CN103930567B - 表皮生长因子受体激酶结构域中的新型复合突变 - Google Patents

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Abstract

发现在EGFR基因的外显子19中的6个新突变，所述外显子在肿瘤中常常是突变的。本发明包括检测所述突变的方法、基于是否存在所述突变的预后方法和预测对治疗的反应的方法。

Description

表皮生长因子受体激酶结构域中的新型复合突变
发明领域
本发明涉及用于癌症治疗的癌症诊断和伴随诊断。具体地，本发明涉及可用于诊断和预后，以及预测癌症治疗功效的突变的检测。
发明背景
表皮生长因子受体(EGFR)，也称作HER1或ErbB1，是生长因子受体的1型酪氨酸激酶家族的成员。这些膜结合蛋白具有与各种信号途径相互作用的细胞内酪蛋白激酶结构域。在配体结合后，该家族中的受体经历二聚化和随后酪氨酸激酶结构域的自体磷酸化。所述自体磷酸化触发细胞内信号途径中的事件级联，包括Ras/MAPK、PI3K和AKT途径。通过这些途径，HER家族蛋白调节细胞增殖、分化和存活。
多种人恶性肿瘤与EGFR的异常表达或功能相关(Mendelsohn等人，(2000), “TheEGF receptor family as targets for cancer therapy,” Oncogene, 19:6550-6565)。具体地，已证实一些癌症带有在EGFR激酶结构域(外显子18-21)中的突变。在非小细胞肺癌(NSCLC)中，这些突变显示促进恶性细胞中的抗凋亡途径(Pao等人，(2004), "EGFreceptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" andare associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib",P.N.A.S. 101 (36): 13306–13311；Sordella等人，(2004), "Gefitinib-sensitizingEGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways", Science 305(5687): 1163–1167)。
已开发出靶向EGFR的治疗。例如，西妥昔单抗(ERBITUX™)和帕尼单抗(VECTIBIX™)是抗EGFR抗体。厄洛替尼(TARCEVA™)和吉非替尼(IRESSA™)是可用作EGFR酪氨酸激酶的口服活性选择性抑制剂的喹唑啉类。这些药物在其癌症由异常EGFR活性驱动的患者中最为有效。IRESSA™ (IRESSA泛亚洲研究(IPASS))的随机、大规模、双盲研究比较了吉非替尼与作为非小细胞肺癌(NSCLC)中的一线治疗的常规化疗(Mok等人，(2009), “Gefitinib orcarboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma”, N Eng J Med 361:947-957)。IPASS研究了具有确认的腺癌病史的1,217名患者。研究揭示在具有EGFR突变阳性肿瘤的患者中，IRESSA™的无进展生存(PFS)显著长于化疗。对于EGFR没有突变的肿瘤，情形相反： 化疗的PFS显著长于IRESSA™。研究证明为了改进肺癌患者成功治疗的机会，必须已知EGFR突变状态。
临床结果的分析揭示，具有在EGFR的激酶结构域(外显子18-21)中带有突变的肿瘤的患者对厄洛替尼的反应比具有表达野生型EGFR的肿瘤的那些患者更好(美国专利号7,294,468和7,960,118)。这些突变可预测对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)，例如喹唑啉类厄洛替尼(TARCEVA™)和吉非替尼(IRESSA™)的反应。在EGFR突变中，氨基酸746-750的缺失在肺癌患者中特别常见(参见美国专利号7,294,468和Kosaka等人，(2004), “Mutations ofthe epidermal growth factor receptor gene in lung cancer, biological andclinical implications”, Cancer Res. 64:8919-23)。Kosaka等人记载了涉及277名日本肺癌患者的研究。日本研究揭示EGFR突变出现在40%的肺腺癌中。约一半的突变(20%的患者)是氨基酸746-750 (核苷酸2238-2250)附近的缺失。
EGFR激酶结构域中的一些突变是常见的，而其他发生的频率较低。然而，重要的是，对于EGFR突变的临床测试靶向尽可能多的突变。这将确保具有罕见突变的患者不收到“假阴性”测试结果。如果罕见突变没有被检测到，具有这样突变的患者将无法接受潜在的挽救生命的治疗。因此，当发现EGFR激酶结构域中的新突变时，检测这种突变在某些患者中具有影响临床结果的潜力。
发明内容
在一个实施方式中，本发明是特异性杂交到包含突变的核酸的寡核苷酸，所述突变选自以下列表：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A。
在另一个实施方式中，本发明是检测来自人的样品中的表皮生长因子受体(EGFR)基因中的突变的方法，包括： 使样品中的核酸接触能够选择性地与包含突变的目标核酸杂交的寡核苷酸，所述突变选自以下列表：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A；将所述样品在允许所述寡核苷酸与所述目标核酸选择性杂交的条件下温育；和检测所述杂交。
在又另一个实施方式中，本发明是治疗具有肿瘤的患者的方法，所述肿瘤可能带有在表皮生长因子受体(EGFR)基因中具有突变的细胞，所述方法包括要求测试患者的样品中以选自以下列表的突变表征的突变EGFR基因的存在：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A；和如果报告存在任何所述突变，向所述患者施用抑制由所述突变基因编码的突变EGFR蛋白的信号转导的化合物。所述实施方式包括抑制由所述突变基因编码的突变EGFR蛋白的信号转导的化合物，其用于与肿瘤相关或由肿瘤导致的疾病的治疗中，所述肿瘤可能带有在表皮生长因子受体(EGFR)基因中具有突变的细胞，包括要求测试患者样品中以选自以下列表的突变表征的突变EGFR基因的存在：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A；和是否报告存在任何所述突变。
在又另一个实施方式中，本发明是用于检测人EGFR基因中的突变的试剂盒，包括选自以下列表的任何突变：SEQ ID NO: 11-40中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A，所述试剂盒包含选自SEQ ID NO: 11-40的一个或多个寡核苷酸。
在又另一个实施方式中，本发明是用于检测人EGFR基因中的突变的反应混合物，包括选自以下列表的任何突变：SEQ ID NO: 11-40中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A，所述反应混合物包含选自SEQ ID NO: 11-40的一个或多个寡核苷酸。
在又另一个实施方式中，本发明是选自SEQ ID NO: 11-40的寡核苷酸在检测人EGFR基因中的突变中的用途，所述突变选自以下列表：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A。在这个实施方式的变式中，本发明是检测人EGFR基因中的突变在癌症的诊断或预后中的用途，所述突变选自以下列表：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A。在这个实施方式的进一步变式中，本发明是检测人EGFR基因中的突变在设计癌症患者的治疗或预测癌症患者对治疗的反应中的用途，所述突变选自以下列表：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A。
附图说明
图1 (1A-1C)显示了SEQ ID NO: 1，野生型EGFR的cDNA序列。
图2显示SEQ ID NO: 2，野生型EGFR的氨基酸序列。
图3显示SEQ ID NO: 3，EGFR基因的核苷酸2221-2260的野生型序列；和SEQ IDNO: 4，突变2236_2248>ACCC。
图4显示SEQ ID NO: 3，EGFR基因的核苷酸2221-2260的野生型序列；和SEQ IDNO: 5，突变2237_2244>CGCCC。
图5显示SEQ ID NO: 6，EGFR基因的核苷酸2221-2280的野生型序列；和SEQ IDNO: 7，突变2252_2277>AC。
图6显示SEQ ID NO: 6，EGFR基因的核苷酸2221-2280的野生型序列；和SEQ IDNO: 8，突变2240_2264>CGAAAGA。
图7显示SEQ ID NO: 3，EGFR基因的核苷酸2221-2260的野生型序列；和SEQ IDNO: 9，突变2239_2240 TT>CC。
图8显示SEQ ID NO: 6，EGFR基因的核苷酸2221-2280的野生型序列；和SEQ IDNO: 10，突变2264 C>A。
发明详述
定义
为了促进对本公开的理解，提供本文使用的术语的定义如下。
术语“n_m”或“n-m del”是指导致缺少在位置“n”和“m”之间的核苷酸的核酸的突变。术语“n_m>XYZ”是指复合突变，其中所述核酸缺少在位置“n”和“m”之间的核苷酸，但在它们的位置插入核苷酸序列XYZ。例如，术语“2236_2248>ACCC”是指导致缺少核苷酸2236-2248，但在缺失的核苷酸的位置插入核苷酸序列ACCC的核酸的突变。
术语“nX>Y”是指导致在位置“n”的核苷酸X被核苷酸Y取代的突变。例如，术语“2264C>A”是指导致在2264位的胞嘧啶被腺嘌呤取代的突变。类似地，术语“2239_2240TT>CC”是指在2239和2240位的两个胸腺嘧啶被两个胞嘧啶取代的突变。
术语“等位基因-特异性引物”或“AS引物”是指与目标序列的多于一个变体杂交，但能够在目标序列的变体之间进行区分的引物，因为只有对于一种变体，在适合的条件下通过核酸聚合酶有效延伸所述引物。对于目标序列的其他变体，延伸的效率较低、无效或不能检测。
术语“普通引物”是指包括等位基因-特异性引物的引物对中的第二引物。普通引物不是等位基因-特异性的，即在等位基因-特异性引物所区分的目标序列的变体之间不进行区分。
所使用的术语“互补”或“互补性”涉及通过Watson-Crick碱基配对规则而相关的多核苷酸的反平行链。术语“完全互补”或“100%互补”是指反平行链之间的所有碱基都具有Watson-Crick配对的互补序列，即在多核苷酸双链体中的任何两个碱基之间没有错配。然而，即便在缺少完全互补性的情况下，在反平行链之间形成双链体。术语“部分互补”或“不完全互补”是指低于100%完全互补(例如，在多核苷酸双链体中存在至少一个错配或失配的碱基)的反平行多核苷酸链之间的碱基的任何比对。部分互补链之间的双链体通常稳定性低于完全互补链之间的双链体。
术语“样品”是指包含或假定包含核酸的任何组合物。它包括从个体分离的组织或体液的样品，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪液、血细胞、器官和肿瘤，并且还涉及从采自个体的细胞建立的体外培养物的样品，包括福尔马林-固定的石蜡包埋组织(FFPET)和由其分离的核酸。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”互换使用。“寡核苷酸”是有时用于描述较短的多核苷酸的术语。寡核苷酸可由指定核苷酸序列的区域对应的至少6个核苷酸，例如至少约10-12个核苷酸，或至少约15-30个核苷酸组成。
术语“一级序列”是指多核苷酸或寡核苷酸中的核苷酸的序列。核苷酸修饰，例如含氮碱基修饰，糖修饰或其他骨架修饰不是一级序列的一部分。标签，例如缀合到寡核苷酸的生色团也不是一级序列的一部分。因此，两条寡核苷酸可共享相同的一级序列，但在修饰和标签方面不同。
术语“引物”是指与目标核酸中的序列杂交，并且能够在适合用于此类合成的条件下充当沿着核酸互补链的合成的启动点的寡核苷酸。如本文使用的术语“探针”是指与目标核酸中的序列杂交，并且通常是可检测地标记的寡核苷酸。探针可具有修饰，例如使探针无法通过核酸聚合酶延伸的3'-末端修饰，和一个或多个生色团。具有相同序列的寡核苷酸可在一个测定中充当引物且在不同的测定中充当探针。
如本文使用的术语“目标序列”、“目标核酸”或“目标”是指待扩增、检测或二者的核酸序列的部分。
术语“杂交的”和“杂交”是指导致双链体形成的两条核酸之间的碱基配对相互作用。不需要两条核酸在其全长具有100%互补性而实现杂交。
术语“选择性杂交”和“特异性杂交”是指核酸主要(50%或更多的杂交分子)或几乎全部(90%或更多的杂交分子)地与存在于复杂混合物(其中还存在其他核酸)中的特定核酸杂交。例如，在典型PCR条件下，引物特异性与目标核酸杂交，并排除与同样存在于溶液中的非目标核酸杂交。特异性杂交的引物驱动目标核酸扩增，以产生目标核酸的扩增产物，其至少是最主要的扩增产物并且优选是几乎全部(例如，代表样品中所有扩增产物的90%或更多)扩增产物。优选地，存在如此少量的非特异性扩增产物，以使其是不可检测的或检测的量如此之少，以容易地与特异性扩增产物区分。类似地，探针特异性与目标核酸杂交，并排除与同样存在于反应混合物中的非目标核酸杂交。特异性杂交的探针允许特异性检测目标核酸，以产生可检测的信号，其至少是最主要的信号，并且优选是几乎全部(例如，代表样品中90%或更多的所有扩增产物)信号。
本发明描述了EGFR激酶结构域中的新型突变，其可用于癌症诊断和预后，设计治疗方案和预测治疗的成功。
本文使用的核苷酸编号是参考SEQ ID NO: 1，如图1中所示。在SEQ ID NO: 1中，涵盖本文所述的6个突变的核苷酸2221和2280之间的序列部分以粗体标示且带有下划线。
本文使用的氨基酸编号是参考SEQ ID NO: 2，如图2中所示。在SEQ ID NO: 2中，信号序列包括氨基酸1-24，细胞外结构域包括氨基酸24-645，跨膜结构域包括氨基酸646-668，且细胞质构域包括氨基酸669-1210，其中，酪氨酸激酶结构域是氨基酸718-964，且苏氨酸磷酸化位点是氨基酸678。
本研究确定了在人EGFR基因中的外显子19 (激酶结构域的一部分)中的6个新型突变。所述突变图解说明在图3-8中。在所述附图中，从野生型基因缺失的序列以下划线标示。插入到突变基因的缺失位置的序列以粗斜体显示。突变也总结在表1中。
表1：人EGFR基因的外显子19中的新突变和野生型序列
第一突变2236_2248>ACCC显示在图3中。图3显示了野生型EGFR (SEQ ID NO: 3)的核苷酸序列的片段和编码突变 2236_2248>ACCC (SEQ ID NO: 4)的相应片段。
第二突变2237_2244>CGCCC显示在图4中。图4显示了野生型EGFR (SEQ ID NO: 3)的核苷酸序列的片段和编码突变2237_2244>CGCCC (SEQ ID NO: 5)的相应片段。
第三突变2252_2277>AC显示在图5中。图5显示了野生型EGFR (SEQ ID NO: 6)的核苷酸序列的片段和编码突变2252_2277>AC (SEQ ID NO: 7)的相应片段。
第四突变2240-2264>CGAAAGA显示在图6中。图6显示了野生型EGFR (SEQ ID NO:6)的核苷酸序列的片段和编码突变2240-2264>CGAAAGA (SEQ ID NO: 8)的相应片段。
第五突变2239_2240 TT>CC显示在图7中。图7显示了野生型EGFR (SEQ ID NO: 3)的核苷酸序列的片段和编码突变2239_2240 TT>CC (SEQ ID NO: 9)的相应片段。
第六突变2264 C>A显示在图8中。图8显示了野生型EGFR (SEQ ID NO: 6)的核苷酸序列的片段和编码突变2264 C>A (SEQ ID NO: 10)的相应片段。
在一个实施方式中，本发明包括用于检测EGFR的外显子19中的突变的寡核苷酸，所述突变选自以下列表：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A。在一个实施方式中，本发明包括寡核苷酸(SEQ ID NO: 11-40)，其用于通过等位基因特异性PCR (表2)检测上述突变(等位基因特异性PCR已描述于美国专利号6,627,402中)。如表2中所示，寡核苷酸SEQ ID NO: 12-14、17-20、23-25、28-30、33-35、37和38是选择性的，即等位基因特异性引物。这些等位基因特异性引物的某些包含与野生型和突变目标序列二者的内部错配。等位基因特异性PCR引物中的其他错配已显示提高引物的选择性，参见美国专利公开号No. 2010/0099110。表2中的其他寡核苷酸，SEQ ID NO: 11、15、16、21、26、27、31、32和36不是选择性的，即，不是等位基因特异性。这些寡核苷酸引导突变模板和野生型模板二者的扩增。本发明的这些选择性和非选择性引物任意地命名为“正向”引物。对于指数扩增，这些引物可以与不是等位基因特异性的第二“反向”引物配对，例如SEQ ID NO: 40。对于基于探针的检测，可使用探针，例如SEQ ID NO: 39。本领域技术人员理解SEQ ID NO: 39和40是非限定性的实例。不同的反向引物和不同的探针也可与选自SEQ ID NO: 11-40的正向引物一起使用。
表2：
用于检测EGFR的外显子19中的新突变的寡核苷酸
普通引物 = 扩增突变和野生型核酸二者的引物
选择性引物 = 仅扩增突变核酸而不扩增野生型核酸的引物
E = N4-叔丁基-苯甲基-dC
F = N6-叔丁基-苯甲基-dA
M = FAM
Q = BHQ2
P = 磷酸。
为了引物的成功延伸，所述引物需要具有与目标序列的至少部分互补性。通常，在引物3'-末端的互补性比在所述引物5'-末端的互补性更重要(Innis等人，Eds. PCRProtocols, (1990) Academic Press, Chapter 1, pp. 9-11)。这意味着5'-末端的变化，即在5'-末端的核苷酸的添加、取代或去除不影响引物在PCR测定中的性能。因此，本发明涵盖表2中公开的引物，以及带有5'-末端变化的这些引物的变体。
类似地，为了成功的探针杂交，所述探针需要具有与目标序列的至少部分互补性。通常，接近探针中央部分的互补性比在探针末端的互补性更为重要(Innis等人，Chapter32, pp. 262-267)。这意味着在探针末端的变化，即，几个核苷酸的添加、取代或去除，不影响探针在杂交中的性能。因此，本发明涵盖表2中公开的探针，以及带有末端变化的这些探针的变体。
在这种实施方式的其他变式中，所述探针具有特别的结构，包括蛋白-核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、分子信标探针(Tyagi等人，(1996), Nat. Biotechnol. 3:303-308)或SCORPIONS®自探测引物(Whitcombe等人，(1999), Nat. Biotechnol. 8:804-807)。可使用放射性、荧光或发色团标签标记探针。例如，可通过实时等位基因特异性聚合酶链式反应检测突变，其中，探针与扩增产物的杂交导致探针的酶促消化和消化产物的检测(TaqMan™探针，Holland等人， (1991) P.N.A.S. USA 88:7276-7280) 。探针和目标之间的杂交还可以通过检测由于核酸双链体形成而导致的荧光变化而被检测(美国专利公开号2010/0143901)，或通过检测探针和目标之间杂交物的特征解链温度而被检测(美国专利号5,871,908)。
可检测肿瘤或其他身体样品，例如尿、唾液或血清中的突变EGFR基因或基因产物。上述讨论的用于检测肿瘤样品中的突变EGFR基因或基因产物的相同技术可应用于其他身体样品。例如，癌细胞从肿瘤脱落并出现在这样的身体样品中。现有技术的核酸检测方法能够在广泛的多种样品类型中检测在非癌细胞背景中的突变细胞。
在另一个实施方式中，本发明是治疗具有肿瘤的患者的方法，所述肿瘤可能带有在外显子19中具有突变的EGFR基因的细胞，所述突变选自SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A；所述方法包括要求所述测试患者的患者样品中的一个或多个上述突变；和如果检测到所述突变，向所述患者施用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或EGFR抑制剂。所述实施方式包括抑制由所述突变基因编码的突变EGFR蛋白的信号转导的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或EGFR抑制剂，其用于与肿瘤相关或由肿瘤导致的疾病的治疗中，所述肿瘤可能带有在表皮生长因子受体(EGFR)基因中具有突变的细胞，包括要求测试患者样品中以选自以下列表的突变表征的突变EGFR基因的存在：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A；和是否报告存在任何所述突变。在这种实施方式的变式中，所述酪氨酸激酶抑制剂是EGFR激酶抑制剂，例如，如西妥昔单抗、帕尼单抗、厄洛替尼或吉非替尼。
在这种实施方式的变式中，所述方法进一步包括查询一个或多个以下突变：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del Pins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、D770-N771 del NPGins、D770-N771 del SVD ins、P772-H773 dup、P772-H773 del V ins、M766-A767 del AIins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y，和E746-A750 del AP ins；和如果存在一个或多个所述突变，向所述患者施用抑制由所述突变基因编码的突变EGFR蛋白的信号转导的化合物。导致以上列出的突变的核苷酸变化和检测它们的方法公开在美国专利号7,294,468和7,960,118和2011年10月25日提交的美国申请序号13/280,976 (突变E746-A750 del AP ins)。可通过使用与多个探针的杂交同时或分离地检测多个突变，例如，以斑点-印迹或核酸阵列形式、多重PCR，例如多重等位基因特异性PCR，和继之以探针解链测定的多重PCR，其中每个探针由突变特异性解链温度表征。多重突变也可以通过高通量测序检测，例如，使用涉及附着于固体支持物的单个分子的乳液PCR扩增，随后通过合成的测序，以及序列数据的生物信息分析的方法，例如454 Life Sciences,Inc. (Branford, Conn)开发的方法。
在另一个实施方式中，本发明是测定具有恶性肿瘤的患者对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)或EGFR抑制剂的改变的反应的方法。所述方法包括查询患者样品的EGFR的外显子19中的一个或多个突变的存在，所述突变选自SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A；和如果发现突变，确定所述治疗很可能是成功的。在这种实施方式的变式中，所述酪氨酸激酶抑制剂是EGFR激酶抑制剂或EGFR抑制剂是，例如，西妥昔单抗、帕尼单抗、厄洛替尼或吉非替尼。
在这种实施方式的变式中，所述方法进一步包括查询一个或多个以下突变：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del Pins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、D770-N771 del NPGins、D770-N771 del SVD ins、P772-H773 dup、P772-H773 del V ins、M766-A767 del AIins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y，和E746-A750 del AP ins；和如果存在一个或多个所述突变，确定使用酪氨酸激酶抑制剂的治疗很可能是成功的。
在又另一个实施方式中，本发明是包含检测EGFR的外显子19中的一个或多个突变所需的试剂的试剂盒，所述突变选自SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A。所述试剂盒可包含寡核苷酸，例如对于突变序列具有特异性但对野生型序列没有特异性的探针或扩增引物。任选地，试剂盒中的一个或多个等位基因特异性引物、普通引物和探针可选自表2。所述试剂盒进一步包括实施扩增和检测测定所必需的试剂，例如PCR、实时PCR或转录介导的扩增(TMA)的组分。在一些实施方式中，突变-特异性寡核苷酸是可检测地标记的。在这样的实施方式中，所述试剂盒包含用于标记和检测所述标签的试剂。例如，如果寡核苷酸用生物素标记，则所述试剂盒可包含链霉亲和素试剂和酶及其发色底物。在这种实施方式的变式中，所述试剂盒进一步包括用于检测EGFR基因中至少一种或多种突变的试剂，所述突变选自以下： G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、D770-N771del NPG ins、D770-N771 del SVD ins、P772-H773 dup、P772-H773 del V ins、M766-A767del AI ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y，和E746-A750 del AP ins。
在又另一个实施方式中，本发明是用于检测人EGFR基因中的突变的反应混合物，包括选自以下列表的一个或多个突变：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A，所述反应混合物包含选自SEQ ID NO: 11-40的一个或多个寡核苷酸。
在又另一个实施方式中，本发明是选自SEQ ID NO: 11-40的寡核苷酸在检测选自以下列表的一个或多个突变中的用途：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A。在这个实施方式的变式中，本发明是检测一个或多个选自以下的突变在癌症的诊断或预后中的用途：SEQID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A。在这个实施方式的进一步变式中，本发明是检测一个或多个选自以下的突变在设计癌症患者的治疗或预测癌症患者对治疗的反应中的用途：SEQ IDNO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC和2264 C>A。
实施例1
确定肺癌患者样品中的突变
从肺癌(NSCLC)患者获得组织样品。将样品作为福尔马林固定的，石蜡包埋组织(FFPET)保存。从样品获得核酸，并在Genome Sequencer FLX仪器(454 Life Sciences,Branford, Conn.)上对其进行直接测序。
在来自样品的总计3550个读数的平均24.6%中检测到2236_2248>ACCC突变。在来自样品的总计4205个读数的平均27.7%中检测到2237_2244>CGCCC突变。在来自样品的总计5368个读数的平均24.6%中检测到2252_2277>AC突变。在来自样品的总计3394个读数的平均32.2%中检测到2240-2264>CGAAAGA突变。在来自样品的总计3120个读数的平均74.3%中检测到2239_2240 TT>CC突变。在来自样品的总计3394个读数的平均32.8%中检测到2264 C>A突变。发现只有部分的读数包含反映出以下事实的突变，即所述样品是肿瘤和非肿瘤细胞的混合物。
实施例2
使用等位基因-特异性寡核苷酸检测突变
在这个实施例中，通过分别包含突变和野生型插入物的质粒表示突变体和野生型目标。使用突变特异性引物或在对照反应中使用非选择性“普通”引物扩增目标。
每个15 µL的反应包含10,000拷贝的目标DNA和标准PCR试剂，包括三磷酸核苷、DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶和各0.1µM的正向和反向引物，和0.05µM探针(所有均选自表2)。使用LightCycler™ 480仪器(Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.)完成扩增和分析。使用以下概况循环进行反应：50℃ 5分钟，随后为95℃ 10秒和62℃ 30秒的2个循环，随后为93℃ 10秒和62℃ 30秒的55个循环。
每个正向引物的结果显示在表3中。通过“达到阈值的循环数”或Ct值表示扩增。较高的Ct表示扩增功效较低，例如，通过错配引物。∆Ct表示野生型和突变目标扩增之间的差别。∆Ct的存在表明检测到突变，并且∆Ct的数值代表测定的选择性。
表3：
通过等位基因-特异性PCR检测突变
* 每个Ct 是两次试验的平均值
NA：没有扩增
对照：普通的，不是等位基因特异性正向引物。
尽管已参考具体实施例详细描述本发明，但对本领域技术人员显而易见的是可在本发明范围内进行多种修饰。因此，本发明的范围不应限于本文所述的实施例，而是通过后续呈递的权利要求限定。

Claims (4)

1.突变特异性寡核苷酸在制备用于检测人表皮生长因子受体(EGFR)基因中的一个或多个突变的试剂盒中的用途，所述寡核苷酸特异性地与包含选自以下的突变的核酸杂交：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA和2264 C>A。
2.权利要求1的用途，其中所述寡核苷酸选自SEQ ID NO: 12-14、17-20、23-25、28-30和33-35。
3.用于检测人EGFR基因中的突变的试剂盒，包括选自以下的任何突变：SEQ ID NO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA和2264 C>A，所述试剂盒包含选自SEQ ID NO: 12-14、17-20、23-25、28-30和33-35的一个或多个寡核苷酸，且任选地进一步包含核酸前体、核酸聚合酶和支持所述核酸聚合酶活性所必需的试剂和溶液。
4.用于检测人EGFR基因中的突变的反应混合物，包括选自以下的任何突变：SEQ IDNO: 1中的2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240_2264>CGAAAGA和2264C>A，所述反应混合物包含选自SEQ ID NO: 12-14、17-20、23-25、28-30和33-35的一个或多个寡核苷酸，且任选地进一步包含核酸前体、核酸聚合酶和支持所述核酸聚合酶活性所必需的试剂和溶液。
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