CN111607593A - 一种用于检测egfr基因突变的核苷酸序列组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核苷酸序列组，包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变位点的突变型EGFR基因的一部分；正向引物的3’末端对应EGFR基因的突变位点、对应突变位点向EGFR基因5’端1‑10个碱基的位置或对应EGFR突变位点向EGFR基因3’端1‑10个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应EGFR基因的突变位点、对应突变位点向EGFR基因5’端1‑10个碱基的位置或对应EGFR突变位点向EGFR基因3’端1‑10个碱基的位置。采用本发明的核苷酸序列组，配合荧光定量PCR检测方法，可以将EGFR突变基因的检测灵敏度提升至0.01％。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于基因突变检测的核苷酸序列组及其应用。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌主要分为两种类型：一类是非小细胞肺癌，另一类是小细胞肺癌。非小细胞肺癌(NON-small cell lungcancer，NSCLC)占肺癌的75-80％。大部分中晚期NSCLC患者，采用全身化学药物治疗，而一些早期NSCLC患者可以采取手术或者局部放疗、化疗进行治疗。然而，传统的治疗方案在NSCLC中晚期治疗中的疗效并不令人满意，且化疗的不良反应大，患者难以耐受。
EGFR(epidermal growth factor receptor)是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。
EGFR基因突变常集中在细胞内的酪氨酸激酶区域，突变率最高的是21外显子的点突变(L858R)和19外显子的两种缺失突变(E746-750del)，这两者均属于敏感突变，可导致酪氨酸激酶结构域的活化，意味着TKI药物的耐药性。前期研究显示这两者在所有EGFR基因突变中的比例占90％以上，肺腺癌患者EGFR基因敏感突变阳性率在高加索人群约为10％，在亚裔人群和我国均为50％左右。研究显示，其中50％的患者是在这两种突变的基础上，又发生了20外显子790位密码子的突变(T790M)，因此，在选择临床用药时，除敏感突变外，T790M的耐药基因检测也同样重要。
现有的EGFR基因突变检测方法中，组织活检侵袭性大，样本获取难度大，且异质性表现明显。测序法实验操作复杂，数据分析难度较大，成本较高，且检测周期长，很难满足临床需求。而基于循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)的液体活检技术，可以非侵入的方式对肿瘤相关基因突变进行检测，而且患者普遍更容易接受非侵入性的样本采集方式。但是血清/血浆中ctDNA含量低，比如在肿瘤早期阶段，ctDNA仅占总游离DNA的0.01％，因此，常用的检测方法比如测序法的检测灵敏度无法完成有效检测。
因此，本领域技术人员致力于开发一种提高EGFR基因突变检测灵敏度的方法。
发明内容
有鉴于现有技术中活检侵袭性大、测序法操作复杂、成本高及周期长以及常规荧光定量PCR检测方法灵敏度仅能达到1％的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种提高EGFR基因突变检测灵敏度的方法。
为实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种核苷酸序列组。在一个具体实施方式中，该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变位点的突变型EGFR基因的一部分；正向引物的3’末端对应EGFR基因的突变位点、对应突变位点向正义链5’端10个碱基以及突变位点向正义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应突变型EGFR基因反义链中突变位点、突变位点向反义链5’端10个碱基以及突变位点向反义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置。
可选地，正向引物或反向引物上包括人为突变位点；该人为突变位点使得正向引物与含有突变位点的EGFR基因的反义链不能完全互补；或者该人为突变位点使得反向引物与突变型EGFR基因的正义链不能完全互补。
可选地，人为突变位点位于距正向引物3’端1-10个碱基位置；或者人为突变位点位于距反向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置。
在另一个具体实施方式中，该核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列，所述阻断核苷酸序列能与对应于所述突变位点处的一段野生型EGFR基因的反义链互补。
可选地，该阻断核苷酸序列的3’端添加有2-5个相对于野生型EGFR基因的非互补碱基，或者添加有使阻断核苷酸序列本身不能延伸的3’端化学修饰。
进一步可选地，3’端化学修饰为3'ddC、3'反向dT(3'Inverted dT)、3'C3间隔子(3'C3spacer)、3'氨基(3'Amino)或3'磷酸化(3'phosphorylation)。
在又一个具体实施方式中，正向引物和反向引物扩增的片段为包括突变位点的60-120bp长度的序列。
可选地，该核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团
可选地，正向引物和反向引物的序列长度为15-35bp，退火温度为55-65℃。
可选地，该核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团。可选地，荧光基团选自FAM、HEX、CY5、VIC、TET、JOE和ROX；淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、TAMRA和MGB。可通过设置不同的荧光基团，实现同一检测孔中同时检测多个位点。
在又一个具体实施方式中，突变位点选自野生型EGFR基因的第790位密码子、第858位密码子和第19号外显子删除突变中的一个或多个。
在又一个具体实施方式中，核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团。
在一个具体实施方式中，该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变位点的突变型EGFR基因的一部分；正向引物的序列选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列中的一个或多个。
进一步地，反向引物的序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列中的一个或多个。
可选地，该核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列，阻断核苷酸序列的序列选自如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列中的一个或多个。。
可选地，该核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团，该探针的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的序列中的一个或多个。
本发明的第二个方面提供了一种试剂盒。在一个具体实施方式中，该试剂盒包括如上所述的核苷酸序列组。
可选地，每一个正向引物的浓度均为300±200nM，每一个反向引物的浓度均为300±200nM，每一个阻断核苷酸序列的浓度均为0-4μM，探针的浓度为100-400nM。
可选地，该试剂盒中还包括DNA聚合酶、镁离子、dNTP和缓冲液。
本发明的第三个方面还提供了一种检测基因突变的方法，其特征在于，使用如上所述的核苷酸序列组进行PCR扩增。
可选地，上述方法适用于检测循环肿瘤DNA、肿瘤组织DNA、细胞提取DNA和粪便提取DNA。
可选地，采用荧光定量PCR进行检测。
可选地，荧光信号通过荧光染料或荧光探针获得。
采用本发明的核苷酸序列组，配合荧光定量PCR检测方法，可以将EGFR突变基因的检测灵敏度提升至0.01％，可以用于以血液中的ctDNA为样本进行检测，从而有助于临床上对患者的基因突变状态进行判断。
并且，当配合采用荧光定量PCR的检测方法时，实验操作简便，数据分析及结果判读直观，检测成本较低，能够在2小时内出具检测结果，能够最大限度满足临床需求。通过荧光染料对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。通过软件对荧光积累信息进行分析和计算，能获得待测样品模板的初始浓度。
以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的原理示意图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
本发明中所述的EGFR野生型基因的序列NCBI登录号为NCBI Gene ID:1956。野生型EGFR基因第790位密码子、第858位密码子和第19号外显子周边序列如SEQ ID NO:13、SEQID NO:14和SEQ ID NO:15所示。
在第一个具体实施方式中，根据EGFR基因的突变点，设计能扩增包含突变位点的核苷酸序列组。该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，在一个可选的实施方式中，扩增的序列长度为60-120bp长度。正向引物或者反向引物的3’末端对应EGFR基因的突变位点、对应突变位点向正义链5’端10个碱基以及突变位点向正义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应突变型EGFR基因反义链中突变位点、突变位点向反义链5’端10个碱基以及突变位点向反义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置。
在一个可选的实施方式中，正向引物或者反向引物包括人为突变位点。该人为突变位点是设计引物时人为引入的，并且与样本中的突变点位置不同。人为突变位点使得正向引物或者反向引物与含有突变位点的EGFR基因不能完全互补，以增加野生型和突变型DNA的区分度。引入的人为突变位点数量可以根据正向引物或者反向引物的长度进行，一般可以引入1-2个人为突变位点。可选地，可以在正向引物或者反向引物上引入1个人为突变位点。可选地，人为突变位点位于距正向引物或者反向引物3’端1-10个碱基位置；或者人为突变位点位于距反向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团，用于在检测时提供荧光信号。
在第二个具体实施方式中，根据EGFR基因的突变点，设计能扩增包含突变位点的核苷酸序列组。该核苷酸序列组包括正向引物、反向引物和阻断核苷酸序列，在一个可选的实施方式中，扩增的序列长度为60-120bp长度。
正向引物及反向引物的设计原则与第一个具体实施方式中一致。
阻断核苷酸序列能竞争性抑制野生型基因扩增。阻断核苷酸序列与对应于所述突变位点处的一段野生型EGFR基因序列互补。阻断核苷酸序列的3’端添加有2-5个相对于野生型EGFR基因的非互补碱基，或者添加有使阻断核苷酸序列本身不能延伸的3’端化学修饰，通过非互补碱基或者化学修饰，实现抑制野生型基因扩增的目的。可选地，3’端化学修饰为3’ddC、3'Inverted dT、3'C3spacer、3'Amino或3'phosphorylation。
利用上述核苷酸序列组检测EGFR基因突变点的原理如图1所示，阻断核苷酸序列与野生型EGFR基因结合，使得正向引物不能与野生型EGFR基因结合，从而使野生型EGFR基因不能扩增。阻断核苷酸序列不能与突变型EGFR基因结合，此时正向引物与突变型EGFR基因结合，从而与反向引物一起扩增出目的片段。
在一个可选的实施方式中，正向引物或反向引物包括人为突变位点。人为突变点的设计原则与第一个具体实施方式中的一致。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团，用于在检测时提供荧光信号。
在第三个具体实施方式中，根据如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的野生型EGFR基因第790位密码子、第858位密码子和第19号外显子周边序列设计核苷酸序列组。该核苷酸序列组用于检测第790位密码子、第858位密码子和第19号外显子突变中的一个或多个。
该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，正向引物选自如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的序列中的一个或多个。反向引物选自如SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示的序列中的一个或多个。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列。阻断核苷酸序列选自如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列中的一个或多个。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括探针。探针的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的序列中的一个或多个。
在第四个具体实施方式中，根据如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的野生型EGFR基因第二外显子及周边序列设计核苷酸序列组。该核苷酸序列组用于检测第790位密码子、第858位密码子和第19号外显子突变中的一个或多个。
该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，其中，在正向引物上引入了一个人为突变位点。正向引物选自如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列中的一个或多个。反向引物选自如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列中的一个或多个。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列。阻断核苷酸序列选自如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列中的一个或多个。
在一个可选的实施方式中，该核苷酸序列组还包括探针。探针的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的序列中的一个或多个。
实施例1检测灵敏度实验
本实施例使用的核苷酸序列组包括正向引物、反向引物、阻断核苷酸序列和探针(序列由上海生工生物工程有限公司合成)，具体如表1所示：
表1核苷酸序列组
探针的荧光基团为FAM、HEX、CY5、VIC、TET、JOE或者ROX；淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2、TAMRA或者MGB。通过探针法获得荧光信号。
1、突变型细胞系DNA
突变型细胞系DNA购自康为世纪(货号：CW2771S)和科佰生物(货号：CBP10338，CBP10334，CBP10335)，采用NGS定量突变频率。
2、灵敏度实验的检测模板处理
检测模板中，DNA突变频率分别为1％、0.1％、0.05％、0％。
阳性参考品(即含有突变位点的突变型DNA)浓度为15ng/ul，阴性参考品(即不含有突变位点的野生型DNA)浓度为15ng/ul，将阳性参考品与阴性参考品按比例混合，将阳性样本分别稀释到1％，0.1％，0.05％。
3、荧光定量PCR检测
使用如表1所示的引物，以及如上检测模板DNA，按照如下所示的PCR扩增体系配置PCR反应液。每个突变位点设置三个重复。其中，定量PCR试剂购自赛默飞(TaqPathTMProAmpTM Master Mix)、Kapa Biosystems(KK4701)或Toyobo(QPS-101)。
PCR的扩增反应体系如下：
使用配置的反应体系进行荧光定量PCR检测(定量PCR仪为Bio-rad CFX96)，PCR扩增的反应条件为：
其中，针对EGFR野生型基因的第858位氨基酸从L突变成R的突变，使用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8所示的引物和阻断核苷酸序列，使用SEQ ID NO：17所示的探针进行荧光定量PCR检测，检测结果如表2所示：
表2荧光定量PCR检测结果
根据表2中的结果，表明采用如表1中的核苷酸序列组合，EGFR基因突变位点的检测下限可达0.05％。
实施例2检测灵敏度实验
本实施例使用的核苷酸序列组包括引入人为突变位点的正向引物、反向引物和阻断核苷酸序列(序列由上海生工生物工程有限公司合成)，具体如表3所示：
表3核苷酸序列组
探针的荧光基团为FAM、HEX、CY5、VIC、TET、JOE或者ROX；淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2、TAMRA或者MGB。通过探针法获得荧光信号。
1、突变型细胞系DNA
突变型细胞系DNA购自康为世纪(货号：CW2771S)和科佰生物(货号：CBP10338，CBP10334，CBP10335)，采用NGS定量突变频率。
2、灵敏度实验的检测模板处理
检测模板中，DNA突变频率分别为1％、0.1％、0.05％、0％。
阳性参考品(即含有突变位点的突变型DNA)浓度为15ng/ul，阴性参考品(即不含有突变位点的野生型DNA)浓度为15ng/ul，将阳性参考品与阴性参考品按比例混合，将阳性样本分别稀释到1％，0.1％，0.05％。
3、荧光定量PCR检测
使用如表3所示的引物，以及如上检测模板DNA，按照如下所示的PCR扩增体系配置PCR反应液。每个突变位点设置三个重复。其中，定量PCR试剂购自赛默飞(TaqPathTMProAmpTM Master Mix)、Kapa Biosystems(KK4701)或Toyobo(QPS-101)。
PCR的扩增反应体系如下：
使用配置的反应体系进行荧光定量PCR检测(定量PCR仪为Bio-rad CFX96)，PCR扩增的反应条件为：
其中，针对EGFR野生型基因的第858位氨基酸从L突变成R的突变，使用SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8所示的引物和阻断核苷酸序列，使用SEQ ID NO：17所示的探针进行荧光定量PCR检测，检测结果如表4所示：
表4荧光定量PCR检测结果
根据表4中的结果，表明采用如表3中的核苷酸序列组合，EGFR基因突变位点的检测下限可达0.05％。
实施例3检测灵敏度实验
本实施例使用的核苷酸序列组包括引入人为突变位点的正向引物和反向引物(序列由上海生工生物工程有限公司合成)，具体如表5所示：
表5核苷酸序列组
探针的荧光基团为FAM、HEX、CY5、VIC、TET、JOE或者ROX；淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2、TAMRA或者MGB。通过探针法获得荧光信号。
1、突变型细胞系DNA
突变型细胞系DNA购自康为世纪(货号：CW2771S)和科佰生物(货号：CBP10338，CBP10334，CBP10335)，采用NGS定量突变频率。
2、灵敏度实验的检测模板处理
检测模板中，DNA突变频率分别为1％、0.1％、0.05％、0％。
阳性参考品(即含有突变位点的突变型DNA)浓度为15ng/ul，阴性参考品(即不含有突变位点的野生型DNA)浓度为15ng/ul，将阳性参考品与阴性参考品按比例混合，将阳性样本分别稀释到1％，0.1％，0.05％。
3、荧光定量PCR检测
使用如表5所示的引物，以及如上稀释后的检测模板，按照如下所示的PCR扩增体系配置PCR反应液。每个突变位点设置三个重复。其中，定量PCR试剂购自赛默飞(TaqPathTMProAmpTM Master Mix)、Kapa Biosystems(KK4701)或Toyobo(QPS-101)。
PCR的扩增反应体系如下：
使用配置的反应体系进行荧光定量PCR检测(定量PCR仪为Bio-rad CFX96)，PCR扩增的反应条件为：
其中，针对EGFR野生型基因的第858位氨基酸从L突变成R的突变，使用SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：5所示的引物序列，使用SEQ ID NO：17所示的探针进行荧光定量PCR检测，检测结果如表6所示：
表6荧光定量PCR检测结果
根据表6中的结果，表明采用如表5中的核苷酸序列组合，EGFR基因突变位点的检测下限可达0.1％。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 成都华青精准医疗科技有限公司
<120> 一种用于检测EGFR基因突变的核苷酸序列组及其应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcacctcca ccgtgca 17
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtcaagat cacagatttt ggg 23
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagaaggtga gaaagttaaa attcccgtc 29
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagttgagca ggtactggga g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtggcttta ggtcagccag 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acagcaaagc agaaactcac a 21
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgtgcagctc atcacgcagc tcataaaa 28
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttttgggctg gccaaactgc ataa 24
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcaaggaatt aagagaagca acatctccgt tta 33
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accgtgcagc acatcat 17
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtcaagatca cacattttgg gcg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaattcccg tcgctatcaa aac 23
<210> 13
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tggacaaccc ccacgtgtgc cgcctgctgg gcatctgcct cacctccacc gtgcagctca 60
tcacgcagct catgcccttc ggctgcctcc tggactatgt ccgggaacac aaagacaata 120
ttggctccca gtacctgctc aactggtgtg tg 152
<210> 14
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaacgtactg gtgaaaacac cgcagcatgt caagatcaca gattttgggc tggccaaact 60
gctgggtgcg gaagagaaag aataccatgc agaaggaggc aaagtaagga ggtggcttta 120
ggtcagccag cattttcctg acaccaggga 150
<210> 15
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcaccatctc acaattgcca gttaacgtct tccttctctc tctgtcatag ggactctgga 60
tcccagaagg tgagaaagtt aaaattcccg tcgctatcaa ggaattaaga gaagcaacat 120
ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgatg tgagtttctg ctttgctgtg tgggggtcca 180
tggctctgaa cctcaggccc 200
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcggctgcct cctggactat gtccg 25
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
taccatgcag aaggag 16
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aagccaacaa ggaaat 16
Claims (10)
1.一种核苷酸序列组，其特征在于，所述核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变位点的突变型EGFR基因的一部分；所述正向引物的3’末端对应突变型EGFR基因正义链中突变位点、突变位点向正义链5’端10个碱基以及突变位点向正义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应突变型EGFR基因反义链中突变位点、突变位点向反义链5’端10个碱基以及突变位点向反义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置。
2.如权利要求1所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述正向引物或所述反向引物上包括人为突变位点；所述人为突变位点使得正向引物与含有突变位点的EGFR基因的反义链不能完全互补；或者所述人为突变位点使得所述反向引物与突变型EGFR基因的正义链不能完全互补。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述人为突变位点位于距正向引物3’端1-10个碱基位置；或者所述人为突变位点位于距反向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置。
4.如权利要求1所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列，所述阻断核苷酸序列能与对应于所述突变位点处的一段野生型EGFR基因的反义链互补。
5.如权利要求4所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述阻断核苷酸序列的3’端添加有2-5个相对于野生型EGFR基因的非互补碱基，或者添加有使阻断核苷酸序列本身不能延伸的3’端化学修饰。
6.如权利要求5所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述3’端化学修饰为3'ddC、3'反向dT(3'Inverted dT)、3'C3间隔子(3'C3spacer)、3'氨基(3'Amino)或3'磷酸化(3'phosphorylation)。
7.如权利要求1所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物扩增的片段为包括所述突变位点的60-120bp长度的序列。
8.一种核苷酸序列组，其特征在于，所述核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变位点的突变型EGFR基因的一部分；所述正向引物的序列选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列中的一个或多个。
9.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-8中任一项所述的核苷酸序列组。
10.一种检测基因突变的方法，其特征在于，使用如权利要求1-8中任一项所述的核苷酸序列组进行PCR扩增。
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