA125、糖尿病史三个指标的风险因子——Cmi)，对胰腺癌肝转移状况具有很好的诊断效能。
确定Cmi＝-1.869+1.253*糖尿病史+0.004*CA125+0.918*hsa-miR-483-5p，其中确定的诊断界值为-0.6968，CA125为具体检测数值(单位为U/L)，糖尿病史根据有无赋值为1或者0。经过检测后，发现伴有肝转移组Cmi水平显著升高(P<0.05，其中未发生肝转移组，Cmi的平均值为-1.258，而发生肝转移组，Cmi的平均值为1.325，图4)。我们取-△Ct＝-0.6968作为判断有无肝转移的界值，确定在该界值下，判断胰腺癌肝转移的敏感性为93.85％，特异性为67.24％(图3)。
实施例5：12例伴有隐匿性肝转移胰腺癌患者hsa-miR-483-5p表达水平检测
为了测试该风险因子Cmi对于隐匿性胰腺癌肝转移的预测价值，本发明收集了12例隐匿性肝转移患者的胰腺癌组织(即前期进行EUS-FNA穿刺时，CT或MRI未发现肝转移，但三个月内随访发现肝转移)，进行上述风险因子的测定，结果发现：上述12例胰腺癌组织样本中，Cmi的数值均高于-0.6968的界值，提示Cmi对于上述隐匿性肝转移的胰腺癌病例，具有很好的预测价值(图5)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.miR-483-5p作为诊断标志物在制备胰腺癌肝转移早期诊断试剂盒中的应用，所述的miR-483-5p的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是指检测生物样品中miR-483-5p的表达量的试剂在制备胰腺癌肝转移早期诊断试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的生物样品为胰腺癌组织。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括：对miR-483-5p具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括检测miR-483-5p表达量的反转录引物、PCR上游引物、PCR下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:4所示。
6.miR-483-5p、CA125和糖尿病史在制备胰腺癌肝转移早期诊断试剂盒中的应用。
7.一种胰腺癌肝转移早期诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含检测胰腺癌组织中hsa-miR-483-5p表达水平、血清中的CA125表达量以及糖尿病史的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，miR-483-5p表达水平，与CA125及糖尿病病史联合，计算得到胰腺癌肝转移诊断的风险因子Cmi，其计算公式为：
Cmi＝-1.869+1.253*糖尿病史+0.004*CA125+0.918*hsa-miR-483-5p；
其中，CA125为血清ELISA法得到的具体检测数值，单位为U/L；糖尿病史根据有无赋值为1或者0；hsa-miR-483-5p为受试人群的胰腺占位组织进行总microRNAs抽提、反转录和PCR扩增，与U6的Ct值作为对照，计算得到的-△Ct值；诊断界值为-0.6968，计算Cmi高于-0.6968，诊断为已发生胰腺癌肝转移。
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