WO2020134950A1 - 用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合及试剂盒 - Google Patents

用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合及试剂盒 Download PDF

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WO2020134950A1
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王弢
孙爱娟
乔岩
任小芸
徐荣荣
孙玉龙
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江苏为真生物医药技术股份有限公司
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention belongs to the field of biotechnology and specifically relates to the detection of EGFR/KRAS or EGFR/KRAS/ALK/ROS1 or EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1 or EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA, etc.
  • a gene mutation/fusion kit relates to a method for detecting related gene mutation/fusion using the kit.
  • the present invention provides such a method that can be used for the differentiation of benign and malignant lung nodules, provides a corresponding kit and a gene mutation/fusion combination, and a layout method of a detection system for multi-gene joint detection that achieves the above object.
  • one of the objects of the present invention is to provide a gene combination method that can assist in the detection of benign and malignant lung nodules by multi-gene detection; the second object of the present invention is to provide a reagent for the multi-gene detection The third object of the present invention is to provide a layout of the kit detection system that can realize the above-mentioned multi-gene joint detection.
  • the multi-gene combination may be a gene mutation/fusion combination of EGFR/KRAS or a gene mutation/fusion combination of EGFR/KRAS/ALK/ROS1 or a gene mutation/fusion combination of EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1 or EGFR/KRAS /BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA gene mutation/fusion combination.
  • the kit contains primers and probes for detecting EGFR/KRAS gene mutations.
  • the kit further includes PCR buffers, dNTPs, and magnesium dichloride, DNA polymerase, reverse transcriptase and other reagents suitable for PCR detection.
  • the final concentration of the components contained in the kit is as follows: 1 ⁇ PCRbuffer, MgCl22.5mM, dNTP250 ⁇ M, primer 250nM, amplification retardation probe 500nM, probe 500nM, DNA polymerase 1U, reverse transcriptase 1U and DNA template 0.05-20ng.
  • the method for the detection, differentiation or auxiliary diagnosis of benign and malignant human lung nodules using the kit of the present invention includes the following steps:
  • Sample collection collect patient samples (such as blood, sputum, etc.) as samples to be tested;
  • test results judge EGFR/KRAS or EGFR/KRAS/ALK/ROS1 or EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1 or EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/ based on the ⁇ Ct value
  • ⁇ Ct value is less than the cut-off value, it indicates that the corresponding mutation/fusion has occurred in the amplified segment, and the test result is positive.
  • the beneficial effects of the present invention are as follows: (1) Using fluorescent quantitative PCR technology to detect specific gene mutation/fusion combination, the benign and malignant lung nodules can be differentiated and clinically assisted in diagnosis, providing clinical guidance and reducing clinical pressure. (2) Compared with the clinicopathological diagnosis results, the test results of the kit are high in detection accuracy, sensitivity up to 50%, and specificity up to 100%. It can assist clinical to judge the characteristics of lung nodules. (3) The use of experience samples such as plasma can achieve the purpose of detection, which is more convenient.
  • the instruments used in the present invention are as follows: Lightcycler 480, high-speed centrifuge, water bath pot, vortex shaker, refrigerator, oven, sterilization pot.
  • Reagents used in the present invention DNA polymerase (Roche), reverse transcriptase (thermo), 10 ⁇ PCRBuffer (Roche), MgCl2 (Roche), dNTP (TaKaRa), purified water.
  • Probes used in the present invention All probes should be of electrophoretic grade (PAGE) or HPLC grade, free of impurities.
  • the EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA gene mutation/fusion detection kit is used as an example to illustrate the optimization results of the present invention.
  • the kit of this example contains all mutation/fusion sites involved in the present invention, here only L858R (EGFR gene mutation), G12D (KRAS gene mutation), EML4exon13-ALKexon20 (ALK fusion gene), CD74exon6-ROS1exon32 (ROS1 fusion Gene) as an example to illustrate how to detect and optimize the target gene.
  • EGFR/KRAS the negative control of EGFR/KRAS gene is human blood DNA without mutation of EGFR/KRAS gene, which can be used directly without dilution; the positive quality control of EGFR/KRAS gene consists of the sequence of EGFR gene L858R mutation and KRAS
  • the sequence mutated at the G12D site of the gene was ligated into the pUC57-Amp vector, then transformed into E. coli, purified by extraction, and then diluted to a concentration of 100 copies (concentration about 10-6ng/ul).
  • the sequence of mutation/fusion containing EGFR (L858R) and KRAS (G12D) mutation/fusion sites is as follows:
  • ALK/ROS1 gene negative control product is ALK/ROS1 gene unfused human blood RNA, which can be used directly without dilution;
  • ALK/ROS1 gene positive quality control product is from EML4exon13-ALKexon20 (ALK fusion gene) locus
  • the fusion sequence of CD74exon6-ROS1exon32 (ROS1 fusion gene) site was connected to pUC57-Amp vector, and then transformed into E. coli, extracted and purified, and then diluted to a concentration of 100 copies (concentration is about 10-6ng/ ul).
  • the positive sequence containing ALK and ROS1 fusion is as follows:
  • Primer probe sequence acquisition According to the sequence containing the mutation/fusion site, refer to the patent: CN104762408B CN102776291BCN 104805206B to design primers, probes and amplification retardation probes. Design primers to detect EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53 gene mutation/fusion and fusion.
  • NTC no template control
  • the internal standard signal of the sample should have a curve rising, indicating that the experiment is normal; if there is no signal rising or a part of no signal rising, it means that the sample added contains PCR inhibitors or the sample is not added enough, and it needs to be re-extracted and then tested or Test after increasing the dosage, but if there is a signal in the FAM or HEX channel in the tube, it may be because the amplification of the mutation/fusion sequence inhibits the amplification of the internal standard sequence, and the result is still reliable.
  • the sample is positive for the mutation/fusion corresponding to the site; otherwise, it is negative or lower than the detection limit of the kit.
  • the optimal reaction conditions are: 1 50-65 °C reverse transcription for 15 minutes; 2 95 °C pre-denaturation while inactivating reverse transcriptase for 40s; 3
  • the optimized detection system and reaction program were used to analyze the minimum detection limit of EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA mutation/fusion site.
  • the minimum detection limit research mainly includes the following three aspects: 1) The study of the minimum detection limit of the mutation/fusion ratio: the ratio of the lowest mutation/fusion DNA that can be detected under the condition of a certain DNA concentration; 2) The minimum detection limit of the DNA concentration Study: The lowest DNA concentration that can be detected when the mutation/fusion ratio is constant; 3) Minimum copy number study: The lowest copy number that can be detected when the mutation/fusion ratio is constant.
  • Tissue samples Collected 30 non-small cell lung cancer tissue samples and their preoperative blood samples.
  • the samples were from the Zhejiang Institution Hospital Biological Sample Bank and the Suzhou Premed Laboratory. Tissue samples are used as true biological paraffin tissue DNA extraction kit (column method)
  • RNA extraction kit for true biological paraffin embedded tissues Cat.NO.: WZ1201 to extract DNA and RNA respectively.
  • Blood samples were extracted using QIAamp QIAamp Circular Nucleic Acid Kit (55114) extraction kit. Then use the combination in Example 1, EGFR/KRAS combination, EGFR/KRAS/ALK/ROS1 combination, EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1 combination to detect the relevant gene mutations/fusions of 30 patients respectively.
  • the fusion test results are based on the immunohistochemical results of tissue samples. The specific result statistics are shown in Tables 6-1 to 6-4 below.
  • Plasma sample test results Gold standard results 1 EGFR EGFR 19-del 2 wild wild wild 3 EGFR EGFR L858R 4 EGFR EGFR L858R 5 wild wild wild 6 EGFR wild 19-del 7 BRAF BRAF V600E 8 wild wild wild wild wild
  • Plasma sample test results Gold standard results 1 EGFR EGFR 19-del 2 wild wild wild 3 EGFR EGFR L858R 4 EGFR EGFR L858R 5 wild wild wild 6 EGFR wild 19-del 7 wild wild V600E 8 wild wild wild 9 KRAS KRAS G12D 10 wild wild wild wild 11 EGFR EGFR 19-del 12 EGFR EGFR L858R 13 wild wild wild wild 14 wild wild wild wild 15 wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild
  • Plasma sample test results Gold standard results 1 EGFR EGFR 19-del 2 wild wild wild 3 EGFR EGFR L858R 4 EGFR EGFR L858R 5 wild wild wild 6 EGFR wild 19-del 7 wild wild V600E 8 wild wild wild 9 KRAS KRAS G12D 10 wild wild wild wild 11 EGFR EGFR 19-del 12 EGFR EGFR L858R 13 wild wild wild 14 wild wild wild wild 15 wild wild wild wild 16 EGFR EGFR 19-del 17 wild wild wild 18 wild wild wild wild wild wild wild wild 20 EGFR EGFR 19-del twenty one EGFR wild 19-del twenty two EGFR EGFR L858R
  • Plasma sample test results Gold standard results 1 EGFR EGFR 19-del 2 wild wild wild 3 EGFR EGFR L858R 4 EGFR EGFR L858R 5 wild wild wild 6 EGFR wild 19-del 7 BRAF BRAF V600E 8 wild wild wild 9 KRAS KRAS G12D 10 wild wild wild wild 11 EGFR EGFR 19-del 12 EGFR EGFR L858R 13 wild wild wild 14 wild wild wild wild wild wild 15 wild wild wild wild 16 EGFR EGFR 19-del 17 wild wild wild wild 18 wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild 20 EGFR EGFR 19-del twenty one EGFR wild 19-del twenty two EGFR EGFR L858R twenty three wild wild wild twenty four ALK ALK ALK 25 wild wild wild wild 26 wild wild wild wild 27 wild wild H1047R 28 wild wild wild wild 29 wild wild wild wild wild wild wild wild wild wild.
  • the results show that when the method of the present invention is used to detect lung cancer tissue samples, the detection result is 78.5%-100% compared with the gold standard. Among them, the detection sites involved in Example 1 are the most complete, and the detection coincidence rate is also the highest. However, other gene combination methods: EGFR/KRAS; EGFR/KRAS/ALK/ROS1; EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1, etc. can also obtain a higher coincidence rate; using the method of the present invention to detect blood samples, the detection side results Compared with the gold standard, the compliance rate is 64.4 to 85%. In summary, the present invention detects mutations/fusions in lung cancer samples, and the detection result has a higher compliance rate compared with the gold standard. The negative coincidence rate can reach 100%, and the accuracy is high. Similar effects can be obtained with various gene combinations involved in the present invention.
  • Preoperative plasma samples were collected from 30 patients with pulmonary nodules diagnosed as uncertain nodules or non-calcified nodules on the first CT and subsequently undergoing surgery.
  • the sample comes from the Second affiliated Hospital of Suzhou University, Shanghai Chest Hospital.
  • the extraction was carried out with Kaijie Bio's QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (55114) co-extraction kit. Then use the method of Example 1 to detect the mutations/fusions of related genes in 30 patients, taking the clinical diagnosis results as the gold standard.
  • the results show that the method of the present invention is used to detect lung nodule samples, and the detection result is 70%-73.3% compared with the gold standard. Among them, the positive coincidence rate is 43.75%-50%, the negative coincidence rate is 100%, and the specificity is high.
  • This method can be used for the auxiliary diagnosis of benign and malignant lung nodule samples.
  • the method of the present invention has a better expected effect on lung nodular blood (specifically plasma) samples, and is also applicable to lung cancer tissue and blood (specifically plasma) samples, and those skilled in the art can easily anticipate
  • body fluid samples such as saliva, urine, sputum, etc.
  • the combination of the present invention also has the expected detection effect.

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Abstract

一种以血浆为样品，利用PCR技术鉴别肺结节良恶性的基因突变/融合组合，具体组合为：EGFR/KRAS或EGFR/KRAS/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA。以及相关的试剂盒、试剂盒使用时检测体系的布局方式。

Description

用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合及试剂盒 技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及检测EGFR/KRAS或EGFR/KRAS/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA等基因突变/融合的试剂盒，涉及利用该试剂盒检测相关基因突变/融合的方法。
背景技术
2015年我国肺癌新发病例约73.3万，在我国所有癌症中发病率、死亡率均第一。因早期症状不明显，肺癌发现时多为中晚期，5年生存率仅16.1％；而早期肺癌发现后，长期生存率高达90％以上。早期肺癌的发现是降低肺癌致死率的关键。低剂量CT是目前国际公认的早期肺癌筛查方式，美国肺癌筛查试验(NLST)研究结果表明，低剂量螺旋CT筛查可降低20％的肺癌死亡率。
随LDCT筛查逐渐普及，无临床症状的肺内微小结节检出率越来越多，肺微小结节的定性诊断成为关键，越早诊断对患者越有利。对于肺微小结节，最大的问题是良恶性的准确鉴别，特别是1cm以下的结节更是成为禁区。随访和诊治时间的延长不仅加重患者心理、生理负担，也增加了医院的压力。临床急需更好的方法、更多角度的证据协助临床医生作出更准确的判断，从而得到及时治疗，达到提高治愈率、降低死亡率的目的。
在精准医学时代，基于液态活检的血液分子标志物辅助肺结节良恶性鉴别将是非常有前景的解决之道。本发明提供这样一种可用于肺结节良恶性鉴别的方法，提供相应的试剂盒以及基因突变/融合组合及实现上述目的的多基因联合检测的检测体系的布局方式。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种可辅助肺结节良恶性鉴别的多基因联合检测的基因组合方式；本发明的目的之二在于提供一种上述多基因检联合检测的试剂盒；本发明的目的之三在于提供一种可实现上述多基因联合检测的试剂盒检测体系的布局方式。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
(1)肺结节良恶性鉴别的多基因组合方式
所述多基因组合可为EGFR/KRAS的基因突变/融合组合或EGFR/KRAS/ALK/ROS1的基因突变/融合组合或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1的基因突变/融合组合或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA的基因突变/融合组合。
(2)检测EGFR/KRAS或EGFR/KRAS/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA基因突变/融合的试剂盒。
所述试剂盒含有检测EGFR/KRAS基因突变的引物及探针。
或含有检测EGFR/KRAS/ALK/ROS1基因突变/融合的引物及探针。
或含有检测EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1基因突变/融合的引物及探针。
或含有检测EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA基因突变/融合的引物及探针。
进一步的，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTPs、和二氯化镁、DNA聚合酶、逆转录酶等适合PCR检测的试剂。
优选的，所述试剂盒中包含组分的终浓度如下：1×PCRbuffer、MgCl22.5mM、 dNTP250μM、引物250nM、扩增阻滞探针500nM、探针500nM、DNA聚合酶1U、反转录酶1U和DNA模板0.05-20ng。
(3)检测EGFR/KRAS或EGFR/KRAS/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA基因突变/融合时检测体系的布局方式。优选的布局方式如表2所示。
(4)用本发明上述试剂盒进行人肺结节良恶性检测、鉴别或辅助诊断的方法，包括如下步骤：
(a)样本收集：收集患者样品(如血液、痰液等)作为待测样品；
(b)样本提取：从待测样品中提取DNA和/或RNA；
(c)样本检测：利用本发明试剂盒进行荧光定量PCR扩增反应；
(d)检测结果判读：根据△Ct值判断待测样品中EGFR/KRAS或EGFR/KRAS/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA基因突变/融合情况，若△Ct值<切值，表明扩增区段发生相应突变/融合，检测结果为阳性。
本发明的有益效果在于：(1)使用荧光定量PCR技术对特定基因突变/融合组合进行检测即可对肺结节良恶性进行鉴别和临床辅助诊断，提供临床指导，减轻临床压力。(2)本试剂盒检测结果与临床病理诊断结果相比：检测准确度高，灵敏度达50％，特异性达100％。可辅助临床对肺结节特性进行判断。(3)使用体验样品如血浆即可达到检测目的，更加便捷。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中所使用的仪器如下：Lightcycler480、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。
本发明中所使用的试剂：DNA聚合酶(罗氏公司)、逆转录酶(thermo公司)、10×PCRBuffer(罗氏公司)、MgCl2(罗氏公司)、dNTP(TaKaRa)、纯化水。
本发明中所使用探针：所有探针纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。
实施例1
本实施例以EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA基因突变/融合检测试剂盒为例来阐述本发明相关优化结果。本实施例试剂盒包含本发明涉及的全部突变/融合位点，在此仅以L858R(EGFR基因突变)、G12D(KRAS基因突变)、EML4exon13-ALKexon20(ALK融合基因)、CD74exon6-ROS1exon32(ROS1融合基因)为例来举例说明如何对目标基因进行检测和体系优化。
(1)反应质控品获得：
1)EGFR/KRAS：EGFR/KRAS基因阴性质控品为EGFR/KRAS基因未突变的人血液DNA，无需稀释直接使用；EGFR/KRAS基因阳性质控品由EGFR基因L858R位点突变的序列及KRAS基因G12D位点突变的序列连接到pUC57-Amp载体，然后转化大肠杆菌后，经提取纯化，然后稀释成浓度为100拷贝数(浓度约为10-6ng/ul)。其中含EGFR(L858R)及KRAS(G12D)突变/融合位点的具突变/融合体序列如下：
L858R:
Figure PCTCN2019123432-appb-000001
Figure PCTCN2019123432-appb-000002
G12D：
Figure PCTCN2019123432-appb-000003
2)ALK/ROS1：ALK/ROS1基因阴性质控品为ALK/ROS1基因未融合的人血液RNA，无需稀释直接使用；ALK/ROS1基因阳性质控品由EML4exon13-ALKexon20(ALK融合基因)位点的融合序列及CD74exon6-ROS1exon32(ROS1融合基因)位点的融合序列连接到pUC57-Amp载体，然后转化大肠杆菌后，经提取纯化，然后稀释成浓度为100拷贝数(浓度约为10-6ng/ul)。其中含ALK及ROS1融合的阳性序列如下：
EML4exon13；ALKexon20
Figure PCTCN2019123432-appb-000004
CD74exon6；ROS1exon32
Figure PCTCN2019123432-appb-000005
(2)引物探针序列获得：根据含突变/融合位点的序列参照专利：CN104762408B CN102776291BCN 104805206B进行引物、探针、扩增阻滞探针的设计。设计检测EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53基因突变/融合及融合的引物。(3)根据设计的引物和扩增阻滞探针，对各组分在如下条件下进行优化：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mMdNTPs、0.1～1μM探针、0.1～2μM扩增阻滞探针、0.05～2ng/μl模版DNA、1～5mM二氯化镁，反应程序①为50-65℃逆转录15-30分钟；②92～97℃预变性同时灭活逆转录酶30～60s；③92～97℃变性10～20s，50～65℃退火及延伸10～30s，进行35～55个循环且收集荧光信号；④最后40℃保存。
(4)荧光定量结束后根据CT值进行结果判定，具体方法如下：
①无模板对照(NTC)的信号无曲线升起，说明实验无污染，可继续分析实验情况。若Ct值≥40.0时，有微弱的扩增，对实验的影响极微，可以继续分析实验情况。
②所有阳性质控位点的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
③样本有效性(Control)的判读如下：
外控Ct＜25，样本加入过量，建议稀释后重新检测。
外控25≤Ct≤35，样本加入量适中。
外控Ct≥35，样本含量过低，需重新制备样本或增加使用量进行检测。
④样品的内标信号均应有曲线升起，说明实验正常；若无信号升起或部分无信号升起，说明加入的样本含有PCR抑制剂或样本加入量不够，需要重新提取后再检测或增加用量后再检测，但如果管内FAM或HEX通道有信号，可能是由于突变/融合序列的扩增抑制了内标序列的扩增，结果仍然可信。
⑤计算各位点的检测Ct值。
⑥检测结果的判定：首先确定样品各个反应管各通道的突变/融合Ct值，然后确定该样品的外控Ct值。计算样品各位点的ΔCt值＝突变/融合Ct值-外控Ct值。突变/融合Ct值是指样品突变/融合信号对应的Ct值；外控Ct值是指样品对应的外控信号(FAM信号)的Ct值。
⑦若反应管的某一通道的ΔCt值小于相对应的ΔCt的Cut-off值，则该样品为该位点对应的突变/融合阳性；反之则为阴性或低于本试剂盒的检测下限。
(5)实验结果
对反应体系的优化结果显示，如表1所示的反应体系效果最佳。
表1、最优反应体系
原材料 体系(反应最终体系浓度)
10×PCR buffer 1×
MgCl 2 2.5mM
dNTP 250μM
引物(上下游) 250nM
扩增阻滞探针 500nM
探针 500nM
DNA聚合酶 1U
反转录酶 1U
DNA模板 0.05-20ng
总体系 20μL
最佳反应条件为：①为50-65℃逆转录15分钟；②95℃预变性同时灭活逆转录酶40s；③
95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，进行35～55个循环且收集荧光信号；④最后40℃保存。
最佳基因组合方式如表2所示。
表2、检测EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA基因的布局
Figure PCTCN2019123432-appb-000006
其余组合如：EGFR/KRAS或EGFR/KRAS/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1基因突变/融合的试剂盒参照上述表进行相应通道的删减可获得。各位点的切值如表3所示
表3、检测EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA试剂盒的各孔位的切值
孔号 FAM/HEX切值
1 8
2 10
3 8
4 8
5 7
6 6
7 11
8 11
实施例2
利用优化的检测体系和反应程序分析EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA突变/融合位点的最低检测限度。
最低检测限度研究主要包括以下三方面：1)突变/融合比例最低检测限的研究：在DNA浓度一定的条件下能检出的最低突变/融合DNA的比例；2)DNA浓度的最低检测限的研究：在突变/融合比例一定的情况下能检出的最低DNA浓度；3)最低拷贝数研究：在突变/融合比例一定的情况下能检出的最低拷贝数。
表3、突变/融合率最低检测限度结果
Figure PCTCN2019123432-appb-000007
表4、检测浓度最低检测限度结果
Figure PCTCN2019123432-appb-000008
表5、最低检测拷贝数结果
Figure PCTCN2019123432-appb-000009
结果显示，最低检测拷贝数研究结果表明其最低检测限度可达到1-5拷贝数。
实施例3
收集30例非小细胞肺癌组织样本及其术前血液样本，样本来源于浙江省肿瘤医院生物样本库、苏州普瑞迈德检验所。组织样本用为真生物石蜡组织DNA提取试剂盒(柱式法)
Cat.NO.：WZ1102及为真生物石蜡包埋组织RNA提取试剂盒Cat.NO.：WZ1201分别提取DNA及RNA，血液样本采用凯杰生物QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(55114)提取试剂盒进行提取。然后使用实施例1中的组合、EGFR/KRAS组合、EGFR/KRAS/ALK/ROS1组合、EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1组合分别检测30例病人的相关基因突变/融合情况，突变检测结果以组织样本的测序结果金标准，融合检测结果以组织样本免疫组化的结果为金标准。具体结果统计如下表6-1至6-4。
表6-1实施例1方法的检测结果：
样本编号 组织样本检测结果 血浆样本检测结果 金标准结果
1 EGFR EGFR 19-del
2 野生 野生 野生
3 EGFR EGFR L858R
4 EGFR EGFR L858R
5 野生 野生 野生
6 EGFR 野生 19-del
7 BRAF BRAF V600E
8 野生 野生 野生
9 KRAS KRAS G12D
10 野生 野生 野生
11 EGFR EGFR 19-del
12 EGFR EGFR L858R
13 野生 野生 野生
14 野生 野生 野生
15 野生 野生 野生
16 EGFR EGFR 19-del
17 野生 野生 野生
18 野生 野生 野生
19 野生 野生 野生
20 EGFR EGFR 19-del
21 EGFR 野生 19-del
22 EGFR EGFR L858R
23 野生 野生 野生
24 ALK ALK ALK
25 野生 野生 野生
26 野生 野生 野生
27 PIK3CA PIK3CA H1047R
28 野生 野生 野生
29 野生 野生 野生
30 野生 野生 野生
表6-2 EGFR/KRAS组合检测结果：
样本编号 组织样本检测结果 血浆样本检测结果 金标准结果
1 EGFR EGFR 19-del
2 野生 野生 野生
3 EGFR EGFR L858R
4 EGFR EGFR L858R
5 野生 野生 野生
6 EGFR 野生 19-del
7 野生 野生 V600E
8 野生 野生 野生
9 KRAS KRAS G12D
10 野生 野生 野生
11 EGFR EGFR 19-del
12 EGFR EGFR L858R
13 野生 野生 野生
14 野生 野生 野生
15 野生 野生 野生
16 EGFR EGFR 19-del
17 野生 野生 野生
18 野生 野生 野生
19 野生 野生 野生
20 EGFR EGFR 19-del
21 EGFR 野生 19-del
22 EGFR EGFR L858R
23 野生 野生 野生
24 野生 野生 ALK
25 野生 野生 野生
26 野生 野生 野生
27 野生 野生 H1047R
28 野生 野生 野生
29 野生 野生 野生
30 野生 野生 野生
表6-3 EGFR/KRAS/ALK/ROS1检测结果
样本编号 组织样本检测结果 血浆样本检测结果 金标准结果
1 EGFR EGFR 19-del
2 野生 野生 野生
3 EGFR EGFR L858R
4 EGFR EGFR L858R
5 野生 野生 野生
6 EGFR 野生 19-del
7 野生 野生 V600E
8 野生 野生 野生
9 KRAS KRAS G12D
10 野生 野生 野生
11 EGFR EGFR 19-del
12 EGFR EGFR L858R
13 野生 野生 野生
14 野生 野生 野生
15 野生 野生 野生
16 EGFR EGFR 19-del
17 野生 野生 野生
18 野生 野生 野生
19 野生 野生 野生
20 EGFR EGFR 19-del
21 EGFR 野生 19-del
22 EGFR EGFR L858R
23 野生 野生 野生
24 ALK ALK ALK
25 野生 野生 野生
26 野生 野生 野生
27 野生 野生 H1047R
28 野生 野生 野生
29 野生 野生 野生
30 野生 野生 野生
表6-4 EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1检测结果
样本编号 组织样本检测结果 血浆样本检测结果 金标准结果
1 EGFR EGFR 19-del
2 野生 野生 野生
3 EGFR EGFR L858R
4 EGFR EGFR L858R
5 野生 野生 野生
6 EGFR 野生 19-del
7 BRAF BRAF V600E
8 野生 野生 野生
9 KRAS KRAS G12D
10 野生 野生 野生
11 EGFR EGFR 19-del
12 EGFR EGFR L858R
13 野生 野生 野生
14 野生 野生 野生
15 野生 野生 野生
16 EGFR EGFR 19-del
17 野生 野生 野生
18 野生 野生 野生
19 野生 野生 野生
20 EGFR EGFR 19-del
21 EGFR 野生 19-del
22 EGFR EGFR L858R
23 野生 野生 野生
24 ALK ALK ALK
25 野生 野生 野生
26 野生 野生 野生
27 野生 野生 H1047R
28 野生 野生 野生
29 野生 野生 野生
30 野生 野生 野生
表7本发明试剂盒检测配对肺癌组织及血浆样本与金标准对比统计结果
检测试剂盒 组织阳性符合率 组织阴性符合率 组织总体符合率 血液阳性符率 血液阴性符合率 血液总体符合率
实施例1 100％ 100％ 100％ 85％ 100％ 93.3％
EGFR/KRAS 78.5％ 100％ 90％ 64.4％ 100％ 83.3％
EGFR/KRAS/ALK/ROS1 85.7％ 100％ 93.3％ 71.4％ 100％ 86.7％
EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1 92.8％ 100％ 96.7％ 78.6％ 100％ 90％
结果显示，使用本发明的方法检测肺癌组织样本，其检测结果与金标准相比符合率为78.5％-100％。其中实施例1所涉及的检测位点最全，其检测符合率也最高。但其他基因组合方式：EGFR/KRAS；EGFR/KRAS/ALK/ROS1；EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1等也能获得较高的符合率；使用本发明的方法检测血液样本，其检测侧结果与金标准相比，符合率为64.4-85％。综上，本发明检测肺癌样本中的突变/融合，其检测结果与金标准相比符合率较高。其阴性符合率可达100％，准确性较高。以本发明所涉及的各种基因组合方式均能获得相似的效果。
实施例4
采集30例首次CT诊断为不确定结节或非钙化结节且后续经过手术的有病理诊断信息的肺结节患者的术前血浆样本。样本来源于苏州大学附属第二医院，上海胸科医院。用凯杰生物的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(55114)共提取试剂盒进行提取。然后使用实施例1的方法分别检测30例病人的相关基因突变/融合情况，以临床诊断结果为金标准。
具体结果统计如下表8-1至表8-4。
表8-1实施例1方法的检测结果：
样本编号 试剂盒检测结果 病理检测结果
1 野生 AIS(恶性)
3 野生 MIA(恶性)
4 EGFR MIA(恶性)
6 野生 IAC(恶性)
9 EGFR IAC(恶性)
10 野生 IAC(恶性)
11 ALK AIS(恶性)
12 KRAS MIA(恶性)
16 EGFR MIA(恶性)
17 野生 AIS(恶性)
19 EGFR MIA(恶性)
20 KRAS AIS(恶性)
21 野生 MIA(恶性)
26 野生 MIA(恶性)
27 KRAS AIS(恶性)
28 野生 MIA(恶性)
2 野生 炎症(良性)
5 野生 炎症(良性)
7 野生 炎症(良性)
8 野生 炎症(良性)
13 野生 炎症(良性)
14 野生 炎症(良性)
15 野生 炎症(良性)
18 野生 炎症(良性)
22 野生 炎症(良性)
23 野生 AAH(良性)
24 野生 AAH(良性)
25 野生 AAH(良性)
29 野生 AAH(良性)
30 野生 AAH(良性)
表8-2 EGFR/KRAS组合检测结果
样本编号 试剂盒检测结果 病理检测结果
1 野生 AIS(恶性)
3 野生 MIA(恶性)
4 EGFR MIA(恶性)
6 野生 IAC(恶性)
9 EGFR IAC(恶性)
10 野生 IAC(恶性)
11 野生 AIS(恶性)
12 KRAS MIA(恶性)
16 EGFR MIA(恶性)
17 野生 AIS(恶性)
19 EGFR MIA(恶性)
20 KRAS AIS(恶性)
21 野生 MIA(恶性)
26 野生 MIA(恶性)
27 KRAS AIS(恶性)
28 野生 MIA(恶性)
2 野生 炎症(良性)
5 野生 炎症(良性)
7 野生 炎症(良性)
8 野生 炎症(良性)
13 野生 炎症(良性)
14 野生 炎症(良性)
15 野生 炎症(良性)
18 野生 炎症(良性)
22 野生 炎症(良性)
23 野生 AAH(良性)
24 野生 AAH(良性)
25 野生 AAH(良性)
29 野生 AAH(良性)
30 野生 AAH(良性)
表8-3 EGFR/KRAS/ALK/ROS1组合检测结果
样本编号 试剂盒检测结果 病理检测结果
1 野生 AIS(恶性)
3 野生 MIA(恶性)
4 EGFR MIA(恶性)
6 野生 IAC(恶性)
9 EGFR IAC(恶性)
10 野生 IAC(恶性)
11 ALK AIS(恶性)
12 KRAS MIA(恶性)
16 EGFR MIA(恶性)
17 野生 AIS(恶性)
19 EGFR MIA(恶性)
20 KRAS AIS(恶性)
21 野生 MIA(恶性)
26 野生 MIA(恶性)
27 KRAS AIS(恶性)
28 野生 MIA(恶性)
2 野生 炎症(良性)
5 野生 炎症(良性)
7 野生 炎症(良性)
8 野生 炎症(良性)
13 野生 炎症(良性)
14 野生 炎症(良性)
15 野生 炎症(良性)
18 野生 炎症(良性)
22 野生 炎症(良性)
23 野生 AAH(良性)
24 野生 AAH(良性)
25 野生 AAH(良性)
29 野生 AAH(良性)
30 野生 AAH(良性)
表8-4 EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1组合检测结果
样本编号 试剂盒检测结果 病理检测结果
1 野生 AIS(恶性)
3 野生 MIA(恶性)
4 EGFR MIA(恶性)
6 野生 IAC(恶性)
9 EGFR IAC(恶性)
10 野生 IAC(恶性)
11 ALK AIS(恶性)
12 KRAS MIA(恶性)
16 EGFR MIA(恶性)
17 野生 AIS(恶性)
19 EGFR MIA(恶性)
20 KRAS AIS(恶性)
21 野生 MIA(恶性)
26 野生 MIA(恶性)
27 KRAS AIS(恶性)
28 野生 MIA(恶性)
2 野生 炎症(良性)
5 野生 炎症(良性)
7 野生 炎症(良性)
8 野生 炎症(良性)
13 野生 炎症(良性)
14 野生 炎症(良性)
15 野生 炎症(良性)
18 野生 炎症(良性)
22 野生 炎症(良性)
23 野生 AAH(良性)
24 野生 AAH(良性)
25 野生 AAH(良性)
29 野生 AAH(良性)
30 野生 AAH(良性)
表9本发明试剂盒检测配对肺癌组织及血浆样本与金标准对比统计结果
检测试剂盒 阳性符合率 阴性符合率 总体符合率
实施例1 50％ 100％ 73.3％
EGFR/KRAS 43.75％ 100％ 70％
EGFR/KRAS/ALK/ROS1 50％ 100％ 73.3％
EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1 50％ 100％ 73.3％
结果显示，使用本发明的方法检测肺结节样本，其检测结果与金标准相比符合率为70％-73.3％。其中阳性符合率43.75％-50％，阴性符合率100％，特异性较高。说明本方法可用于肺结节样本良恶性的辅助诊断。
根据以上结果可知本发明的方法对于肺结节血液(具体的为血浆)样品具有较好 的预期效果，对于肺癌组织和血液(具体的为血浆)样品同样适用，而且本领域技术人员可以容易预期对于唾液、尿液、痰液等体液样品，本发明的组合同样具有预期的检测效果。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

  1. 用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合，其特征在于组合为：EGFR/KRAS或EGFR/KRAS/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA。
  2. 一种用于肺结节良恶性鉴别的试剂盒，其特征在于：对权利要求1所述的基因突变/融合组合进行检测。
  3. 一种使用权利要求2所述试剂盒的方法，其特征在于：使用时检测体系的布局方式为：
    Figure PCTCN2019123432-appb-100001
  4. 根据权利要求3的方法，进一步的具体布局方式为：
    Figure PCTCN2019123432-appb-100002
  5. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括引物和探针、其他合适的试剂。
  6. 基因突变/融合组合作为检测对象用于制备检测肺结节良恶性的试剂盒的用途，所述基因突变组合为：EGFR/KRAS或EGFR/KRAS/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA。
  7. 检测基因突变/融合组合的寡核苷酸用于制备检测肺结节良恶性的试剂盒的用途，所述基因突变/融合组合为：EGFR/KRAS或EGFR/KRAS/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1或EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1/STK11/NRAS/TP53/PIK3CA。
  8. 根据权利要求7所述的寡核苷酸，其为引物和/或探针，探针为常规探针或扩增阻滞探针。
  9. 权利要求6或7所述的用途，其特征在于：检测肺结节良恶性的方法中使用的 检测样品是包含DNA和/或RNA的人体组织或体液。
  10. 根据权利要求9所述的用途，所述样品为肺结节组织或血液、血浆、血细胞、唾液、痰液、尿液等。
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