KR20170133285A - 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상피 세포 성장인자 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물과 상기 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 암 환자 예후의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트{The composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene(EGFR) and the EGFR mutation kit consisting of the compounds}
본 출원은 2016년 5월 25일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2016-0064259호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상피 세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물과 상기 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트에 관한 것이다.
암이란 다양한 원인에 의해 세포의 분열과 사멸 간의 균형이 파괴됨으로써 계속적인 분열과 증식에 의해 발생한 비정상적인 세포의 집단을 의미하며, 종양 또는 신생물이라고도 한다. 일반적으로 장기, 백혈구, 뼈, 림프절 등을 포함한 100 가지 이상의 신체의 여러 부분에 발병하며, 주변조직으로 침윤하는 현상 및 다른 기관으로 이동하는 전이를 통해 심각한 증상으로 발전한다.
암의 치료제는 지속적으로 개발되고 있어, 현재 임상에서 사용되는 각종 암에 대한 치료제는 수십 가지에 이르고 있다. 하지만 현재까지도 임상의들은 두 가지의 어려움을 겪고 있는데, 첫째는 치료제가 치료 효과를 나타내기까지는 몇주 정도의 시간이 소요되고 개개 환자들에게 효과가 있는 치료제를 미리 알 수가 없다는 것이다. 즉, 항암제의 치료 효과는 며칠 내에 판정할 수 있는 것이 아니라 수주에 걸쳐서 서서히 나타나기 때문에 처방된 약물이 효과가 없다고 판단하기까지는 오랜 시간이 걸린다는 것이다. 그 후 치료 효과가 부적절하다면 다른 종류의 치료제로 변경을 고려하는데, 결국 치료를 시작할 때 임상의가 환자에게 적절한 치료제를 선택하지 못하였다면, 효과적인 치료까지 시간이 그만큼 지체하게 되며, 병의 진행, 재발 및 예후에 치명적인 영향을 미치게 된다.
두 번째 어려움은 치료제에 치료 반응을 보이지 않는 환자가 다수 존재하는 점이다. 예를 들어, 유방암 치료제인 라파티닙(lapatinib)은 HER2 단백질의 수치가 높고(HER2 양성) EGFR 단백질의 수치가 낮은 경우에 치료효과가 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 그러나 전이성 HER2 음성 유방암은 라파티닙에 반응을 하지 않아 라파티닙이 효과가 없는 것으로 드러났다. 이러한 연구결과를 참고하면, 일단 유방암 환자들은 치료를 받기 전에 정확한 검사를 통하여 HER2 음성인지 혹은 양성인지를 확실히 밝혀야 적절한 치료를 선택할 수 있음을 알 수 있다.
따라서, 치료제에 대한 치료반응과 그 부작용을 미리 예측할 수 있다면, 환자에게 맞는 약물을 미리 선별하여 약물을 잘못 선택함으로 인하여 생기는 치료 탈락(dropout)률을 낮추고 약물의 순응도를 높일 수 있을 것이다. 또한 약물의 효과가 나타나기까지 걸리는 시간과 환자가 겪을 지도 모르는 부작용의 위험을 피해 갈 수 있을 것이다.
한편, EGFR(epidermal growth factor receptor)은 erbB 수용체 부류의 단백질 티로신 인산화효소의 일종이다. 성장 인자 리간드, 예컨대 표피 성장 인자(EGF: epidermal growth factor) 결합시, 상기 수용체는 또 다른 EGFR 분자와 동종 이량체를 형성할 수 있거나, 또는 또 다른 부류 구성원, 예컨대 erbB2(HER2), erbB3(HER3), 또는 erbB4(HER4)와 이종 이량체를 형성할 수 있다.
erbB 수용체의 동종 및/또는 이종 이량체의 형성은 세포내 도메인에서 중요 티로신 잔기의 인산화를 결과로 생성하고, 세포 증식 및 생존에 관여하는 많은 세포내 신호 전달 경로의 자극을 유도한다. erbB 부류 신호 전달의 탈조절은 증식, 침윤, 전이, 혈관형성 및 종양 세포 생존을 조장하며, 그리고 폐암, 두경부암 및 유방암을 비롯한 많은 인간 암에서 기술되어 있다.
그러므로, erbB 부류가 항암 약물 개발을 위한 합리적인 표적을 대표하고, 제피티닙(IRESSA™), 엘로티닙(TARCEVA™)을 비롯한, EGFR을 표적하는 다수의 제제가 현재 임상적으로 이용될 수 있다. 2004년에는 EGFR에서 활성화 돌연변이가 비소세포 폐암(NSCLC: non-small-cell lung cancer)에서 제피티닙 요법에 대한 반응과 상관관계가 있다는 것이 보고되었다(Science [2004] Vol.304, 1497-500 및 New England Journal of Medicine [2004] Vol. 350, 2129-39). 가장 일반적인 EGFR 활성화 돌연변이인 L858R 및 delE746_A750은 야생형(WT: wild type) EGFR에 비하여 소분자 티로신 키나제 억제제, 예컨대 제피티닙 및 엘로티닙에 대한 반응성과 관련이 있다고 알려져 있다. 궁극적으로, 제피티닙 또는 엘로티닙을 사용하는 요법에 대한 획득 내성이 발생할 수 있다. 예를 들면 게이트키퍼 잔기 T790M의 돌연변이가 발생하면 제피티닙 및 엘로티닙에 대한 내성을 가진다고 알려져 있으며, 상기 돌연변이는 임상적으로 내성을 띠는 환자 중 50%에서 검출되는 것으로 보고된 바 있다.
이와 같이, EGFR 돌연변이의 존재는 제피티닙 또는 엘로티닙과 같은 EGFR 키나아제 저해제에 반응하는 약물 감수성의 강력한 예측인자로 작용하므로, 최적의 치료적 접근을 위해 EGFR 돌연변이의 효과적이고 신속한 검출 방법이 요구된다.
이에 본 연구진은 환자의 혈액 내 cfDNA에 적용시키기 적합한 EGFR 유전자의 돌연변이를 검출하는 프라이머/프로브 세트 및 이를 포함하는 키트를 개발하여 특허 출원을 한 바 있다(출원번호: 10-2015-0101915). 하지만 본 발명을 통해 EGFR 유전자의 돌연변이를 더 효율적이고 정확하게 검출할 필요가 있어, 추가적으로 프라이머/프로브 세트를 연구하고, 제피티닙이나 엘로티닙외의 다른 EGFR 저해제가 작용하는 돌연변이 사이트에 대하여 연구해 볼 필요가 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
이에 본 발명자들은 EGFR 돌연변이를 신속하게 검출하여 EGFR 관련 암 환자의 약물치료 전략을 선택하거나, 암의 전이 또는 재발을 방지하기 위한 모니터링 수단으로 사용하기 위하여 EGFR 유전자의 돌연변이를 검출하는데 적합한 프라이머/프로브 세트 및 이를 포함하는 키트를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 EGFR(epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 EGFR(epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 EGFR 저해제 투여 환자의 치료반응성 평가에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 시료에서 EGFR 돌연변이 검출 방법을 제공하는 것이다.
(a) 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계;
(c) 상기 중합효소연쇄반응으로 증폭된 산물의 돌연변이 비율을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 돌연변이 비율을 종전의 돌연변이 비율 측정결과와 비교하여 감소 또는 증가여부를 확인하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 EGFR 저해제 투여 환자의 치료 반응성 평가용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 EGFR(epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 EGFR(epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, EGFR 저해제 투여 환자의 치료반응성 평가에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 시료에서 EGFR 돌연변이 검출 방법을 제공한다.
(a) 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계;
(c) 상기 중합효소연쇄반응으로 증폭된 산물의 돌연변이 비율을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 돌연변이 비율을 종전의 돌연변이 비율 측정결과와 비교하여 감소 또는 증가여부를 확인하는 단계.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, EGFR 저해제 투여 환자의 치료 반응성 평가용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공한다.
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
ⅰ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 16 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
ⅱ) 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머 및 서열번호 21, 28 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
ⅲ) 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 13 내지 15, 22, 23, 35로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 및
ⅳ) 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머 및 서열번호 24 내지 27, 29로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 하나이상 선택된 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR(epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 EGFR 저해제에 대한 치료 반응성(responsiveness) 예측을 위한 것을 특징으로 한다. 2004년에 EGFR에서의 돌연변이가 비소세포 폐암(NSCLC: non-small-cell lung cancer)에서 제피티닙 요법에 대한 반응과 상관관계가 있다는 것이 보고(Science [2004] Vol.304, 1497-500 및 New England Journal of Medicine [2004] Vol. 350, 2129-39)된 이래로 많은 관련 EGFR 돌연변이가 확인되었다.
본 발명에서 ‘EGFR(epidermal growth factor receptor)’은 종양유전자(oncogene)인 erbB 또는 ErbB1의 단백질 산물로, erbB 또는 ErbB1은 수많은 암 발생에 있어 중요 인자로 알려진 원발암유전자(protooncogenes)인 ERBB 군의 하나이다. 폐암을 포함하여, 유방암, 방광암, 위암 등에서 EGFR의 발현이 증가되는 것이 관찰되었다.
본 발명에서 'EGFR 저해제'는 폐암, 유방암, 방광암, 위암 등의 상피세포암을 치료하기 위한 EGFR 표적 약물로서, 특히 제피티닙(Gefitinib)(AstraZeneca UK Ltd., 상표명 "IRESSA"), 엘로티닙(Erlotinib)(Genentech, Inc. & OSI Pharmaceuticals, Inc., 상표명 "TARCEVA"), 아파티닙(Afatinib)(Boehringer Ingelheim GmbH corp., 상품명 “GIOTRIF”)과 오시머티닙(osimertinib)(AstraZeneca UK Ltd., 상표명 "TAGRISSO")이 대표적인 약물이다. 또한 약물에 대한 획득 내성을 가지는 T790M/C797S 동시 돌연변이 및 C797S 돌연변이에 대한 약물반응성을 가지는 EGFR Tyrosine kinase inhibitor 인 EAI045(CAS No. 1942114-09-1)이 개발 중에 있다(Cancer letter[2017] Vol.385, 51-54 및 nature letter [2016] Vol. 534, 129-132). 제피티닙과 엘로티닙은 퀴나졸린계 화합물로서, EGFR의 티로신 키나제 활성을 저해하여 인산화를 억제함으로써 세포성장을 막는다. 보다 바람직하게, 엘로티닙(erlotinib), 제피티닙(gefitinib), 아파티닙(Afatinib), 오시머티닙(osimertinib) 또는 EAI045 (CAS No. 1942114-09-1)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다 .
본 발명에서 ‘치료 반응성’은 암의 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 경우의 성장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 억제된다면 치료제에 대해서 ‘반응성’이라고 정의할 수 있다. 암의 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 경우의 성장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 매우 낮은 정도로 억제되거나 억제되지 않는다면 치료제에 대해서 ‘비반응성’이라고 정의할 수 있다. 암의 성장은 종양의 크기 또는 그 종양 유형에 적합한 종양 마커의 발현을 측정하는 방법 등 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 또한 상기 ‘반응성’에는 유의미한 생존곡선상의 생존시기의 증가를 나타낼 수 있으며, ‘비반응성’의 척도는 환자의 삶의 질, 전이도 등을 비롯하여 종양의 성장 크기를 넘는 추가의 기준을 이용해서 평가될 수 있다.
보다 바람직하게는 EGFR(epidermal growth factor receptor)의 저해제에 대한 치료 반응성일 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 암은 폐암, 유방암, 방광암, 위암일 수 있다.
본 발명에서 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명에서 “프로브”는 정량적 PCR에 이용되는 taqman probe의 일종으로 디자인된 것이다. 바람직하게는 프로브에는 형광 물질(HEX, VIC, FAM dye)를 부착하였으며, 모든 프로브의 3'쪽에는 ??쳐(quencher)로 BHQ1이 이용될 수 있다. TaqMan probe는 일반적으로 5‘ 말단을 형광 물질로, 3’ 말단을 quencher 물질로 tagging한 oligonucleotide이며, TaqMan probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridization하지만, probe의 3‘ 말단에 quencher가 있기 때문에 빛을 주어도 형광을 발하지 못하지만, 다음 과정인 extension step에서 Taq DNA polymerase가 가지고 있는 5’→3‘ exonuclease 활성에 의해, 주형에 hybridization한 TaqMan probe가 분해되면 형광물질이 probe로부터 분리되어 quencher에 의한 억제가 해제되고 형광을 발하게 되는 원리에 의해서 PCR 반응에 따른 형광이 정량적으로 발하게 된다.
본 발명에서 프로브는 형광물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 HEX(hexachlorofluorescein), FAM(fluorescein amidite), EverGreen 형광염료가 결합되는 것을 특징으로 한다.
구체적으로 프로브에 FAM, HEX 형광염료(형광물질) 또는 EvaGreen 형광염료가 결합된 형태를 사용하였으므로 이들에 대한 형광을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 이와 같은 과정은 상용의 검출장치(예를 들어, biorad사의 Droplet Reader)에 의해서 수행될 수 있으며, 해당 장치내에서 각각의 샘플의 droplet 형광 신호를 각각 감지 및 positive와 negative droplet의 수를 세어 자동으로 분석까지 완료될 수 있다.
이 때 검출을 위해서 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브 및 표준 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브는 각각 상이한 형광물질과 결합되어 있을 수 있다.
본 발명은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 키트는 background(noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 야생형 서열을 이용하여 돌연변이 검출용 프로브가 야생형 서열에 non-specific 하게 binding 하지 못하도록 디자인 한 oligomer(blocker)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 키트는 바람직하게는 본 발명의 프라이머/프로브 세트를 이용한 PCR 반응에 의한 EGFR 유전자의 돌연변이의 검출에 이용될 수 있다. 본 발명의 키트는 PCR 이나 이의 검출에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명의 키트는 RUO(research use only) 또는 IVD(in vitro diagnostics) 키트일 수 있다. IVD 키트에는 IVD-CDx(in vitro companion diagnostics) 키트도 포함된다.
본 발명은 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 16 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
또한, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머 및 서열번호 21, 28 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
또한 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 13 내지 15, 22, 23, 35로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
또한, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머 및 서열번호 24 내지 27, 29로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 qPCR(quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법에 사용되는 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 키트에 적용가능한 주형은 EGFR의 돌연변이 검출이 필요하며, PCR 반응이 가능한 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 혈액에서 분리된 무세포 DNA(cell-free DNA, cfDNA), 포르말린 고정 파라핀 포매(formalin fixed parafin embedded. FFPE) 조직에서 분리된 DNA 또는 상기 조직 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA(complementary DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 한다.
인간 혈장에서 순환하는 cfDNA는 염증성 장애, 산화 스트레스 및 악성 종양 등의 다양한 생리학적 및 병리학적 병태들에서 연구되고 있다. cfDNA의 혈류 방출과 관련된 정확한 기전은 불확실하지만, 아마도 세포자살, 세포괴사 및 세포로부터의 능동적인 방출이 종합적으로 작용하는 것으로 보인다. 혈관을 통해 순환하는 cfDNA는 잠재적으로 유용한 바이오마커이다. DNA 수준과 단편화 패턴은 진단 및 예후 예측 목적으로 흥미로운 가능성을 제시한다. 특히 환자의 혈액에서 간단히 검출할 수 있다는 점에서 삶의 질을 크게 훼손하지 않고 간편하고 신속하게 바이오마커를 검출할 수 있다는 유용성이 있다.
생검 후 환자에게서 얻은 조직은 통상적으로 포르말린(포름알데히드) 등에 의해서 고정화한다. 고정화한 생물학적 샘플은 일반적으로 탈수시키고, 파라핀 등의 고체 지지체에 포매하며, 이렇게 제조된 시료를 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 시료라고 한다. FFPE 시료 상의 핵산, 특히 DNA는 고정된 세포에 존재하고, 단편화 되어 있거나 포르말린에 의해 교차 결합되어 있으므로 파라핀을 제거하고 고정된 세포를 용해하여 DNA를 비롯한 핵산을 세포 내에서 용출시킬 필요가 있다.
본 발명에 있어서 '파라핀'은 형태학적, 면역조직화학적 및 효소조직화학적인 해석을 포함하는 모든 해석에 있어서 사용되는 생체시료의 포매 매체를 포괄적으로 말하는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서의 파라핀은 석유계 파라핀 왁스 단체(單體)여도 되고, 당해 석유계 파라핀 왁스를 기제(基劑)로 하여, 포매 매체의 품질향상 등의 목적으로 첨가될 수 있는 모든 다른 성분을 포함한 것이어도 된다. 여기서, 석유계 파라핀 왁스는 석유에 유래하는 상온에서 고형인 탄화수소류의 혼합물을 말한다.
일반적으로 FFPE 처리된 암 환자의 검체 시료를 회전식 미세톱(rotary microtome)으로 5~10μm 의 두께로 절단한 다음 상용의 FFPE 용 핵산 분리 키트 또는 이를 활용하는 장치를 통해 DNA를 포함하는 핵산을 분리할 수 있다. FFPE에서 핵산을 분리하는 키트/장치는 예를 들어 지멘스 사의 Tissue Preparation System 및 이와 관련된 시약(VERSANT tissue preparation reagents)을 들 수 있다.
본 발명의 키트는 혈액에서 분리된 CTC(circulating tumor cell)에서 분리된 DNA 또는 상기 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC) 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA(complementary DNA)를 주형으로 할 수 있다.
본 발명에서 주형으로 사용할 수 있는 ‘순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)'는 악성 종양환자의 말초혈액에서 발견되는 종양세포로, 암전이 과정에서 중요한 역할을 한다. CTC는 암의 연구, 진단에 매우 중용하게 여겨지고 있으나, 말초혈액 내에 CTC가 매우 적어, 수백만개 이상의 정상 혈구세포에 섞여 있는 수십 개 이하의 종양세포를 검출할 수 있는 정도의 민감도가 요구되는 검출 시스템이 필요하다.
본 발명의 시료에서 분리되는 핵산은 바람직하게는 게놈 DNA이며, 더 바람직하게는 돌연변이를 보유하고 있을 것으로 추정되는 게놈 DNA이다.
본 발명의 조성물 또는 키트는 바람직하게는 자동화 또는 반자동화된 방법의 EGFR 돌연변이 검출에 이용될 수 있다. 상기에서 자동화는 샘플(시료)의 투입; 추출, 분리, 반응이 완료된 기재(예를 들어, 튜브, 플레이트)의 재배치 또는 이동; 시약, 버퍼의 스톡(stock)에의 투입, 보충; 장비의 유지관리를 제외한 전부 또는 대부분 과정이 인간 이외의 수단(예를 들어, 로봇)을 통해서 이루어지는 것을 의미한다.
본 발명의 일실시예에서 종래의 제품과 비교한 결과 본 발명의 조성물 또는 키트는 EGFR 유전자의 돌연변이 검출에 있어서 cfDNA 시료 FFPE 시료에 대해서 우수한 돌연변이 검출능을 보이는 것을 확인할 수 있었다(실시예 10 참조),
참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990); Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons(1997); Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67(1987); De Andres et al., BioTechniques 18: 42044(1995); Held et al., Genome Research 6:986-994(1996); T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91(2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29(2001)).
본 발명은 EGFR 저해제 투여 환자의 치료반응성 평가에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
(a) 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계;
(c) 상기 중합효소연쇄반응으로 증폭된 산물의 돌연변이 비율을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 돌연변이 비율을 종전의 돌연변이 비율 측정결과와 비교하여 감소 또는 증가여부를 확인하는 단계를 포함하는 시료에서 EGFR 돌연변이 검출 방법을 제공한다.
본 발명은
ⅰ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 16 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
ⅱ) 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머 및 서열번호 21, 28 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
ⅲ) 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 13 내지 15, 22, 23 및 35로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 및
ⅳ) 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머 및 서열번호 24 내지 27, 29로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 하나이상 선택된 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 저해제 투여 환자의 치료 반응성 평가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 ‘시료’는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본，조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물，세포 용해물，전혈，혈장, 혈청，침，안구액，뇌척수액, 땀, 뇨，젖，복수액, 활액，복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있으며，가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 또한 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어，여과，증류，추출，농축，방해 성분의 불활성화，시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는 환자로부터 획득한 CTC(circulating tumor cell), 혈액, FFPE(formalin fixed paraffin embedded), cfDNA(cell-free DNA), 신선한 표본(fresh sample) 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 환자로부터 획득한 혈액 또는 FFPE(formalin fixed paraffin embedded)일 수 있고, 전술한 바와 같이 상기 시료로부터 게놈 DNA 또는 돌연변이를 보유하고 있을 것으로 추정되는 DNA를 분리하여 EGFR 유전자 돌연변이 검출에 사용할 수 있다.
본 발명의 검출방법은 앞서 설명한 바와 같이, 엘로티닙(erlotinib), 제피티닙(gefitinib), 아파티닙(afatinib), 오시머티닙(osimertinib) 및 C797S 대한 표적 티로신 키나아제 억제제(Tyrosine kinase inhibitor)과 같은 EGFR 저해제에 대한 치료 반응성 예측을 위한 것이며, qPCR(quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법으로 EGFR 유전자 돌연변이를 검출할 수 있다.
본 발명에서 상기 ‘치료제에 대한 저항성’은 표적 항암 칠제인 EGFR 저해제를 이용한 치료로부터 치료 효과가 나타나지 않는 특성을 의미한다. 예를 들어, 항암치료 이후 종양의 크기가 변하지 않거나 처음과 동일한 효과를 나타내기 위해 더 많은 양의 약물을 투여하는 경우를 말하며, 바람직하게는 종양의 크기가 변하지 않는 것을 말한다.
본 발명에서 상기 ‘치료제에 대한 감수성’은 표적 항암 치료제인 EGFR 저해제를 이용한 치료로부터 이익을 얻거나 치료 효과가 발생할 수 있는 특성을 말한다. 예컨대, 항암치료 이후 종양의 크기가 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 그 이상 줄어드는 것을 말하며, 바람직하게 종양의 크기가 30% 또는 그 이상 줄어드는 것(항암제에 대한 고형 암의 반응을 평가하는 기준인 RECIST(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)에 따른 완전반응과 부분반응)을 말한다.
본 발명에서 상기 ‘치료 반응성 평가 방법’은 EGFR 저해제를 투여하기 전에환자의 혈액 또는 FFPE 시료로부터 EGFR 돌연변이 비율을 측정한 결과와 EGFR 저해제를 투여하여 일정 기간 후에 동일한 환자의 혈액 또는 FFPE 시료로부터 EGFR 돌연변이 비율을 측정한 결과를 비교하여 감소 또는 증가하는 것을 확인하는 것이다. 또한 치료 반응성 평가 방법은 환자를 치료하는 기간 동안 암세포의 증가 또는 감소를 모니터링하는 방법일 수 있으며, EGFR 저해제에 대한 반응성을 모니터링하는 방법일 수 있다. 바람직하게 상기 돌연변이 비율의 증가는 암세포가 증가하는 것 또는 치료제에 대한 저항성이 증가하는 것을 의미하고, 돌연변이 비율의 감소는 암세포가 감소하는 것 또는 치료제에 대한 감수성이 유지되는 것을 의미한다.
상기 ‘일정 기간’은 환자로부터 처음 획득한 시료를 이용하여 돌연변이 비율을 측정한 뒤, 1일 내지 1년 간격으로 동일한 환자로부터 획득한 시료를 이용하여 돌연변이 비율을 측정하여 비교할 수 있고, 바람직하게는 1일 내지 10개월 간격으로 동일한 환자로부터 획득한 시료를 이용하여 돌연변이 비율을 측정할 수 있고, 보다 바람직하게는 7일 내지 5개월 간격으로 동일한 환자로부터 획득한 시료를 이용하여 돌연변이 비율을 측정할 수 있으며, 가장 바람직하게는 7일 내지 2개월 간격으로 동일한 환자로부터 획득한 시료를 이용하여 돌연변이 비율을 측정할 수 있다.
본 발명의 상기 ‘EGFR 돌연변이’는 L858R, L861Q, T790M, 19 deletion, G719X, C797S, 20 insertion 및 S768I 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 L858R, 19 deletion, T790M일 수 있다.
따라서, 본 발명은 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물과 이를 포함하는 키트을 제공한다. 본 발명의 방법은 암 환자 예후의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트의 구성(MMX 1 내지 4)을 나타낸 것으로, 각 MMX에 포함되는 프로브 및 검출 가능한 EGFR 변이의 종류를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트가 46종의 EGFR mutation site를 검출할 수 있는지 여부를 확인한 결과이며, MMX1(A)과 MMX2(B)에 포함되는 EGFR mutation site에서만 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트가 46종의 EGFR mutation site를 검출할 수 있는지 여부를 확인한 결과이며, MMX3(A 및 C)와 MMX4(B)에 포함되는 EGFR mutation site에서만 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 EGFR 변이를 가지고 있는 환자의 FFPE 샘플을 이용하여 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트의 검출민감도를 확인한 결과이다 (A: 19del(c.2235_2249del15), B: L858R(c.2573_2574T>C)).
도 5는 EGFR 변이를 가지고 있지 않은 혈액샘플을 이용하여 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트의 false positive 결과값을 확인한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
혈장에서 cell free DNA( cfDNA )의 분리
혈장 cfDNA는 순환 핵산 추출 키트(QIAGEN)를 제조사의 권고안에 따라 사용하여 분리하였다. 환자의 혈액을 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하여, 세포 파편을 조심하면서 혈장 1ml를 15 ml튜브로 이동시켰다. 이 샘플에, 용해 완충액 800 ㎕와 재구성한 프로테아제 K 100 ㎕를 혼합하였다. 짧게 볼텍싱(voltexing)한 후, 튜브를 60℃에서 30분간 인큐베이션 시켰다. 결합 완충액 1.8 ml을 샘플에 혼합한 다음, 짧게 볼텍싱 한 후, 얼음에 5분간 반응시켰다. 순환 핵산 키트에 구비된 진공 연결관을 진공 펌프에 장착 시킨 후, 컬럼과 통과 분획 튜브를 진공 연결관의 상부에 결합시켰다. 통과 분획 튜브에 샘플을 넣고, 진공펌프를 가동시켜 컬럼 안의 샘플을 통과시켰다. 컬럼을 씻어주기 위하여 세척 용액 700 ㎕를 통과 분획 튜브에 넣고, 다시 진공펌프를 가동시켜 컬럼을 세척하였다. 통과 분획 튜브와 진공 연결관은 버리고, 컬럼을 새로운 컬렉션 튜브에 결합시켰다. 컬럼 안의 세척용액을 완전히 제거하기 위하여 14000rpm으로 3분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 컬럼을 새로운 컬렉션 튜브에 결합시키고 56℃에서 10분간 컬럼을 건조시켰다. 컬럼을 새로운 1.5 ml 에펜도르프 튜브로 옮기고, 컬럼의 중앙에 용출완충액 50㎕를 넣고, 실온에서 1분간 인큐베이션 시켰다. 그 이후 14000rpm으로 실온에서 1분간 원심분리 하여 DNA샘플을 용출시켰다. 사용하기 전까지 4℃에 저장하거나 또는 장기간 보관하는 경우에는 -70℃에서 동결시켰다.
< 실시예 2>
표준 물질 벡터의 제작
디자인된 프라이머와 프로브를 검증하기 위해, 그리고 ddPCR 수행에 필요한 표준물질을 만들기 위해 표준물질 벡터(mini-clone으로 명명)를 제작하였다. mini-clone의 제작과정은 먼저 EGFR의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간, 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp을 합성하였다. 합성된 DNA 단편은 pIDTSmart Amp 벡터의 universal link sequence 사이에 삽입하고, 제작된 clone은 대장균 DH5α 세포에 형질전환(transformation) 시켰다.
circular form 또는 super-coiled form으로 존재하는 표준물질 벡터를 선형화시켜 ddPCR(droplet digital PCR)시 효율을 극대화시키기 위하여 표준물질 벡터에 제한효소를 처리하였다. 표준물질 벡터(Miniclone DNA) 선형화를 위해 ClaI 또는 Pst1 제한효소를 37℃에서 30분간 반응하고, 반응산물은 clean up 과정을 거친 후 -20℃에서 사용 전까지 보관하였다.
본 발명에서의 검출 대상의 PCR 증폭 후의 수준은 대상 시료에 따라 전체적으로 차이가 있을 수 있으므로 돌연변이에 특이적인 프라이머/프로브에 의한 증폭여부의 판별을 위한 기준이 필요하다. 표준물질 벡터는 이를 위한 것으로 게놈 DNA 유전자 변이를 포괄하는 100bp 내지 350bp의 폴리뉴클레오티드가 통상의 벡터에 형질전환된 것을 이용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 표준물질 벡터는 EGFR의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간, 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp을 합성하여 pIDTSmart Amp 벡터에 삽입하여 사용할 수 있다.
< 실시예 3>
프라이머 / 프로브 디자인 및 선발
폐암 관련 유전자인 EGFR의 바이오 마커를 개발하기 위해 cosmic번호(http://cancer.sanger.ac.uk)를 기반으로 하여 돌연변이 위치를 확인하였다. 유전자의 exon별 프라이머를 primer3 프로그램을 사용하여 forward가 intron부분과 overlapping될 수 있도록 디자인하였다. 이 때, 프라이머의 Tm값은 55~60℃로 하였으며 GC%는 40~62%로 디자인하였다.
프로브는 조건을 충족하는 것들을 선별하여 taqman probe로 디자인하였다. 5‘ wild type 프로로브에는 HEX/FAM reporter fluorescence를 부착하였으며, 5’ mutant probe에는 HEX/FAM dye를 부착하여 이후에 증폭 여부를 검출 가능하도록 하였다. 모든 프로브의 3' 쪽에는 quencher로 BHQ1을 사용하였다. EGFR exon 18, 19, 20, 21번에 각각 3, 4, 8, 2개의 프로브들을 디자인하여 합성하였다. 본 발명자들에 의해 디자인된 프로브는 allele specific을 갖고 있으며 대부분의 프로브들이 cosmic 번호를 가지고 있었다.
한편, background(noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 야생형 시퀀스를 이용하여 돌연변이 검출용 프로브가 야생형 시퀀스에 non-specific하게 결합하지 못하도록 blocker oligomer를 제작하였다.
디자인된 프라이머와 프로브의 정보를 각각 표 1 및 표 2에 나타냈다.
프라이머의 정보
Primer name Sequence Seq. no. Exon
C1-F1 tgaggatcttgaagaagaaactga 1 Exon 18
C1-R1 ctgtgccaaagggaccttacct 2 Exon 18
C5-F15 ccctccaggaagcctaaacg 3 Exon 19
C29-R1 aggttcagagccatggacaa 4 Exon 19
C36-F1 ccctccaggaagcctacg 5 Exon 20
C36-R1 cagccgaagggcatga 6 Exon 20
C36-F18 ccctccaggaagcaactacg 7 Exon 20
F36-R16 tttgtgaattcccggacatagtc 8 Exon 20
C36-F17 ccacactgacgtgaacctct 9 Exon 20
C36-R14 ggtggaggaatgaggcagat 10 Exon 20
C44-F1 acaccgcagcataagtcaagat 11 Exon 21
C44-R1 tgcctccttcaatgcatggtat 12 Exon 21
프로브의 정보
Probe name Sequence Seq. no. Exon Mutant
EP2-2 FAM-tcaaagtgctgccgcctccggtgc 13 엑손 18 G719A
EP3-3 FAM-aaaagatcaaaccgtgctgagctccg 14 엑손 18 G719S
EP4-3 FAM-aaaagatcaaaccgtgctgtgctccg 15 엑손 18 G719C
EP22-1 FAM-cgtcgctatcaagaagaatcgaaagcca 16 엑손 19 exon 19 deletion
EP31-1 FAM-ccgtcgctatcaaaagtatctccgaaagcca 17 엑손 19 exon 19 deletion
EP33-1 FAM-ccgtcgctatcaaaattccaagaaagccaaca 18 엑손 19 exon 19 deletion
EP29-3 FAM-aagagaagcaacactcgatgtgagtttc 19 엑손 19 exon 19 deletion
2X EP36 HEX-gcatctgcctcacaactccaccgt 20 엑손 20 QC
2X EP37-Y FAM-catgagctgcatcgatgagytgca 21 엑손 20 T790M
EP48 HEX-atgcccttcggaacagcctcct 22 엑손 20 C797S
EP49 HEX-atgcccttcggaactccctcct 23 엑손 20 C797S
EP50 HEX-atgcccttcggaagcctcctc 35 엑손 20 C797S
EP38-2 FAM-tacgtgatggccccatcgtggaca 24 엑손 20 S768I
EP40-2 FAM-tggacaacccccaccccacgtgt 25 엑손 20 exon 20 insertion
EP41 FAM-cgtggacccggtaacccccacgtgt 26 엑손 20 exon 20 insertion
EP42-2 FAM-ccagcgcctggacagcgtgg 27 엑손 20 exon 20 insertion
EP45 HEX-cacagattttggccgcgggccaa 28 엑손 21 L858R
EP46-3 HEX-tggccaaccacagctgggtg 29 엑손 21 L861Q
EP47-3 HEX-ttttgggcgtgccccaaactg 30 엑손 21 L858R
선행문헌(출원번호: 10-2015-0101915)의 프로브와 비교하였을 때, 서열번호 13 내지 15, 28은 명칭은 같지만 결합된 형광물질과 염기서열이 다르며, 서열번호 19 내지 23, 35는 새로운 염기서열의 프로브이다. 또한 서열번호 24 내지 27은 명칭과 형광물질은 같으나 염기서열이 다르다. 반면, 서열번호 29 및 30은 기존의 프로브와 같은 프로브이다.
블로커 올리고머의 정보
Blocker name Sequence Seq. no Exon
E-ex19-B1 cgtcgctatcaaccggaattaagagaagca 31 19
E-ex21-B1 gattttgggctgccgccaaact 32 21
E-ex18-B1 aagtgctgggccctccggtg 33 18
E-C38-B1 cgtgatggccccagcgtgga 34 20
< 실시예 4>
프라이머 및 프로브의 돌연변이 검출능
ddPCR 장비로 QX200™ Droplet digital PCR system(Bio-RAD, USA)을 이용하였다. 샘플 준비로는 MMX1, MMX2, MMX3, MMX4 mixture가 있는 8-stirp PCR tube에 20 ul씩 분주하였고 각 tube에 Ultrapure Water(NTC), Positive control(PC), 환자 검체로부터 추출한 template DNA를 1ul씩 넣었다. 상기 MMX1, MMX2, MMX3 및 MMX4 mixture에 대한 정보는 하기 표 4에 기재하였다. 또한, 각 MMX에 포함된 프라이머 및 프로브에 대한 구체적인 정보를 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
8-Strip PCR tube cap을 닫고 볼텍싱(vortexing) 한 후 Spin down 하였고 실온에서 10분간 Incubation 하였다. 준비된 샘플은 Droplets Generation 단계로 8-Channel Electronic Pipette을 이용하여 8-Strip PCR tube 에서 20ul를 취하여 Cartridge의 sample well에 Loading하였다. Droplet generation oil을 70ul씩 Cartridge의 oil loading well에 Loading 한 후 Droplet Generator Gasket의 위아래를 구분하여 장착하고 QX200™ Droplet Generator넣어 작동시켰다. Droplet generation 과정에서 만들어진 Droplet을 8-Channel Electronic pipette을 이용하여 40ul를 96 well plate로 옮겨 준 후 Pierceable Foil Heat Seal(BIO-RAD, 181-4040)의 붉은색 선이 아래로 가도록 plate위에 덮고 PX1™ PCR Plate Sealer(180℃, 5초 sealing)에 넣고 Sealing 하였다. PCR reaction 과정은 Veriti 96-Well Thermal Cycler를 이용하였고 PCR 반응이 끝난 후 반응된 증폭된 PCR산물을 FAM과 HEX로 구분하여 Reading 하게 하였다. 결과산물은 Bio-RAD 가 제공하는 QuantaSoft software로 수행하였다.
한편, 상기 표 4에 기재한 MMX 1 내지 4가 각각 검출할 수 있는 EGFR mutation site를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 EGFR 유전자 변이 검출 키트(이하 “GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit”라 함)는 상기 MMX 1 내지 4를 모두 포함하고 있으며, 각각의 구성들은 EGFR mutation site를 검출할 수 있음을 보여주고 있다. 이들은 또한 FAM과 HEX로 mutation을 구분할 수 있다. 예를 들어, 도 1의 MMX1에서 19 deletion mutation 은 FAM으로 sample의 quality를 측정하기 위해 EGFR wild type은 HEX를 이용하였다. 따라서 각각 FAM과 HEX로 유전적 변이를 구분하였다.
또한 기존 논문에 발표된 자료를 근거로 하여 EGFR tyrosine kinase inhibitor 약제들인 엘로티닙, 제피티닙, 아파티닙, 오시머티닙의 약물반응성과 관련된 mutation site를 표시하였으며 붉은색은 약에 대해 저항성을 보이는 EGFR 변이를 나타낸 것이며 노란색은 약에 효과를 보이는 EGFR 변이를 나타내고 있다.
< 실시예 5>
GenesWell TM ddEGFR Mutation Test 키트의 돌연변이 검출 시험
본 발명의 GenesWellTM ddEGFR Mutation Test 키트가 EGFR 엑손 18 내지 21의 46개 mutation site를 검출할 수 있는지 알아보기 위해 43개의 표준물질을 이용하였다. 표준물질 43개를 사용한 이유는 3개의 mutation site는 동일한 sequence를 포함하고 있기 때문이다. 또한 cancer의 특징 중의 하나인 heterozygote를 감안하여 Miniclone을 wildtype인 gDNA와 50%로 spiking 하여 샘플을 준비하였다. 본 시험에 사용된 DNA양은 12 ng/sample 이며 모든 46개의 샘플들은 MMX1 내지 4와 각각 반응시켜 ddPCR을 수행하였다.
그 결과 도 2, 도 3에 나타낸 바와 같이, MMX 1 내지 4가 각각 검출할 수 있는 EGFR 변이들만 검출되었으며, 프로브를 포함한 mixture간의 교차반응은 보이지 않았다. 또한, NTC와 gDNA를 기준으로 cut-off를 설정하여 그 위로 나온 푸른색이나 녹색 droplet들이 검출되면 변이가 검출된 것이며, 도 2 및 도 3에서 각각의 푸른색 또는 녹색 droplet이 의미하는 변이의 종류를 도 1에 기재한 clone number로 표시하였다.
< 실시예 6>
환자의 FFPE 샘플을 이용한 GenesWell TM ddEGFR Mutation Test kit 의 검출 민감도 확인
상기 GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit의 민감도를 측정하기 위하여 EGFR 변이가 있는 비소세포성 폐암 환자의 FFPE 검체에서 유래된 DNA를 사용하였다. 예를 들어 5개의 Exon 19 deletion과 1개의 L858R 변이를 가진 환자의 샘플들은 Human Wild type genomic DNA와 spiking 하여 0.1, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 3% 가 되도록 희석하고 각 농도별로 24회 반복실험을 하였으며, 검출 민감도는 95% 이상 검출되는 농도를 검출한계라고 할 수 있다.
그 결과 표 7에 나타낸 바와 같이, 검출 민감도는 최저 0.49% 에서 1%까지 검출 민감도 범위를 확인 할 수 있었다. 보다 상세하게 도 4에서는 예를 들어 Exon 19del (c. 2235_2249del15)와 L858R (c.2573_2574T>G)에서의 EGFR 변이에 따른 검출 민감도에 대한 결과값을 도식화하였으며, 개별 EGFR 변이별 신뢰도는 19del (0.9953), L858R(0.9955) 임을 확인하였다.
Figure pat00004
< 실시예 7>
동일 환자의 cfDNA 및 FFPE 샘플을 대상으로 한 GenesWell TM ddEGFR Mutation Test kit의 돌연변이 분석
동일한 환자의 FFPE 샘플과 혈장(plasma)을 이용하여 GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit를 이용하여 EGFR 돌연변이를 분석, 비교하였다.
그 결과 표 8에 나타난 바와 같이, 9명 환자의 FFPE와 혈장에서 분리한 cfDNA에 의한 EGFR 돌연변이 결과가 일치하는 것으로 나타났다. 이를 통해, 본 발명의 GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit는 환자의 FFPE 샘플에서 뿐만 아니라, 혈액에서 분리한 cfDNA에서도 EGFR 돌연변이 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
동일 환자의 cfDNA 및 FFPE 샘플에서의 검출 돌연변이 비교
GenesWell ™ ddEGFR Mutation Test Local Hospital
Specimen type Plasma ( cfDNA ) FFPE (Biopsy)
Detection Method ddPCR PNA clamp or Sequencing
Results
Sample ID Report call Mut Frequency Report call
BRM-L-P-B-001-1 L858R/861Q, T790M 5.16%, 10.94% Exon21 missensemt
BRM-L-P-B-002-1 T790M, G719X 2.4%, 4.4% Exon18 missense mt
BRM -L-P-B-003-1* 19del 3.74% Exon19 microdeletion
BRM-L-P-B-004-1 Mut not detected - WT
BRM-L-P-B-005-1 19del 12.54% Exon 19 microdeletion
BRM-L-P-B-006-1 L858R/861Q 64.94% exon 21 mutation (L858R or L861Q)
BRM-L-R-B-020-1 19del 43.01% exon19 microdeletion, T790M
BRM-L-R-B-023-1 19del 81.62% exon 19 microdeletion; p.E746_A750
BRM-L-R-B-008-1 Mut not detected - exon 19 microdeletion; p.E746_A750,
exon 20 missense mutation; p.V769M
BRM -L-P-B-003-4* 19del , T790M 6.48%, 2.87% Exon19 microdeletion
또한, 환자 3의 경우 제피티닙(gefitinib) 처방 이후 시간차를 두고 혈액을 수집하여 검사를 진행하였다. 제피티닙 투약하고 5개월 이후, 환자의 약물반응성이 없어서 혈액을 채취하여 검사를 진행한 결과 약물 내성을 가지는 T790M 돌연변이가 검출되었다. 즉, 본 발명에 따른 GenesWellTM ddEGFR Mutation Test 키트는 질병의 진행상태와 약물반응성에 대한 모니터링이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라, 기존의 EGFR kit들은 한 반응 당 약 25~50 ng을 요구하지만 본 발명의 EGFR IUO 키트는 일반적으로 3 ng 또는 적게는 1.5 ng의 샘플에서도 EGFR 변이를 검출 할 수 있으므로 cfDNA에서 EGFR 변이를 검출하기에 적합한 키트임을 알 수 있다.
< 실시예 8>
EGFR 돌연변이 검출 방법에 대한 비교분석
병원으로부터 IRB 승인 받은 임상샘플을 이용하여 GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit와 Cobas® EGFR mutation test(Roche Molecular Diagnostics, 이하 cobas kit)로 시험하여 결과를 비교하였다.
그 결과 표 9에 나타난 바와 같이, cobas kit는 돌연변이를 검출할 수 없었으나, GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit는 검출할 수 있는 돌연변이 샘플이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
Figure pat00005
이에, cobas kit 에서는 검출되지 않았으나, GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit에서는 돌연변이가 검출된 샘플 8종에 대하여 재실험을 진행하였다. cobas kit 에서의 결과값이 도출되지 않았을 경우에 실시하는 시험법 권고안에 따라 샘플 내의 암세포 비율을 높이기 위한 macrodissection 법을 수행하여 DNA를 추출하였으며, 추출된 DNA를 GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit로 동일하게 분석하였다.
그 결과 표 10에 나타난 바와 같이, 앞서 cobas kit에서 검출하지 못한 돌연변이가 macrodissection한 경우에 GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit와 동일하게 검출되는 것으로 나타났다.
이를 통해, cobas kit가 암세포 비율이 낮아 검출하지 못하는 낮은 비율의 돌연변이에 대하여 GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit가 macrodissection 없이 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 cobas kit 에 비하여 민감도와 정확도가 높다는 것을 시사한다.
Figure pat00006
< 실시예 9>
혈액 샘플에서의 GenesWell TM ddEGFR Mutation Test kit 정량적 검출을 위한 한계값 설정
GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit의 정량적 한계 설정을 위하여 EGFR 돌연변이가 없는 Human Healthy donor plasma (이하, HD plasma)를 사용하여 각 돌연변이에서의 공란한계 및 false positive 검출값을 확인하였다. 본 실험에서는 17명의 HD plasma 1ml로부터 추출한 cfDNA를 이용하여 EGFR 돌연변이별 검출값을 확인하였다.
그 결과 도 5에서 나타난 바와 같이, EGFR 돌연변이가 없는 HD plasma임에도 불구하고 Exon 19 결핍(deletion) 돌연변이가 최대 3.2 카피가 검출되는 것을 확인하였고, 이를 긍정 오류(false positive)라고 한정하였다. 이러한 false positive 결과를 바탕으로 GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit 정량적 검출 한계를 최소 3.3 카피 이상으로 설정하여, GenesWellTM ddEGFR Mutation Test kit로부터 산출된 돌연변이 결과값이 3.3 카피 이상 도출된 경우에, EGFR 돌연변이가 존재한다고 판단하였다.
< 실시예 10>
혈액으로부터 분리한 혈장 샘플에서 검출 가능한 돌연변이의 최소 DNA 양
혈장(plasma) 샘플에서의 검출 가능한 돌연변이 DNA의 최소양(minimum range of input DNA)을 확인하기 위하여 HD plasma (BIOPREDOC, France)에 cfDNA와 유사하도록 인위적으로 제작한 DNA(이하, contrived DNA)를 농도별 희석하여 시험을 실시하였다. EGFR 돌연변이를 가지는 contrived DNA (이하, MT contrived DNA)는 국제공인표준물질인 Horizon 사의 EGFR reference DNA를 E220 Focused-ultra sonicators(Covaris, USA)를 사용하여 200bp로 단편화시켜 제작하였다.
1ml HD plasma에 MT contrived DNA를 각 100, 75, 50, 25, 12.5 cp/ml로 희석하여 Maxwell CSC 장비(Promega, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 cfDNA를 추출하였다.
그 결과 표 11에 나타난 바와 같이, 각 EGFR 돌연변이 검출 민감도는 HD 1ml 내 최소 0.025% 로부터 최대 0.05％임을 확인하였다. 보다 명확하게는 GenesWellTM ddEGFR Mutation Test는 1ml Plasma 내의 미량의 25cp(0.08ng/ml)의 돌연변이를 검출이 가능함을 확인하였다.
Figure pat00007
이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 방법은 암 환자 예후의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> Gencurix Inc. Seoul National University R&DB Foundation <120> The composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene(EGFR) and the EGFR mutation kit using the same <130> NP16-0045P <150> KR 10-2016-0064259 <151> 2016-05-25 <160> 35 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1-F1 primer <400> 1 tgaggatctt gaagaagaaa ctga 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1-R1 primer <400> 2 ctgtgccaaa gggaccttac ct 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5-F15 primer <400> 3 ccctccagga agcctaaacg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C29-R1 primer <400> 4 aggttcagag ccatggacaa 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C36-F1 primer <400> 5 ccctccagga agcctacg 18 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C36-R1 primer <400> 6 cagccgaagg gcatga 16 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C36-F18 primer <400> 7 ccctccagga agcaactacg 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F36-R16 primer <400> 8 tttgtgaatt cccggacata gtc 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C36-F17 primer <400> 9 ccacactgac gtgaacctct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C36-R14 primer <400> 10 ggtggaggaa tgaggcagat 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C44-F1 primer <400> 11 acaccgcagc ataagtcaag at 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C44-R1 primer <400> 12 tgcctccttc aatgcatggt at 22 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP2-2 probe <400> 13 tcaaagtgct gccgcctccg gtgc 24 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP3-3 probe <400> 14 aaaagatcaa accgtgctga gctccg 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP4-3 probe <400> 15 aaaagatcaa accgtgctgt gctccg 26 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP22-1 probe <400> 16 cgtcgctatc aagaagaatc gaaagcca 28 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP31-1 probe <400> 17 ccgtcgctat caaaagtatc tccgaaagcc a 31 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP33-1 probe <400> 18 ccgtcgctat caaaattcca agaaagccaa ca 32 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP29-3 probe <400> 19 aagagaagca acactcgatg tgagtttc 28 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2X EP36 probe <400> 20 gcatctgcct cacaactcca ccgt 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2X EP37-Y probe <400> 21 catgagctgc atcgatgagy tgca 24 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP48 probe <400> 22 atgcccttcg gaacagcctc ct 22 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP49 probe <400> 23 atgcccttcg gaactccctc ct 22 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP38-2 probe <400> 24 tacgtgatgg ccccatcgtg gaca 24 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP40-2 probe <400> 25 tggacaaccc ccaccccacg tgt 23 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP41 probe <400> 26 cgtggacccg gtaaccccca cgtgt 25 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP42-2 probe <400> 27 ccagcgcctg gacagcgtgg 20 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP45 probe <400> 28 cacagatttt ggccgcgggc caa 23 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP46-3 probe <400> 29 tggccaacca cagctgggtg 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP47-3 probe <400> 30 ttttgggcgt gccccaaact g 21 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-ex19-B1 <400> 31 cgtcgctatc aaccggaatt aagagaagca 30 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-ex21-B1 <400> 32 gattttgggc tgccgccaaa ct 22 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-ex18-B1 <400> 33 aagtgctggg ccctccggtg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E-C38-B1 <400> 34 cgtgatggcc ccagcgtgga 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP50 probe <400> 35 atgcccttcg gaagcctcct c 21

Claims (21)

  1. ⅰ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 16 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
    ⅱ) 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머 및 서열번호 21, 28 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
    ⅲ) 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 13 내지 15, 22, 23 및 35로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 및
    ⅳ) 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머 및 서열번호 24 내지 27, 29로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 하나이상 선택된 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR(epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 EGFR 유전자 돌연변이 검출은 EGFR 저해제에 대한 치료 반응성(responsiveness) 예측을 위한 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 EGFR 저해제는 엘로티닙(erlotinib), 제피티닙(gefitinib), 아파티닙(Afatinib), 오시머티닙(osimertinib) 및 C797S 대한 표적 티로신 키나아제 억제제(Tyrosine kinase inhibitor)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 형광물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 형광물질은 HEX(hexachlorofluorescein), FAM(fluorescein amidite), EverGreen dye로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
  6. 제1항의 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 RUO(research use only) 키트.
  7. 제1항의 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 IVD(in vitro diagnostics) 키트.
  8. 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 16 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 31의 올리고머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  10. 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머 및 서열번호 21, 28 및 30로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 32의 올리고머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  12. 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 13 내지 15, 22, 23 및 35로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 33의 올리고머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머 및 서열번호 24 내지 27, 29로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 34의 올리고머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 qPCR(quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법에 사용되는 것임을 특징으로 하는 키트.
  17. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 혈액에서 분리된 무세포 DNA(cell-free DNA, cfDNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 키트.
  18. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 포르말린 고정 파라핀 포매(formalin fixed parafin embedded. FFPE) 조직에서 분리된 DNA 또는 상기 조직 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA(complementary DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 혈액에서 분리된 CTC(circulating tumor cell)에서 분리된 DNA 또는 상기 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC) 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA(complementary DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 키트.
  20. EGFR 저해제 투여 환자의 치료반응성 평가에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 시료에서 EGFR 돌연변이 검출 방법;
    (a) 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계;
    (c) 상기 중합효소연쇄반응으로 증폭된 산물의 돌연변이 비율을 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 돌연변이 비율을 종전의 돌연변이 비율 측정결과와 비교하여 감소 또는 증가여부를 확인하는 단계.
  21. ⅰ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 16 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
    ⅱ) 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머 및 서열번호 21, 28 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
    ⅲ) 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 13 내지 15, 22, 23 및 35로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 및
    ⅳ) 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머 및 서열번호 24 내지 27, 29로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 하나이상 선택된 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 저해제 투여 환자의 치료 반응성 평가용 조성물.
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