CN108486232A - 一种检测人类egfr基因t790m突变的组合产品、组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测人类egfr基因t790m突变的组合产品、组合物、试剂盒及其应用 Download PDF

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杨春燕
丁蕊
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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品、组合物、试剂盒及其应用。所述组合产品包括引物和锁核酸探针，其中锁核酸探针的5'端第4、6、7、8和10位核苷酸为锁核酸。此引物和探针组合产品可检测的扩增子更短，检测突变的阴阳性同时，还可以获得样本中该突变的比例，具有灵敏度高、特异性强等优点。本发明的试剂盒能够为EGFR基因T790M突变肺癌患者的治疗提供用药指导、药效评估和疗效检测，有很好的应用前景。

Description

一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品、组合物、试剂 盒及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品、组合物、试剂盒及其应用。
背景技术
随着分子生物学的迅速发展，人们对肿瘤的认识达到了分子水平。许多肿瘤相关基因己被发现，肿瘤药物的靶向治疗也得到了很好的疗效，根据不同药物的疗效与肿瘤基因类型有相关性，采取检测肿瘤基因类型能帮助临床医生采取精准的治疗方案。美国食品药品监督管理局于2003月批准了美国阿斯利康(Aotrazeneca)公司生产的小分子基因靶点药物吉非替尼(Gefitinib，也称为易瑞沙/Iressa)用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。吉非替尼是一种口服的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，它对EGFR突变的肺癌患者有很好的治疗敏感性，通过抑制该酶的活性来抑制肿瘤的增长、增殖，却无明显的化疗副作用。
但是据估计，约30-40％的亚洲NSCLC患者在确诊时携带EGFR突变，高达2/3的患者在接受当前己上市的EGFR-TKI治疗后，病情进展产生T790M耐药突变，使得EGFR-TKI失去了治疗效果，疾病无法控制。(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗有抵抗的EGFR T790M突变阳性(EGFR基因外显子20第790位密码子出现C>T转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由苏氨酸转变为甲硫氨酸，T790M)、手术无法治愈的或复发性非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗。所以服用EGFR-TKI的肺癌患者需要定期检查T790M突变，监控EGFR-TKI耐药进展，帮助医生选择最佳治疗方案，避免耽搁治疗有效时机。
目前检测EGFR基因突变最常用的样本来源是肿瘤的病理组织或细胞学标本，但是组织取材均为有创操作，有时难以实施，且这些操作受肿瘤大小、部位、患者一般情况等影响，有时不能取得满意的组织或组织量太少不能进行基因突变检测。并且随着疾病的进展EGFR-TKIs耐药性的出现，常常需要再次进行分子生物学检测，而组织取材为有创操作，不能使捷、反复进行。近些年循环肿瘤DNA(ctDNA)被认为是一种可能代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本。肿瘤组织、肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释放游离DNA进入外周血。ctDNA用于肿瘤突变检测优势在于：操作无创，在疾病的任一进程中都可获取；可以作为一种肿瘤标记物，实现实时检测和动态监测；克服肿瘤组织的异质性。因此，使用外周血游离DNA监测患者EGFR基因突变状态，探索患者EGFR-TKI耐药机制及预测预后成为一条可行的途径。然而，目前使用ctDNA检测EGFR基因突变仍有一些技术上的缺点与挑战：
1)血液检测中，ctDNA含量较低；
2)ctDNA片段相对小，约为180bp；
3)在不同的肿瘤组织中，ctDNA含量差异很大；
4)ctDNA中肿瘤相关的DNA所占比例不同人差别较大，并且常因比例小而难以测出；
5)以前的研究显示，与肿瘤组织相比，ctDNA检测EGFR突变灵敏度仅为43-66％。因此，高灵敏度的ctDNAEGFR基因突变检测技术的发展十分重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品，所述的组合产品包括引物和锁核酸探针，检测的扩增子更短，检测突变的阴阳性同时，还可以获得样本中该突变的比例，具有灵敏度高、特异性强等优点，能够检测到样本中0.01％突变频率的等位基因突变。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合物产品，其特征在于，包括引物和锁核酸探针；
所述引物包括序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物；
所述锁核酸探针序列如SEQ ID NO：3所示，其5'端第4、6、7、8和10位核苷酸为锁核酸。
本发明的第二目的在于提供一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合物，其包含上述引物和锁核酸探针组合产品和/或肽核酸阻断核酸。
本发明的第三目的在于提供一种检测人类EGFR基因T790M突变的试剂盒，包括上述引物和锁核酸探针组合产品和/或肽核酸阻断核酸。
本发明的第四目的在于提供如上组合产品、组合物或试剂盒在制备肿瘤患者用药敏感性检测剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)针对EGFR基因T790M突变设计了特定序列的引物对和特定序列的探针，实现对EGFR基因T790M突变的高灵敏度检测；
(2)更短的扩增子检测可以检测更多打断的DNA片段，锁核酸探针和肽核酸阻断寡聚核酸易于区分阳性和阴性样本。数字PCR的使用能够检测到样本中0.01％突变频率的等位基因突变；
(3)检测T790M突变的阴阳性的同时还可以获得样本中该突变的比例，从而为EGFR靶向治疗提供参考；
(4)可检测的样本来源多样，既可以是肿瘤组织DNA，也可以是ctDNA，扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围，实现无创检测T790M突变。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中的分别使用常规探针和锁核酸探针的数字PCR对比结果图；
图2为本发明一个实施例中的分别使用和未使用肽核酸阻断核酸的数字PCR对比结果图，其中(-)表示未使用肽核酸阻断核酸，(+)表示使用了肽核酸阻断核酸；
图3为本发明一个实施例中的血浆游离DNA中EGFR野生型基因和EGFR T790M突变型基因的数字PCR结果图；
图4为本发明一个实验例中的EGFR基因T790M灵敏度的数字PCR结果图，其中N为阴性对照。
具体实施方式
本发明的第一目的在于提供一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品，其包括引物和锁核酸探针；
所述引物包括序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物；
所述锁核酸探针序列如SEQ ID NO：3所示，其5'端第4、6、7、8和10位核苷酸为锁核酸。经数字PCR扩增后，扩增子长度为51bp，更短的扩增子检测可以检测更多打断的DNA片段，有较好的检出效果。
锁核酸(LNA)是一种寡核苷酸衍生物，含有一个或多个2'-O，4'-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸，核糖的2'-O位和4'-C位通过缩水作用形成氧亚甲基桥，并连接成环形。这个环形的桥能够降低核糖的柔韧性，使磷酸盐骨架局部结构的稳定性增强，赋予LNA一些优越的特性，如高亲合力，优异的碱基错配识别能力以及抗核酸酶分解的能力。
所述引物和探针可以根据本领域的现有技术合成，也可以委托专业的公司制备。
该组合产品可以将SEQ ID NO：1-2所示的引物分别储存于不同的容器，例如EP管中，也可以将正向引物和反向引物混合存放。
所述锁核酸探针的5'端标记荧光发射基团，3'端标记淬灭基团。
所述荧光发射基团选自FAM、HEX、VIC或JOE中的任一种，优选为FAM。
所述淬灭基团选自所IABkFQ、TAMRA、BHQ或MGB中的任一种，优选为IABkFQ。
和常规探针相比，在一些实施例中，锁核酸探针的退火温度要高6℃，阴性结果的荧光强度被抑制，通过阴性结果荧光强度被抑制可以更好的判别阳性和阴性结果。锁核酸探针表现出更好的特异性。
此检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品，还包括肽核酸阻断核酸，其序列如SEQ ID NO：4所示。
肽核酸(PNA)肽核酸为合成物，是以酰胺键连接骨架代替磷酸二酯键的核酸类似物，不能被生物体内天然存在的核酸酶和蛋白酶识别而消化降解，具有很高的生物稳定性。而且PNA由呈电中性的多肽骨架结构构成，不会与带负电荷的发生排斥作用，在与dsDNA杂交时，形成特有的立体构型，使三链结构更稳定，PNA-DNA的结合力高于DNA-DNA。此外，因PNA链为非手性分子，因此就避免了合成时出现异构体，需要纯化的困难。
由于血浆中含有大量来自正常细胞的血浆游离DNA(cfDNA)，需要高灵敏度的检测方法来区分正常细胞所释放的cfDNA与肿瘤细胞释放的cfDNA。肽核酸阻断核酸能够抑制正常细胞释放的cfDNA的PCR扩增过程。运用在T790M突变的检测上，提升了PCR的效率，增加了阳性检出率。
本发明的第二目的在于提供一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合物，其包含上述引物和锁核酸探针组合产品和/或肽核酸阻断核酸。
所述组合物可以以溶液的形式存在，溶剂优选为水；所述组合物中还可以包括pH缓冲试剂及酶等。
所述正向引物的浓度为0.8-1.2μM，还可以选择1.0μM；反向引物的浓度为0.8-1.2μM，还可以选择1.0μM。
所述锁核酸探针的浓度为0.2-0.3μM，还可以选择0.25μM。
所述阻断核酸的浓度为4.5-5.5μM，还可以选择5μM。
以上浓度均为工作浓度，由于高浓度比低浓度保存时间长，所以在实际应用中可以配成较高浓度的储存液，在使用时稀释到相应浓度即可。
本发明的第三目的在于提供一种检测人类EGFR基因T790M突变的试剂盒，包括上述引物和锁核酸探针组合产品和/或肽核酸阻断核酸。
51bp的扩增长度片段在荧光强度检测阈值为8000时有较好的检出率。
所述试剂盒还包括数字PCR反应缓冲液、样品处理液、无核酸水、DNA聚合酶、EGFR基因T790M突变型对照序列以及野生型对照序列的一种或多种。
所述DNA聚合酶可加入所述数字PCR反应缓冲液中，组成数字PCR反应缓冲液进行整合包装。
所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种，优选为Taq。
所述样品处理液所处理的样品包括血液、血浆、肿瘤细胞或组织。
所述样品处理液包括二甲苯溶液、无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、蛋白酶K、SDS、氯仿、苯酚、异戊醇中的一种或多种。
EGFR基因T790M的突变型对照序列以及野生型对照序列可以质粒的形式携带包装。
所述试剂盒内还可以加入无核酸水，以作为阴性对照。
本发明的第四目的在于提供如上组合产品、组合物或试剂盒在制备肿瘤患者用药敏感性检测剂中的应用。通过EGFR基因T790M的突变使EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)对肺癌患者失去治疗作用，疾病无法得到控制。通过对EGFR基因T790M突变率的检测，可以帮助医生了解患者的耐药性，为患者的治疗提供用药指导、药效评估和疗效检测，有很好的应用前景。
一种诊断肺癌患者用药敏感性的方法，包括：
提取待测样品中的DNA，用如上所述的组合产品、组合物或试剂盒对包含EGFR基因T790M突变位点的核酸片段进行定量数字PCR检测，经软件分析和计算后得到样本中该基因突变率及突变的比例。
优选的，如上所述的应用或方法，所述肺癌包括非小细胞肺癌；
优选的，如上所述的应用或方法，所述药包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂；
优选的，如上所述的应用或方法，所述待检测样品包括血液、血浆、肿瘤细胞或组织；
优选的，所述待检测样品来源于动物，例如灵长类动物，例如人。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1.引物和探针的设计
根据Genbank查询得到人类EGFR基因的野生型及突变型基因序列，用软件PrimerPremier5设计等位基因特异性扩增引物和水解探针。
EGFR T790M正常及周边序列如SEQ ID NO：5所示。
引物包括正向引物和反向引物，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
探针为锁核酸探针，其序列如SEQ ID NO：3所示，其5'端第4、6、7、8和10位核苷酸为锁核酸。
肽核酸阻断核酸，其序列如SEQ ID NO：4所示。
2.样本准备
组织样本细胞在二甲苯中保存过夜，使用QIAamp FFPE Tissue Kit(Qiagen KK,Tokyo,Japan)提取DNA。组织样本提取的模板DNA通过超声打断成约200bp的片段。提取获得的DNA在检测前于4℃条件下保存。
3.数字PCR定量检测T790M突变
(1)反应体系：PCR混合物20μL，包含10μL ddPCR Supermix(不含dUTP)(Bio-Rad)，引物各1μM，探针0.25μM，200μM dNTP，5μL DNA，5μM的肽核酸阻断核酸。
(2)反应平台：QX200微滴数字PCR系统(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)。
(3)反应条件：见下表。
表1数字PCR反应条件
温度 时间 循环数
95℃ 10分 1
94℃ 30秒 45
57℃ 1分 45
退火温度由梯度PCR优化获得(数据未在此显示)。
(4)检测分析：使用QX-200droplet reader和QuantaSoft analysis软件进行分析。3个微滴高于8000荧光阈值的结果判读为阳性。基于泊松分布，使用QuantaSoftsoftware 9.2.1(Bio-Rad)进行目标等位基因频率的计算。
实施例2
1.引物和探针的设计
根据Genbank查询得到人类EGFR基因的野生型及突变型基因序列，用软件PrimerPremier5设计等位基因特异性扩增引物和水解探针。
EGFR T790M正常及周边序列如SEQ ID NO：5所示。
引物包括正向引物和反向引物，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
探针为锁核酸探针，其序列如SEQ ID NO：3所示，其5'端第4、6、7、8和10位核苷酸为锁核酸。
2.样本准备
血液样本使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen KK)提取DNA。提取的模板DNA通过超声打断成约200bp的片段。提取获得的DNA在检测前于4℃条件下保存。
3.数字PCR定量检测T790M突变
(1)反应体系：PCR混合物20μL，包含10μL ddPCR Supermix(不含dUTP)(Bio-Rad)，引物各0.8μM，探针0.2μM，200μM dNTP，5μL DNA(来自2mL左右的血样)。
(2)反应平台：QX200微滴数字PCR系统(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)。
(3)反应条件：见下表。
表2数字PCR反应条件
温度 时间 循环数
95℃ 10分 1
94℃ 30秒 45
57℃ 1分 45
退火温度由梯度PCR优化获得(数据未在此显示)。
(4)检测分析：使用QX-200droplet reader和QuantaSoft analysis软件进行分析。3个微滴高于8000荧光阈值的结果判读为阳性。基于泊松分布，使用QuantaSoftsoftware 9.2.1(Bio-Rad)进行目标等位基因频率的计算。
实施例3
1.引物和探针的设计
根据Genbank查询得到人类EGFR基因的野生型及突变型基因序列，用软件PrimerPremier5设计等位基因特异性扩增引物和水解探针。
EGFR T790M正常及周边序列如SEQ ID NO：5所示。
引物包括正向引物和反向引物，序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
探针为锁核酸探针，其序列如SEQ ID NO：3所示，其5'端第4、6、7、8和10位核苷酸为锁核酸。
肽核酸阻断核酸，其序列如SEQ ID NO：4所示。
2.样本准备
血液样本使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen KK)提取DNA。提取的模板DNA通过超声打断成约200bp的片段。提取获得的DNA在检测前于4℃条件下保存。
3.数字PCR定量检测T790M突变
(1)反应体系：PCR混合物20μL，包含10μL ddPCR Supermix(不含dUTP)(Bio-Rad)，引物各1.2μM，探针0.3μM，200μM dNTP，5μL DNA(来自2mL左右的血样)，5.5μM的肽核酸阻断核酸。
(2)反应平台：QX200微滴数字PCR系统(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)。
(3)反应条件：见下表。
表3数字PCR反应条件
温度 时间 循环数
95℃ 10分 1
94℃ 30秒 45
57℃ 1分 45
退火温度由梯度PCR优化获得(数据未在此显示)。
(4)检测分析：使用QX-200droplet reader和QuantaSoft analysis软件进行分析。3个微滴高于8000荧光阈值的结果判读为阳性。基于泊松分布，使用QuantaSoftsoftware 9.2.1(Bio-Rad)进行目标等位基因频率的计算。
实验例1
将50ng含有T790M突变的DNA稀释成0，0.01％，0.02％，0.03％，0.05％，0.1％，0.2％，0.5％，1.0％，10％和100％的浓度梯度，以此为模板，按照实施例1中的方法进行实验，检测该方法的灵敏度。结果见说明书附图4，图中N为阴性对照(加水)，结果表明，其灵敏度较高，能够检测到样本中0.01％突变频率的等位基因突变。
实验例2
验证试验。
1.将常规探针(即SEQ ID NO：6)和锁核酸探针进行对照试验，试验方法如上述实施例1或2或3所示。结果见说明书附图1。从图中可以看出，锁核酸探针通过降低阴性结果的荧光强度，避免假阳性的发生。
2.加入和不加入肽核酸阻断核酸进行对照试验，试验方法如上述实施例1或2或3所示。结果见说明书附图2。从图中可以看出，肽核酸阻断核酸提升了PCR的效率，增加了阳性检出率，可提升目标等位基因突变的PCR效率。
3.比较野生型和突变型基因的检出率，结果如说明书附图3所示。从图在中可以看出，51bp的扩增长度片段在荧光强度检测阈值为8000时有较好的检出率。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京求臻基因科技有限公司
<120> 一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品、组合物、试剂盒及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ctgcctcacc tccacc 16
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cagccgaagg gca 13
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tcatcatgca gc 12
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
catcacgcag c 11
<210> 5
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ctgcctcacc tccaccgtgc agctcatcac gcagctcatg cccttcggct gcctcctgga 60
ctatgtccgg gaacacaaag acaatattgg ctcccagtac ctgctcaact ggtgtgtgca 120
gatcgcaaag ggcatgaact acttggagga ccgtcgcttg gtgcaccgcg acctggcagc 180
caggaacgta ctggtgaaaa caccgcagca tgtcaagat 219
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atgagctgca tgatgag 17

Claims (10)

1.一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品，其包括引物和锁核酸探针；
所述引物包括序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物；
所述锁核酸探针序列如SEQ ID NO：3所示，其5'端第4、6、7、8和10位核苷酸为锁核酸。
2.根据权利要求1所述的一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品，其特征在于，所述探针的5'端标记荧光发射基团，3'端标记淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品，其特征在于，所述荧光发射基团选自FAM、HEX、VIC或JOE中的任一种，优选为FAM。
4.根据权利要求2所述的一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品，其特征在于，所述淬灭基团选自所IABkFQ、TAMRA、BHQ或MGB中的任一种，优选为IABkFQ。
5.根据权利要求1～4任一项所述的一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品，其特征在于，所述组合产品还包括肽核酸阻断核酸，其序列如SEQ ID NO：4所示。
6.含有权利要求1～5任一项所述组合产品的组合物；
优选地，所述正向引物的浓度为0.8-1.2μM，反向引物的浓度为0.8-1.2μM；
优选地，所述锁核酸探针的浓度为0.2-0.3μM。
7.根据从属权利要求5的权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述肽核酸阻断核酸的浓度为4.5-5.5μM。
8.一种检测人类EGFR基因T790M突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的组合产品。
9.根据权利要求8所述的一种检测人类EGFR基因T790M突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括数字PCR反应缓冲液、样品处理液、无核酸水、DNA聚合酶、EGFR基因T790M突变型对照序列以及野生型对照序列的一种或多种。
10.权利要求1～5任一项所述的组合产品或权利要求6或7所述的组合物或权利要求8或9所述的试剂盒在制备肿瘤患者用药敏感性检测剂中的应用。
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