CN111518908A - 尿液前列腺癌标志物组合及其在制备精准诊断试剂中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种尿液前列腺癌标志物组合及其在制备精准诊断试剂中的用途。本发明的标志物组合中,包括属于非编码RNA的基因、融合基因等。在尿液样品中,这些基因可呈现在前列腺癌患者以及正常患者中的表达差异,而对这些基因进行联合检测,可以呈现精准的检测结果,特异性和灵敏度非常理想。
Description
技术领域
本发明属于疾病诊断技术领域,更具体地,本发明涉及尿液分子标志物 及其在制备精准诊断前列腺癌的试剂中的用途。
背景技术
前列腺癌在欧美国家男性中是最常见的恶性肿瘤,发病率居首位。世界 权威癌症统计数据杂志《CA Cancer J Clin》统计表明,美国2017年新发前 列腺癌病例161,360人,占男性恶性肿瘤发病率第一位(19%),死亡率第三位 (8%)。中国前列腺癌的发病率虽低于西方国家,但由于环境污染、饮食结构 西方化及人口老龄化等因素,近年来前列腺癌的发病率有逐年上升趋势,尤 其在经济发达地区发病率迅速升高,已位列中国男性癌症发病率的第六位, 成为威胁中国老年男性健康的重要原因之一。
早诊早治可显著提高前列腺癌的临床预后并降低死亡率。目前前列腺癌 的早期诊断主要依赖于前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)和经 直肠超声检查。目前血清PSA是筛选前列腺癌最重要的参考指标,然而PSA 作为前列腺癌的筛查工具并不具有特异性,从而导致前列腺穿刺活检阴性率 较高,也使得重复穿刺数增加。尤其是PSA处于“灰区”(4~10ng/mL)时,前 列腺癌的检出率仅为25%左右,活检阴性率占70~80%。不必要的活检增加 了前列腺出血及感染的风险,增加了患者焦虑情绪和穿刺时的痛苦,同时也 导致了部分低危前列腺癌的过度治疗。而部分PSA水平不高的患者仍可罹 患前列腺癌。因此,寻找一种更加精准的肿瘤标志物以供临床筛查、诊疗刻 不容缓。
研究发现,前列腺癌患者尿液中存在一些与肿瘤相关的生物标志物分 子,因此采集尿液更为方便,尿液检测是一种无创性技术。但是,之前报道 的检测方法常常需要直肠指检(DRE)或前列腺按摩以使得足够前列腺衍生的 细胞能够进入尿液,同时需要离心分离尿液沉渣,存在操作繁琐,耗时长等 问题。另外操作直肠指检会导致病人的不适,甚至炎症,极大影响了这些检 测方法的普及和大面积推广。因此,迫切需要新的、无创伤性的检测方法, 以帮助对前列腺疾病的诊断、预后、监测或治疗选择。
发明内容
本发明通过分析临床受试者晨尿初始段尿液样品中的多种基因标志物, 开发了一种简洁的、非入侵性的测试方法,用于精准诊断前列腺癌患者。
在本发明的第一方面,提供一种用于检测前列腺癌的试剂盒,包括:特 异性检测人PCA3基因(非编码RNA)的检测试剂;特异性检测人MALAT1 基因(非编码RNA)的检测试剂;特异性检测人TMPRSS2-ERG基因(融合基因) 的检测试剂;特异性检测人SChLAP1基因(非编码RNA)的检测试剂;特异 性检测人TTTY15-USP9Y基因(融合基因)的检测试剂;特异性检测人DLX1 基因的检测试剂;和特异性检测人HOXC6基因的检测试剂;其中,所述的 检测前列腺癌所针对的待测样本为尿液。
在一个优选例中,所述特异性检测所述基因的检测试剂包括选自下组的 试剂:特异性扩增所述基因的引物或特异性识别所述基因的探针;较佳地, 特异性检测所述基因的检测试剂为特异性扩增所述基因的引物。
在另一优选例中,所述特异性检测人PCA3基因的检测试剂为SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示核苷酸序列的引物。
在另一优选例中,所述特异性检测人MALAT1基因的检测试剂为SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示核苷酸序列的引物。
在另一优选例中,所述特异性检测人TMPRSS2-ERG基因的检测试剂为 SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的引物。
在另一优选例中,所述特异性检测人SChLAP1基因的检测试剂为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的引物。
在另一优选例中,所述特异性检测人TTTY15-USP9Y基因的检测试剂为 SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16所示核苷酸序列的引物。
在另一优选例中,所述特异性检测人DLX1基因的检测试剂为SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示核苷酸序列的引物。
在另一优选例中,所述特异性检测人HOXC6基因的检测试剂为SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示核苷酸序列的引物。
在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括:特异性检测内参基因的检测 试剂;较佳地,所述的特异性检测内参基因的检测试剂是针对人KLK3基因 的引物;更佳地,所述的特异性检测内参基因的检测试剂是:SEQ ID NO:9 和SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的引物。
在另一优选例中,所述的内参基因用于指示DNA提取和/或检测的质量。
在另一优选例中,所述的前列腺癌为中国患者罹患的前列腺癌。
在另一优选例中,所述的试剂盒是应用于对中国患者进行前列腺癌的筛 查、检测或诊断的试剂盒。
在另一优选例中,所述的引物各自独立地存在于所述试剂盒中,或被混 合形成混合液。
在另一优选例中,所述的尿液为全天不同时间点的尿液;较佳地,所述 的尿液为晨尿;更佳地,所述的尿液为晨尿首段25-40mL尿液样品。
在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括选自下组的试剂(但不限于): 尿液保存液,RNA捕获液,洗涤液,洗脱液,磁珠,DNA聚合酶(如Taq酶), dNTPs,质控品、阴性对照和/或说明书。
在本发明的另一方面,提供人PCA3基因、人MALAT1基因、人 TMPRSS2-ERG基因、人SChLAP1基因、人TTTY15-USP9Y基因、人DLX1 基因和人HOXC6基因的用途,用于制备检测前列腺癌的试剂;其中,所述 的检测前列腺癌所针对的待测样本为尿液;较佳地,所述的尿液为晨尿。
在本发明的另一方面,提供特异性检测人PCA3基因、人MALAT1基因、 人TMPRSS2-ERG基因、人SChLAP1基因、人TTTY15-USP9Y基因、人DLX1 基因和人HOXC6基因的试剂的用途,用于制备检测前列腺癌的试剂盒;其 中,所述的检测前列腺癌所针对的待测样本为尿液;较佳地,所述的尿液为 晨尿。
在一个优选例中,特异性检测所述基因的检测试剂包括选自下组的试 剂:特异性扩增所述基因的引物或特异性识别所述基因的探针;较佳地,特 异性检测所述基因的检测试剂为特异性扩增所述基因的引物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显 而易见的。
附图说明
图1、分子标志物在不同时间点收集的匹配尿液中具有对等的含量。其 中,FirstMorning Void:早晨首次尿液(晨尿首段25-40mL);Pre-DRE:直肠 指检前尿液;Post-DRE:直肠指检后尿液。
图2、内参基因校正。
图3、在活检阳性肿瘤患者组中,七种尿液RNA评分均显著高于阴性对 照组。
图4、前列腺肿瘤中PCA3的特异性和敏感性评分。
图5、多基因指标的特异性和敏感性评分,联合检测极大地提高了预测 前列腺癌患病的风险。
具体实施方式
本发明人致力于前列腺癌的尿液检测标志物的研究,经过广泛的研究筛 选,确定了7个特别适用于利用尿液样品进行前列腺癌诊断的敏感基因,它 们是PCA3、MALAT1和SChLAP1,属于融合基因的TMPRSS2-ERG和 TTTY15-USP9Y,以及DLX1,HOXC6,它们为非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)。本发明人发现,在尿液样品中,这些基因可呈现在前列腺癌患者以 及正常患者中的表达差异,而对这些基因进行联合检测,可以优势互补,呈 现精准的检测结果,特异性和灵敏度非常理想。因此,这些基因可作为前列 腺癌的尿液标志物;可作为设计前列腺癌尿液诊断试剂的基础。
如本文所用,“样本”或“样品”包括从个体中获得的、适合于提取核 酸并检测的物质,本发明中所述的样品较佳地为尿液样品或经过加工的尿液 样品(如尿沉淀)。
如本文所用,术语“前列腺癌”与“前列腺肿瘤”可互换使用。
尿液标志物
本发明人收集了大量的临床病例,筛选适用于尿液检测前列腺癌的标志 物,进而揭示了一组可以高准确度地检出与前列腺癌的标志物。以尿液,优 选地以患者晨尿为待测样品,针对这些标志物进行联合检测,检出前列腺癌 的准确性显著高于应用单一标志物的情形,也显著高于联合应用其它标志物 的情形。利用晨尿初始尿液检测分子标志物具有可行性,不需要DRE或前列 腺按摩,尤其不需要从尿样品分离细胞沉淀的样品制备步骤,从而便于大规 模人群体检。
非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是一类不具备编码蛋白质功能的 基因组转录产物。研究发现,ncRNA表达失调与人类疾病的发生密切相关, 更重要的是其表达失调具有组织特异性、在体液中被便捷、稳定地检测,因 此ncRNA作为肿瘤断分子标志物有巨大的临床应用潜能。
前列腺癌抗原3(PCA3)基因是一个前列腺癌特异性的非编码RNA片段, 定位于第9号染色体上(9q21-22),其全长约25kb,包含4个外显子和3个内 含子,其序列可见GenBank登录号NR_132312中第1~3922位所示。PCA3 基因特异性地高表达于人类前列腺癌细胞和转移坏死灶中,在正常前列腺、 良性前列腺增生细胞中不表达或低表达,且其表达水平与前列腺癌Gleason 病理分级有关。目前己发现,PCA3在95%的前列腺癌患者中过度表达。此外,在前列腺外组织以及良性前列腺疾病中尚未检测到PCA3转录,证明 PCA3是前列腺癌具特异性的肿瘤标志物,PCA3不受年龄、前列腺体积或其 他前列腺病(前列腺炎)的影响。但是,现有的针对PCA3的检测试剂在诊断 的便捷性、准确性等方面仍有一些亟待改进的方法。例如,Gen-probe公司 开发的基于PCA3/PSA的检测试剂盒,应用转录介导的扩增(TMA)方法给出 PCA3/PSA在直肠指检后收集的尿液(非普通尿液或晨尿)中的浓度 (copy/mL),然后二者相比后乘以1000即为前列腺癌风险评估值。该方法操 作流程繁琐,耗时长,质控及结果判读复杂,复检率较高15.2%,跟临床常 规PCR仪器不兼容,需另外购置仪器设备。更重要的是,该方法需要直肠指 检或前列腺按摩后的尿液,不利于大面积推广。
前列腺癌相关的SWI/SNF拮抗分子(SWI/SNF complex antagonist associatedwith prostate cancer 1,SChLAP1)是前列腺癌组织中异常表达的长 非编码RNA,其序列可见GenBank登录号NR_104319中第1~1436位所示。 SChLAP1是一种基因间lncRNA,主要存在于前列腺癌细胞中,在良性前列 腺中无表达,在侵袭性的前列腺癌中表达增加,因此将其确定为侵袭性前列 腺癌的一个潜在生物标志物。但是,近年来发现其它癌症,如膀胱癌、肾癌 等也有中度表达水平,因此利用单一SChLAP1作为检测前列腺癌的标志物, 存在特异性欠佳的问题。但本发明人在人群分析中发现,尽管其特异性相对 不理想但当运用于组合检测的靶标时,可作为一个良好的互补性标志物,有 利于提高整体判断时的准确性。
肺腺癌转移相关转录因子(metastasis-associated lung adenocarcinomatranscript 1,MALAT1)是一种lncRNA,其序列可见GenBank登录号 NR_002819中第1~8779位所示。MALAT1在人类多种肿瘤组织中表达均显 著升高,包括肺癌、肝癌、膀胱癌以及前列腺癌等。通过多中心验证发现它 可作为诊断前列腺癌的分子标志物。但是,由于其在包括前列腺癌的较多恶 性肿瘤中呈表达增高,存在特异性欠佳的问题,并且现有技术中其采集方法 需要直肠指检(DRE),影响了该技术的广泛应用。而本发明人发现,其可作 为一个良好的互补性标志物,有利于提高整体判断时的准确性。
许多前列腺癌患者存在雄激素调节基因与致癌基因融合的特异性改变, 尤其是TMPRSS2基因与致癌基因ETS家族的融合。在欧美,有超过50%的 前列腺癌患者存在TMPRSS2:ERG融合基因,该融合基因的序列可见 GenBank登录号FJ423744.1中第1~235位所示。一项多中心研究,对病人 直肠指检后的尿液(非普通尿液或晨尿)标本进行分析,发现TMPRSS2:ERG 诊断前列腺癌的灵敏度为37%,特异度为94%,阳性预计值(PPV)为94%;联合检测TMPRSS2:ERG和PCA3的灵敏度为73%,显著提高了检测的敏感 度。尤为重要的是,TMRPSS2:ERG基因融合是目前最特异性的前列腺癌生 物标志物,在其他任何癌症及正常前列腺组织中均未发现ERG基因融合。
不同种族人群中,融合基因的表达率也不尽相同,在欧美人群中普遍高 频表达(50%~80%)的融合基因TMPRSS2-ERG在中国人群中的阳性率仅为 14.3%,因此单一检测中国人群TMPRSS2:ERG融合基因具有较低的敏感度, 但本发明人发现,将其用于进行多种基因联合检测,对于提高检测的准确性 是有效的。
TTTY15-USP9Y是一种在前列腺癌组织中发现的非编码融合基因。该融 合基因由两个基因TTTY15(GenBank ID:NR_001545.2)以及基因USP9Y (GenBank ID:NG_008311.1)在转录阶段特异性地契合而成。其在中国人群中 的表达频率为35.2%,提示这些融合基因具有中国人群特异性。尽管在前瞻 性研究中发现前列腺按摩后尿液沉渣中存在融合基因USP9Y-TTTY15,但是 其敏感性及特异性还需进一步的提高,且获取前列腺按摩后尿液沉渣的过程 具有一定的复杂性,还需考虑进一步简化的方案,例如在普通尿液或晨尿中 其是否有检测意义。
DLX1基因是一个转录因子,与果蝇distal-less genes具有同源性。该基 因的序列可见GenBank登录号NM_178120中第1~2356位所示。据报道 DLX1促进多种肿瘤,包括前列腺癌、卵巢癌等的细胞生长,迁移和菌落形 成。该基因参与神经内分泌上皮细胞的分化,与前列腺癌的侵袭性相关。联 合检测直肠指检后收集的尿液(非普通尿液或晨尿)样本的3个基因(HOXC6, TDRD1和DLX1)用于胰腺癌以及前列腺癌的早期诊断。但是,由于其在包 括前列腺癌的较多恶性肿瘤中呈表达增高,存在特异性欠佳的问题,并且样 本需要前列腺按摩后尿沉渣,影响了该技术的广泛应用。
HOXC6属于转录因子Homeobox(HOX)的家族成员。该基因的序列可见 GenBank登录号NM_004503中第1~1651位所示。HOXC6在许多人类癌症 中,包括骨肉瘤,髓母细胞瘤以及乳腺癌,肺癌和前列腺癌等实体癌中高表 达。在前列腺癌中,HOXC6具有调节其他致癌基因和抑癌基因活性的功能, 而高表达的程度与Gleason评分相关。据报道,联合尿液(非普通尿液或晨尿) 分子标志物(DLX1、HOXC6)和临床危险因素(年龄、PSA、前列腺体积、家 族史、DRE),可以评估前列腺癌的风险。但是该方法需要结合血清PSA,PSA 密度,DRE状态,年龄等临床因素,不适合普通人群检测以及筛查。
诊断试剂和试剂盒
在确定了靶向检测的各个基因的组合后,可以针对这些基因来设计特异 性检测的检测试剂。特别优选的,所述检测试剂,特异性扩增所述基因的引 物或特异性识别所述基因的探针。
基于本发明的新发现,还提供了基于所述的多核苷酸序列设计的检测试 剂,用于体外检测样品中相应基因的表达情况。
在本发明的优选方式中,所述的试剂是PCR引物。更为优选地,所述特 异性检测人PCA3基因的检测试剂为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示核 苷酸序列的引物;所述特异性检测人MALAT1基因的检测试剂为SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的引物;所述特异性检测人TMPRSS2-ERG 基因的检测试剂为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的引物; 所述特异性检测人SChLAP1基因的检测试剂为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的引物;所述特异性检测人TTTY15-USP9Y基因的检测 试剂为SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16所示核苷酸序列的引物;所述特异 性检测人DLX1基因的检测试剂为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷 酸序列的引物;所述特异性检测人HOXC6基因的检测试剂为SEQ ID NO:3 和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的引物。
根据本发明人反复的研究工作,上述引物对扩增获得的扩增产物具有合 适的长度,且特异性高,对于复杂体系的扩增也具有良好的特异性,特别适 合用于精准的检测。
本发明还提供了体外检测样品中多核苷酸的试剂盒,该试剂盒包括:容 器,以及位于容器中的诊断试剂;较佳地,所述的诊断试剂可以是上述的引 物组合。
此外,所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、DNA纯化、PCR扩增 等所需的各种试剂。
此外,所述的试剂盒中还可包括使用说明书,其中标明检测操作步骤和 结果判定标准,以便于本领域技术人员应用。
本发明的技术方案可依托荧光定量PCR平台,提供临床急需的、适合中 国国情的精准诊断前列腺癌的检测技术。
肿瘤发生是一个多基因、多步骤的异质性癌变,仅仅依靠单个分子标志 物的检测必然存在一些局限性,影响其临床诊断结果。例如以上各个基因单 个应用于诊断或将它们与其它的部分基因联合应用于诊断时,在临床上仍然 体现了种种不足。在欧美有超过50%的前列腺癌患者存在TMPRSS2:ERG融 合基因,然而在中国人群中该融合基因的发生率仅为20%左右。同样,在欧 美人群中尚未发现的融合基因USP9Y:TTTY15,在中国人群中却高达35.2%, 提示这些融合基因具有中国人群特异性。本发明的技术方案,从多种多样的 肿瘤标志物中进行筛选,将多个上述的基因进行有机整合,实现优势互补, 利用自主创新的多参数风险预测模型,使得诊断的精准程度获得很大的提高, 为患者提供前列腺癌存在的风险程度,帮助临床医生作出合理判断,以决定 是否继续临床监测或进行前列腺穿刺活检,减少PSA灰区患者的焦虑,避免 不必要的组织活检。
该发明通过分析肿瘤患者晨尿初始段尿液样品中的多种基因标志物,使 用的尿样品未经直肠指检(DRE)的患者样品,适用于患者的晨尿首段25-40 mL尿液样品,不需要DRE或前列腺按摩,尤其不需要从尿样品分离细胞沉 淀的样品制备步骤,开发了一种非入侵性的测试方法,用来帮助病人及其医 生对早期前列腺癌做出治疗决定。本领域中,此类诊断的敏感性和特异性的 提高是举步维艰的,而本发明的技术方案则可有效地提高了这些指标,为患 者提供了易于检测且准确性高的诊断方案。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第 三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
1、研究试剂
尿液保存液:
100mM Tris-HCl,500mM LiCl,10mM EDTA,pH 7.5,1%十二烷磺 酸锂(lithiumdodecyl sulfate),5mM二硫苏糖醇(dithiothreitol)。
RNA捕获液:
150mM HEPES,500mM LiCl,450mM LiOH,100mM EDTA,250μg/mL 超顺磁性的共价结合(dT)14的磁珠(Sera-Mag,GE life science),pH 6.4。
洗涤液:
10mM HEPES,150mM NaCl,6mM NaOH,1mM EDTA,0.5%(v/v) EtOH,0.1%(w/v)SDS,pH 7.5。
洗脱液:
5mM Tris-HCl,pH 7.5。
2、实施例2~4的研究人群
选取2019年7月至2020年1月因前列腺疾病于医院初次就诊的男性患 者以及健康体检者为研究对象。入选该研究的人群标准为:1)年龄>45岁的 男性患者;2)所有患者均为初次发病就诊,无前列腺药物治疗史;3)直肠指 检可疑患者需行前列腺穿刺活检;4)血清PSA水平可疑患者需行前列腺穿刺 活检;5)没有进行前列腺肿瘤治疗。排除标准:1)既往或同时患有其他恶性 肿瘤,有手术、放化疗史的患者;2)严重慢性病(糖尿病、高血压、慢性肾脏 病、肝病等)患者;3)依从性差,不能完成随访者;4)病历资料不完整者。
本研究经医院伦理委员会审批并获得所有研究对象的知情同意。按照委 员会的规定,所有患者均签署书面知情同意书。临床资料的收集包括年龄、 血清PSA、前列腺穿刺活检以及是否具有前列腺癌家族史等临床信息。
患者来自浙江大学医学院附属第一医院、浙江大学医学院附属第二医 院、浙江省人民医院等3家三甲医院的泌尿外科门诊或住院病例。本研究经 本院伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书。
3、尿样采集
为了研究不同时间点收集的尿液对RNA含量的影响,每一位患者收集 三份尿液样品,包括晨尿初始尿液、直肠指检前、以及直肠指检后。收集初 始段尿液10~20mL,在收集后1小时内按如下方法处理尿液:1)将样品杯 倒置5次以重新悬浮细胞。2)用移液管转移2.5mL尿液到样本输送管,并添 加2.5mL尿液保存液。3)盖紧尿液输送管,轻轻颠倒5次混合。处理后的尿 液标本在-20℃可保存11个月,最多反复冻融5次。
直肠指诊采用传统前列腺按摩方法,对患者进行按摩,自前列腺两侧向 中央沟、自上而下纵向各按摩2~3次,再按摩中央沟一次,将前列腺液挤入 尿道。之后约1小时内,收集初始段尿液10~20mL,然后按照以上方法处 理尿液。
处理后的尿液标本在-20℃可保存11个月,最多反复冻融5次。
4、磁珠法提取尿液RNA
提取前,将经尿液保存液处理的尿液样本于37℃下解冻15分钟,在此 期间每5分钟将试管倒置一次。将200μL处理后的尿液样本加入400μL RNA 捕获液,涡旋混匀1分钟,62℃水浴中孵育30分钟,然后在室温下孵育40 分钟。将反应液置于磁场中静置2分钟,除去上清液,然后向含磁珠的EP 管中加入500μL洗涤液,涡旋20秒后置于磁场中静置2分钟,吸弃上清液, 将其重悬于30μL预热(75℃)洗脱液中,并在75℃水浴中温育2分钟后,在 磁场中静置2分钟,将上清液转移至另一洁净无酶的离心管中,在-80℃温 度下保存即可得到最终提取纯化的RNA。RNA浓度和质量用NanoDrop 2000 分光光度计分析。
5、制备引物混合物(0.1X)
将各PCR引物混合并稀释100X。具体讲,取1μL 10μM PCR引物于EP 管中,加H2O至100μL,旋涡混匀后在微型离心机中瞬时离心,立即置于冰 上备用。
PCR引物浓度分别为10μM,具体序列如下:
DLX1上游:5’-gcggcctctttgggactcacac-3’(SEQ ID NO:1);
DLX1下游:5’-ggccaacgcactaccctccaga-3’(SEQ ID NO:2);
HOXC6上游:5’-atgaattcgcacagtggggt-3’(SEQ ID NO:3);
HOXC6下游:5’-ttgatctgtcgctcggtcag-3’(SEQ ID NO:4);
MALAT1上游:5’-cttccctaggggatttcagg-3’(SEQ ID NO:5);
MALAT1下游:5’-gcccacaggaacaagtccta-3’(SEQ ID NO:6);
PCA3上游:5’-tggtgggaaggacctgatgatacag-3’(SEQ ID NO:7);
PCA3下游:5’-tctcccagggatctctgtgcttcc-3’(SEQ ID NO:8);
KLK3上游:5’-gtctgcggcggtgttctg-3’(SEQ ID NO:9);
KLK3下游:5’-tgccgacccagcaagatc-3’(SEQ ID NO:10);
SChLAP1上游:5’-tggacacaatttcaagtcctca-3’(SEQ ID NO:11);
SChLAP1下游:5’-catggtgaaagtgccttataca-3’(SEQ ID NO:12);
T2-ERG上游:5’-ctggagcgcggcaggaa-3’(SEQ ID NO:13);
T2-ERG下游:5’-ccgtaggcacactcaaacaacga-3’(SEQ ID NO:14);
TTTY15-USP9Y上游:5’-catcacctggagtccgtgtaag-3’(SEQ ID NO:15);
TTTY15-USP9Y下游:5’-cctactggagagccatgagtg-3’(SEQ ID NO:16)。
6、合成第一链cDNA
该方法参考SuperScriptTMIV VILOTM手册。简单讲,将尿液RNA稀释到 0.25ng/μL,取8μL稀释后的RNA样本于200μL PCR管中,并立即置于冰 上。加入2μL 5X SuperScriptTMIVVILOTM预混液,轻轻混合后,瞬时离心, 将反应管放在PCR仪中进行逆转录反应。反应条件为:25℃ 10分钟;50℃ 10 分钟;85℃ 5分钟。反应结束后将PCR管放回预冷的PCR架中,于–70℃ 下长期保存。
7、预扩增cDNA
表1
将PCR管放入热循环仪器中进行cDNA预扩增。反应条件如表2。
表2
反应完成后立即从热循环仪上取出并将其放在冰上。稀释PCR预扩增产 物(1:10),也就是加225μLH2O至25μLPCR管中,将预扩增产物储存在-20℃ 待用。
8、实时荧光QPCR定量靶基因
准备QPCR反应液,将以下试剂按照顺序分别加入PCR管中,用透明胶 膜密封后,旋涡混匀并在微型离心机中瞬时离心。如需要多个样品的QPCR 反应,在冰上先配制总混合物,该混合物由反应体系中各组分按其指定体积 的适当倍数组成,然后取该总混合物13μl加入到每一PCR管中,最后于各 反应管中加入引物启动反应。每次加样均应使用单独的加样器枪头,小心勿 使样品之间相互污染。引物具体序列见前述5。PCR体系如表3。
表3
组分 | 体积(μL)/反应 |
SYBR<sup>TM</sup>Green Master Mix(2×) | 7.5 |
cDNA预扩增产物 | 2.5 |
上游引物(10μM) | 1 |
下游引物(10μM) | 1 |
H2O | 3 |
总体积 | 15 |
将反应管放入ABI 7000PCR仪进行实时荧光PCR扩增。QPCR反应程 序为:
(1)标准反应模式
(2)溶解曲线
阶段 | 升降温度 | 温度 | 时间 |
1 | 1.6℃/秒 | 95℃ | 15秒 |
2 | 1.6℃/秒 | 60℃ | 1分钟 |
3 | 0.075℃/秒 | 95℃ | 15秒 |
9、校准品(Calibrator)制备以及检测
提取前列腺癌细胞株LnCaP以及VCaP总RNA。以逆转录后的cDNA 为模板,分别利用上述5所述的上游引物以及下游引物进行PCR扩增,获 得目标基因,然后将PCR产物装入TA载体,测序验证后得到各靶基因的重 组质粒。提取重组质粒,将每个质粒的浓度调至104copy/mL待用。
用前述5所述的核苷酸序列为引物,以稀释后的标准品为模板(Cal104), 按8中的反应条件以及热循环程序进行扩增。
10、阳性质控品
利用T7 RiboMAX Express试剂盒,将重组质粒中的目标基因体外转录 表达RNA。利用RNeasy mini试剂盒(QIAGEN)分离纯化RNA,用0.8%琼脂 糖凝胶电泳确定其完整性以及均一性。RNA浓度用NanoDrop 2000分光光度 计分析,其OD260值在1.8~2.0之间表示RNA纯度较好。将同样浓度的RNA 混合并等份保存在-70℃,作为QPCR定量分析的阳性质控品。
11、结果分析以及评估尿液RNA对前列腺癌早期诊断的临床意义
荧光PCR扩增曲线与阈值线的交叉点即是循环阈值(Cycle threshold, Ct),表示PCR反应中靶基因浓度的相对测量。Ct值与mRNA的初始浓度成 反比,Ct越低,样品中的基因表达就越高。待测标本靶基因的含量用相对定 量的方法分析,其中KLK3基因作为内参进行校正,使用ΔΔCt方法计算目 标基因与参考基因(KLK3)的比率以标准化qPCR结果,校正后尿液靶基因的 比值(Score)公式为:
TargetScore=2(Ct(Cal104)KLKs-Ct(Sample)KLKs)-(Ct(Cal104)target-Ct(Sample)target)×10,000
统计分析利用SPSS(版本19.0)。受试者工作特征(ROC)曲线用来评估生 物标志物的敏感性和特异性,使用单向方差分析(ANOVA)和卡方检验来比较 分类变量频率和显著差异。对数据的似然比进行逻辑回归分析,以双重确认 分析结果。p值<0.05时,差异被认为具有统计学意义。
·敏感度=肿瘤患者中高于截断值的标本例数/患者标本例数;
·特异度=肿瘤患者中低于截断值的标本例数/对照标本例数;
·阳性预测值(PPV)=肿瘤患者中高于截断值的标本例数/高于截断值 的所有标本例数;
·阴性预测值(NPV)=肿瘤患者中低于截断值的标本例数/低于截断值 的所有标本例数;
·准确度=(肿瘤患者中高于截断值的标本例数+肿瘤患者中低于截断值 的标本例数)/所有标本例数。
实施例
实施例1、标志物的筛选
本发明人前期收集了大量前列腺癌患者的临床样品进行分析,结合分析 了一些数据库中关于列腺癌患者的样品信息,进行大规模筛选,最终确定了 7种特定的、适用于进行以尿液为测定样品进行联合检测的靶基因,这些基 因分别为TMPRSS2-ERG(T2ERG),PCA3,SChLAP1,MALAT1, TTTY15-USP9Y,HOXC6以及DLX1。
后续的实施例中,本发明人进一步收集了91例临床研究对象,年龄为 57~86岁,平均(67.3±11.2)岁;前列腺癌组50例,前列腺增生或者健康 组41例。所有病例均经穿刺活检病理组织学证实。
实施例2、对比不同时间点收集的尿液对于分子标志物的影响
应用以上“材料和方法”中描述的步骤以及检测方法,本发明人共分析 了60例来自不同时间点收集的尿液样品,包括22例晨尿,19例直肠指检前 尿液,以及19例直肠指检后尿液。
结果如图1,分子标志物在不同时间点收集的匹配尿液中具有对等的含 量,也即应用本发明的方法对于不同时间点收集的尿液样本具有同等的检测 敏感度。
该结果表明,利用晨尿初始尿液检测分子标志物具有可行性,不需要 DRE或前列腺按摩,尤其不需要从尿样品分离细胞沉淀的样品制备步骤,从 而便于大规模人群体检。
实施例3、评价尿液RNA在肿瘤组以及对照组含量的比较
应用以上描述的步骤以及检测方法,对7种靶基因,分别为 TMPRSS2-ERG(T2ERG),PCA3,SChLAP1,MALAT1,TTTY15-USP9Y,HOXC6以及DLX1,进行了尿液样品定量PCR(qPCR);同时,以KLK3(PSA) 为内参基因。原始Ct值按以下方法整理并校正。首先,去掉KLK3 Ct值>30的尿液样品,以确保样本中有足够的前列腺细胞。首先将每个样品的原始Ct 值取平均值,利用KLK3基因作为内参进行校正,使用ΔΔCt方法计算目标 基因与参考基因(KLK3)的比率以标准化qPCR结果(图2)。
结果,在91例检测的尿液样本中,本发明人共筛选出7种在肿瘤组含 量明显高于健康组的靶基因(p<0.05,两组差异有统计学意义),并且可以较 好地将健康人群和患者区分出来,包括TMPRSS2-ERG(T2ERG),PCA3, SChLAP1,MALAT1,TTTY15-USP9Y,HOXC6以及DLX1(图3),表明其 对前列腺肿瘤诊断的临床意义。
因此,本发明人共发现了7个有效的分子标志物。
实施例4、ROC分析以及诊断模型的建立
单变量Logistic回归分析,表4显示所有七种尿液基因对前列腺肿瘤具 有显著的诊断价值,其中PCA3评分ROC曲线下面积(AUC)最大,具有最高 的总体敏感性和特异性(AUC=0.77),且与前列腺肿瘤的临床诊断呈显著相 关性(图4)。
表4
分子标志物 | AUC(95%CI) | 特异性(%) | 敏感度(%) |
PCA3 | 0.77(0.67-0.85) | 68.0 | 80.5 |
DLX1 | 0.68(0.54-0.80) | 61.3 | 72.0 |
TTTY15-USP9Y | 0.67(0.55-0.78) | 30.8 | 96.7 |
TMPRSS2-ERG | 0.63(0.38-0.83) | 50.0 | 85.7 |
MALAT1 | 0.59(0.48-0.70) | 36.0 | 87.5 |
HOXC6 | 0.56(0.38-0.72) | 77.3 | 53.9 |
Schlap1 | 0.53(0.38-0.69) | 19.3 | 100.0 |
进一步利用多元Logistic回归来评估不同基因组合模型的诊断性能。在 PCA3基本模型中,按照AUC排序逐一添加单一RNA分子,结果如表5。 在多元逻辑回归分析中,多指标预测模型,包含七种尿液RNA分子(7基因), AUC最大为0.87(95%CI:0.78-0.93),其诊断前列腺癌的敏感度(Sensitivity) 和特异度(Specificity)分别为78.0%和87.8%(图5)。
表5
因此,本发明首次通过分析肿瘤患者晨尿初始段尿液样品中的多种RNA 分子,不需要DRE或前列腺按摩,尤其不需要从尿样品分离细胞沉淀的样品 制备步骤,开发了一种非入侵性快速简单的测试方法,用来帮助病人及其医 生对早期前列腺癌做出治疗决定。7基因检测效果明显优于现有技术中检测 工具如Gen-probe PCA3产品的效果(曲线下面积0.66,特异性以及敏感度分 别为66%和65%)。
实施例5、7基因联合检测对于预测前列腺癌患病风险的意义
利用上述的检测试剂和方法,分析了来自浙江省人民医院泌尿外科门诊 或住院病例45例晨尿样本。临床穿刺活检病理诊断结果显示,共有前列腺癌 样本31例,前列腺良性病变14例。按照上述描述的计算公式,计算各RNA 分子的评分,利用实施例4中建立的多指标预测模型,双盲评估45例患者前 列腺癌患病风险,四格表卡方检验见表6。
表6
χ2检验P<0.001,说明两种检测方法相关性非常好;KAPPA值为80.0%, 表明两种检测方法具有较好的一致性。并且诊断灵敏度90.3%(28/31),特异 性92.9%(13/14),阳性预测值96.6%(28/29),阴性预测值81.3%(13/16),误 诊率(假阳性率)7.1%(1/14),漏诊率(假阴性率)9.6%(3/31)。
因此,本发明中针对晨尿样本检测特定RNA组合的方案,已能达到与 临床穿刺活检接近的结果,准确性高,可满足临床检验要求。同时,鉴于其 检测的为晨尿样本,与临床穿刺相比,对于受试者而言,受试样本易于获取、 不带来痛苦,检测速度快;对于医院而言,易于实现目标人群的大规模普及 性检测,从而有利于实现前列腺癌的初期平均检出时间的大幅度提前,提高 治疗效果以及患者的生存率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文 献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容 之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样 落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 奥尔文泰生物科技(杭州)有限公司
<120> 尿液前列腺癌标志物组合及其在制备精准诊断试剂中的用途
<130> 201176
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 1
gcggcctctt tgggactcac ac 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 2
ggccaacgca ctaccctcca ga 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 3
atgaattcgc acagtggggt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 4
ttgatctgtc gctcggtcag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 5
cttccctagg ggatttcagg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 6
gcccacagga acaagtccta 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 7
tggtgggaag gacctgatga tacag 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 8
tctcccaggg atctctgtgc ttcc 24
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 9
gtctgcggcg gtgttctg 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 10
tgccgaccca gcaagatc 18
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 11
tggacacaat ttcaagtcct ca 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 12
catggtgaaa gtgccttata ca 22
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 13
ctggagcgcg gcaggaa 17
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 14
ccgtaggcac actcaaacaa cga 23
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 15
catcacctgg agtccgtgta ag 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 16
cctactggag agccatgagt g 21
Claims (10)
1.一种用于检测前列腺癌的试剂盒,包括:
特异性检测人PCA3基因的检测试剂;
特异性检测人MALAT1基因的检测试剂;
特异性检测人TMPRSS2-ERG基因的检测试剂;
特异性检测人SChLAP1基因的检测试剂;
特异性检测人TTTY15-USP9Y基因的检测试剂;
特异性检测人DLX1基因的检测试剂;和
特异性检测人HOXC6基因的检测试剂;
其中,所述的检测前列腺癌所针对的待测样本为尿液。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,特异性检测所述基因的检测试剂包括选自下组的试剂:特异性扩增所述基因的引物或特异性识别所述基因的探针;较佳地,特异性检测所述基因的检测试剂为特异性扩增所述基因的引物。
3.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述特异性检测人PCA3基因的检测试剂为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的引物;
所述特异性检测人MALAT1基因的检测试剂为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的引物;
所述特异性检测人TMPRSS2-ERG基因的检测试剂为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的引物;
所述特异性检测人SChLAP1基因的检测试剂为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的引物;
所述特异性检测人TTTY15-USP9Y基因的检测试剂为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示核苷酸序列的引物;
所述特异性检测人DLX1基因的检测试剂为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物;
所述特异性检测人HOXC6基因的检测试剂为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的引物。
4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中还包括:
特异性检测内参基因的检测试剂;较佳地,所述的特异性检测内参基因的检测试剂是针对人KLK3基因的引物;更佳地,所述的特异性检测内参基因的检测试剂是:SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的引物。
5.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的尿液为直肠指检前或后的尿液,或为晨尿;或
所述的引物各自独立地存在于所述试剂盒中,或被混合形成混合液。
6.权利要求1~5任一所述的试剂盒,其特征在于,该试剂盒中还包括选自下组的试剂:尿液保存液,RNA捕获液,洗涤液,洗脱液,磁珠,DNA聚合酶,dNTPs,质控品、阴性对照和/或说明书。
7.人PCA3基因、人MALAT1基因、人TMPRSS2-ERG基因、人SChLAP1基因、人TTTY15-USP9Y基因、人DLX1基因和人HOXC6基因的用途,用于制备检测前列腺癌的试剂;其中,所述的检测前列腺癌所针对的待测样本为尿液;较佳地,所述的尿液为晨尿。
8.特异性检测人PCA3基因、人MALAT1基因、人TMPRSS2-ERG基因、人SChLAP1基因、人TTTY15-USP9Y基因、人DLX1基因和人HOXC6基因的试剂的用途,用于制备检测前列腺癌的试剂盒;其中,所述的检测前列腺癌所针对的待测样本为尿液;较佳地,所述的尿液为晨尿。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,特异性检测所述基因的检测试剂包括选自下组的试剂:特异性扩增所述基因的引物或特异性识别所述基因的探针;较佳地,特异性检测所述基因的检测试剂为特异性扩增所述基因的引物。
10.如权利要求9所述的用途,其特征在于,所述特异性检测人PCA3基因的检测试剂为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的引物;
所述特异性检测人MALAT1基因的检测试剂为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的引物;
所述特异性检测人TMPRSS2-ERG基因的检测试剂为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的引物;
所述特异性检测人SChLAP1基因的检测试剂为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的引物;
所述特异性检测人TTTY15-USP9Y基因的检测试剂为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示核苷酸序列的引物;
所述特异性检测人DLX1基因的检测试剂SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物;
所述特异性检测人HOXC6基因的检测试剂为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的引物。
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