CN110863053A

CN110863053A - 一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法

Info

Publication number: CN110863053A
Application number: CN201911306300.1A
Authority: CN
Inventors: 闫文瑞; 林威; 谢东瑜; 蔡兴盛; 李梦真; 邓泱泱; 杨冬成
Original assignee: Guangzhou Mygene Medical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Mygene Medical Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2020-03-06

Abstract

本发明公开了一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法，该方法根据扩增曲线鉴定EGFR vIII突变体；操作简便：只需一个反应即可实现鉴别；检测速度快：全部操作过程仅需两小时；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

Description

一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法

技术领域

本发明涉及核酸领域，具体涉及一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法。

背景技术

胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是成人中最常见的恶性脑部肿瘤，并且是容易致死癌症之一。GBM分为原发性肿瘤(占比大于90％)和由低级胶质瘤引起的继发性肿瘤。

GBM患者通常会发生EGFR基因扩增和EGFR vIII形式的突变体。EGFR扩增与高水平的EGFR蛋白表达相关，EGFR vIII突变体与持续的信号激活有关。

EGFR，也称为HER1或ERBB1，属于ERBB跨膜受体酪氨酸激酶家族。该受体酪氨酸激酶家族包括ERBB1、ERBB2、ERBB3和ERBB4，或者称为HER1-4。EGFR与表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、肝素结合EGF(HBEGF)、表蛋白(epigen)或表皮调节蛋白(epiregulin)等配体结合后可以形成同源二聚体或与其他ERBB家族成员形成异二聚体。

EGFR二聚体化后导致其细胞膜内的C末端磷酸化(自磷酸化)，可以作为SRC同源2(SH2)域的结合位点，也可以结合信号蛋白，包括生长因子受体结合蛋白2(GRB2)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、含SRC同源性2结构域的转化蛋白1(SHC1)以及信号转导和转录激活蛋白(STAT)。这些信号蛋白可以调节下游的生理和病理过程。

EGFR激酶结构域中的激活突变可在非小细胞肺癌(NSCLC)中检测到，如21外显子中的L858R突变和19外显子缺失突变。然而，21外显子中的L858R突变和19外显子缺失突变在GBM中发生概率低。在GBM中经常出现独特的EGFR缺失和点突变。其中，GBM中发现的EGFR突变体，最常见的是EGFR vIII。与正常的EGFR相比，EGFR vIII缺少氨基酸6–273，缺失这268个氨基酸后，新合成的蛋白在5和274位氨基酸之间形成一个带有甘氨酸残基的连接位点。这种突变导致EGFR外显子2–7缺失，使突变受体不能与任何已知的配体结合。

虽然EGFR vIII不包含配体结合域，不能与任何已知的配体结合，但是其处于自身结构性激活状态。EGFR vIII可以促进细胞增殖、血管生成、以及在不同模型中可促进肿瘤入侵。研究表明，EGFR vIII仅在肿瘤中发现有表达，而正常组织中无表达，表明EGFR vIII是一个很好的用于靶向治疗的候选靶点。

目前，抗EGFR/EGFR vIII的治疗手段，包括小分子TKI、抗体、疫苗、嵌合抗原受体(CAR)T细胞和基于RNA的疗法。EGFR vIII异常信号已被证明在驱动肿瘤进展中发挥重要作用，并且通常与不良预后相关。

针对EGFR vIII的检测方法有二代测序、一代测序和免疫组化(IHC)法。二代测序方法虽然可以对多个样本同时检测，也可以对多个基因位点同时检测，但成本较高、实验周期较长，且数据分析需要专门的生物信息学人员；一代测序方法可以直观的判读碱基的点突变、插入、缺失和基因融合，但灵敏度较低，当突变发生的频率较低(低于15％)时不易检出。免疫组化(IHC)可以检测EGFR vIII的表达水平，但是其特异性依赖抗体的特异性，而且判读有一定的主观性，也需要专业的人员判读。

因此，目前急需一种操作相对简易、检测结果可靠且可快速检测EGFR vIII突变体的方法。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠。

本发明的目的在于提供一种检测EGFR vIII突变体的引物及探针。

本发明的另一目的在于提供一种检测EGFR vIII突变体方法。

本发明的再一目的在于提供一种检测EGFR vIII突变体试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供了一种检测EGFR vIII突变体的荧光PCR引物，其核苷酸序列如下所示：

F1：5'-GCTCTTCGGGGAGCAGCGATGCGAC-3'；

R1：5'-AGGCTCGGACGCACGAGCCGTGATC-3'。

本发明的第二方面，提供了一种检测EGFR vIII突变体的荧光PCR探针，其核苷酸序列如下所示：

探针P1：5'-AAAAGAAAGGTAATTATGTG-3'。

根据本发明的实施例，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、JOE、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种。

本发明的第三方面，提供了一种检测EGFR vIII突变体的荧光PCR试剂盒，该试剂盒中含有前面所述的引物。

根据本发明的实施例，该试剂盒中还含有前面所述的探针。

本发明的第三方面，提供了一种检测EGFR vIII突变体的荧光PCR方法，包括以下步骤：

1)从样本中提取RNA；

2)以提取的RNA为模板，逆转录为cDNA，使用前面所述的引物对F1、R1，及前面所述探针P1进行荧光PCR扩增反应获得扩增产物；

3)对扩增产物进行扩增曲线分析，确定样本中是否存在EGFR vIII突变体。

根据本发明的实施例，步骤2)中的荧光PCR扩增反应体系为：

根据本发明的实施例，步骤2)中的荧光PCR扩增反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火40s；循环35～45次。

根据本发明的实施例，步骤3)中所述扩增曲线分析的具体分析过程为：出现探针FAM 5’端标记荧光的荧光扩增曲线说明EGFR vIII突变体阳性，扩增出现探针TAMRA 5’端标记荧光的荧光扩增曲线说明EGFR vIII突变体阳性；未出现荧光扩增曲线表明样本中不含有EGFR vIII突变体，为阴性。

本发明的有益效果是：

1)实验操作简便，检测速度快。

一代测序方法需要对PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，使用纯化试剂盒纯化或琼脂糖凝胶回收产物纯化，这会增加实验操作时间，而且可能造成样本的交叉污染；二代测序法建库、上机测序、数据分析实验周期长，而且数据分析需要专门的生物信息学人员进行操作；本试剂盒在PCR扩增后不需要琼脂糖凝胶电泳，可以直接上机检测，减少操作时间，降低样本交叉污染的可能，而且实验操作周期短，收到样本后，实验操作与上机检测额、数据分析，仅需要两小时就可以完成。

2)结果容易判读，灵敏度高、特异性好。

一代测序方法对低频突变无法检测到，本试剂盒可以对RNA总量为1ng、EGFR vIII突变体的拷贝数20copies的样本准确检测。对于样本获取量少时也可以得到准确的结果。

本试剂盒仅对EGFR vIII突变体有扩增，而对EGFR其他突变如19外显子缺失(19del)、L858R、T790M点突变以及20外显子插入(20ins)的样本无扩增；对存在ALK融合、ROS1融合、RET融合的样本也没有扩增。说明本试剂盒特异性好，不会对非目标突变产生扩增而造成假阳性。

3)节省成本。

对比二代测序方法，文库构建、上机测序、数据分析，成本高昂，本试剂盒经优化后的体系，成本小，收益高。对于临床未满足的EGFR vIII突变体单基因检测，提供了选择。

本试剂盒所需的仪器平台为荧光定量PCR系统，对比昂贵的二代测序仪器，荧光定量PCR系统价格较低且仪器分布广泛。本试剂盒可以兼容常见的荧光定量PCR平台，更方便临床的应用推广。

本试剂盒为单基因检测，对比高昂的二代测序成本，本试剂盒的成本极大的降低，可以降低患者的检测成本，从而为更好的服务于受检者。

本试剂盒的重点是通过设计多条引物、探针组合，针对EGFR vIII突变体的转录本区域存在连续碱基的情况下，设计特异的MGB探针，筛选出较优的探针，极大的提高检测体系的灵敏度。对于RNA总量为1ng、EGFR vIII突变体的拷贝数20copies的样本可以实现准确检测。本试剂盒灵敏度的提高还在于对引物的浓度和探针浓度优化，合适的引物和探针浓度，进一步提高了检测体系的灵敏度和特异性。

本试剂盒对镁离子的浓度优化调整，确定最终镁离子的浓度为4mM时，扩增效率高，荧光信号强。因此一款灵敏度高、特异性好的检测试剂盒，可以给未被满足的市场提供选择。

附图说明

图1是本试剂盒对人工合成的EGFR vIII突变体RNA阳性参考品和阴性参考品的检测结果。

图2是本试剂盒对EGFR vIII突变体阳性质粒的检测灵敏度的扩增曲线。

图3是本试剂盒对EGFR vIII突变体阳性质粒的检测灵敏度的标准曲线。

图4是本试剂盒对EGFR常见的突变位点和常见的融合突变的检测特异性。

图5是本试剂盒对3例临床标本的检测扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1引物及探针

经过对所设计的大量引物和探针进行筛选后，发现下列引物对及探针，对EGFRvIII突变体的检测效果最好，碱基序列如表1和表2。

表1 EGFR vIII以及内参基因的核苷酸序列如下：

表2 EGFR vIII突变体和内参基因检测的引物和探针核苷酸序列

所述的探针P1、P2序列5’端标记的荧光基团选自FAM、JOE、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列P1、P2序列3’端标记的猝灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ中一种。

使用本发明引物、探针用于检测EGFR vIII突变体，将提取的组织的总RNA经反转录为cDNA，设计合适的引物和taqman MGB探针，可以实现良好的单基因检测目的，且灵敏度高、特异性强。

反转录体系：

荧光定量PCR的扩增反应体系分两个，分别是EGFR vIII突变体扩增体系和内参基因扩增体系：

本试剂盒扩增体系1：EGFR vIII突变体扩增体系

本试剂盒扩增体系2：内参基因扩增体系

荧光定量PCR反应的条件是：95℃预变性5～15min；94～95℃变形10～15s，58～63℃退火30～40s，循环35～45次。

实施例2阳性参考品和阴性参考品检测

将人工合成的EGFR vIII突变体RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增实验，发现有扩增曲线，说明该样本存在EGFR vIII突变体。

使用人工合成EGFR vIII突变体的RNA，以50ng/μL的293RNA为介质稀释，EGFRvIII突变体拷贝数分别为2000copies、200copies。然后对稀释后的EGFR vIII突变体RNA进行反转录。

使用本试剂盒检测混合后的阳性参考品的投入量分别为：10ng，2000copies；10ng，200copies；1ng，200copies；1ng，20copies。扩增CT值见下表3。扩增曲线见图1.

结果：本试剂盒可以检测到的RNA总量为1ng、EGFR vIII突变体的拷贝数20copies的样本。

将野生型293T细胞的RNA(简称293RNA)进行逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增实验，同时进行阴性对照品ddH2O(NTC)检测，发现293RNA没有扩增曲线，说明该样本不存在EGFR vIII突变体；阴性对照品ddH2O(NTC)无扩增曲线，表明实验体系无污染。

表3本试剂盒对阳性参考品和阴性参考品的扩增Ct值

注：

1.参考品投入量中，以质量表示293RNA的投入量，以拷贝数表示人工合成EGFRvIII突变体RNA的投入量。

2.Ct值为Undetermined，表示该检测孔没有扩增。

实施例3阳性对照品灵敏度实验

使用本试剂盒的体系，将阳性质粒标准品稀释至10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL，扩增曲线如图2所示；标准曲线如图3所示，标准曲线的扩增效率为100.35％；扩增的Ct值见下表4。

表4本试剂盒对梯度稀释的阳性质粒标准品扩增Ct值

由阳性对照品质粒的扩增可知，本试剂盒的检测灵敏度为100copies的阳性质粒标准品。

实施例4临床样本检测

1)提取样本RNA，并经Qubit荧光定量；

2)将提取的RNA逆转录为cDNA，逆转录体系使用随机引物；逆转录试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司；

逆转录体系为：

逆转录反应程序：50℃，30min；85℃，10min；热盖温度：105℃；

3)以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应并收集荧光信号；

本试剂盒扩增体系1：EGFR vIII突变体检测扩增体系

本试剂盒扩增体系2：内参基因扩增体系

荧光定量PCR反应的条件是：95℃预变性10min；95℃变形10s；60℃退火40s；循环35～45次。延伸阶段收集荧光信号。

4)结果分析：

①阳性：当阴性对照组无扩增曲线且特定阳性对照组具有明显的扩增曲线，检测样本的扩增曲线有明显的指数增长期(出现探针FAM 5’端标记荧光的荧光扩增曲线)，说明该样本存在EGFR vIII突变体；

②阴性：当阴性对照组无扩增曲线且特定阳性对照组具有明显的扩增曲线，但检测样本无Ct值且曲线无明显的指数增长期(出现探针TAMRA5’端标记荧光的荧光扩增曲线)，说明该样本不存在EGFR vIII突变体。

实施例5临床样本特异性实验

分别使用EGFR 19外显子缺失(19del)、L858R点突变、T790M点突变以及20外显子插入(20ins)的样本各1例，提取RNA后，反转录为cDNA，使用本发明建立的EGFR vIII突变体检测体系对cDNA检测。

分别使用ALK融合、ROS1融合、RET融合的样本各1例，提取RNA后，反转录为cDNA，使用EGFR vIII突变体检测体系对cDNA检测。

结果：内参基因有扩增曲线，EGFR vIII没有扩增曲线，表明该样本不存在EGFRvIII突变体，说明本发明试剂盒的特异性良好，不会对非EGFR vIII突变体的突变类型扩增。检测结果ct值和扩增曲线如表5、图4。

表5本试剂盒对EGFR常见的突变位点和常见的融合突变检测特异性

注：Undetermined表示没有扩增，没有Ct值。

由图4可知，临床样本的EGFR vIII位点的Ct值为Undetermined，表示没有扩增，扩增曲线末尾稍微抬起，可能是荧光背景信号造成的，不影响对EGFR vIII位点的结果判读。

实施例6

将3例肺癌样本进行RNA的提取，反转录为cDNA，使用本发明试剂盒检测。检测结果为EGFR vIII突变体阳性，与NGS的结果一致(表6)。

表6 3例临床样本本试剂盒检测结果与NGS检测结果对比

注：Undetermined表示没有扩增，没有Ct值。

图5中可知，本试剂盒检测的3例临床样本，内参基因扩增正常；NTC无扩增；EGFRvIII位点均有扩增曲线，说明这3例样本均为EGFR vIII突变体阳性。本试剂盒检测结果与NGS的检测结果一致。

实施例7

一种试剂盒，包括以下部分：

1)EGFR vIII突变体检测的引物F1，R1以及探针P1；

2)内参基因检测的引物F2，R2以及探针P2；

3)阴性对照品分两种：分别是无模板对照ddH2O和野生型293T细胞的RNA，以下简称293RNA；

阳性对照品分两种：分别是人工合成EGFR vIII突变体RNA序列和本实验室构建的EGFR vIII突变体质粒。多重质控避免检测结果的假阳性和假阴性。

4)逆转录酶、逆转录缓冲液、DNA聚合酶、dNTP以及实时荧光PCR反应缓冲液。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州迈景基因医学科技有限公司

<120> 一种检测EGFR vIII突变体的引物、探针及方法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 742

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccggcgcag cgcggccgca gcagcctccg ccccccgcac ggtgtgagcg cccgacgcgg 60

ccgaggcggc cggagtcccg agctagcccc ggcggccgcc gccgcccaga ccggacgaca 120

ggccacctcg tcggcgtccg cccgagtccc cgcctcgccg ccaacgccac aaccaccgcg 180

cacggccccc tgactccgtc cagtattgat cgggagagcc ggagcgagct cttcggggag 240

cagcgatgcg accctccggg acggccgggg cagcgctcct ggcgctgctg gctgcgctct 300

gcccggcgag tcgggctctg gaggaaaaga aaggtaatta tgtggtgaca gatcacggct 360

cgtgcgtccg agcctgtggg gccgacagct atgagatgga ggaagacggc gtccgcaagt 420

gtaagaagtg cgaagggcct tgccgcaaag tgtgtaacgg aataggtatt ggtgaattta 480

aagactcact ctccataaat gctacgaata ttaaacactt caaaaactgc acctccatca 540

gtggcgatct ccacatcctg ccggtggcat ttaggggtga ctccttcaca catactcctc 600

ctctggatcc acaggaactg gatattctga aaaccgtaaa ggaaatcaca gggtttttgc 660

tgattcaggc ttggcctgaa aacaggacgg acctccatgc ctttgagaac ctagaaatca 720

tacgcggcag gaccaagcaa ca 742

<210> 2

<211> 1128

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggatgatg atatcgccgc gctcgtcgtc gacaacggct ccggcatgtg caaggccggc 60

ttcgcgggcg acgatgcccc ccgggccgtc ttcccctcca tcgtggggcg ccccaggcac 120

cagggcgtga tggtgggcat gggtcagaag gattcctatg tgggcgacga ggcccagagc 180

aagagaggca tcctcaccct gaagtacccc atcgagcacg gcatcgtcac caactgggac 240

gacatggaga aaatctggca ccacaccttc tacaatgagc tgcgtgtggc tcccgaggag 300

caccccgtgc tgctgaccga ggcccccctg aaccccaagg ccaaccgcga gaagatgacc 360

cagatcatgt ttgagacctt caacacccca gccatgtacg ttgctatcca ggctgtgcta 420

tccctgtacg cctctggccg taccactggc atcgtgatgg actccggtga cggggtcacc 480

cacactgtgc ccatctacga ggggtatgcc ctcccccatg ccatcctgcg tctggacctg 540

gctggccggg acctgactga ctacctcatg aagatcctca ccgagcgcgg ctacagcttc 600

accaccacgg ccgagcggga aatcgtgcgt gacattaagg agaagctgtg ctacgtcgcc 660

ctggacttcg agcaagagat ggccacggct gcttccagct cctccctgga gaagagctac 720

gagctgcctg acggccaggt catcaccatt ggcaatgagc ggttccgctg ccctgaggca 780

ctcttccagc cttccttcct gggcatggag tcctgtggca tccacgaaac taccttcaac 840

tccatcatga agtgtgacgt ggacatccgc aaagacctgt acgccaacac agtgctgtct 900

ggcggcacca ccatgtaccc tggcattgcc gacaggatgc agaaggagat cactgccctg 960

gcacccagca caatgaagat caagatcatt gctcctcctg agcgcaagta ctccgtgtgg 1020

atcggcggct ccatcctggc ctcgctgtcc accttccagc agatgtggat cagcaagcag 1080

gagtatgacg agtccggccc ctccatcgtc caccgcaaat gcttctag 1128

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctcttcggg gagcagcgat gcgac 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggctcggac gcacgagccg tgatc 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaaagaaagg taattatgtg 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgggtcagaa ggattcctat gtg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgctcctcgg gagccacacg cag 23

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atcctcaccc tgaagtacc 19

Claims

1.一种检测EGFR vIII突变体的荧光PCR引物，其核苷酸序列如下所示：

F1：5'-GCTCTTCGGGGAGCAGCGATGCGAC-3'；

R1：5'-AGGCTCGGACGCACGAGCCGTGATC-3'。

2.一种检测EGFR vIII突变体的荧光PCR探针，其核苷酸序列如下所示：

探针P1：5'-AAAAGAAAGGTAATTATGTG-3'。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、JOE、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种。

4.一种检测EGFR vIII突变体的荧光PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求1所述的引物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有权利要求2或3所述的探针。

6.一种检测EGFR vIII突变体的荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)从样本中提取RNA；

2)以提取的RNA为模板，逆转录为cDNA，使用权利要求1所述的引物对F1、R1，及

权利要求2或3所述探针P1进行荧光PCR扩增反应获得扩增产物；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2)中的荧光PCR扩增反应体系为：

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2)中的荧光PCR扩增反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火40s；循环35～45次。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述扩增曲线分析的具体分析过程为：出现探针FAM 5’端标记荧光的荧光扩增曲线说明EGFR vIII突变体阳性，扩增出现探针TAMRA5’端标记荧光的荧光扩增曲线说明EGFR vIII突变体阳性；未出现荧光扩增曲线表明样本中不含有EGFR vIII突变体，为阴性。