KR20070031894A - 표피성장인자 수용체를 표적으로 하는 치료에 대한 암의반응성을 결정하는 방법 - Google Patents

표피성장인자 수용체를 표적으로 하는 치료에 대한 암의반응성을 결정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표피성장인자 수용체(EGFR) 치료에 대한 암의 반응성을 결정하기 위한 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서는, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 적어도 하나의 변이의 존재는 티로신 키나제 저해제인 제피티니브에 대한 민감성을 부여한다. 따라서 이러한 돌연변이에 대한 진단분석법은 제피티니브나 에를로티니브 및 다른 티로신 키나제 저해제의 투여를 상기 약제들에 가장 잘 반응할 환자들에게 투여할 수 있도록 할 것이다.
표피성장인자 수용체(EGFR), 티로신 키나제 저해제

Description

표피성장인자 수용체를 표적으로 하는 치료에 대한 암의 반응성을 결정하는 방법{METHOD TO DETERMINE RESPONSIVENESS OF CANCER TO EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR TARGETING TREATMENTS}
전립선암이나, 유방암, 결장암, 폐암, 이자암, 난소암, 지라암, 고환암, 흉선암 등의 상피세포암(epithelial cell cancer)은, 상피세포들의 비정상적인 가속화된 성장을 특징으로 하는 질환들이다. 이러한 가속화된 성장은 초기에는 종양 형성을 유발하게 된다. 결국에는 다른 기관 부위들로의 전이도 일어날 수 있다. 다양한 암들에 대한 진단 및 치료상의 진전이 있어왔지만, 이러한 질환들은 여전히 상당한 사망률로 귀결된다.
폐암은 산업화된 국가들에 있어서 암 사망의 주도적 원인으로 남아있다. 폐에서 시작되는 암은 두 가지 주요한 타입으로 나누어지는데, 현미경 상에 그 암세포들이 어떻게 보이느냐에 따라 비소세포(non-small cell) 폐암과 소세포(small cell) 폐암으로 나누어진다. 비소세포 폐암(편평세포암종(squamous cell carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 그리고 대세포암종(large cell carcinoma))은 일반적으로 소세포 폐암에 비해 보다 느리게 다른 기관으로 퍼진다. 약 75%의 폐암 케이스가 비소세포 폐암으로 분류되며(예, 선암종), 나머지 25%가 소세포 폐암이다. 비소세포 폐암(NSCLC)은 미국, 일본 그리고 서부유럽에서의 암 사망의 주 도적 원인이다. 병이 진행된 환자들의 경우, 화학요법은 생존과 관련하여 약간의 유익한 점들을 제공하기는 하지만 심각한 독성을 감내해야한다. 이러한 점은 종양의 성장을 지시하는 결정적인 유전적 손상을 특이적으로 표적으로 하는 치료제에 대한 필요성을 강조한다(Schiller JH et al., N Engl . J. Med ., 346: 92-98, 2002).
표피성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; 이하 "EGFR")는 질량이 170 킬로달톤(kDa)으로 막에 결합된 단백질인데, 상피세포의 표면에 발현된다. EGFR은 세포주기조절분자들의 부류(class)인 단백질 티로신 키나제의 성장인자수용체 군(family)의 일원이다(W. J. Gullick et al., 1986, Cancer Res., 46:285-292). EGFR은 세포외 도메인에 자신의 리간드(EGF 또는 TGF-α)가 결합하면 활성화되고, 그 결과, 동 수용체의 세포내 티로신 키나제 도메인이 자가인산화반응을 일으키게 된다(S. Cohen et al., 1980, J. Biol . Chem ., 255:4834-4842; A. B. Schreiber et al., 1983, J. Biol . Chem ., 258:846-853).
EGFR은, 성장촉진 종양유전자(growth promoting oncogene)인 erbB 또는 ErbB1의 단백질 산물인데, 이 erbB 또는 ErbB1은 많은 인간 암들의 발병과 진행에 있어서 극히 중요한 역할을 한다고 믿어지고 있는, 원발암유전자(protooncogenes)의 ERBB 군의 일원이다. 특히, 아교모세포종(glioblastomas)뿐만 아니라 유방암, 방광암, 폐암, 머리 암, 목 부위 암, 및 위암에서 EGFR의 발현이 증대된다는 것이 관찰되어 왔다. ERBB 종양유전자 군은 구조적으로 연관된 4개의 막횡단(transmembrane) 수용체들, 즉, EGFR, HER-2/neu(erbB2), HER-3(erbB3), 및 HER- 4(erbB4)를 코딩하고 있다. 임상적으로, 종양에 있어서 ERBB 종양유전자의 증폭 및/또는 수용체의 과다발현은 치료법에 대한 반응성과 상관관계가 있을 뿐만 아니라 병의 재발과 환자의 좋지 않은 예후와도 상관관계가 있다는 것이 보고되어 있다(L. Harris et al., 1999, Int. J. Biol . Markers , 14:8-15; 및 J. Mendelsohn and J. Baselga, 2000, Oncogene, 19:6550-6565).
EGFR은 세 개의 주요 도메인들로 구성되어 있는데, 당화되어 있고(glycosylated), 2개의 시스테인 풍부 영역을 갖는 리간드-결합 포켓(ligand-binding pocket)을 함유하는 세포외 도메인(extracellular domain: ECD); 짧은 막횡단 도메인; 및 고유의 티로신 키나제 활성을 갖는 세포내 도메인이 그것이다. 막횡단 영역은 리간드-결합 도메인을 세포내 도메인과 결합시켜준다. 비당화형태의 EGFR에 대한 연구와 함께 아미노산과 DNA 염기서열분석은 EGFR의 단백질 골격이 질량이 132 kDa이고, 1186개의 아미노산 잔기를 갖는다는 것을 보여준다(A. L. Ulrich et al., 1984, Nature, 307:418-425; J. Downward et al., 1984, Nature, 307:521-527; C. R. Carlin et al., 1986, Mol . Cell . Biol., 6:257-264; 및 F.L.V. Mayes and M. D. Waterfield, 1984, The EMBO J., 3:531-537).
EGF나 또는 TGF-α가 EGFR에 결합하면 신호전달경로가 활성화되고, 그 결과, 세포가 증식된다. EGFR 분자의 이량체화(dimerization), 입체구조의 변화 (conformational change), 그리고 내재화(internalization)는 세포내 신호를 전달하는 기능을 하는데, 이는 세포의 성장을 조절하는 것으로 이어진다(G. Carpenter and S. Cohen, 1979, Ann . Rev . Biochem., 48:193-216). 성장인자수용체 기능의 조절에 영향을 주거나 또는 수용체 및/또는 리간드의 과다발현으로 이어지는 유전자적 변경들의 결과, 세포가 증식된다. 거기에 더해서, EGFR은 세포의 분화와, 세포의 운동성(motility)의 향상, 단백질의 분비, 혈관의 신생(neovascularization), 침범(invasion), 암세포의 전이 및 화학요법제나 방사선에 대한 내성에 있어서 어떤 역할을 한다는 결론이 내려져 있다(M.-J. Oh et al., 2000, Clin . Cancer Res., 6:4760-4763).
EGFR에 대한 다양한 저해제들이 동정되었으며, 그 중에는 이미 다양한 암들에 대한 치료로서 임상 시험이 진행되고 있는 여러 개가 포함되어 있다. 최신의 요약은 de Bono, J. S. and Rowinsky, E.K. (2002), "The ErbB Receptor Family: A Therapeutic Target For Cancer", Trends in Molecular Medicine, 8, S19-26을 참조할 수 있다.
암 치료에 있어서 치료적 개입(therapeutic intervention)을 위한 유망한 표적의 세트에는 HER 키나제 축(HER-kinase axis)에 속하는 구성원들이 포함된다. 그것들은, 예를 들면, 전립선이나 폐, 유방의 고형상피세포종양(solid epithelial tumor)들에 있어서, 자주 상향조절(upregulated)되어 있고, 또한 아교모세포종 (glioblastoma)들에서도 상향조절되어 있다. 표피성장인자 수용체(EGFR)는 HER 키나제 축의 구성원 중의 하나로서, 몇가지 서로 다른 암 치료법들의 개발을 위한 선택의 표적이 되어 왔다. EGFR 티로신 키나제 저해제(EGFR tyrosine kinase inhibitors: EGFR-TKIs)들은 이러한 치료법들 중의 하나인데, 그 이유는 EGFR 경로의 활성화에는 티로신 잔기들의 가역인산화 과정이 요구되기 때문이다. 달리 말하 자면, EGFR-TKI들은 종양 세포들의 성장과 분화를 일으키는 세포의 신호경로를 촉발 및/또는 유지하는 일을 하고 있는 세포 표면의 수용체를 차단한다. 구체적으로는, 이들 저해제들이 HER-1로 명명되는 EGFR 키나제 도메인을 간섭(interfere)한다고 믿어진다. 보다 더 유망한 EGFR-TKI들 중에는 3가지의 화합물 시리즈들이 있는데, 그들은 퀴나졸린(quinazolines)과 피리도피리미딘(pyridopyrimidines), 그리고 피롤로피리미딘(pyrrolopyrimidines)이다.
임상적인 개발에 있어서 보다 진보된 화합물들 중의 2가지로서 제피티니브(Gefitinib)(AstraZeneca UK Ltd.에 의해 개발된 화합물 ZD1839; 상표명 IRESSA 로 구입가능; 이하 "IRESSA")와 에를로티니브(Erlotinib)(Genentech, Inc.과 OSI Pharmaceuticals, Inc.에 의해 개발된 화합물 OSI774; 상표명 TARCEVA로 구입가능; 이하 “TARCEVA")가 있는데, 둘 다 고무적인 임상결과들을 낳고 있다. IRESSA나 TARCEVA 를 사용하는 종래의 암 치료법은 각 화합물을 500 mg을 넘지 않는 양으로 매일, 경구 투여하는 것이다. IRESSA는, 2003년 5월에, 진행된 비소세포 폐암 환자들의 치료를 위해 승인되어, 이러한 제품들 중 제일 먼저 미국 시장에 진입하게 되었다.
IRESSA는 경구적으로 유효한(orally active) 퀴나졸린으로서 EGFR 분자상의 티로신 키나제의 인산화를 직접 저해함으로써 기능한다. 아데노신 삼인산(ATP)의 결합부위에 경쟁적으로 작용하며, 이는 HER-키나제 축의 억제로 이어진다. IRESSA 반응의 정확한 메카니즘은 완전하게 이해되고 있지는 않다. 하지만, EGFR의 존재가 IRESSA의 작용에 필수 전제임을 여러 연구들은 개시한다.
이들 화합물들을 사용하는데 있어서의 심대한 한계는 그 수용자들이 그 치료법에 최초로 반응한 이후, 그 치료효과들에 대해 내성을 발달시키는 경우가 있거나, 또는 EGFR-TKI에 대해 측정가능한 정도의 반응을 전혀 보이지 않을 수도 있다는 점이다. 사실, 진행된 비소세포 폐암 환자들 중 단지 10-15%만이 EGFR 키나제 저해제 들에 반응한다. 따라서 IRESSA 와 TARCEVA 에 대한 민감도 밑에 놓인 분자수준의 메카니즘에 대한 보다 나은 이해는 아마도 표적 치료법에 있어서 그러한 치료를 통해 가장 많이 혜택을 보는 인간들에게 극히 유익할 것이다.
암, 특히 폐암이나 난소암, 유방암, 뇌암, 대장암, 그리고 전립선암들 같은 상피세포암의 만족할 만한 치료에 대한 당 기술분야의 상당한 요구가 있으며, 여기서 만족할 만한 치료라는 것은 TKI 치료법으로부터의 이점들과 환자들에게 나타난 무반응성을 극복하는 것을 포함한다. 이러한 치료는 개인들의 건강에, 그리고 특히, 암이 특히 흔한 나이가 많은 인간들의 건강에 극적인 효과를 줄 수 있다.
제피티니브(IRESSA®) 같은 티로신 키나제 저해제(TKI) 치료법은 상술한 바와 같은 암에 걸린 인간들 중의 대다수에게는 효과적이지 않다. 본 발명자들은 놀랍게도, EGFR의 키나제 도메인에서의 체세포 돌연변이의 존재가, IRESSA나 TARCEVA 같은 TKI에 대한 EGFR의 민감성을 현저하게 증가시킴을 발견하였다. 예를 들면, 그러한 암을 가진 환자들 중 30% 미만이 현재 통용되는 TKI 들에 의한 치료에 민감한 반면, EGFR 키나제 도메인에서의 돌연변이를 가진 환자들 중에서 50%를 넘는 환자들, 보다 바람직하게는 60, 70, 80, 90 %의 환자들이 민감하다. 또, 이 러한 돌연변이들은 EGFR의 키나제 활성을 증가시킨다. 따라서 이러한 돌연변이들을 가진 환자들은 현재의 티로신 키나제 저해제(TKI), 예를 들면 제피티니브 같은, 치료법에 반응할 것이다.
따라서, 본 발명은 암에 걸린 인간 환자에 있어서 표피성장인자 수용체(EGFR) 표적 치료의 유효 가능성을 결정하는 신규한 방법을 제공한다. 이 방법은 야생종 erbB1 유전자에 대하여, 상기 환자의 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 적어도 하나의 핵산 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 적어도 하나의 변이가 존재하면 그것은 EGFR 표적 치료가 유효할 것이라는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 핵산 변이는 EGFR의 키나제 활성을 증대시킨다. 그렇게 되면, 상기 환자는 EGFR 표적 치료를 받을 수 있게 된다. 본 발명의 하나의 태양에서는, EGFR 표적 치료가 티로신 키나제 저해제이다. 바람직한 태양에서는, 상기 티로신 키나제 저해제가 아닐리노퀴나졸린(anilinoquinazoline)이다. 아닐리노퀴나졸린은 합성 아닐리노퀴나졸린이어도 된다. 바람직하게는 합성 아닐리노퀴나졸린은 제피티니브이거나 또는 에를로티니브이다. 또 다른 태양에서는, EGFR 표적 치료가 4-디메틸아미노-부트-2-엔산[4-(3-클로로-4-플루오로-페닐아미노)-3-시아노-7-에톡시-퀴놀린-6-일]-아미드("EKB-569", "EKI-569"로 칭하기도 함. 예로서 WO/2005/018677과 Torrance et al., Nature Medicine, vol.6, No.9, Sept. 2000, p. 1024를 참조) 및/또는 HKI-272 또는 HKI-357(Wyeth; Greenberger et al., Proc. 11th NCI EORTC-AACR Symposium on New Drugs in Cancer Therapy, Clinical Cancer Res. Vol.6 Supplement, Nov. 2000, ISSN 1078-0432; Rabindran et al., Cancer Res. 64: 3958-3965(2004); Holbro and Hynes, Ann . Rev . Pharm . Tox . 44:195-217(2004); Tsou et al., J. Med . Chem. 2005, 48, 1107-1131; 및 Tejpar et al., J. Clin . Oncol. ASCO Annual Meeting Proc. Vol. 22, No. 14S: 3579(2004) 참조)를 포함하는 비가역적 EGFR 저해제이다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자로부터 얻은 생물학적 시료로부터 EGFR을 얻는다. EGFR(또는 erbB1 유전자)의 키나제 도메인에서의 변이는 ATP-결합 포켓의 입체구조에 영향을 준다. 바람직하게는, EGFR의 키나제 도메인에서의 변이는 엑손 18, 19, 20 또는 21에서의 인프레임 결실(in frame deletion) 또는 치환이다.
하나의 태양에서는, 상기 인프레임 결실은 EGFR(erbB1)의 엑손 19에 존재한다. 상기 엑손 19에서의 인프레임 결실은 바람직하게는 적어도 코돈 747, 748, 749, 및 750의 아미노산인 류신, 아르기닌, 글루탐산, 및 알라닌의 결실을 포함한다. 하나의 태양에서, 상기 인프레임 결실은 누클레오티드 2235∼2249을 포함하며, 아미노산 746∼750(글루탐산, 류신, 아르기닌, 글루탐산, 및 알라닌 서열)이 결실되어 있다(표 2, 표 S2, 도 2B, 도 4A, 도 5, 서열번호 511, 도 6C, 및 도 8C 참조). 또 다른 태양에서, 상기 인프레임 결실은 누클레오티드 2236∼2250을 포함하며, 아미노산 746∼750이 결실되어 있다(표 S2, 도 5, 서열번호 511, 및 도 6C 참조). 또는, 상기 인프레임 결실은 누클레오티드 2240∼2251을 포함하거나(표 2, 도 2C, 도 4A, 도 5, 서열번호 511 참조), 또는 누클레오티드 2240∼2257을 포함한 다(표 2, 표 S3A, 도 2A, 도 4A, 도 5, 서열번호 511, 도 6C, 및 도 8E 참조). 또는, 상기 인프레임 결실은, 누클레오티드 2239∼2247을 포함하고 이와 함께 누클레오티드 2248의 구아닌이 시토신으로 치환된 것이거나(표 S3A 및 도 8D 참조), 또는 누클레오티드 2237의 아데닌이 티민으로 치환된 것과 함께 누클레오티드 2238∼2255의 결실을 포함하거나(표 S3A 및 도 8F 참조), 또는 누클레오티드 2254∼2277의 결실을 포함한다(표 S2 참조). 또는, 상기 인프레임 결실은 표 S3B에 나타낸 바와 같이, 누클레오티드 2239∼2250delTTAAGAGAAGCA; 2251A>C, 또는 2240∼2254delTAAGAGAAGCA, 또는 2257∼2271delCCGAAAGCCAACAAG를 포함한다.
또 다른 태양에서, 상기 치환은 EGFR의 엑손 21에 존재한다. 엑손 21에서의 상기 치환은 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 하나의 태양에서, 엑손 21에서의 상기 치환은 누클레오티드 2573의 티민이 구아닌으로 치환된 것을 포함한다(도 4A 및 도 5, 서열번호 511 참조). 이 치환의 결과, 아미노산이 치환되는데, 아미노산 858의 야생형 류신이 아르기닌으로 대체된다(도 5, 표 2, 표 S2, 표 S3A, 도 2D, 도 6A, 도 8B, 및 서열번호 512 참조). 또는 엑손 21에서의 상기 치환은 누클레오티드 2582의 티민이 아데닌으로 치환된 것을 포함한다(도 4A, 및 도 5, 서열번호 511 참조). 이 치환의 결과, 아미노산이 치환되는데, 아미노산 861의 야생형 류신이 글루타민으로 대체된다(도 5, 표 2, 도 2E, 표 S3B, 및 서열번호 512 참조).
상기 치환은 EGFR의 엑손 18에도 존재할 수 있다. 하나의 태양에서, 엑손 18에서의 치환은, 누클레오티드 2155의 구아닌이 티민으로 치환된 것이다(도 4A 및 도 5, 서열번호 511 참조). 이 치환의 결과, 아미노산이 치환되는데, 코돈 719의 야생형 글리신이 시스테인으로 치환된다(도 5, 서열번호 512 참조). 또 다른 태양에서 엑손 18에서의 치환은 누클레오티드 2155의 구아닌이 아데닌으로 치환된 것이고, 그 결과 아미노산이 치환, 즉, 코돈 719의 세린이 야생형 글리신으로 치환된다(표 S2, 도 6B, 도 8A, 도 5, 서열번호 511 및 512 참조).
또 다른 태양에서 상기 치환은 서열번호 511의 누클레오티드 2316 후이면서 누클레오티드 2317 전인 곳에 구아닌, 구아닌, 티민(GGT)이 삽입된 것이다(2316_2317 ins GGT). 이는 아미노산 772에 발린(V)을 삽입(P772_H733 insV)하는 것으로도 기술할 수 있다. 다른 돌연변이들은 표 S3B에 나타나 있으며, 예로서, 서열번호 511의 누클레오티드 2309의 후이면서 누클레오티드 2310의 전인 곳에 CAACCCGG를 삽입하는 것과, 서열번호 511의 누클레오티드 2311의 후이면서 누클레오티드 2312의 전인 곳에 GCGTGGACA를 삽입하는 것을 포함한다. 상기 치환은 또한 엑손 20에 존재할 수도 있으며, 하나의 태양에서는 누클레오티드 2334 및 2335에서 GG가 AA로 치환된 것이다(표 S3B 참조).
요약하면, 바람직한 태양들에서, erbB1 유전자의 핵산 변이는, 서열번호 511의 누클레오티드 2155의 구아닌의 티민으로의 치환, 또는 구아닌의 아데닌으로의 치환, 서열번호 511의 누클레오티드 2235∼2249, 2240∼2251, 2240∼2257, 2236∼2250, 2254∼2277, 또는 2236∼2244의 결실, 서열번호 511의 누클레오티드 2316의 후이면서 누클레오티드 2317의 전인 곳에 누클레오티드인 구아닌, 구아닌, 티민(GGT)의 삽입, 서열번호 511의 누클레오티드 2573의 티민의 구아닌으로의 치환 또는 서열번호 511의 누클레오티드 2582의 티민의 아데닌으로의 치환이다.
적어도 하나의 핵산 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것은 그 수용체를 코딩하고 있는 핵산의 한 세그먼트를 증폭함으로써 결정될 수 있다. 증폭될 상기 세그먼트의 길이는 1000 누클레오티드 이하, 바람직하게는 500 누클레오티드 이하, 가장 바람직하게는 100 누클레오티드 이하이다. 증폭될 상기 세그먼트는 복수의 변이를 포함할 수 있다.
또 다른 태양에서는, 적어도 하나의 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것은 변이 부위를 함유하는 EGFR 핵산을 적어도 하나의 핵산 프로브에 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 프로브는, 변이 부위를 포함하고 그 변이 부위에 상보적인 누클레오티드 염기들을 함유하는 핵산 서열과 선택적 혼성화(selective hybridization) 조건하에서 우선적(preferentially)으로 혼성화한다. 혼성화는 검출가능한 표지로써 검출될 수 있다.
또 다른 태양에서, 적어도 하나의 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것은 적어도 하나의 핵산 염기서열을 분석하여 기존에 알려진 erbB1 핵산 서열과 상기 분석된 서열을 비교하는 것을 포함한다. 또는, 적어도 하나의 변이의 존재 또는 부재는 적어도 하나의 핵산 서열의 질량분석 결정을 포함한다.
바람직한 태양에서, 적어도 하나의 핵산 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것은 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것을 포함한다. 가상(hypothetical)의 변이를 함유하고 있는 erbB1 핵산 서열을 증폭하고 그 증폭된 핵산의 누클레오티드 서열을 결정한다. 증폭된 핵산의 누클레오티드 염기서열을 결정하는 것은 적어도 하나의 핵산 세그먼트의 서열 분석을 포함한다. 또는, 증폭결과물은 그들의 크기에 따라 서로 분리해 낼 수 있는 방법들 중, 어떤 방법에 의해서든지 분석될 수 있는데, 이 방법들에는 자동 또는 수동 겔 전기영동법이나 다른 유사한 방법들이 포함된다.
또는, 적어도 하나의 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것은 유전자 내의 복수의 변이의 하플로타입(haplotype)을 결정하는 것을 포함한다.
또 다른 태양에서, EGFR 변이의 존재 또는 부재는 erbB1 유전자의 산물(단백질)을 분석함으로써 검출될 수 있다. 이 태양에서는, EGFR 변이체에 특이적으로 결합하는 프로브가 사용된다. 바람직한 태양에서는, 그 프로브는 EGFR 변이체에 우선적으로 결합하는 항체이다. EGFR의 변이체가 존재하면 EGFR 표적 치료가 유효할 수 있을 것으로 예견된다. 또는, 상기 프로브는 항체 단편이나 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화된 항체(humanized antibody), 또는 엡테이머(aptamer)이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 핵산 변이를 EGFR 유전자(erbB1) 내에 포함하는 핵산 서열에 선택적 결합 조건 하에서 특이적으로 결합하는 프로브를 제공한다. 하나의 태양에서, 상기 변이는 erbB1의 키나제 도메인에서의 돌연변이이며, 이 돌연변이는 ATP-결합 포켓에 구조적 변화를 부여한다.
본 발명의 프로브는 약 500 누클레오티드 이하의 염기들, 바람직하게는 약 100 누클레오티드 이하의 염기들, 가장 바람직하게는 약 50 누클레오티드 이하 또는 약 25 누클레오티드 이하의 염기들로 된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 그 프로 브는 DNA, RNA, 또는 펩티드 핵산(PNA)으로 구성될 수도 있다. 나아가서, 그 프로브는 검출가능 표지를 함유할 수도 있는데, 그러한 검출가능 표지로는, 예를 들면, 형광 표지나 효소적 표지가 있다.
본 발명은 또한 암에 걸린 환자에 있어서, 표피성장인자 수용체(EGFR)에 대한 표적 치료의 유효 가능성을 결정하는 새로운 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자로부터 얻은 생물학적 시료 중의 EGFR의 키나제 활성을 결정하는 것을 포함한다. EGFR 리간드로 자극한 후, 대조군에 비하여 키나제 활성이 증가되면, EGFR 표적 치료가 유효할 가능성이 있음을 나타낸다.
본 발명은 또한 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자를 치료하는 신규한 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자의 EGFR의 키나제 도메인이 적어도 하나의 변이를 함유하는지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 그 EGFR은 종양이나 암의 부위에 위치하고 있고, 핵산의 변이는 체세포 변이이다. 그러한 변이의 존재는 EGFR 표적 치료가 유효할 것임을 나타낸다. 만일 그러한 변이가 존재하면, 티로신 키나제 저해제가 환자에게 투여된다.
위와 같이, 확인된 환자에게 투여한 상기 티로신 키나제 저해제는 아닐리노퀴나졸린일 수 있고, 또는, 예를 들면, EKB-569, HKI-272 및/또는 HKI-357(Wyeth)과 같은 비가역적 티로신 키나제 저해제일 수 있다. 바람직하게는, 아닐리노퀴나졸린은 합성 아닐리노퀴나졸린이고, 가장 바람직하게는 상기 합성 아닐리노퀴나졸린은 제피티니브, 에를로티니브이다.
본 발명의 방법으로 치료받을 수 있는 암은 예를 들면 위장관암, 전립선암, 난소암, 유방암, 머리와 목 암, 폐암, 비소세포(non-small cell) 폐암, 신경계암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 이자암, 생식-비뇨기암, 그리고 방광암 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 태양에서, 그 암은 비소세포 폐암이다.
본 발명의 PCR 방법을 수행하기 위한 키트도 제공된다. 상기 키트는 적어도 하나의 축퇴성 프라이머 쌍을 갖는데, 이 프라이머 쌍은 EGFR 키나제 도메인의 ATP-결합 포켓을 코딩하고 있는 유전자들의 경계 부분의 핵산 영역에 결합하도록 설계되어 있다. 이에 더하여, 상기 키트는 PCR 증폭반응을 수행하는데 필요한 산물과 시약, 및 설명서를 포함하고 있다.
바람직한 태양에서, 키트에 포함된 프라이머 쌍들은 서열번호 505, 506, 507, 및 508로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시예에서의 표 6과 7에 기재되어 있는 프로브들도 또한 바람직한 프로브들이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 표피성장인자 수용체(EGFR) 변이체의 키나제 촉매 활성을 저해하는 화합물을 선별하는 방법을 개시한다. 첫 번째 단계로서, EGFR 변이체를 가능성이 있는 화합물과 접촉시킨다. 그 결과로서 나타나는 EGFR 변이체의 키나제 활성을 검출하고 EGFR 변이체의 키나제 활성을 저해하는 화합물을 선별한다. 하나의 태양에서는, 상기 EGFR 변이체는 세포 내부에 들어 있다. 상기 방법은 키나제 도메인에 2차 돌연변이를 갖는 EGFR 변이체들의 키나제 활성을 저해하는 화합물을 선별하는데에도 또한 사용될 수 있는데, 여기서 상기 2차 돌연변이는 예를 들면 제피티니브나 에를로티니브 같은 TKI에 대해 내성을 부여한다.
하나의 태양에서, EGFR의 변이체는 표지되어 있다. 또 다른 태양에서는 EGFR이 고체 지지체에 결합되어 있다. 바람직한 태양에서는 고체 지지체는 단백질 칩이다.
본 발명의 또 다른 태양에서는, 표피성장인자 수용체(EGFR) 변이체의 키나제 촉매 활성을 저해하는 약제 조성물이 개시된다. EGFR 변이체의 키나제 촉매 활성을 저해하는 화합물은 항체, 항체 단편, 소분자, 펩티드, 단백질, 안티센스 핵산, 리보자임, PNA, siRNA, 올리고누클레오티드 엡테이머, 및 펩티드 엡테이머로 이루어진 군으로부터 선택된다.
EGFR 매개 질병을 가진 환자를 치료하는 방법도 개시되어 있다. 이 방법에 의하면, 상기 환자에게 표피성장인자 수용체(EGFR) 변이체의 키나제 촉매 활성을 저해하는 약제 조성물을 투여한다.
하나의 태양에서, 상기 EGFR 매개 질병은 암이다. 바람직한 태양에서, 그 암은 상피세포 기원의 것이다. 예로서, 그 암은 위장관암, 전립선암, 난소암, 유방암, 머리 및 목 암, 폐암, 비소세포 폐암, 신경계암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 이자암, 생식-비뇨기 암, 방광암이다. 바람직한 태양에서, 그 암은 비소세포 폐암이다.
또 다른 태양에서는, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 2차 돌연변이의 획득을 예측하는(또는 돌연변이를 선별하는) 방법이 개시된다. 유효량이지만 준치사량의 티로신 키나제 저해제를 erbB1 유전자의 변이형을 발현하는 세포와 접촉시킨다. 티로신 키나제 저해제의 성장 저지 효과에 내성을 갖는 세포들을 선별하여 erbB1 키나제 도메인 내의 추가적인 돌연변이의 존재에 대하여 erbB1 핵산을 분석 한다. 하나의 태양에서, 상기 세포는 시험관내(in vitro)에 있다. 또 다른 태양에서는 상기 세포는 유전자도입 동물로부터 얻어진다. 하나의 태양에서, 상기 유전자도입 동물은 마우스이다. 이 마우스 모델에서, 연구될 세포들은 종양 생검으로부터 얻어진다. 본 발명에 의해 선별된, erbB1 키나제 도메인에 2차 돌연변이를 갖는 세포들은, 위의 방법에서, 키나제 도메인에 2차 돌연변이를 갖는 EGFR 변이체의 키나제 활성을 저해하는 화합물을 선별하는데 사용될 수 있다.
erbB1 유전자의 키나제 도메인의 2차 돌연변이 획득을 예측하기 위한 하나의 또 다른 태양에서는, 맨처음 erbB1 유전자의 변이형을 발현하는 세포들을 유효량의 돌연변이 유발제(mutagenizing agent)와 접촉시킨다. 상기 돌연변이 유발제는, 예를 들면, 에틸 메탄설포네이트(EMS), N-에틸-N-니트로소우레아(ENU), N-메틸-N-니트로소우레아(MNU), 포카르박신 하이드로클로라이드(Prc), 메틸 메탄설포네이트(MeMS), 클로람뷰실(Chl), 멜팔란(melphalan), 포르카르바진 하이드로클로라이드, 사이클로포스파미드(Cp), 디에틸 설페이트(Et2SO4), 아크릴아미드 모노머(AA), 트리에틸렌 멜라민(TEM), 니트로겐 머스타드, 빈크리스틴(vincristine), 디메틸니트로스아민, N-메틸-N’-니트로-니트로소구아니딘(MNNG), 7,12-디메틸벤즈안트라센(DMBA), 에틸렌 옥사이드, 헥사메틸포스포르아미드, 비설판(bisulfan), 또는 에틸 메탄설포레이트(EtMs)이다. 그 후 상기 세포를 유효량이지만 준치사량의 티로신 키나제 저해제와 접촉시킨다. 티로신 키나제 저해제의 성장 저지 효과에 내성을 갖는 세포들을 선별하고, 그 erbB1의 키나제 도메인에서의 추가적인 돌연변이들 의 존재 여부에 대하여 그 erbB1 핵산을 분석한다.
도 1A∼1B는 난치의 비소세포 폐암(NSCLC)에 있어서의 제피티니브 반응에 대한 대표도이다. 도 1A는 제피티니브로 처치하기 전의 오른쪽 폐의 커다란 덩어리를 보여주는, 케이스 6(표 1)의 흉부 CT 스캔이며, 도 1B는 제피티니브 처치 개시로부터 6주 후의 현저한 개선을 보여준다.
도 2는 제피티니브-반응성 종양에서의 EGFR 돌연변이들을 보여준다.
도 2A∼2C는 키나제 도메인 내에 이형접합(heterozygous) 인프레임 결실을 갖는 종양 표본 내의 EGFR 유전자의 누클레오티드 서열을 보여준다(이중 피크들)(각각 도시된 순서대로 서열번호 643∼654). 상기 결실의 두 절단점을 명시하기 위해 센스와 안티센스 방향에서의 트레이싱(tracings)을 표시하였고, 야생형 누클레오티드 서열은 대문자로, 돌연변이 서열은 소문자로 나타내었다. delL747-T751insS 돌연변이의 5’절단점 앞에는 코딩된 아미노산을 변경하지 않는 T로부터의 C로의 치환이 선행한다.
도 2D와 도 2E는 이형접합 미스센스 돌연변이(heterozygous missense mutation)(화살표)들을 보여주는데, 이들의 결과로 티로신 키나제 도메인 내에서 아미노산이 치환된다(서열번호 656 및 658). 이중 피크들은 이형접합 돌연변이 부위에서의 2개의 누클레오티드를 나타낸다. 비교를 위하여, 대응하는 야생형 서열도 나타내었다(서열번호 655 및 657).
도 2F는 EGF 리간드에 의해 결합된 이량체화된 EGFR 분자의 도식도이다. 세포외 도메인(2개의 수용체 리간드 [L]-도메인들과 1개의 퓨린유사(furin-like) 도메인을 함유함), 막횡단 영역, 및 세포질 도메인(촉매 키나제 도메인을 함유함)이 강조되어 있다. EGFR의 자가인산화에 의해 활성화되는 다운스트림 효과기(STAT3, MAP 키나제(MAPK), 및 AKT)와 함께, 수용체 활성화의 표지로 사용되는 자가인산화 부위인, 티로신1068의 위치(Y-1068)가 지적되어 있다. 모두 티로신 키나제 도메인 내에 있는, 종양과 관련된 돌연변이들의 위치가 나타나 있다.
도 3은 EGFR 돌연변이체의 증진된 EGF-의존성 활성화와 EGFR 돌연변이체의 제피티니브에 대한 증대된 감수성을 보여준다.
도 3A는 EGF를 혈청 결핍 세포들(serum starved cells)에 첨가한 후의, delL747-P753insS와 L858R 돌연변이체의 리간드-유도 활성화의 시간 경로(time course)를 야생형 EGFR과 비교하여 보여준다. Cos-7 세포들(대조군; 오른쪽 패널)에서 발현된 EGFR의 전체 수준과 비교하여, EGFR의 자가인산화가 수용체 활성화의 표지로 이용되며, EGFR(왼쪽 패널)의 인산화된 티로신1068 잔기를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 웨스턴 블로팅법이 사용된다. EGFR의 자가인산화는 EGF(10 ng/ml) 첨가 후, 간격을 두고 측정된다.
도 3B는 야생형과 돌연변이체 수용체의 인산화의 EGF-유도를 그래프로 나타낸 것이다(패널 A를 참조). 세 개의 독립적인 실험들로부터의 자가방사선상(autoradiograph)을 NIH 이미지 소프트웨어를 사용하여 계량하였으며, EGFR 인산 화의 강도는 전체 단백질 발현에 대해 정규화되어 있고, 표준편차와 함께 그 수용체의 퍼센트 활성화로 표현되어 있다.
도 3C는 제피티니브에 의한 EGFR 활성화 저해의 투여량 의존성을 보여준다. 야생형 또는 돌연변이형 수용체를 발현하는 Cos-7 세포를 100 ng/ml의 EGF로 30분간 자극하고 웨스턴 블로팅 분석하여 EGFR 티로신1068의 자가인산화를 나타내었다. 세포들은 처리되지 않았거나(U), 또는 도면에 나타나 있는 바와 같이, 제피티니브의 농도를 점차 증가시키면서 3시간 동안 전처리된 것들이다(왼쪽 패널). 발현된 EGFR 단백질의 총량은 대조군(오른쪽 패널)에 나타나 있다.
도 3D은 패널 3C에 묘사된 2개의 실험들로부터의 결과를 계량화한 것이다(NIH 이미지 소프트웨어). 인산화된 EGFR의 농도는 단백질 발현 수준에 대해 정규화되었으며, 그 수용체의 퍼센트 활성화로 나타내어져 있다.
도 4는 EGFR의 ATP-결합 포켓 내에 있는 주요한 부위들에서의 돌연변이들의 클러스터링을 나타낸다.
도 4A는 복수의 경우의 NSCLC(서열번호 495∼504(DNA))에 있어서, EGFR 유전자의 엑손 19의 중첩되는 인프레임 결실의 위치와, 엑손 21의 미스센스 돌연변이의 위치를 보여준다. 각 엑손의 부분적인 누클레오티드 서열이 나타나 있는데, 점선에 의해 결실이 표시되어 있고, 미스센스 돌연변이는 밑줄 및 강조되어 있으며, 야생형 EGFR 누클레오티드와 아미노산 서열들이 나타나 있다(서열번호 493 및 494(DNA) 및 509∼510(아미노산)).
도 4B는 키나제 도메인의 아미노 로브(N)와 카르복시 로브(C)의 사이에 위치한 EGFR ATP 틈의 3차원적 구조를 보여준다(좌표는 PDB 1M14로부터 얻은 것이고, Cn3D 소프트웨어를 이용하여 도시한 것이다). 제피티니브를 나타내는 저해제는 상기 ATP 틈을 차지하고 있는 것으로 그려져 있다. 2개의 미스센스 돌연변이들의 위치가 키나제의 활성화 루프 내에 나타나 있고, 3개의 인프레임 결실들은 모두 다른 루프 내에 존재하며, 상기 ATP 틈의 측면에 위치하고 있다.
도 4C는 EGFR 키나제 도메인의 클로즈업 도면인데, ATP나 또는 저해제와의 결합에 참여하는 주요한 아미노산 잔기가 나타나 있다. 구체적으로는, 제피티니브 같은 4-아닐리노퀴나졸린 화합물은 ATP-결합 부위를 차지함으로써 촉매과정을 저해하며, 메티오닌793(M793) 및 시스테인775(C775) 잔기와 수소결합을 형성한다. 반면 그들의 아닐리노 환(ring)은 메티오닌766(M766), 리신745(K745), 및 류신788(L788) 잔기에 가깝다. 돌연변이의 표적으로 되는 상기 루프 내에서의 인 프레임 결실은 저해제에 대한 이들 아미노산의 위치를 변경시키는 것으로 예측된다. 돌연변이된 잔기들은 상기 티로신 키나제의 활성화 루프 내에 나타나 있다.
도 5A-5D에는 erbB1 유전자의 누클레오티드와 아미노산 서열이 나타나 있다. 아미노산들은 당업자들에게 알려져 있는 단일 글자들로 표시되어 있다. 키나제 도메인에서의 누클레오티드 변이들은 환자 번호에 의해 강조되어 있다(표 2 참조). 서열번호 511은 누클레오티드 1에서 3633까지를 포함한다. 서열번호 512는 아미노산 1에서 1210까지를 포함한다.
도 6A-6C: EGFR과 B-Raf 키나제 도메인들 내의 선택된 영역들의 서열 정렬. 인간 NSCLC에서의 EGFR 돌연변이들의 묘사. NSCLC 종양에서의 EGFR(gb:X00588;) 돌연변이들은 회색으로 강조되어 있다. 복수의 종양형들(5)에서의 B-Raf(gb:M95712) 돌연변이들은 검은색으로 강조되어 있다. 별표 표시들(*)은 EGFR과 B-Raf 사이에 보존된 잔기들을 가리킨다. 도 6A는 활성화 루프 내(서열번호 477-479)의 L858R 돌연변이를 나타낸다. 도 6B는 P-루프(서열번호 480-482) 내의 G719S 돌연변이를 나타낸다. 도 6C는 EGFR 엑손 19(서열번호 483-489) 내의 결실 돌연변이를 나타낸다.
도 7: EGFR 키나제 도메인의 3차원적 구조 내의, 미스센스 돌연변이들인 G719S와 L858R의 위치 및 Del-1 결실의 위치. 활성화 루프는 노란색으로, P-루프는 파란색으로 나타나 있고, 그리고 C-로브 및 N-로브는 표시되어 있다. 돌연변이나 또는 결실의 표적이 된 잔기들은 빨간색으로 강조되어 있다. Del-1 돌연변이는 코돈 746∼750 내의 ELREA 잔기들을 표적으로 한다. 돌연변이들은 키나제들 내의 고도로 보존된 영역들 내에 위치하며, ATP와 또한 제피티니브와 에를로티니브가 결합할 것으로 예측되는 영역을 둘러싸고 있는, P-루프와 활성화 루프들에서 발견된다.
도 8A-8F. 정상조직 및 종양조직들로부터 얻은 EGFR DNA의 대표적인 크로마토그램들. 확인된 돌연변이들의 위치는 다음과 같다. 도 8A는 엑손 18 키나제 도메인 P루프(서열번호 659∼660)를 나타낸다. 도 8B는 엑손 21 키나제 도메인 A-루프(서열번호 661∼662)를 나타낸다. 도 8C는 엑손 19 키나제 도메인 Del-1(서열번 호 663∼665)을 나타낸다. 도 8D는 엑손 19 키나제 도메인 Del-3(서열번호 666∼668)을 나타낸다. 도 8E는 엑손 19 키나제 도메인 Del-4(서열번호 669∼671)을 나타낸다. 도 8F는 엑손 19 키나제 도메인 Del-5(서열번호 672∼674)을 나타낸다.
도 9: EGFR과 BCR-ABL 폴리펩티드들의 서열 정렬과, 약에 대한 내성을 갖는 표현형을 부여하는 잔기들의 위치. GenBank 고유번호 NM_005228에 개시된 누클레오티드 서열에 의해 코딩되는 EGFR 폴리펩티드(서열번호 492)와, GenBank 고유번호 M14752에 개시된 누클레오티드 서열에 의해 코딩되는 BCR-ABL 폴리펩티드(서열번호 491)가 정렬되어 있고, 보존된 잔기들은 음영처리되어 있다. 티로신 키나제 저해제 이마티니브(imatinib)(STI571, Glivec/Gleevec)에 대한 내성을 부여하는 BCR-ABL 돌연변이들은 별표(*)로 표시되어 있다.
도 10은 EGFR 검사가 진행 중인 전이성 NSCLC 환자를 위한 의사결정 프로세스를 보여준다.
도 11은 EGFR 엑손 18-24(크기를 반영하지 않은)의 도식도이다. 화살표들은 확인된 돌연변이들의 위치를 가리킨다. 별표(*)는 각 위치에서 돌연변이를 가진 환자의 수를 나타낸다. 확대된 도면은 엑손 19의 결실들의 중첩과, 각 결실을 갖는 환자 수를 보여 준다. 이 결과는 현재까지의 모든 EGFR 돌연변이를 포함하는 것은 아니다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 암에 걸린 환자에 있어서 표피성장인자수용체(EGFR) 표적 치료의 유효 가능성을 결정하는 신규한 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 환자의 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 적어도 하나의 핵산 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 적어도 하나의 변이가 존재하는 것은 EGFR 표적 치료가 유효할 것임을 나타낸다. 바람직하게, 상기 핵산 변이는 EGFR 키나제 활성을 증대시킨다. 그렇게 되면, 상기 환자는 EGFR 표적 치료를 받을 수 있게 된다. 본 발명의 하나의 태양에서는, 상기 EGFR 표적 치료는 티로신 키나제 저해제이다. 바람직한 태양에서는, 상기 티로신 키나제 저해제는 아닐리노퀴나졸린이다. 상기 아닐리노퀴나졸린은 합성 아닐리노퀴나졸린일 수 있다. 바람직하게는 상기 합성 아닐리노퀴나졸린은 제피티니브이거나 또는 에를로티니브이다.
정의:
"ErbB1", "표피성장인자 수용체", 및 "EGFR"이라는 용어들은 본 원에서 서로 호환적으로 사용되며, 예를 들면 Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914(1987)에 개시되어 있는 천연 서열 EGFR 및 그 변이체들(예, Humphrey et al. PNAS(USA) 87:4207-4211(1990)에 개시된 EGFR의 결실 돌연변이)을 포함한다. erbB1은 EGFR 단백질 산물을 코딩하는 유전자를 가리킨다.
본 원에 사용된 "키나제 활성을 증대시키는 핵산 변이"라는 용어는 키나제 활성을 증대시키는 결과를 낳는, 유전자의 누클레오티드 서열에서의 변이(즉, 돌연변이)를 가리킨다. 증대된 키나제 활성은 핵산에서의 변이의 직접적인 결과이고, 그 유전자가 코딩하는 단백질과 관련되어 있다.
본 원에 사용된 "약", 또는 "화합물"이라는 용어는 질병이나 상태를 치료 또는 예방 또는 조절하기 위해 환자에게 투여하는 화학물질(chemical entity) 또는 생물학적 산물 또는 이들의 조합을 가리킨다. 화학물질 또는 생물학적 산물은 바람직하게는 저분자량 화합물이지만 반드시 저분자량 화합물이어야 하는 것은 아니고, 더 큰 화합물일 수도 있으며, 그 예에는 핵산 올리고머, 아미노산, 탄수화물, 단백질, 올레고누클레오티드, 리보자임, DNA효소, 당단백질, siRNA, 지질단백질, 엡테이머 및 그들의 변형체(modification)나 조합이 제한 없이 포함된다.
본 발명의 의미맥락에서의 "유전형"이라는 용어는 유전자의 특정한 대립형질을 가리키며, 특정 부위에서의 핵산서열에 존재하는 특정 누클레오티드에 의해서 정의될 수 있다.
"유전자의 변이형", "유전자형", 또는 "대립유전자"라는 용어는 집단 내에서의 어떤 유전자의 하나의 특정한 형태를 가리키는 용어이며, 그 특정한 형태는 유전자 서열 내부의, 적어도 하나의, 및 흔히는 둘 이상의 변이체 부위의 서열에 있어서 동일 유전자의 다른 형태들과 다른 것이다. 그 유전자의 서로 다른 대립유전자들간에서 서로 다른 이러한 변이체 부위들의 서열들은 "유전자 서열 변이", "변이", 또는 "변이체"라고 명명한다. 비록 돌연변이라는 용어가 유해한 표현형과 관련된 대립유전자를 지칭할 때 흔히 사용되기는 하지만, 당 기술분야에 알려진 동등한 다른 용어 중에는 돌연변이와 다형성이 포함된다. 본 발명의 바람직한 양상에서, 상기 변이들은 본 원 명세서에 포함된 변이표에 게재된 변이들로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 의미맥락에서 "프로브"라는 용어는 구조상 서로 다른 표적 분자들을 검출 가능할 정도로 구분할 수 있는 분자를 가리킨다. 검출은 사용되는 프로브의 타입에 따라, 및 표적 분자의 타입에 따라 다양한 서로 다른 방법으로 행하여질 수 있다. 따라서, 예를 들면, 검출은 표적 분자의 활성 수준의 식별에 기초할 수도 있으나, 바람직하게는, 특이적 결합의 검출에 기초한다. 그러한 특이적 결합의 예에는, 항체 결합과 핵산 프로브 혼성화가 포함된다. 따라서, 프로브로는 효소 기질, 항체와 항체 단편, 및 바람직하게는, 핵산 혼성화 프로브를 예로 들 수 있다.
본 원에 사용된 "유효한"과 "유효성"이라는 용어는 약리학적인 유효성과 생리학적인 안전성 모두를 포함한다. 약리학적인 유효성은 환자에게 있어서 소망의 생물학적 효과를 거둘 수 있는 치료능력을 가리킨다. 생리학적인 안전성은 치료의 투여의 결과로 나타나는, 독성의 수준, 또는 세포, 조직 및/또는 개체 수준에서의 다른 생리학적인 역효과를 가리킨다(흔히 부작용이라고 불린다). "덜 유효한"의 의미는 그 치료가 치료요법상 약리학적인 유효성이 상당히 낮은 수준을 의미하거나 및/또는 치료요법상 생리학적인 역효과 수준이 더 큰 것을 의미한다.
본 원에 사용된 "프라이머"라는 용어는 올리고누클레오티드를 가리키는데, 폴리누클레오티드에 대해 상보적인 프라이머 연장 산물(primer extension product)의 합성이 촉매되는 조건하에 놓여지면 프라이머는 상보 가닥을 따라 폴리누클레오티드 합성의 개시점으로 역할할 수 있다. 이러한 조건들은 4개의 서로 다른 누클레오티드 삼인산 또는 누클레오시드 유사체들과, DNA 중합효소 및/또는 역전사효소 같은 하나 이상의 중합제들이 적합한 온도 하에 적합한 완충액("완충액"이란 보조인자인 대체물 또는 pH나 이온 강도 등에 영향을 미치는 대체물을 포함한다) 중에 존재하는 것이다. 프라이머는 중합효소를 위한 시약의 존재하에 연장 산물의 합성을 시발하기 위해서는 충분히 길어야만 한다. 전형적인 프라이머는 표적 서열에 대해 실질적으로 상보적인 서열 길이를 적어도 약 5 누클레오티드 함유하나, 좀 더 긴 프라이머들이 바람직하다. 대개 프라이머들은 15∼26 누클레오티드를 함유하나, 더 긴 프라이머들도 채택될 수 있다.
프라이머는 항상 표적 서열, 즉 프라이머가 결합할 수 있는 증폭될 특정 서열에 대해 실질적으로 상보적인 서열을 함유한다. 프라이머는 또한 필요에 따라 프로모터 서열을 포함한다. "프로모터 서열"이라는 용어는 RNA 중합효소에 의해 특이적으로 인식되는 단일 가닥의 핵산 서열을 뜻한다. 상기 RNA 중합효소는 인식된 서열에 결합하여 전사과정을 개시하는데, 이 전사과정을 통해 RNA 전사체가 만들어진다. 원칙적으로 어떤 프로모터 서열이든, 그 개시서열을 인식할 수 있는 중합효소가 알려져 있고 입수 가능하면 채용할 수 있다. 알려져 있는 유용한 프로모터들은 어떤 박테리오파지 중합효소, 예를 들면, 박테리오파지 T3, T7, 또는 SP6 등에 의해 인식되는 것들이다.
"마이크로어레이(microarray)"는 고체 지지체의 표면 위에 형성된 각각 한정된 면적을 갖는 불연속적(discrete) 영역들의 선형 또는 2차원 배열이다. 마이크로어레이 위의 불연속적인 영역들의 밀도는 단일 고체상 지지체 표면 위에서 검출되는 표적 폴리누클레오티드의 총 수에 의해 결정되며, 바람직하게는 적어도 약 50/cm2, 보다 바람직하게는 적어도 약 100/cm2, 더 바람직하게는 적어도 약 500/cm2, 한층 더 바람직하게는 적어도 약 1,000/cm2이다. 본 발명에서 사용되는 DNA 마이크로어레이는 칩, 또는 표적 폴리누클레오티드를 증폭하거나 복제할 때 사용하는 다른 표면 위에 놓여진 올리고누클레오티드 프라이머의 배열이다. 배열 내의 각 특정 프라이머 그룹의 위치가 알려져 있기 때문에, 표적 폴리누클레오티드의 정체는 그것이 마이크로어레이상의 특정 위치에 결합함에 기초하여 결정될 수 있다.
"표지"라는 용어는 분석 시료에서 표적 폴리누클레오티드의 존재를 가리키는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 구성물을 가리킨다. 적합한 표지로는 방사성 동위원소, 누클레오티드 발색단, 효소, 기질, 형광 분자, 화학발광부분, 자기 입자(magnetic particle), 생물발광부분 등을 들 수 있다. 이와 같이, 표지는 분광법적인 수단, 광화학적 수단, 생화학적 수단, 면역화학적 수단, 전기적인 수단, 광학적인 수단 또는 화학적인 수단에 의해 검출 가능한 어떤 구성물이라도 좋다.
"지지체"라는 용어는 비드, 입자, 딥스틱(dipstick), 섬유, 필터, 막, 및 유리 슬라이드와 같은 통상적인 지지체 및 유리 슬라이드 같은 실란 또는 실리케이트 지지체를 가리킨다.
"증폭"이라는 용어는 광의로 사용되어 증폭 산물을 생성하는 것을 의미하며, 그러한 증폭 산물의 예로서는 추가의 표적 분자, 또는 표적 유사 분자, 또는 시료에 표적 분자가 존재함으로써 생성되는, 표적 분자에 대해 상보적인 분자 등을 들 수 있다. 표적이 핵산인 상황에서, 증폭 산물은 DNA 또는 RNA 중합효소, 또는 역전사효소 등에 의해 효소적으로 생성될 수 있다.
본 원에 사용된 "생물학적 시료"란 한 개인으로부터 분리된 조직이나 체액의 시료를 가리키며, 그 예로서는 혈액, 혈장, 혈청, 종양 생검, 오줌, 변, 가래, 척수액, 흉수, 유두흡인액, 림프액, 피부의 외부 절개, 호흡기, 장, 생식비뇨기의 관, 눈물, 침, 젖, 세포(혈액 세포를 포함하지만 이에 한정하지 않음), 종양, 기관, 및 in vitro 세포배양액 성분 시료 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 태양에서, 이러한 시료는 절제나, 기관지경 생검, 또는 원발암(primary tumor) 또는 전이된 암의 중심부바늘생검(core needle biopsy), 또는 흉수로부터의 세포 블럭으로부터 얻어진다. 부가적으로, 미세바늘흡인물 시료(fine needle aspirate sample)가 사용된다. 시료는 파라핀 포매(paraffin-embedded) 조직이어도 좋고 또는 냉동시킨 조직이어도 좋다.
"항체"라는 용어는 항원에 결합할 수 있는 면역 글로불린 단백질을 의미한다. 본 원에 사용된 항체는, 관심있는 항원 또는 항원성 단편에 결합할 수 있는, 예를 들면 F(ab’)2, Fab’, Fab와 같은 항체 단편을 포함하는 의미이다. 바람직하게는, 항원에 항체가 결합함으로써 EGFR의 변이형의 활성을 저해한다.
"인간화된 항체"라는 용어는, 본 원에서, 예를 들면 Fab, Fab’, F(ab’)2, 및 Fv와 같은 항체 단편들로만 구성되는 항체뿐만 아니라, 온전한 항체 분자, 즉, 2개의 온전한 경쇄과 2개의 온전한 중쇄로 구성된 항체를 기술하는데 사용되며, 그 CDR은 인간이 아닌 소스에서 유래하는 것이고, Ig 분자 또는 그 단편의 나머지 부 분은 인간 항체, 바람직하게는 인간의 항체를 코딩하는 핵산 서열로부터 만들어진 인간 항체로부터 유래하는 것이다.
본 원에 사용된 "인간 항체", 및 "인간화된 항체"라는 용어는 항체 분자의 모든 부분이 인간의 항체를 코딩하는 핵산 서열로부터 유래된 항체를 기술하기 위해 사용된다. 그러한 인간 항체는 항체 치료에 사용되는 것으로서 가장 바람직한 것인데, 왜냐하면 그러한 항체는 인간 환자에 있어서 면역 반응을 거의 유도하지 않거나 또는 전혀 유도하지 않기 때문이다.
본 원에 사용된 "키메라 항체"라는 용어는 위의 "인간화된 항체" 용어의 정의에서 기술한 바와 같이 항체 단편 뿐만 아니라 항체 분자를 기술하는데 사용된다. "키메라 항체"라는 용어는 인간화된 항체를 포함한다. 키메라 항체는 제1 포유동물 종으로부터 유래하는 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열로 된 적어도 하나의 부분과, 제2의 다른 포유동물 종에서 유래하는 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열로 된 또 다른 부분을 갖는다.
바람직하게는, 가변부위는 비-인간 포유동물 종으로부터 유래하는 것이고, 불변부위는 인간 종으로부터 유래된 것이다. 특히, 키메라 항체는 바람직하게는, 항체의 가변부위를 코딩하는 비-인간 포유동물로부터의 9 누클레오티드 서열과 항체의 불변부위를 코딩하는 인간으로부터의 누클레오티드 서열로부터 만들어진다.
표 2는 본 발명에 기재되어 있는 방법에 관련된 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 DNA 서열 변이의 부분적인 리스트이다. 이러한 변이들은 제피티니브에 반응한 NSCLC 환자들로부터 얻은 생물학적 시료와 제피티니브에 노출되지 않은 환 자들로부터 얻은 생물학적 시료에 대한 연구중에서 본 발명자들에 의해 확인된 것들이다.
핵산 분자들은 당업자에게 주지된 많은 과정들 중 특정 생물학적 시료에 맞는 특정 분리 과정을 선택하여 특정의 생물학적 시료로부터 분리해 낼 수 있다. 예를 들면, 고형의 재료로부터 핵산 분자를 얻음에 있어서는 냉동-해동 및 알칼린 용해 과정이 유용할 수 있고, 오줌으로부터 핵산 분자를 얻는 방법으로서는 가열 및 알칼린 용해 과정이 유용할 수 있고, 혈액으로부터 핵산을 얻는 방법으로서는 단백질분해효소 K 추출법을 사용할 수 있다(Rolff, A et al. PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer(1994)).
검출 방법
암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자들에 있어서 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 특정 변이나 복수의 변이들의 존재 또는 부재를 결정하는 것은 다양한 방식으로 수행가능하다. 그러한 시험들은 통상 생물학적 시료들, 즉, 조직 생검, 오줌, 변, 가래, 혈액, 세포, 긁어낸 조직, 유방 흡인액, 또는 다른 세포성 물질들로부터 수집된 DNA나 또는 RNA를 이용하여 수행되며, 또한 다양한 방법들을 통해 수행될 수 있다. 이러한 방법들에는, 다음에 국한하지는 않지만, PCR, 대립유전자-특이적 프로브와의 혼성화, 돌연변이의 효소적 검출, 미스매치에 대한 화학적 절단(cleavage), 질량분석 또는 DNA 서열결정이 있으며, 미량서열결정(minisequencing)도 포함된다. 특정의 태양에서, 대립유전자-특이적 프로브와의 혼성화는 2가지 포맷으로 수행가능하다:(1) 다수의 DNA 칩 응용들에서처럼, 고체상(유리, 실리콘, 나일론 막)에 결합된 대립유전자-특이적 올리고누클레오티드와 용액 중의 표지된 시료, 또는 (2) 결합된 시료(흔히 복제된 DNA 또는 PCR 증폭된 DNA)와 용액 중의 표지된 올리고누클레오티드(대립유전자에 특이적인 것 또는 혼성화에 의해 서열분석할 수 있도록 짧은 것). 진단 시험은 흔히 고체 지지체 위에 변이들의 구획(panel)을 포함하며, 이에 따라 하나 이상의 변이들을 동시에 결정할 수 있다.
또 다른 양상에서, erbB1 유전자에 있어서 핵산 변이를 증가시키는 적어도 하나의 키나제 활성의 존재를 검출하는 것은 하플로타입 결정 시험을 수반하기도 한다. 하플로타입 결정 방법은 예로서 WO 00/04194에 개시된 바와 같이, 당업자에게 알려져 있다.
바람직하게는, 키나제 활성을 증가시키는 적어도 하나의 핵산 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 것은 중합효소연쇄반응(PCR) 같은 방법에 의해 변이 부위나 또는 부위들의 서열을 결정하는 것을 포함한다. 또는, 키나제 활성을 증가시키는 핵산 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 방법에는 사슬 종료 DNA 서열결정(chain terminating DNA sequencing) 또는 미량서열결정, 올리고누클레오티드 혼성화, 또는 질량분석이 포함될 수 있다.
본 발명의 방법들은 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자에 있어서 EGFR 표적 치료의 유효 가능성(또는 유효성의 결핍)을 예측하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 암은 여기에 한정하는 것은 아니지만, 위장관암, 전립선암, 난소암, 유방암, 머리와 목 암, 폐암, 비소세포 폐암, 신경계 암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 이자암, 생식-비뇨기 암, 및 방광암 같은 상피세포 기원의 암을 포함한다. 바람직한 태양에서 상기 암은 비소세포 폐암이다.
본 발명은 일반적으로 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자에 있어서 EGFR 표적 치료의 유효성을 나타내주는 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 변이들을 동정하는 것과 관계가 있다. 부가적으로, EGFR의 키나제 도메인에서의 특정 변이를 동정하는 것은 진단적 또는 예후적 시험에 이용될 수 있다. 예로서, erbB1의 키나제 도메인에 적어도 하나의 변이가 존재하는 것은, 환자에게, 예를 들면, 티로신 키나제 저해제 같은 EGFR을 표적으로 하는 화합물에 의한 치료가 유익할 수 있을 것임을 나타낸다.
진단 시험을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 여기에 참조로 편입되는 특허출원 WO 00/04194에 개시되어 있다. 모범이 되는 방법에서, 상기 진단 시험은, erbB1 유전자 서열의 키나제 도메인에서의 하나 또는 그 이상의 알려진 변이상에 걸친 DNA 또는 RNA 세그먼트(일반적으로 RNA를 cDNA로 변환한 후)를 증폭하는 것을 포함한다. 그 후 이 증폭된 세그먼트 중의 핵산 변이들을 동정하기 위해, 이 증폭된 세그먼트를 서열결정하고, 및/또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 건다.
PCR
하나의 태양에서, 본 발명은 PCR에 의해, 또는 연결 연쇄 반응(ligation chain reaction: LCR)(예로서, Landegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080; 및 Nakazawa, et al., 1994. Proc . Natl . Acad . Sci. USA 91: 360-364 참조)에 의해 시험용 생물학적 시료 중의 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 변이체를 탐색하는 방법을 제공한다. LCR은 특히 EGFR 유전자의 점돌연변이를 검출하는데 유용할 수 있다(Abravaya, et al., 1995. Nucl . Acids Res. 23: 675-682 참조). 상기 방법은 표적 서열을 증폭하기 위한, 그 유전자의 하나 이상의 보존된 영역에 대응하는 축퇴성 프라이머를 설계하는 단계, 상기 프라이머를 사용하고 시험용 생물학적 시료로부터 얻어진 DNA 또는 cDNA를 주형으로 하여 증폭 반응을 시키는 단계 및 상기 PCR 산물의 분석 단계를 포함한다. 시험용 생물학적 시료의 PCR 산물의 대조군 시료와의 비교로부터 시험용 생물학적 시료의 변이가 드러난다. 그 변화는 시험용 생물학적 시료 중에 핵산 변이의 존재일 수도 있고 부재일 수도 있다.
대안적 증폭방법에는 자기 지속성 서열 복제(Guatelli, et al., 1990. Proc . Natl. Acad . Sci. USA 87: 1874-1878 참조), 전사 증폭 시스템(Kwoh, et al., 1989. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86: 1173-1177 참조), Qb 레플리카제(Lizardi, et al., 1988. BioTechnology 6: 1197 참조), 또는 다른 어떤 핵산 증폭 방법이 포함된다. 그 후 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 증폭된 분자를 검출한다. 이들 검출 스킴은 핵산 분자들이 매우 적은 수로 존재할 때, 핵산 분자들을 검출하는데 특히 유용하다.
본 발명에 따른 유용한 프라이머는 예를 들면 서열번호 493, 494, 509, 및 510을 가이드로 하여 erbB1 유전자의 키나제 도메인의 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 이용하여 설계한다. 프라이머는 유전자의 상동 영역에서 설계되는 데, 여기서 적어도 2개의 상동 영역은 길이나 핵산 서열에 있어서 가변인 서열의 불일치(divergent) 영역에 의해 분리되어 있다.
예를 들면, 동일하거나, 또는 고도로 상동인, 바람직하게는 적어도 80%∼85%, 더 바람직하게는 적어도 90%∼99% 상동인 적어도 약 6개, 바람직하게는 적어도 8∼10개의 연속된 아미노산의 서열. 가장 바람직하게는, 상기 아미노산 서열은 100% 동일한 것이다. 정방향과 역방향 프라이머들은, 코돈 축퇴성의 유지 및 알려진 유전자 패밀리 구성원 중 주어진 위치에서 다양한 아미노산들이 나타남에 기초하여 설계된다. 여기서 가리키는 상동성의 정도는 표준 서열비교 소프트웨어인 protein-BLAST 같은 것을 디폴트 세팅으로 하고 이용하여 얻어진 아미노산 서열 분석에 기초한다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
아래의 표 3은 축퇴 코드들의 사용법과 그들의 표준 심볼들을 나타낸다.
<표 3>
T C A G
T TTT Phe (F) TTC " TTA Leu (L) TTG " TCT Ser (S) TCC " TCA " TCG " TAT Tyr (Y) TAC TAA Ter TAG Ter TGT Cys (C) TGC TGA Ter TGG Trp (W)
C CTT Leu (L) CTC " CTA " CTG " CCT Pro (P) CCC " CCA " CCG " CAT His (H) CAC " CAA Gln (Q) CAG " CGT Arg (R) CGC " CGA " CGG "
A ATT Ile (I) ATC " ATA " ATG Met (M) ACT Thr (T) ACC " ACA " ACG " AAT Asn (N) AAC " AAA Lys (K) AAG " AGT Ser (S) AGC " AGA Arg (R) AGG "
G GTT Val (V) GTC " GTA " GTG " GCT Ala (A) GCC " GCA " GCG " GAT Asp (D) GAC " GAA Glu (E) GAG " GGT Gly (G) GGC " GGA " GGG "
바람직하게는 L, R, 및 S 같은 6배 축퇴 코돈들은 실제에 있어서는 6배 이상의 축퇴를 일으키므로 회피된다. L의 경우에, TTR과 CTN은 YTN(8배 축퇴)으로 되어버리고, R의 경우 CGN과 AGR은 MGN(8배 축퇴)으로 되어버리고 마지막으로 S의 경우, TCN, 및 AGY는 WSN(16배 축퇴)으로 되어버릴 수 있다. 3가지 경우 모두에 있어서 이들 중 6개는 표적 서열에 매치될 것이다. 이러한 특이성의 상실을 피하기 위해, 이러한 영역들을 피하거나, 또는 예를 들면 하나의 집단에는 S에 대하여 TCN을 포함시키고, 다른 집단에는 S에 대하여 AGY를 포함시키는 것과 같이 각각 대안적(alternative) 축퇴 코돈을 갖는 2개의 집단으로 만드는 것이 바람직하다.
프라이머들은 많은 입수할 수 있는 컴퓨터 프로그램들을 이용하여 설계될 수 있으며, Oligo Analyzer 3.0; Oligo Calculator; NetPrimer; Methprimer; Primer3; WebPrimer; PrimerFinder; Primer9; Oligo2002; Pride 또는 GenomePride; Oligos; 및 Codehop 등이 포함되지만 이것들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 프로그램에 대한 상세한 정보는 예를 들면, www.molbiol.net 로부터 얻을 수 있다.
프라이머들은 당업자에게 알려져 있는 표지들을 이용하여 표지될 수 있다. 그러한 표지로는 방사성 표지나 형광 표지, 염색 표지, 및 효소 표지가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
증폭결과물의 분석은 증폭결과물을 그들의 크기에 따라 분리할 수 있는 방법이면 어느 것이나 사용하여 수행될 수 있으며, 이러한 방법으로는 자동과 수동의 겔 전기영동, 질량분석 등이 있다.
또는, 증폭결과물은 서열차이를 이용하여, 예를 들면 핵산 어레이에 혼성화 하는 것뿐만 아니라 SSCP, DGGE, TGGE, 화학적 절단, 또는 제한 단편 다형성(restriction fragment polymorphism)을 이용하여 분리될 수 있다.
핵산 분리, 증폭, 및 분석 방법은 당업자에게는 일상적인 것이며, 프로토콜예는, 예를 들면, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set) Ed. Joseph Sambrook, David W. Russel, 및 Joe Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory; 3판(2001. 1. 15), ISBN: 0879695773에서 찾아볼 수 있다. PCR 증폭에 사용되는 방법에 대한 특별히 유용한 프로토콜 소스는 PCR (Basics: From Background to Bench) by M.J. McPherson, S. G. Moeller, R. Beynon, C. Howe, Springer Verlag; 1판(2000. 10. 15), ISBN: 0387916008 이다.
바람직하게는, 인간 EGFR의 엑손 19 및 21은 다음의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭된다: 엑손 19 센스 프라이머, 5’-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3’ (서열번호 505); 엑손 19 안티센스 프라이머, 5’-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3’ (서열번호 506); 엑손 21 센스 프라이머, 5’-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3’ (서열번호 507); 및 엑손 21 안티센스 프라이머, 5’-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3’ (서열번호 508).
대안적 태양에서, 시료 세포로부터의 EGFR 유전자 내에 있는 돌연변이는 제한효소 절단 패턴 상의 변경에 의해 동정될 수 있다. 예를 들면, 시료와 대조군 DNA를 분리하고, 증폭하고(필요에 따라), 1 이상의 제한 엔도누클레아제로 소화(digest)하고, 단편들의 길이를 겔 전기영동에 의해 결정하고, 비교한다. 시료와 대조군 DNA 간의 단편 길이 차이는 시료 DNA에서의 돌연변이를 시사한다. 또 한, 서열 특이적 리보자임을 사용하여(예로서, 미국 특허번호 5,493,531 참조), 리보자임 절단 부위의 발달 또는 상실에 의해 특정 돌연변이의 존재를 평가할 수 있다.
EGFR 유전자에서의 돌연변이를 검출하는 다른 방법은, 절단제로부터의 보호에 의해 RNA/RNA 또는 RNA/DNA의 이형 2본쇄(heteroduplex)에 있어서 미스매치된(mismatched) 염기들을 검출하는 방법을 포함한다(예로서, Myers, et al., 1985. Science 230: 1242 참조). 일반적으로, “미스매치 절단”기술은 조직 시료로부터 얻은 잠재적 돌연변이 RNA 또는 DNA와 함께 야생형 EGFR 서열을 함유하는 RNA 또는 DNA를 혼성화함으로써 형성된(표지된) 이형 2본쇄를 마련하는 것에 의해 시작된다. 이중 가닥 2본쇄를, 대조군과 시료 가닥 간의 염기쌍 미스매치로 인해 존재하게 되는, 2본쇄 중의 단일 가닥으로 된 영역을 절단하는 물질로 처리한다. 예를 들면, RNA/DNA 2본쇄를 리보누클레아제로 처리할 수 있고, DNA/DNA 혼성물(hybrid)을 S1 누클레아제로 처리하여 그 미스매치된 영역을 효소적으로 소화(digest)할 수 있다. 또 다른 태양에서는, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 2본쇄를 하이드록실아민 또는 오스뮴 테트록사이드, 및 피페리딘으로 처리하여 그 미스매치된 영역을 소화(digest)할 수 있다. 미스매치된 영역의 소화 후에 얻어진 물질들은 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 크기에 따라 분리하여 돌연변이 부위를 결정한다(예로서, Cotton, et al., 1988. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85: 4397; Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295 참조). 어떤 태양에서는, 검출을 위해 대조군 DNA 또는 RNA를 표지할 수 있다.
또 다른 태양에서는, 미스매치 절단 반응에, 세포 시료로부터 얻어진 EGFR cDNA에서의 점돌연변이를 검출 및 지도작성(mapping)하기 위해 규정된 시스템에서 이중 가닥 DNA 내의 미스매치된 염기쌍을 인식하는 하나 이상의 단백질(소위 "DNA 미스매치 수복" 효소)이 채용된다. 예를 들면 E.coli mutY 효소는 G/A 미스매치에서 A를 절단하며 HeLa 세포로부터의 DNA 글리코실라제는 G/T 미스매치에서 T를 절단한다(예로서, Hsu, et al., 1994. Calcinogenesis 15: 1657-1662 참조). 모범적인 태양에 따르면, 예를 들면 DEL-1부터 DEL-5, G719S, G857V, L883S 또는 L858R EGFR 서열과 같은 돌연변이 EGFR 서열에 기초한 프로브를 시험 세포(들)로부터의 cDNA 또는 다른 DNA 산물에 혼성화시킨다. 그 2본쇄를 DNA 미스매치 수복효소로 처리하고 만약 그 절단 산물이 있다면 전기영동 등에 의해 검출할 수 있다(예로서 미국 특허번호 5,459,039 참조).
또 다른 태양에서는, EGFR 유전자에서의 돌연변이를 확인하는데 있어서 전기영동 이동성(electrophoretic mobility)의 변경을 이용할 것이다. 예를 들면, 단일 가닥 입체구조 다형성(SSCP)을 이용하여 돌연변이와 야생형 핵산 간의 전기영동 이동성 차이를 검출할 수 있다(Orita, et al., 1989. Proc . Natl . Acad . Sci. USA: 86: 2766; Cotton, 1993. Mutat . Res. 285: 125-144; Hayashi, 1992. Genet . Anal. Tech . Appl. 9: 73-79 참조). 시료와 대조군 EGFR 핵산의 단일 가닥 DNA 단편들은 변성되고(denatured) 재결합(renature)될 것이다. 단일-가닥 핵산의 2차 구조는 서열에 따라 변하는데, 그에 따른 전기영동 이동성의 변경에 의해 심지어 단일 염기 변화까지도 검출 가능하게 된다. DNA 단편들은 표지되거나 표지된 프로 브로 검출될 수 있다. 분석의 감도는 그 2차 구조가 서열 변화에 보다 민감한 RNA(DNA를 사용하는 것보다 민감)를 사용함으로써 향상될 수 있다. 하나의 태양에서, 본 방법은 이형 2본쇄 분석을 이용하여, 이중가닥 이형 2본쇄 분자를, 그 전기영동 이동성의 변화에 기초하여 분리한다(Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5 참조).
또 다른 태양에서는, 변성제(denaturant)의 농도 구배를 갖는 폴리아크릴아미드 겔 내의 돌연변이 또는 야생형의 단편들의 이동을, 변성 구배 겔 전기영동법(denaturing gradient gel electrophoresis: DGGE)을 사용하여 분석한다(Myers, et al., 1985. Nature 313: 495 참조). 분석의 방법으로서 DGGE가 사용될 때, DNA는 완전히 변성되지 않도록 하기 위해 변형(modify)될 것인데, 이는, 예를 들면, PCR에 의해, 대략 40bp의 고융점 GC-풍부 DNA인 GC 클램프를 부가하는 것이다. 또 다른 태양에서는, 대조군과 시료 DNA의 이동성 차이를 확인하기 위해 변성 구배 대신에 온도 구배가 이용된다(Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys . Chem. 265: 12753).
점돌연변이를 검출하는 다른 기술들의 예는, 선택적 올리고누클레오티드 혼성화, 선택적 증폭, 또는 선택적 프라이머 연장을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 올리고누클레오티드 프라이머를 그 중심부에 알려진 돌연변이가 위치하도록 제조한 후, 오직 완벽한 매치일 때만 혼성화를 허용하는 조건하에서, 표적 DNA와 혼성화시킬 수 있다(Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163; Saiki, et al., 1989. Proc . Natl . Acad . Sci. USA 86: 6230 참조). 그러한 대립 유전자 특이적 올리고누클레오티드들은 그 올리고누클레오티드들이 혼성화 막에 부착하여 표지된 표적 DNA와 혼성화 될 때, PCR 증폭된 표적 DNA나 또는 다수의 서로 다른 돌연변이들과 혼성화 된다.
또는, 선택적 PCR 증폭에 의존하는, 대립유전자 특이적 증폭 기술을 본 발명과 함께 사용할 수 있다. 특이적 증폭을 위한 프라이머로서 사용되는 올리고누클레오티드는 관심 대상의 돌연변이를 그 분자의 중심부에 가질 수 있으며(증폭이 분별 혼성화(differential hybridization)에 의존하도록. 예로서, Gibbs, et al., 1989. Nucl . Acids Res. 17: 2437-2448 참조), 또는 프라이머의 극단의 3’-말단(extreme 3'-terminus)에 가질 수도 있는데, 이렇게 할 경우 적합한 조건하에서라면, 미스매치, 또는 중합효소 연장(polymerase extension)이 방지 또는 감소된다(예로서, Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238 참조). 부가적으로, 절단에 기초한 검출이 가능하도록 돌연변이 영역 내에 신규한 제한 부위를 도입하는 것이 바람직할 수도 있다(Gasparini, et al., 1992. Mol . Cell Probes 6: 1 참조). 어떤 태양에서는, 증폭용 Taq 연결효소(ligase)를 사용하여 증폭을 행할 수도 있을 것이다(Barany, 1991. Proc . Natl . Acd . Sci . USA 88: 189 참조). 그러한 경우에는, 5’서열의 3’-말단에서 완벽한 매치가 있을 때만 연결(ligation)이 될 것이므로, 이로써 증폭의 존재 또는 부재를 찾음으로써, 알려진 돌연변이가 특정 부위에 존재하는 것을 검출할 수 있게 될 것이다.
고형의 지지체와 프로브
대안적 태양에서는, 적어도 하나의 핵산 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것은, 상술한 바와 같이 하여 확인된, erbB1 유전자의 소망 영역에 대응하는 핵산 서열을 프로브와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 프로브는, 예를 들면, 분별 결합 또는 혼성화에 의해, 특정 형태의 유전자, 또는 특정 변이 또는 변이들의 존재를 구별할 수 있다. 따라서, 본보기로 되는 프로브로는 핵산 혼성화 프로브, 펩티드 핵산 프로브, 적어도 하나의 누클레오티드 유사체를 또한 함유하는 누클레오티드-함유 프로브, 예를 들면 단일클론 항체와 같은 항체, 및 여기서 논의한 다른 프로브들을 들 수 있다. 당업자들은 특정 특이성을 가진 프로브를 준비하는데 익숙하다. 당업자들은 유전자의 2개의 변이형들 간의 구분을 최적화하기 위해 다양한 변수를 조정할 수 있음을 인식할 것이며, 이러한 변수의 조정에는 염 농도, 온도, pH의 변화, 및 테트라메틸 암모늄 클로라이드 같은, GC vs . AT 염기쌍의 분별 친화도(differential affinity)에 영향을 주는 다양한 화합물들의 첨가 등이 포함된다(F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, K. Struhl 및 V. B. Chanda(편집자), John Wiley & Sons에 의한 「Current Protocols in Molecular Biology(분자생물학에서의 최근 프로토콜)」 참조).
따라서, 바람직한 태양에서는, 적어도 하나의 변이의 존재 또는 부재의 검출은, 적어도 하나의 변이부위를 포함하는 핵산 서열을, 프로브와, 바람직하게는 핵산 프로브와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 프로브는, 혼성화가 선택적 혼성화 조건하에서 수행될 때, 변이 부위에 비-상보적 염기를 갖는 핵산 서열 형태에 혼성화되는 것과 비교해서, 변이 부위에 상보적인 염기를 함유하는 핵산 서열 형태에 우선적으로 혼성화한다. 그러한 핵산 혼성화 프로브는 2개 또는 그 이상의 변이 부위에 걸쳐 있다. 달리 구체적으로 적시하지 않는다면, 핵산 프로브는 염기 쌍 짝짓기 기능이 유지되는 한, 하나 이상의 핵산 유사체, 표지 또는 다른 대체물 또는 부분들을 포함할 수 있다.
상기 프로브는, 예를 들면, 서열번호 495, 497, 또는 499의 결실된 영역의 양 쪽에, 적어도 3개의 연속적인 누클레오티드에 결합하도록 설계될 수 있다. 그러한 프로브는, 적합한 조건하에서 혼성화 될 때, EGFR의 변이형에는 결합할 것이나, 야생형 EGFR에는 결합하지 않을 것이다.
그러한 혼성화 프로브는 당업계에 잘 알려져 있다(예로서, Sambrook et al., Eds.,(최신판), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (3판, 2001), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조). 엄격한 혼성화 조건들은 전형적으로 약 1 M 미만의 농도로 염을 포함할 것이며, 더 보편적으로는 약 500 mM 미만, 바람직하게는 약 200 mM 미만의 농도로 포함한다. 혼성화 온도는 5℃ 까지 낮아질 수 있으나, 전형적으로는 22℃ 보다 높고, 더 전형적으로는 약 30℃보다 높고, 바람직하게는 약 37℃를 넘는다. 보다 긴 단편은 특이적 혼성화를 위해 보다 높은 혼성화 온도를 요구한다. 다른 요소들도 혼성화의 엄격성에 영향을 주기도 하는데, 여기에는, 염의 구성과 상보적 가닥의 길이, 유기 용매의 존재, 및 염기 미스매칭의 정도가 포함되며, 사용되는 변수들의 조합은 어느 변수 하나의 절대 척도(absolute measure)보다 더 중요하다. 조절될 수 있는 다른 혼성화 조건들로는 완충액 타입 및 농도, 용액 pH, 배경 결합(background binding) 을 감소시키기 위한 차단제(blocking reagent)(예로서, 반복서열, Cot1 DNA, 차단 단백질 용액)의 존재와 농도, 세제(detergent)의 타입과 농도, 폴리누클레오티드의 상대농도를 증가시키는 폴리머 같은 분자, 금속 이온과 그 농도, 킬레이터와 그 농도, 및 당 기술분야에 알려져 있거나 발견할 수 있는 다른 조건들을 들 수 있다. 주어진 프로브에 대해 완벽하게 상보적인 서열에 대한 최적의 융해 온도(melting temperature)를 예측하기 위해 공식을 사용할 수도 있으나, 혼성화 조건의 어떤 세트하에서 프로브에 대한 실제 융해 온도는 경험적으로 결정되어야만 한다. 또한, 주어진 조건 세트 하에서의 프로브의 정확한 융해 온도를 결정하기 위해, Sambrook et al., "Molecular Cloning," 3판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 기재된 바와 같이, 그 프로브의 정확한 상보성을 시험할 수도 있다. 혼성화 온도는, 표적 폴리누클레오티드와 결합된 지지체를 사용하는 주어진 혼성화 용액에 대해, 소망하는 엄격성의 수준에서 검출 가능한 프로브의 결합이 검출되는 온도 범위가 확인될 때까지, 체계적으로 변경할 수 있다. 상기 엄격성은, 오직 고도의 상보성을 갖는 표적 폴리누클레오티드만이 혼성화하는 높은 엄격성, 또는 프로브에 상보적인 영역을 갖는 추가적인 표적 폴리누클레오티드가, 비상보적 표적 폴리누클레오티드와 상기 지지체에, 비특이적 결합으로부터 비롯되는 배경 수준 이상으로 검출 가능하게 혼성화하는 낮은 엄격성을 말한다. 지지체 상의 잠재적 표적 폴리누클레오티드에 의해 주어진 조건 세트하에서 혼성화를 수행한 후, 그 지지체를, 엄격성을 점진적으로 상향하는 조건하에(전형적으로는 염 농도를 낮추거나 및/또는 온도를 증가시키지만 다른 조건을 변경할 수도 있음), 뚜렷한 포지티브 신호가 보 일만큼 배경 결합이 낮아질 때까지, 세정한다. 이것은 그 진행상황을 모니터할 수 있는데, 여기에는 프로브가 방사선사진법적으로 방사성 동위원소로 표지되는 가이거 계수기를 이용하는 방법과, 형광 촬상 장치(fluorescent imager)를 이용하는 방법, 및 프로브 결합을 검출할 수 있는 다른 수단들을 이용하는 방법들이 있다. 상기 지지체는 그러한 과정 중 말라서는 안되며, 마르면 상기 프로브는 심지어 배경 지점들에까지 비가역적으로 결합되어버릴 수도 있다. 프로브가 바람직하지 않은 배경 또는 가짜 포지티브 신호를 내보내면, 포지티브 신호가 배경과 구분될 때까지, 차단제를 채용하거나 프로브의 다른 영역을 사용하거나 또는 다른 프로브를 사용한다. 배경을 뛰어넘는 만족할 만한 신호를 제공하는 조건을 일단 찾으면, 포지티브 신호를 제공하는 당해 표적 누클레오티드를 분리하여 더욱 특징을 규명한다. 상기 분리된 폴리누클레오티드를 서열결정할 수 있으며, 그 서열을 데이터뱅크 엔트리나 또는 알려진 서열과 비교할 수 있고, 필요하다면, 당업계에 알려진 기술에 의해 전장 클론을 얻을 수 있으며, 그 폴리누클레오티드를 적합한 벡터 및 숙주를 사용하여 발현하여, 동정된 폴리누클레오티드가, 그 프로브 폴리누클레오티드의 기원에 유사한 활성을 갖는 단백질을 코딩하고 있는지 여부를 결정할 수 있다. 상기 프로브는 10∼50 누클레오티드에서부터 시작하나, 예를 들면 약 50∼500 누클레오티드 또는 그 이상의 보다 큰 프로브도 채택가능하다.
고체상 지지체
본 발명의 고체상 지지체는 핵산 혼성화와 합성을 지지하는데 적합한 고형의 물질과 구조면 어느 것이나 가능하다. 바람직하게는, 상기 고체상 지지체는 적어도 하나의 실질적으로 단단한 표면을 포함하는데, 그 표면 위에 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 프라이머들이 움직일 수 없게 고정될 수 있다. 상기 고체상 지지체는, 예를 들면, 유리, 합성 폴리머, 플라스틱, 메쉬(mesh) 구조가 아닌 단단한 나일론 또는 세라믹 등으로 만들어질 수 있다. 다른 적합한 고체 지지체 물질들은 당업자에게 알려져 있고, 곧 바로 입수가능하다. 상기 고형 지지체의 크기는 DNA 마이크로어레이 기술에 유용한 표준형의 마이크로어레이 크기면 어느 크기라도 좋으며, 그 크기는 본 발명의 반응을 수행하는데 사용되는 특정 기계에 맞도록 맞출 수도 있다. 올리고누클레오티드를 고정할 목적에 맞는 고체상 지지체를 얻기 위한 방법과 물질은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들면, 미국 특허번호 5,919,523에 기재되어 있는데, 여기에 그 개시 내용을 참고로 편입한다.
상기 고체 지지체는 용기를 갖는 유체의 내부에 마련되거나 그 부분일 수도 있다. 예를 들면, 고체 지지체는 챔버 내에 놓여질 수 있는데, 중합효소연쇄반응(PCR)이 상기 지지체 위에서 행하여질 수 있도록, 상기 챔버의 측면이 고체 지지체의 가장자리를 밀봉한다. 하나의 구체적인 예에서, 상기 챔버는 직각형의 지지체 양변 위에 벽을 가질 수 있는데, 이는 PCR 혼합물이 확실하게 지지체 위에 머물도록 하며, 또한 전체 표면이 프라이머들을 제공하는데 유용하도록 만든다.
본 발명의 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 프라이머들은 올리고누클레오티드를 고체 지지체 위의 특정 위치에 고착(fix), 고정(immobilize), 마련(provide), 및/또는 도포(apply)할 수 있는 사용 가능한 어떤 수단에 의해 고체 지지체의 표면에 고착되고, 고정되고, 마련되고, 및/또는 도포된다. 예를 들면, 포토리소그래피 기술(Affymetrix, Santa Clara, Calif.)을 사용하여, 여기에 참조형태로 편입되어 있는 미국 특허번호 5,919,523, 5,837,832, 5,831,070, 및 5,770,722에 기재되어 있는 바와 같이, 올리고누클레오티드 프라이머를 칩이나 고체 지지체 위의 특정 위치에 도포할 수 있다. 상기 올리고누클레오티드 프라이머는 고형의 지지체에 Brown과 Shalon에 의한 미국 특허번호 5,807,522(1998)에 기재된 바와 같이 도포될 수 있다. 부가적으로, 상기 프라이머는 Genetic MicroSystems사제(Woburn, Mass), GeneMachines사제(San Carlos, Calif.) 또는 Cartesian Technologies사제(Irvine, Calif.)의 로봇 시스템을 이용하여 고체 지지체에 도포될 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에서는, 생물학적인 시료로부터의 표적 폴리누클레오티드의 고체상 증폭이 수행되는데, 여기서는 복수의 올리고누클레오티드 프라이머 그룹들이 고체상 지지체 위에 고정된다. 바람직한 태양에서, 한 그룹내의 프라이머들은 적어도 프라이머들의 제1 세트를 포함하는데, 이 제1 세트의 프라이머들은 그 서열이 동일하며, 표적 폴리누클레오티드의 규정된 서열에 상보적이고, 또 적합한 조건하에서 표적 폴리누클레오티드에 혼성화할 수 있으며, 핵산 합성(즉, 체인 연장 또는 신장)에 대한 개시 프라이머로서 적합한 것이다. 기준 서열의 특정 영역을 커버하는 선별된 프라이머들은 그룹으로서 고체 지지체 위에 불연속적 위치에 고정된다. 바람직하게는, 그룹간의 거리는 증폭결과물을 검출하는데 사용되는 검출수단의 해상도 보다 크다. 바람직한 태양에서, 프라이머들은 고정되어 마이크로 어레이 또는 칩의 형태를 이루고 있으며, 이들은 자동화된 프로세싱을 통해 처리되어 분석될 수 있다. 고정된 프라이머들은 핵산 증폭 수단에 적합한 조건 하에서, 표적 폴리누클레오티드의 고체상 증폭에 사용된다. 이러한 방식으로, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 다양한 잠재적 변이들의 존재 또는 부재를 일회의 분석을 통해 결정할 수 있다.
어떤 생물학적 소스가 erbB1 유전자의 키나제 도메인 위에 적어도 하나의 키나제 활성을 증가시키는 변이를 갖는지를 결정함에 있어서, 건강한 개체로부터 분리된 표적 폴리누클레오티드의 집단을 대조군으로 사용할 수 있다. 또는, 동일 개체의 건강한 조직으로부터 분리된 표적 폴리누클레오티드를 마찬가지로 대조군으로 사용할 수도 있다.
마이크로어레이 상의 in situ-타입 PCR 반응은 Embretson et al., Nature 362: 359-362 (1993); Gosden et al., BioTechniques 15(1): 78-80 (1993); Heniford et al., Nuc. Acid Res. 21(14): 3159-3166 (1993); Long et al., Histochemistry 99: 151-162 (1993); Nuovo et al., PCR Methods and Applications 2(4): 305-312 (1993); Patterson et al., Science 260: 976-979 (1993)에 기재된 바와 같이 하여 수행할 수 있다.
또는, erbB1의 키나제 도메인에서의 변이들은 지지체 위에서 PCR을 수행하지 않고도 고체상 기술에 의해 결정될 수 있다. 각자 erbB1의 키나제 도메인에 특징적인 변이를 이중, 삼중, 또는 사중으로 갖고 있는 복수의 올리고누클레오티드 프로브들을 고체상의 지지체에 결합할 수 있다. 당업자에게 알려져 있으며 상술한 바와 같은 선택적 혼성화 기술에 의해 상기 시험용 생물학적 시료에서의 변이의 존재 또는 부재를 검출할 수도 있다.
질량분석
또 다른 태양에서, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 키나제 활성을 증가시키는 핵산 변이의 존재 또는 부재는 질량분석법을 사용하여 결정할 수 있다. 질량분석을 수행할 핵산 분자의 적합한 양을 얻기 위해, 증폭은 필수적일 것이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 증폭 과정의 예로는 클로닝(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), 중합효소연쇄반응(PCR)(C.R. Newton 및 A. Graham, PCR, BIOS Publishers, 1994), 연결효소연쇄반응(LCR)(Wiedmann, M., et al., (1994) PCR Methods Appl . Vol. 3, pp. 57-64; F. Barnay Proc . Natl . Acad . Sci. USA 88, 189-93 (1991), 가닥치환증폭(strand displacement amplification: SDA)(G. Terrance Walker et al., Nucleic Acids Res. 22, 2670-77 (1994)) 및 RT-PCR(Higuchi, et al., Bio / Technology 11: 1026-1030 (1993)), 대립유전자-특이적 증폭(ASA), 및 전사 기반 처리법(transcription based process) 과 같은 변형들을 들 수 있다.
질량분석을 용이하게 하기 위해, 검출될 핵산 서열을 함유하고 있는 핵산 분자는 고체 지지체에 고정될 수 있다. 적합한 고체 지지체의 예로서는 비드(예로서, 실리카 겔, 조절된 다공 유리(controlled pore glass), 자석, 세파덱스/세파로 스(Sephadex/Sepharose), 셀룰로스), 편평한 표면 또는 칩(예로서, 유리섬유 필터, 유리 표면, 금속 표면(철, 금, 은, 알루미늄, 동, 및 실리콘), 모세관, 플라스틱(예로서, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리비닐리덴디플루오라이드 막 또는 마이크로타이터 판)); 또는, 비드 또는 편평한 표면을 구성하는 것과 유사한 물질로 만들어진 핀이나 빗(comb), 또는 웨이퍼(예로서, 실리콘 웨이퍼)와 같은 편평한 표면에 있는 구멍(pit)에 들어있는 비드를 들 수 있다.
고정은, 예를 들면, 혼성화에 기초하여 달성할 수가 있으며, 그 혼성화는 지지체에 이미 고정된 캡쳐 핵산 서열과, 역시 검출될 핵산 서열을 함유하는 핵산 분자 내에 함유되어 있는 상보적 핵산 서열과의 사이에서 일어난다. 상기 상보적 핵산 분자들 간의 혼성화가 지지체에 의해 방해받지 않도록, 캡쳐 핵산은 고체 지지체와 캡쳐 핵산 서열 사이에 적어도 약 5 누클레오티드의 길이를 갖는 스페이서 영역(spacer region)을 포함할 수 있다. 그 형성된 2본쇄(duplex)는 레이저 펄스의 영향 하에 절단될 것이며, 탈착이 개시될 수 있다. 그 고체 지지체에 결합된 염기 서열은 자연(natural) 올리고리보누클레오티드 또는 올리고디옥시리보누클레오티드뿐만 아니라 그 유사체(예, 티오-변형 포스포디에스테르나 또는 포스포트리에스테르 골격)를 통해 제공될 수 있고, 또는, 상기 염기 서열을 효소적인 분해에 덜 민감하게 해서, 고체 지지체에 결합되어 있는 캡쳐 염기 서열의 전체적인 안정성을 증가시키는, PNA 유사체(예로서, Nielsen et al., Science, 254, 1497 (1991) 참조)와 같은 올리고누클레오티드 모방체들을 사용함으로써 제공될 수 있다.
질량분석법 분석 이전에, 예를 들면, 증발(volatilization)에 요구되는 레이 저 에너지를 낮추기 위해, 및/또는 분절화(fragmentation)를 최소화하기 위해, 핵산 분자를 "콘디쇼닝(conditioning)" 하는 것이 유용할 수 있다. 콘디쇼닝은 바람직하게는 표적 검출 부위가 고정되어 있는 동안에 수행한다. 콘디쇼닝의 한 예는, 핵산 분자의 포스포디에스테르 골격의 변형(modification)(예로서, 양이온 교환)인데, 이것은 누클레오티드 단위마다 결합된 양이온들의 이질성(heterogeneity)에 의한 피크 넓어짐(peak broadening)을 제거하는데 유용할 수 있다. 핵산 분자를 알킬아이오다이드, 아이오도아세트아미드, β-아이오도에탄올, 2,3-에폭시-1-프로판올과 같은 알킬화 물질과 접촉시킴으로써, 핵산 분자의 모노티오 포스포디에스테르 결합을 포스포트리에스테르 결합으로 변환시킬 수 있다. 마찬가지로, 포스포디에스테르 결합을, 트리알킬실릴 클로라이드를 사용하여, 전하를 갖지 않는 유도체로 변환시킬 수도 있다. 콘디쇼닝을 더 하는 것은, N7-또는 N9-디아자퓨린 누클레오티드 또는 RNA 빌딩 블럭과 같은 퓨린 제거(질량분석 도중의 분절화)에 대한 감도를 감소시키는 누클레오티드의 편입(incorporation), 또는 올리고누클레오티드 트리에스테르의 사용, 또는 알킬화된 포스포로티오에이트기의 편입, 또는 PNA와 같은 올리고누클레오티드 모방체의 사용을 포함한다.
어떤 응용에 있어서는, 특정의 포획된(captured) 핵산 단편 위의 2개 이상의 (돌연변이된) 위치(loci)(어레이의 2개 이상의 지점(spot))를 동시에 검출하는 것이 유용할 수 있으며, 또는 다양한 고체 지지체 위의 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 모방체 어레이를 사용하여, 병렬 처리(parallel processing)를 수행하는 것이 유용할 수도 있다. "다중처리(multiplexing)"는 몇 가지 서로 다른 방법들에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 대응하는 검출자(detector)(프로브) 분자(예로서, 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 모방체)를 사용함으로써, 몇 가지 돌연변이를 하나의 표적 서열 상에서 동시에 검출할 수 있다. 그러나, 검출자 올리고누클레오티드 D1, D2, 및 D3 간의 분자량 차이가 동시 검출(multiplexing)이 가능하도록 충분히 커야 한다. 이것은 서열 자체(조성 또는 길이) 또는 검출자 올리고누클레오티드에 질량-변경 작용기 M1-M3 을 도입함으로써 달성될 수 있다.
본 발명에서의 사용을 위한 바람직한 질량분석의 형식은 매트릭스 지원 레이저 탈착 이온화(MALDI), 전기 분사(electrospray: ES), 이온 사이클로트론 공명(ICR), 및 푸리에 변환이다. 질량분석을 수행하는 방법들은 당업자에게 알려져 있으며, Methods of Enzymology, Vol. 193: "Mass Spectrometry"(J.A. McCloskey, 편집자), 1990, Academic Press, New York에 더 기술되어 있다.
서열분석
다른 바람직한 태양에서, 적어도 하나의, 키나제 활성을 증가시키는 핵산 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 것은 적어도 하나의 핵산서열을 서열분석하는 것을 포함한다. 상기 서열분석은, 적어도 하나의 변이 부위를 포함하고 또한 복수의 변이 부위를 포함할 수도 있는 erbB1의 키나제 도메인의 한 부분 또는 여러 부분을 서열 분석하는 것을 포함한다. 바람직하게는 상기 부분의 길이는 500 누클레오티드 이하이고, 보다 바람직하게는 100 누클레오티드 이하이며, 가장 바람직하게는 45 누클레오티드 이하이다. 그러한 서열분석은 당업자들에게 알려져 있는 다양한 방법들에 의해 수행될 수 있는데, 그러한 방법에는 디데옥시 종결법(예로서, 염료로 표지된 디데옥시 누클레오티드를 사용), 미세서열분석법, 및 질량분석법이 포함된다.
면역검출법
하나의 태양에서, 적어도 하나의 키나제의 활성을 증가시키는 핵산 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 것은 EGFR의 다운스트림 표적의 활성화 상태를 결정하는 것을 포함한다.
본원의 발명자들은 EGFR의 주요한 다운스트림 표적의 인산화 상태를 비교했었다. 예를 들면, Ras를 통한 Erk1과 Erk2의 EGF-유도 활성화, PLCγ/PI3K를 통한 Akt의 EGF-유도 활성화, 및 JAK2를 통한 STAT3와 STAT5의 EGF-유도 활성화가 검사되었다. Ras를 통한 Erk1과 Erk2, PLCγ/PI3K를 통한 Akt, JAK2를 통한 STAT3와 STAT5는 EGFR의 발암성 효과를 매개하는 필수적인 다운스트림 경로이다(R.N. Jorissen et al., Exp . Cell Res . 284, 31(2003)).
본원 발명자들은, EGF로 유도된 Erk의 활성화는, 야생형 EGFR 또는 2개의 활성화하는 EGFR 돌연변이체 중 어느 것을 발현하는 세포들 사이에서 분별불가능하다는 것을 입증하였다.
대조적으로, Akt와 STAT5 양자의 인산화는, 돌연변이 EGFR들 중의 어느 것을 발현하는 세포에 있어서 실질적으로 증대되었다. STAT3의 증대된 인산화는 돌연변 이 EGFR을 발현하는 세포들에서 유사하게 관찰되었다. 따라서, EGFR 돌연변이체 내의 C-말단 티로신 잔기의 선택적 EGF-유도 자가인산화반응은 다운스트림 신호전달경로의 선택적 활성화와 매우 상관관계가 높다.
본원의 하나의 태양에서는 EGFR 돌연변이체의 존재를 당 업계에 잘 알려진 면역학적인 기술들을 사용하여 결정할 수 있으며, 그러한 기술에는 예를 들면, 면역조직화학법, 면역세포화학법, FACS 스캐닝, 면역블로팅법, 방사면역측정법, 웨스턴 블로팅법, 면역침전법, 효소결합 면역흡착법(ELISA)과 같은 항체 기술 및 EGFR의 활성화된 다운스트림 표적들에 대한 항체를 사용하는 파생 기술들이 있다. 그러한 표적의 예로서는, 인산화된 STAT3, 인산화된 STAT5, 및 인산화된 Akt을 들 수 있다. 인산기-특이적 항체를 사용하여, STAT3, STAT5, 및 Akt의 활성화 상태를 결정할 수 있다. STAT3, STAT5, 및 Akt의 활성화는 EGFR 돌연변이체의 활성화의 진단 지표로서 유용하다.
본 발명의 하나의 태양에서, 활성화된(인산화된) STAT3, STAT5, 및 Akt의 존재는 EGFR 표적치료가 유효할 수 있음을 나타낸다.
본 발명은 면역조직화학법 또는 면역세포화학법에 의해 시험용 생물학적 시료 중의 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 변이체들을 탐색하는 방법을 제공한다.
예를 들면 면역조직화학법(“IHC”)과 면역세포화학법(“ICC”)을 사용할 수도 있다. IHC는 면역화학법을 조직 절편에 적용하는 것이고, 반면에 ICC는 면역화학법을, 예를 들면, 액체계 표본작업(liquid-based preparation)과 같은 특정의 세 포학적 표본작업을 거친 후의 세포나 조직 임프린트(imprint)에 적용하는 것이다. 면역화학법은 특이적 항체의 사용에 기반한 기술들의 집합으로서, 여기서는 항체를 사용하여 세포 내부 또는 세포 표면의 분자를 특이적으로 표적으로 한다. 상기 항체는 전형적으로 표지를 함유하는데, 이 표지는 생화학적 반응을 하며, 이에 따라 표적 분자를 만나게 되면, 변색한다. 어떤 경우에 있어서는 신호 증폭을 특정의 프로토콜에 통합시킬 수 있으며, 이때 1차 특이적 항체의 적용 후 표지 착색(marker stain)을 포함하는 2차 항체가 적용된다.
면역조직화학법적 분석은 당업자에게 알려져 있다(예로서, Jalkanen, et al., J. Cell . Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell . Biol. 105: 3087-3096 (1987) 참조).
항체는, 다클론항체이든 또는 단일클론항체이든, 다양한 상업적 공급자들로부터 구매할 수 있거나, 또는 예를 들면, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Mannual, 2판; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)에 기재되어 있는 것과 같은 잘 알려진 방법들을 통해 제조할 수도 있다. 일반적으로, 본 발명에 유용한 항체의 예로는 안티-포스포-STAT3, 안티-포스포-STAT5, 및 안티-포스포-Akt 항체를 들 수 있다. 이러한 항체들은, 예를 들면, Upstate Biotechnology사(Lake Placid, NY), New England Biolabs사 (Beverly, MA), NeoMarkers사(Fremont, CA)로부터 구입 가능하다.
전형적으로, 면역조직화학법을 위해서는, 환자로부터 조직 절편을 얻어 이것을 알콜, 아세톤, 파라포름알데히드 같은 적합한 고착제에 의해 고착시키며, 이것 이 항체와 반응한다. 면역조직화학법의 통상의 방법들은 Harlow 및 Lane (eds) (1988) "Antibodies A Laboratory Mannual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Ausbel et al. (eds) (1987), in Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons (New York, NY)에 기재되어 있다. 그러한 검출 분석에 적합한 생물학적 시료들은, 세포, 조직 생검, 전혈(whole blood), 혈장, 혈청, 가래, 뇌척수 액, 유방 흡인액, 흉수, 소변 등을 포함하나 이것들에 한정되는 것은 아니다.
직접 표지술에서는 표지된 항체를 활용한다. 간접 표지술에서는 시료를 다시 표지된 물질과 반응시킨다.
또는, 면역세포화학법을 활용할 수 있다. 일반적으로 환자로부터 세포를 얻어, 알콜, 아세톤, 파라포름알데하이드 같은 적합한 고착제에 의해 고착하며, 그것이 항체와 반응한다. 인간 시료의 면역세포학적 염색은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들면 Brauer et al., 2001 (FASEB J, 15, 2689-2701), Smith-Swintosky et al., 1997에 기재되어 있다.
본 발명의 면역학적 방법은 단지 적은 양의 생물학적 물질을 요구하기 때문에 유익하다. 그 방법은 세포 수준에서 행해질 수 있고, 최소 한 개의 세포가 요구된다. 바람직하게는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자로부터 몇 개의(several) 세포들을 얻어, 본 발명의 방법에 따라 분석한다.
다른 진단 방법들
돌연변이 EGFR 단백질을 검출하는 제제는 돌연변이 EGFR 단백질에 결합할 수 있는 항체이며, 바람직하게는 검출가능하게 표지된 항체이다. 항체는 다클론 항체일 수도 있고, 더 바람직하게는 단일클론항체일 수도 있다. 완전한 항체 또는 예를 들면 Fab, F( ab )2와 같은 항체 단편이 사용될 수도 있다. 프로브 또는 항체에서 "표지된"이라는 용어의 의미는, 검출가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링(즉, 물리적 결합)을 통해 직접 표지한 경우뿐만 아니라, 직접 표지된 다른 시약과의 반응성에 의해 프로브 또는 항체를 간접 표지한 경우 모두를 포괄한다. 간접 표지의 예로는, 형광 표지된 2차 항체를 사용하여 1차 항체를 검출하는 것과, 형광 표지된 스트렙타비딘(streptavidin)에 의해 검출될 수 있도록 비오틴으로 DNA 프로브의 말단을 표지하는 것을 들 수 있다. "생물학적 시료"란 용어는 피험자(subject)의 내부에 존재하는 조직, 세포, 생물학적 액뿐만 아니라, 피험자로부터 분리된 조직, 세포, 생물학적 액을 포함한다. 즉, 본 발명의 검출 방법은, 생체내(in vivo) 뿐만 아니라 생체외(in vitro)에서 생물학적 시료 중의 돌연변이 EGFR mRNA, 단백질, 또는 게놈 DNA를 검출하는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 돌연변이 EGFR mRNA의 검출을 위한 생체외 기술로는 노던 혼성화법(Northen hybridization)과 in situ 혼성화법을 들 수 있다. 돌연변이 EGFR 단백질의 검출을 위한 생체외 기술로는 효소결합 면역흡착법(ELISA), 웨스턴 블로팅법, 면역침전법, 및 면역형광법을 들 수 있다. 돌연변이 EGFR 게놈 DNA의 검출을 위한 생체외 기술로는 서던 혼성화법(Southern hybridization)이 있다. 또한 돌연변이 EGFR 단백질의 검출을 위한 in vivo 기술로는 피험자에게 표지된 항-돌연변이 EGFR 단백질 항체를 도입하는 방법이 있다. 예를 들면, 그 항체는, 피험자 내에서의 그 존재와 위치를 표준 영상 기술(standard imaging techniques)에 의해 검출 가능한 방사성 표지로 표지될 수 있다.
하나의 태양에서는, 생물학적 시료는 피험자로부터의 단백질 분자를 함유한다. 대안적으로, 생물학적 시료는 피험자로부터의 mRNA 분자 또는 게놈 DNA 분자를 포함할 수도 있다.
또 다른 태양에서, 상기 방법들은 대조군 피험자로부터 대조군 생물학적 시료를 얻고, 그 생물학적 시료 내의 돌연변이 EGFR 단백질, mRNA, 또는 게놈 DNA의 존재가 검출될 수 있도록, 그 대조군 시료를, 돌연변이 EGFR 단백질, mRNA, 또는 게놈 DNA를 검출할 수 있는 화합물 또는 시약과 접촉시키고, 그 대조군 시료 내의 돌연변이 EGFR 단백질, mRNA, 또는 게놈 DNA의 존재를 상기 시험용 시료 내의 돌연변이 EGFR 단백질, mRNA, 또는 게놈 DNA의 존재와 비교하는 것을 포함한다.
또 다른 태양에서, 상기 진단 분석은 돌연변이 EGFR의 활성에 대한 것이다. 구체적인 태양에서, 상기 돌연변이 EGFR 활성은 티로신 키나제 활성이다. 그러한 진단 분석은, 적어도 하나의 EGFR 기질의, EGFR-매개 인산화를 검출하기 위한 것이다. EGFR 활성의 수준은 예를 들면 다양한 돌연변이 EGFR 폴리펩티드, 돌연변이 EGFR을 함유하는 다양한 조직, 적어도 하나의 돌연변이 EGFR을 가지고 있을 것으로 의심되는 암 조직으로부터의 생검물 등에서 분석될 수 있다. 필요에 따라, 이들 다양한 세포, 조직 또는 그 추출물에서의 EGFR 활성 수준을 비교할 수 있다. 하나 의 태양에서, 암 조직에서의 높은 수준의 EGFR 활성은, 하나 이상의 티로신 키나제 저해제에 의한 치료에 민감한 암의 진단 지표이다. 관련된 태양에서는, 처리된 또는 처리되지 않은 생검 시료, 세포주, 형질전환 동물 또는 이들 중 어느 것으로부터의 추출물 사이에서 EGFR 활성 수준을 결정하여, 주어진 치료가 돌연변이 EGFR 활성에 미치는 영향을 처리되지 않은 대조군과 비교하여 결정할 수 있다.
환자 치료 방법
하나의 태양에서, 본 발명은 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의, 적어도 하나의, 키나제 활성을 증가시키는 핵산 변이의 존재 또는 부재를 결정함으로써, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자에 대한 치료를 선택하는 방법을 제공한다. 또 다른 태양에서, 상기 변이는 복수의 변이이며, 여기서 복수란 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 유전자 위치(loci)의 변이를 포함할 수 있다.
어떤 태양에서, 적어도 하나의 변이의 존재는 환자의 치료가 효과적이거나 또는 유익함(beneficial)(또는 유익할 가능성이 있음)을 가리킨다. "치료가 효과적"이라는 것은, 유익한 치료 효과의 가능성이, erbB1 유전자의 키나제 도메인에 특정 키나제 활성을 증가시키는 적합한 핵산 변이가 없는 인간보다 크다는 것을 의미한다.
이 치료는 티로신 키나제 저해제의 투여를 포함한다. 이 치료는 치료들의 조합을 포함할 수 있는데, 티로신 키나제 저해제와, 다른 티로신 키나제 저해제, 화학요법, 방사선요법 등과의 조합을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
따라서, 티로신 키나제 저해제의 투여와 관련하여, 암에 "대하여 유효한" 약(drug)이란, 임상적으로 적합한 방법으로 투여한 결과 적어도 통계적으로 유의미한 수의 환자에게서 증상의 개선, 치유, 질병 부담의 경감, 종양의 크기 또는 세포수 감소, 수명의 연장, 삶의 질의 향상 또는 특정 유형의 질병 또는 상태의 치료에 익숙한 의사에 의해 일반적으로 긍정적으로 인식될 수 있는 다른 효과 등과 같은 유익한 효과가 있음을 가리킨다.
바람직한 태양에서, 이 화합물은 아닐리노퀴나졸린 또는 합성 아닐리노퀴나졸린이다. 유럽 특허공개번호 EP 0566226에는 EGFR 티로신 키나제에 대해 활성을 갖는 아닐리노퀴나졸린이 개시되어 있다. 유럽 특허출원 EP 0520722와 EP 0566226에는 특정한 4-아닐리노퀴나졸린 유도체가 수용체 티로신 키나제 저해제로서 유용하다는 사실이 밝혀져 있다. 이들 화합물들에 의해 밝혀진 구조와 활성간의 긴밀한 관계는 명확하게 한정된 결합 양식(binding mode)을 제안한다. 즉 퀴나졸린환은 아데닌 포켓에 결합하며, 아닐리노환은 이웃한 고유의(unique) 친지질성 포켓에 결합한다. 세 개의 4-아닐리노퀴나졸린 유사체(두개는 가역적이며 다른 한 개는 비가역적인 저해제임)는 임상적으로 항암제로 평가되었다(Denny, Farmaco January-February 2001; 56(1-2):51-6 참조). 또는, 상기 화합물은 EKB-569로서, EGFR 키나제 저해제이다(Torrance et al., Nature Medicine, Vol. 6, No. 9, Sept. 2000, p.1024 참조). 가장 바람직한 태양에서, 이 화합물은 제피티니브(IRESSA®) 또는 에를로티니브(TARCEVA®)이다.
여기에 기술된 적어도 하나의 돌연변이 EGFR를 함유하는 암세포를 표적으로 하는 치료는, 단독으로 투여되거나 다른 적합한 항암 치료 및/또는 당업자에게 알려져 있는 치료제와 조합하여 투여된다. 하나의 태양에서, 암과 같은 병변의 치료는, 치료를 요하는 피치료자에게, 제피티니브, 에를로티니브와 같은 EGFR 키나제 활성을 저해하는 화합물의 치료적 유효량을 단독 투여하거나 또는 적어도 하나의 다른 항암제 또는 치료와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 표적으로 된 소분자 의약(small molecule drugs) 또는 항체 기반 전략을 통한 활성화된 단백질 키나제의 저해는 암 치료에 효과적인 접근방법으로 판명되었다(G. D. Demetri et al., N. Eng. J. Med. 347, 472(2002); B. J. Druker et al., N. Engl . J. Med. 344, 1038(2001); D. J. Slamon et al., N. Engl . J. Med. 344, 783 (2001) 참조).
하나의 태양에서, 항암제는 적어도 하나의 화학요법제이다. 관련된 태양에서, 항암제는 적어도 하나의 방사선치료이다. 변형된 태양에서, 항암치료는 항혈관생성 치료이다(예, 엔도스타틴, 안지오스타틴, TNP-470, 카플로스타틴(Caplostatin)(Stachi-Fainaro et al., Cander Cell 7(3), 251 (2005)).
치료제들은 서로 동일해도 달라도 좋으며, 예를 들면, 치료용 방사성 핵종, 약(drug), 호르몬, 호르몬 길항제, 수용체 길항제, 다른 시약에 의해 활성화된 효소 또는 전효소, 오토크린(autocrine), 사이토카인, 또는 당업자에게 알려진 적합한 항암제 중의 어느 것이다. 하나의 태양에서 항암제는, 항-VEGF 항체로서, 고형암과 혈액 악성종양에 대한 항 혈관생성 치료에 있어서 성공적임이 입증된 아바스틴(Avastin)이다(Ribatti et al., 2003, J. Hematother Stem Cell Res. 12(1), 11-12 참조). 독소(Toxin) 역시 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 본 발명에 이용 되는 또 다른 치료제로는 항DNA제, 항RNA제, 안티센스 올리고누클레오티드와 같은 방사성 표지된 올리고누클레오티드, 항단백질제, 항 염색질 세포독성제 또는 항미생물제를 들 수 있다. 당업자에게 알려져 있는 다른 치료제, 및 그러한 다른 치료제의 본 발명에 따른 사용이 특이적으로 고려된다.
항종양제는 알킬화제, 대사저해제, 호르몬제, 항생제, 항체, 생물학적 항암제(anti-cancer biological), 글리벡(gleevec), 콜히친(colchicine), 빈카 알칼로이드(vinka alkaloid), L-아스파라기나제, 프로카르바진(procarbazine), 히드록시우레아, 미토탄(mitotane), 니트로소우레아, 또는 이미다졸 카르복스아미드(imidazole carboxamide)와 같은 다수의 화학요법제 중의 하나일 수 있다. 적합한 제제들은 튜뷸린(tubulin)의 탈분극을 촉진하거나 또는 종양세포 증식을 방해하는 것들이다. 본 발명의 범위 내에서 고려되는 화학요법제에는 미국 식품의약국(Food and Drug Administration)과 미국 보건사회복지성(Department of Health and Human Services)에 의한, 치료동등성이 평가된 승인된 의약품의 오렌지북(Orange Book of Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence Evaluations)에 등재된 항암제들이 포함되나, 이것에 한정되는 것은 아니다. 화학요법제의 예로 카르보플라틴(carboplatin), 파클리탁셀을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. EGFR 키나제 활성을 표적으로 하는 치료 역시 방사선치료와 함께 투여될 수 있다. 당 기술분야에 알려져 있는 다른 항암치료들도 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
치료제는 화학요법제일 수도 있다. 화학요법제들은 당 기술분야에 알려져 있으며 적어도 탁산, 니트로겐 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아, 트리아젠, 폴산(folic acid) 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 빈카 알칼로이드, 항생제, 효소, 백금착화합물, 우레아 치환체, 메틸 히드라진 유도체, 부신피질억제제 또는 길항제를 포함한다. 더 구체적으로, 화학요법제는 스테로이드, 프로게스틴, 에스트로겐, 안티에스트로겐, 안드로겐 등의, 그러나 이것에 한정되지 않는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 더 구체적으로, 화학요법제는 아자리빈(azaribine), 블레오마이신(bleomycin), 브리오스타틴-1(bryostatin-1), 부설판(busulfan), 카르무스틴(carmustine), 클로람부실(chlorambucil), 카르보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), CPT-11, 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine), 다크티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 덱사메타손(dexamethasone), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 독소루비신(doxorubicin), 에티닐 에스트라디올(ethinyl estradiol), 에토포시드(etoposide), 플루오로우라실(fluorouracil), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 겜시타빈(gemcitabine), 히드록시프로게스테론 카프로에이트(hydroxyprogesterone caproate), 히드록시우레아, L-아스파라기나제, 류코보린(leucovorin), 로무스틴(lomustine), 메클로레타민(mechlorethamine), 메드로프로게스테론 아세테이트(medroprogesterone acetate), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 멜팔란, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트(methotrexate), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 미토탄(mitotane), 파클리탁 셀(paclitaxel), 페닐 부티레이트, 프레드니손(prednisone), 프로카르바진(procarbazine), 세무스틴 스트렙토조신(semustine streptozocin), 타목시펜(tamoxifen), 탁산(taxane), 탁솔, 테스토스테론 프로피오네이트, 탈리도마이드, 티오구아닌, 티오테파(thiotepa), 우라실 머스타드(uracil mustard), 빈블라스틴(vinblastine) 또는 빈크리스틴(vincristine)일 수 있다. 화학요법제의 어떠한 조합이든 그 이용이 고려된다. 화학요법제의 투여는 EGFR 활성을 표적으로 하는 치료의 전, 중 또는 후일 수 있다.
다른 적합한 치료제는 방사성 동위원소, 붕소 부가물(boron addend), 면역조절자(immunomodulator), 독소(toxin), 광활성제 또는 광활성염료, 암 화학치료약, 항바이러스약, 항진균약, 항박테리아약, 항원충약, 화학민감화약(chemosensitizing drug)으로 이루어진 군으로부터 선택된다(미국 특허번호 4,925,648 및 4,932,412 참조). 적합한 화학요법제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 19판 (Mack Publishing Co. 1995)과 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Goodman et al., Eds. Macmillan Publishing Co., New York, 1980년 및 2001년판)에 기술되어 있다. 실험 의약들과 같은 다른 적합한 화학요법제들은 당업자에게 알려져 있다. 또, 적합한 치료적 방사성 동위원소는 α-방사체, β-방사체, γ-방사체, 오제 전자 방사체, α-입자를 방사하는 중성자 포획제와 전자 포획에 의해 감쇠되는 방사성 동위원소로 구성되는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 방사성 동위원소는 225Ac, 198Au, 32P, 125I, 131I, 90Y, 186Re, 188Re, 67Cu, 177Lu, 213Bi, 10B 및 211At로 이루어진 군으로부터 선택된다.
둘 이상의 치료제를 사용함에 있어서는, 그들은 동일할 수도 있고 다른 것일 수도 있다. 예를 들면, 치료제는 서로 다른 방사성 핵종들(radionuclides), 또는 약품과 방사성 핵종을 포함할 수 있다. 바람직한 태양에서, EGFR 활성을 표적으로 하는 치료는 돌연변이 EGFR 키나제 활성을 저해한다.
또 다른 태양에서는, 개별적인 에너지 방출의 결과 서로 다른 거리(distance)에 걸쳐 유효한 서로 다른 동위원소들을 제1 및 제2 치료제로 사용한다. 이러한 시약들은 더욱 효과적인 종양 치료를 달성하기 위하여 이용될 수 있으며, 정상적인 임상 상황에서 서로 다른 크기의 다발성 종양을 보이는 환자를 치료하는데 유용하다.
입수가능한 동위원소 중 극히 작은 종양 퇴적물과 단일 세포를 치료하는데 유용한 것은 매우 적다. 이러한 상황에서는 약(drug) 또는 독소(toxin)가 더욱 유용한 치료제로 될 수 있다. 따라서 본 발명의 바람직한 태양에서는, 동위원소를, 약, 독소, 중성자 포획제와 같은 비 동위원소 종과 조합하여 사용한다. 본 발명과 연관되어 이용될 수 있는 많은 약과 독소는 세포에 대하여 세포독성(cytotoxic) 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이들은 Merck Index, Goodman and Gilman 등과 같은 약과 독소의 개론서 및 위에서 언급한 참고문헌들에서 발견된다.
세포내의 단백질 합성을 간섭하는 약 역시 본 발명의 방법에 사용될 수 있는데, 이러한 약들은 당업자에게 알려져 있으며, 푸로마이신(puromycin), 시클로헥시미드(cycloheximide),리보누클레아제를 포함한다.
본 발명의 치료 방법은 암 치료에 사용될 수 있다. 방사성 동위원소, 약, 독소가 암세포와 관련되어 또는 암세포에 의해 제조된 표지에 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 단편에 접합(conjugate)될 수 있다는 사실은 잘 알려져 있다. 또한 이러한 항체 접합체(antibody conjugates)를 사용하여 방사성 동위원소, 약, 독소를 종양 위치에 도달시켜, 치료 효과를 향상시키고 부작용을 최소화할 수 있다. 이러한 시약과 방법에 대한 예들은 Wawrzynczak 및 Thorpe(in Introduction to the Cellular and Molecular Biology of cancer, L. M. Franks and N. M. Teich, eds, Chapter 18, pp.378-410, Oxford University Press. Oxford, 1986), Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of cancer(C. W. Vogel, ed., 3-300, Oxford University Press, N.Y., 1987), Dillman, R. O. (CRC Critical Reviews in Oncology / Hematology 1:357, CRC Press, Inc., 1984), Pastan et al.(Cell 47: 641, 1986), Vitetta et al. (Science 238:1098-1104, 1987) 및 Brady et al.(Int . J. Rad . Oncol . Biol . Phys. 13:1535-1544, 1987)에 검토되어 있다. 암에 대한 면역접합체의 이용 및 다른 형태의 치료에 대한 다른 예들은 특히 미국 특허번호 4,331,647, 4,348,376, 4,361,544, 4,468,457, 4,444,744, 4,460,459, 4,460,561, 4,624,846, 4,818,709, 4,046,722, 4,671,958, 4,046,784, 5,332,567, 5,443,953, 5,541,297, 5,601,825, 5,635,603, 5,637,288, 5,677,427, 5,686,578, 5,698,178, 5,789,554, 5,922,302, 6,187,287호, 및 6,319,500에 개시되어 있다.
부가적으로, 본 발명의 치료 방법은, 어떤 세포 독성 제제의 부작용을 방해, 완화, 역전시키는 다른 화합물 또는 기술과 조합하여 이용할 수 있다. 이러한 조 합의 예로는 미국 특허번호 4,624,846에 기술된 바와 같은, 빠른 제거를 위해 IL-1을 항체와 함께 투여하는 것을 들 수 있다. 이러한 투여는, EGFR 활성을 표적으로 하는 1차 치료로부터 3시간∼72시간 후에, 항암제(세포독성 성분으로서의 방사성 동위원소, 약 또는 독소)와 조합하여 수행할 수 있다. 이것은 순환계로부터의 접합체, 약, 독소의 제거를 증진하며 치료제에 의하여 야기되는 척수 및 다른 조혈독성(hematopoietic toxcity)을 완화 또는 역전시키는데 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양상에서, 암 치료는, 예를 들면 약과 방사성 동위원소; 또는 방사성 동위원소와, 중성자 활성 치료(neutron-activated therapy)를 위한 붕소-10; 또는 약과 생물학적 반응 조절자(biological response modifier); 또는 융합분자접합체(fusion molecule conjugate)와 생물학적 반응 조절자 등과 같이, 둘 이상의 살종양제(tumoricidal agent)의 조합을 포함할 수 있다. 사이토카인을 치료적 투여 계획(therapeutic regimen)에 포함시킴으로써 각 성분의 효율성을 극대화할 수 있다.
유사하게, β 또는 α 방사체인 방사성 동위원소와 접합된 어떤 항백혈병 및 항림프종 항체들은, 이들이 순전히 종양세포에로만 향하여지지 않을 경우, 골수 및 다른 조혈 부작용을 야기할 것이다. 이것은 특히 종양 세포가 순환계 또는 혈액 형성 기관에 있을 경우 발견된다. 적어도 하나의 조혈 사이토카인(예, 콜로니 자극 인자, G-CSF, GM-CSF와 같은 성장 인자)의 동시 및/또는 순차 투여는, 항암 효과를 증가시키는 동시에 조혈 부작용(hematopoietic side effect)을 감소 또는 개선시킴에 있어서 바람직하다.
Harvert, "Nuclear Medicine Therapy", New York, Thieme Medical Publishers, 1087, pp.1-340에 기술된 바와 같이, 다양한 방사성핵종 치료법을 암과 또 다른 병리적 상태의 치료에 이용할 수 있음은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 과정을 경험한 임상의사는, 그 조혈 부작용을 경감하기 위한 과정에, 여기에 기술된 사이토카인 보조 치료를 용이하게 적용할 수 있을 것이다. 이와 유사하게, EGFR 활성을 표적으로 하는 치료와 함께 투여되는 세포독성 약에 의한 치료는, 예를 들면 암 또는 다른 세포 증식 질환을 위한 치료에 사용될 수 있다. 그러한 치료는 동위원소 또는 방사성 표지된 항체에 의한 방사성 동위원소 치료법과 유사한 원칙에 의해 지배된다. 통상의 숙련된 임상의사는 1차 항암 치료의 전, 중 및/또는 후에 부가적인 항암 치료 투여를 적용할 수 있을 것이다.
키트
본 발명은 또한, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 표적 핵산을 증폭하기 위한 축퇴성 프라이머, 및 증폭 프로토콜과 그 결과의 분석을 포함하는 설명서를 포함하는 예측, 진단, 예후 키트를 제공한다. 이 키트는 필요에 따라 완충액, 효소, 및 증폭의 수행과 증폭 결과물의 분석을 위한 용기들을 포함할 수 있다. 이 키트는 DNA 마이크로어레이와 같은 다른 도구(tool)를 포함하는 탐색, 진단, 또는 예후 키트의 일 구성요소일 수도 있다. 바람직하게는, 이 키트는 정상적인 조직 시료로부터 분리된 핵산 및/또는 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 서로 다른 변이들을 나타내는 일련의 시료들로부터 분리된 핵산 등과 같은 하나 이상의 대조 군 주형(template)도 제공한다.
하나의 태양에서, 이 키트는 둘 이상의 프라이머쌍을 제공하며, 각 프라이머쌍은 erbB1 유전자의 서로 다른 영역(각 영역은 잠재적 변이 부위임)을 증폭할 수 있으며, 이에 의해 하나의 반응 또는 몇 개의 병렬적 반응(parallel reaction)으로 생물학적 시료 중의 몇 가지 유전자 변이의 발현을 분석하는 키트를 제공한다.
이 키트 내의 프라이머는 예를 들면 형광으로 표지되어 있어서 증폭 결과물과 이어지는 핵산 변이들의 분석을 용이하게 할 수 있다.
하나의 태양에서는, 2 이상의 변이를 한번의 분석으로 검출할 수 있다. 그러므로 조합 키트는 erbB1 유전자의 키나제 도메인의 서로 다른 세그먼트들을 증폭할 수 있는 프라이머들을 포함할 것이다. 그 프라이머들은, 변이들을 분별할 수 있도록, 서로 다르게 표지될 수도 있다(예를 들어 다른 색의 형광 표지를 사용).
상기 키트 내에 함유되어 있는 프라이머들은 다음 프라이머들을 포함할 수 있다: 엑손 19 센스 프라이머, 5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3'(서열번호: 505); 엑손 19 안티센스 프라이머, 5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3'(서열번호: 506); 엑손 21 센스 프라이머, 5'-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-'3(서열번호: 507); 엑손 21 안티센스 프라이머, 5'-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3'(서열번호: 508).
바람직한 태양에서, 프라이머들은 서열번호 646∼673(표 5 와 6 참조)로 구성되는 군에서 선택된다. 이들 프라이머들은 정방향 프라이머의 5' 말단에 서열번호 645를 가지며, 역방향 프라이머의 5' 말단에 서열번호 674를 가진다.
면역검출 키트
또 다른 태양에서, 본 발명은 다운스트림 EGFR 표적(즉, STAT3, STAT5, 및 Akt)의 활성화 수준을 검출하는데 사용하기 위한 면역학적 키트를 제공한다. 이러한 키트는 일반적으로 STAT3, STAT5, 또는 Akt의 인산화된 형태에 면역특이성을 갖는 하나 이상의 항체들을 포함할 것이다.
본 발명은, 인산화된 Akt, STAT3, 및 STAT5 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 포유동물 세포 내의 인산화된 단백질에 면역특이적으로(immunospecifically) 결합할 수 있는 항체와, 이 항체를 이용하여 포유동물 세포에서 Akt, STAT3, 또는 STAT5 경로 활성화(pathway activation)를 조사할 수 있는 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 바람직한 방법에 있어서는, 이 키트는 인산화된 Akt, STAT3, 또는 STAT5 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 포유동물 세포 내의 인산화된 단백질에 각각 면역특이적으로 결합할 수 있는 서로 다른 항체들을 포함한다.
상기 키트는 일반적으로 a) 약학적으로 허용가능한 담체; b) 적합한 용기에 담겨 있는, 인산화된 STAT3, STAT5, 또는 Akt에 대한 항체; 및 c) 면역검출제를 포함한다. 단클론 또는 다클론 항체들은 상업적으로 입수가능하며, 예를 들면 Current Protoclos in Immunology, John Wiley & Sons, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Krusibeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, 2001에 기술된 바와 같은 당업자에게 알려져 있는 방법으로 제조할 수도 있다.
어떤 태양들에서, 항원과 항체는 칼럼 매트릭스 또는 마이크로타이터 플레이트의 웰(well)과 같은 고체 지지체에 결합되어 있을 수 있다. 이 키트의 면역검출제는 주어진 항체 또는 항원 그 자체와 결합되거나(associated) 연결된(linked) 검출가능한 표지를 포함하는 다양한 형태들 중에서 하나를 택할 수 있다. 2차 결합 배위자에 결합(associated) 또는 부착되어(attached) 있는 검출가능한 표지도 고려된다. 2차 배위자의 예로는 1차 항체 또는 항원에 결합친화성(binding affinity)을 갖는 2차 항체들이 있다.
당 기술분야에 알려져 있는 적합한 분석 표지로는 글루코스 산화효소와 같은 효소 표지(enzyme label); 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(115 mIn, 113 mIn, 112In, 111In), 및 테크네튬(technetium)(99Tc, 99 mTc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브데늄(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru와 같은 방사성 동위원소들; 루미놀(luminol)과 같은 발광 표지들; 플루오레세인(fluorescein), 및 로다민(rhodamine)과 같은 형광 표지들, 및 비오틴(biotin)을 들 수 있다.
본 키트에 사용되는 더 적합한 면역검출제는 2성분제를 포함하며, 이 2성분제는 1차 항체나 1차 항원에 결합친화성을 갖는 2차 항체와 함께, 상기 2차 항체에 결합친화성을 갖는, 검출 표지에 연결되어 있는 3차 항체를 포함한다.
다수의 표지의 예가 당 기술분야에 알려져 있으며 그러한 모든 표지들은 본원발명에 관하여 사용될 수 있다. 방사성 표지, 핵자기 스핀 공명 동위원소(nuclear magnetic spin-resonance isotopes), 형광 표지, 및 적합한 기질과 접촉하여 색을 띠는 결과물을 생성할 수 있는 효소 표지(emzyme tag)가 그 적합한 예이다.
상기 키트는 완전히 접합된 형태, 중간체 형태, 또는 키트의 사용자에 의해 접합될, 분리되어 있는 부분들, 중의 어느 것으로 된 항체-표지 접합체(antibody-label conjugate)를 함유할 수 있다.
상기 키트는, 검출 분석을 위한 표준 곡선(standard curve)을 제작하기 위해 사용되거나 또는 양성 대조군으로서 사용될 수 있는, 표지된 또는 표지되지 않은 항원의 적절히 등분된(aliquored) 조성물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는, 그 형태를 불문하고, 일반적으로, 생물제가 들어 있는, 및 바람직하게는 생물제가 적절히 등분되어 있는 하나 이상의 용기를 포함할 것이다. 이 키트의 성분들은 수성 매체 중에 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다.
본 발명의 면역검출 키트는 필요에 따라 부가적으로 하나 이상의 다양한 암(cancer) 표지 항체 또는 항원을 함유할 수 있다. 이러한 키트는 다양한 환자를 시험하는데 더 유용한 암 표지의 패널(panel)을 제공할 수 있다. 이러한 부가적인 표지의 예로는 p53, 사이클린 D1, p16, 티로시나제, MAGE, BAGE, PAGE, MUC18, CEA, p27,[bgr]HCG 뿐만 아니라 PAS, SeLe(X), HCG와 같은 다른 종양 표지들 또는 당업자에게 알려져 있는 다른 표지들을 들 수 있다.
키트의 용기들은, 일반적으로, 항체 또는 항원이 들어 있거나 바람직하게는 적절하게 등분되어 있는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 또는 주사기 또는 다른 용기를 포함할 것이다. 2차 또는 3차 결합 배위자(binding ligand) 또는 부가적인 성분이 제공될 경우, 이 키트는 일반적으로 이 배위자 또는 성분을 담을 수 있는 제2의, 제3의 또는 다른 부가적인 용기들을 또한 함유할 것이다.
본 발명의 키트는, 전형적으로, 상업적 판매를 위해 기밀된, 항체, 항원 및 , 다른 시약 용기들을 담기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기들로는 소망 바이알이 보유되는, 사출 또는 블로우 성형된 플라스틱 용기들을 들 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 EGFR 변이형의 키나제 활성을 간섭하는 화합물의 동정을 포괄한다. 변이체 EGFR은 그 키나제 도메인에 적어도 하나의 변이를 포함한다. 예를 들어 이러한 화합물은 티로신 키나제 저해제이다. 수용체의 키나제 활성을 간섭하는 화합물을 동정하는 방법들은 당업자에게 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들면 본 명세서에 참고문헌으로서 편입되는 Dhanabal et al., Cancer Res. 59:189-197(1999); Xin et al., J. Biol . Chem. 274:9116-9121(1999); Sheu et al., AntiCancer Res. 18:4435-4441; Ausprunk et al., Dev . Biol. 38:237-248(1974); Gimbrone et al., J. Natl . cancer Inst. 52:413-427; Nicosia et al., In vitro 18:538-549에 더 기술되어 있다. 일반적으로, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 적어도 하나의 변이의 증가된 키나제 활성 특성을 간섭하는 화합물은 여기 개시된 방법을 이용하여 동정된다.
고체 지지체( Solid Support )
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 실행하기 위해 키트를 제공한다. 하나의 태양에서는, 고체 지지체 상의 erbB1 유전자의 키나제 도메인내에서의 변이를 검출하기 위한 키트를 기재한다. 상기 키트는, 예를 들면, 하나의 측정법(assay)으로 복수의 변이를 검출하기 위한 재료 및 시약을 포함한다. 상기 키트는, 예를 들면, 고체 지지체, 특정세트의 표적 폴리누클레오티드용 올리고누클레오티드 프라이머, 중합효소연쇄반응(PCR) 시약 및 구성성분, 예를 들면, DNA 합성 효소, 표지 물질, 및 기타 완충액 및 세정용 시약을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 고체 지지체 상에서 특이적 표적을 증폭시키기 위한 키트 사용 설명서를 포함할 수 있다. 상기 키트가, 예를 들면, 표적 폴리누클레오티드의 특정 세트를 증폭시키기 위해서, 고체 지지체상에 이미 고정된 프라이머 세트를 갖도록 제조된 고체 지지체를 포함하는 경우에는, 이러한 제조된 고체 지지체의 설계 및 구성은 상기에 기재한 바와 같다. 또한, 상기 키트는, 예를 들면, 상기 지지체가 in - situ 타입 PCR 기기를 사용하여 PCR 증폭을 할 수 있는 경우에 in - situ 타입 또는 고체상 타입 PCR 공정을 이용하여, PCR을 수행하는데 필요한 시약을 포함한다. 상기 키트에 포함된 PCR 시약은 범용 PCR 완충액, 열안정성 폴리머라제(예, Taq 폴리머라제), 누클레오티드(예, dNTPs), 및 다른 구성성분 및 표지 분자(예를 들면, 상기한 바와 같은 직접 또는 간접 표지용)를 포함한다. 상기 키트는 고정된 프라이머(immobilized primer)를 단독으로 또는, 필요에 따라서, 용액상 프라이머(solution phase primer)와 함께 사용하는 PCR 증폭법의 실행을 지지하기 위해 조립(assemble)될 수 있다.
필요에 따라서, 상기 키트는 많은 EGFR 변이에 특이적인 올리고누클레오티드가 부착된(affixed) 고체 지지체를 포함할 수 있으며, 이는 도 4A-4C 및 도 7 및 8에 나타내었다. 시험의 생물학적 시료는, erbB1의 키나제 도메인내의 변이의 존재 또는 부재를 결정하기 위해, 선택적 혼성화 조건 하에서, 고체 지지체에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 변이형 EGFR의 키타제 활성을 저해하는 화합물의 동정을 포함한다. 상기 EGFR 변이체는 그 키나제 도메인내에 적어도 하나의 변이를 포함한다. 그러나, 다른 태양에서는, 상기 EGFR 변이체는 제1 TKI, 예를 들면, 제피티니브 또는 에를로티니브에 저항성을 부여하는 2차 돌연변이를 포함한다. 이러한 화합물은, 예를 들면, 티로신 키나제 저해제일 수 있다. 수용체의 키나제 활성을 저해하는 화합물을 동정하는 방법은 당업자에게 일반적으로 알려져 있으며, 또한 예를 들면, 본 명세서 중에 참고로 기재한 Dhanabal et al., Cancer Res. 59:189-197(1999); Xin et al., J. Bio . Chem. 274:9116-9121(1999); Sheu et al., Anticancer Res. 18:4435-4441; Ausprunk et al., Dev . Biol. 38:237-248(1974); Gimbrone et al., J. Natl . Cancer Inst. 52:413-427; Nicosia et al., In vitro 18:537-549에 기재되어 있다. erbB1 유전자의 키나제 도메인내에 존재하는 적어도 하나의 변이의 특징적인 증강된 키나제 활성을 저해하는 화합물은, 통상, 본 명세서 중에 개시한 방법을 사용하여, 동정된다.
동정 즉시, 이 화합물들은 EGFR 표적 치료를 필요로 하는 환자, 예를 들면 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자에게 투여된다.
상기 투여 경로는 정맥내(I.V.), 근육내(I.M.), 피하(S.C.), 진피내(I.D.), 복막내(I.P.), 경막내(I.T.), 흉막내, 자궁내, 직장, 질내, 국소, 종양내 등일 수 있다. 본 발명의 화합물은 주사 또는 여러시간에 걸친 점진적인 주입에 의해 비경구적으로 투여할 수 있으며, 연동운동 수단(peristaltic means)에 의해서 전달할 수도 있다.
투여는 경점막 또는 경피 수단에 의해서도 가능하다. 경점막 또는 경피 투여하기 위해서는, 침투할 장벽에 적합한 침투제가 제제(formulation)에 사용된다. 이러한 침투제는 당업자에게 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들면, 경점막 투여용 담즙염 및 푸시딘산 유도체를 들 수 있다. 또한, 계면활성제(detergent)는 침투를 촉진시키기 위해서 사용할 수 있다. 경점막 투여는 비강 스프레이, 또는, 예를 들면, 좌약을 사용하여 행할 수 있다. 경구투여를 위해, 본 발명의 화합물은 캡슐, 정제(tablet) 및 강장제(tonic) 등의 종래의 경구 투여 형태로 제제화된다.
국소 투여를 위해, 본 발명의 약제학적 조성물(키나제 활성 저해제)은 일반적으로 당업계에서 공지된 바와 같이, 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제제화된다.
본 발명의 치료 조성물은, 예를 들면, 단위 투여량의 주입에 의해, 통상 정맥내 투여된다. 본 발명의 치료 조성물에 관련하여 사용된 경우 "단위 투여량(unit dose)"은 피험자에 대한 단위 투여(unitary dosage)로서 적합한, 물리적으로 구별되는 단위를 말하며, 각 단위는 필요한 희석제(즉, 담체 또는 수송체(vehicle))와 함께, 원하는 치료 효과를 얻을 수 있도록 계산된 소정량의 활성 물질을 포함한다.
상기 조성물은 상기 투여 제제와 양립할 수 있는 방식으로, 치료 유효량으로 투여된다. 투여할 양과 시점은 치료받을 피험자, 활성 성분을 이용할 수 있는 피험자의 시스템의 능력, 및 원하는 치료 효과의 정도에 따라 다르다. 투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 진료의의 판단에 따라 다르며 각 개체마다 상이하다.
본 발명의 방법을 실행하는데 유용한 티로신 키나제 저해제는 본 명세서 중에 기재되어 있다. 의도한 용도에 적합한, 활성 성분을 함유하는 어떠한 제제 또는 약제 전달 시스템은, 당업자에게 일반적으로 공지되어 있는 바에 따라, 사용할 수 있다. 경구투여, 직장투여, 국소투여 또는 비경구 투여용(흡입, 피하, 복막내, 근육내 및 정맥내 투여를 포함함)으로 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업자에게 공지되어 있다. 상기 담체는 제제의 다른 성분과 양립되고 피험자에게 해를 끼치지 않는다는 의미에서 약제학적으로 허용가능한 것이어야 한다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)", "생리적으로 허용가능한(physiologically tolerable)" 및 그들의 문법적인 변화 어구는 서로 호환하여 사용하며, 그 재료가 바람직하지 못한 생리학적 효과를 유발하지 않고 포유동물에 투여할 수 있음을 나타낸다.
비경구적인 투여에 적합한 제제로는, 적합하게는, 피험자의 혈액과 바람직하게는 등장인, 활성 화합물의 살균된 수성 약제를 들 수 있다. 따라서, 이러한 제제는, 적합하게는, 멸균수, 5% 덱스트로스 멸균수 또는 식염수(saline)를 포함할 수 있다. 또한, 유용한 제제로는, 적당한 용제로 희석시 비경구 투여용으로 적합 한 용액으로 되는 화합물을 함유하는 농축 용액 또는 고체를 들 수 있다.
소화관내(enteral) 투여를 위해서는, 화합물을 캡슐, 교갑(cachet), 정제(tablet) 또는 마름모꼴 정제(lozenge) 등의 개별 단위의 불활성 담체에 삽입할 수 있으며, 각 담체는 소정량의 활성 화합물을 분말 또는 과립, 또는 수성액 또는 비수성액의 현탁액 또는 용액(예, 시럽, 엘릭시르(elixir), 에멀션 또는 드래프트(draught))으로서 함유한다. 적합한 담체로는 전분 또는 당류를 들 수 있으며, 윤활제, 향료, 바인더, 및 기타 천연 물질을 포함할 수 있다.
정제는, 필요에 따라, 하나 이상의 보조 성분을 포함하여, 압축 또는 성형에 의해 제조할 수 있다. 압축 정제는 자유-유동 형태(예, 분말 또는 과립)의 활성 화합물을, 필요에 따라, 보조 성분(예, 바인더, 윤활제, 불활성 희석제, 표면 활성 또는 분산제)과 혼합하여, 적합한 기계로 압축하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 분말상 활성 화합물과 적합한 담체의 혼합물을 적합한 기계로 성형하여 제조할 수 있다.
시럽 또는 현탁액은 당(예, 슈크로스)의 농축된 수성 용액에 활성 화합물을 첨가하여 제조할 수 있으며, 보조 성분을 더 첨가해도 좋다. 이러한 보조성분으로는 향료, 당 결정화 방지제, 또는 다른 성분의 용해도를 증가시키는 약제(예, 글리세롤 또는 소르비톨 등의 다가알콜)를 들 수 있다.
직장 투여용 제제는 좌약의 주재료(base)로서 종래의 담체, 예를 들면, 코코아 버터 또는 Witepsol S55TM(Dynamite Nobel Chemical, Germany)를 함유한, 좌약 형태로서 존재할 수 있다.
경구 투여용 제제는 증강제를 함유해도 좋다. 경구적으로 허용가능한 흡수 증강제로는 소디움라우릴설페이트, 팔미토일 카르니틴, 라우레스-9, 포스파티딜콜린, 시클로덱스트린 및 그 유도체 등의 계면활성제; 소디움 데옥시콜레이트, 소디움 타우로콜레이트, 및 소디움 푸시데이트 등의 담즙염; EDTA, 시트르산 및 살리실레이트 등의 킬레이트제; 및 올레산, 라우르산, 아실카르니틴, 모노 및 디글리세라이드 등의 지방산을 들 수 있다. 기타 경구 흡수 증강제로는 염화벤잘코늄, 염화벤즈에토늄, CHAPS(3-(3-콜아미도프로필)-디메틸암모니오-1-프로판설포네이트), Big-CHAPS(N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)-콜아미드), 클로로부탄올, 옥톡시놀-9, 벤질알콜, 페놀, 크레졸, 및 알킬알콜을 들 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 경구 흡수 증강제는 소디움라우릴설페이트이다.
필요에 따라, 상기 화합물은 리포솜(liposome) 또는 미소구체(microsphere) (또는 미세입자(microparticle)) 형태로 투여해도 좋다. 환자 투여용 리포솜 및 미소구체를 제조하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 미국 특허번호 4,789,734에 리포솜내에 생물학적 물질을 캡슐화하는 방법이 참고로 기재되어 있다. 특히, 상기 물질은 수성 용액에 용해되어 있으며, 필요에 따라, 계면활성제와 함께 적합한 인지질 및 지질이 첨가되며, 상기 물질은, 필요에 따라, 투석 또는 초음파 처리된다. 공지의 방법의 재검토는 G. Gregoriadis, Chapter 14, "리포솜" Drug Carries in Biology and Madicine, pp. 287-341(Academic Press, 1979)에 의해 제공된다.
폴리머 또는 단백질로 형성된 미소구체는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 위장관 경로를 통해 직접 혈류로 통과하도록 맞춰질 수 있다. 필요에 따라, 상기 화합물은 미소구체, 또는 미소구체 복합체에 삽입할 수 있으며, 수일에서 수개월간에 걸쳐 천천히 방출되도록 이식(implant)할 수 있다(참고, 미국 특허번호 4,906,474, 4,926,673 및 3,625,214, 및 Jein, TIPS 19:155-157(1998)).
하나의 태양에서, 본 발명의 티로신 키나제 저해제는, 정맥내 투여 후 모세혈관상에서 머무르기에 적합한 사이즈로 한 리포솜 또는 미세입자내로 제제화시킬 수 있다. 상기 리포솜 또는 미세입자가 허혈조직(ischemic tissue) 주변의 모세혈관상에 머무르면, 상기 약제는 그들이 가장 유효할 수 있는 부위에 국소적으로 투여될 수 있다. 허혈조직을 표적으로 하는 적합한 리포솜은 통상 약 200나노미터보다 작고, 또한 일반적으로 단층소포체(unilamella vesicles)이다(참고, 예를 들면, Baldeschweiler에 의한 "Liposomal targeting of ischemic tissue"의 제목의 미국 특허번호 5,593,688에 기재).
바람직한 미세입자는 폴리글리콜라이드, 폴리락티드 및 그들의 공중합체 등의 생분해성 폴리머로 제조한 것이다. 당업자는 원하는 약제 방출 속도 및 원하는 투여량을 포함한 각종 인자에 따라 적합한 담체 시스템을 쉽게 결정할 수 있다.
하나의 태양에서, 상기 제제는 카테터(catheter)를 통해서 직접 혈관 내부에 투여된다. 이 투여는, 예를 들면, 카테터내의 구멍을 통해서 일어날 수 있다. 활성 화합물이 비교적 긴 반감기(약 1일∼1주일)를 가진 태양에서는, 상기 제제는 미국 특허번호 5,410,016에 Hubbell et al.이 개시한 바와 같은, 생분해성 고분자 히 드로겔에 포함될 수 있다. 이 고분자 히드로겔은 조직 루멘의 내부에 전달되어, 상기 폴리머의 분해에 따라 경시적으로 상기 활성 화합물을 방출된다. 원한다면, 상기 고분자 히드로겔은 그 내부에 활성 화합물이 분산된 미세입자 또는 리포솜을 가짐으로써, 활성 화합물의 제어 방출에 대한 또다른 메카니즘을 제공할 수 있다.
상기 제제는, 적합하게는, 단위 투여 형태로 존재할 수 있으며, 제약학 분야의 당업자에게 공지된 방법 중 어느 하나로 제조할 수 있다. 모든 방법은 하나 이상의 보조성분을 구성하는 담체와 활성 화합물을 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 제제는 활성 화합물과 액체 담체 또는 미세하게 쪼개진 고체 담체를 균일하게 잘 혼합함에 의해 제조하고, 그 후, 필요에 따라, 생성물을 원하는 단위 투여 형태로 형상화한다.
상기 제제는 종래의 약제학적 제제에 이용되던 하나 이상의 부가적인 보조성분(예, 희석제, 완충액, 향료, 바인더, 표면 활성화제, 점증제, 윤활제, 현탁용제, 보존제(항산화제 포함) 등)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 화합물은, 호흡기도 투여용으로, 스너프(snuff) 또는 분무기용 에어로졸 또는 용액으로서, 또는 흡입용 미세 분말로서, 단독으로 또는 락토스 등의 불활성 담체와 조합하여 제공될 수 있다. 이러한 경우에 활성 화합물의 입자는 적합하게는 50마이크론 미만의 직경을 갖고, 바람직하게는 10마이크론 미만, 더 바람직하게는 2∼5마이크론의 직경을 갖는다.
통상, 비강 투여용으로는 약산의 pH가 바람직하다. 본 발명의 조성물의 pH로는 약 2∼5가 바람직하고, 약 pH 3.5∼3.9가 더 바람직하고, pH 3.7이 가장 바 람직하다. pH의 조정은 염산 등의 적당한 산을 첨가하여 행한다.
그 내부에 용해 또는 분산된 활성 성분을 함유하는 약리학적 조성물의 제조는 당업계에 잘 알려져 있으며, 제제화에 의거하여 제한할 필요는 없다. 일반적으로 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액의 어느 하나로서 주입할 수 있도록 제조되지만, 사용하기 전에 용액 또는 현탁액으로 하기에 적합한 고체 형태로 제조할 수도 있다. 상기 제제는 유상으로 제조할 수도 있다.
상기 활성 성분은, 약제학적으로 허용가능하고 활성 성분과 양립할 수 있는 부형제(excipient)와, 본 발명의 치료법에 사용하기 적합한 양으로 혼합할 수 있다. 적합한 부형제로는, 예를 들면, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 그들의 조합물이 있다. 또한, 필요에 따라, 상기 조성물은 흡습제 또는 유화제, pH 완충제 등 활성성분의 유효성을 증강시키는 소량의 보조성분(auxiliary substance)을 함유할 수 있다.
본 발명의 키나제 저해제는 그 안에 약제학적으로 허용가능한 구성성분의 염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염으로는, 예를 들면, 염산 또는 인산 등의 무기산, 또는 아세트산, 타르타르산, 만델릭산 등의 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt)(폴리펩티드의 유리 아미노기로 형성됨)을 들 수 있다. 또한, 유리 카르복실기로 형성된 염은, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철 등의 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등의 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
생리학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 잘 알려져 있다. 액체 담체의 예 로는, 상기 활성 성분 및 물 외에는 어떠한 재료도 함유하지 않는 멸균 수성 용액, 또는 생리학적 pH 값의 인산나트륨, 인산염-완충 식염수 등의 생리학적 식염수 또는 둘다 등 완충액을 함유하는 멸균 수성 용액이 있다. 또한, 수성 담체는 하나 이상의 완충액 염은 물론, 염화나트륨 및 염화칼륨 등의 염류, 덱스트로스, 폴리에틸렌글리콜 및 기타 용질(solute)을 함유할 수 있다.
또한, 액체 조성물은 물을 제외하고도 액상(liquid phase)을 더 함유할 수 있다. 이러한 부가적인 액상의 예로는 글리세린, 면실유 등의 식물성 오일, 및 물-오일 에멀션이 있다.
돌연변이 예측
또 다른 태양에서, 본 발명은 티로신 키나제 저해제로 치료한 후 erbB1 유전자에 존재하는 변이를 예측하는 방법을 개시한다. 티로신 키나제에 의한 항암치료에 대한 반응 결과, 종종 그 화합물 또는 다른 유사 화합물에 대한 내성이 생긴다는 것은 일반적으로 공지된 사실이다. 이러한 내성은 약제 표적, 예를 들면, EGFR 내에서의 돌연변이의 획득을 통해 생기는 것으로 생각된다. 이러한 돌연변이 예측(및 선별) 능력은 더 나은 치료 옵션 및 더 낮은 재발을 참작해야한다.
본 발명의 하나의 태양에서는, 제피티니브(또는 유사한 EGFR 표적 치료제)에 반응하였으나 뒤이어 재발한 암환자의 종양 시료로부터, EGFR 키나제 도메인을 코딩하는 DNA를 단리하여 염기서열을 분석한다. 이러한 환자들에서의 재발은 EGFR 키나제 도메인내에서의 2차 돌연변이의 획득을 내포하는 것으로 예상된다. 그 다 음, 본 발명에 개시한 방법을 사용하여, 이러한 새롭게 규정된 돌연변이를 표적으로 하며 그 키나제 활성을 저해하는 화합물을 동정한다. 이러한 화합물은 단독으로 또는 다른 공지의 EGFR 표적 치료제와 조합하여, EGFR 키나제 도메인에 1차 또는 2차(상기와 같은) 돌연변이를 가진 환자의 치료에 사용할 수 있다.
하나의 태양에서는, 시험관내(in vitro)에서, EGFR 키나제(촉매) 도메인내에 존재하는 변이를 예측한다. 이 방법에서는, 인간 암 세포주에서 동정된 키나제 도메인 돌연변이를 포함하는 cDNA로, 세포(예, 섬유아세포)를 안정적으로 트랜스펙션시킨다. 예를 들면, 상기 세포는 도 4A에 기재된 바와 같은 서열번호 495 등의 돌연변이를 보유하고 있는 EGFR에 의해, 또는 다수의 동정 또는 미동정 키나제 도메인-변이 EGFR에 의해 트랜스펙션시킬 수 있다. 키나제 도메인-변이 EGFR로 세포를 트랜스펙션시키면, 배양시 세포의 비정상적인 증식이 일어날 것이다. 안정한 트랜스펙션 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 또한 본 명세서에 참고로 기재한, Current Protocols in Molecular Biololgy(F. M. Ausubel, R Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, K. Struhl 및 V. B. Chanda(편집), John Wiley & Sons., 2004)에 규정되어 있다. 그 다음, 상기 트랜스펙트된 세포에, 세포증식을 저해할 것으로 예상되는 약제, 바람직하게는 티로신 키나제 저해제를 준치사량의 유효 투여량으로 투여한다. 바람직한 태양에서는, 상기 약제는 아닐리노퀴나졸린, 합성 아닐리노퀴나졸린, 제피티니브 또는 에를로티니브이다. 상기 세포를 약제의 존재 하에 연속적으로 배양하여(passage), 생존한 서브클론을 선별한다. 많은 세대를 거쳐서 생존한 세포(즉, 화합물에 내성이 있는 세포)에 대해서, erbB1 유전자에 존재하는 변이에 대한 선별 및 분석을 행한다. 그 결과, 2차 돌연변이는, 생체내(in vivo)에서 티로신 키나제 저해제로 반복 치료한 후에 일어나는 것으로 예측할 수 있다.
필요에 따라서, 세포를, 인간 NSCLC 세포주(예, NCI-1650 및 NCI-1975) 유래의 제피티니브 내성 돌연변이 cDNA로 트랜스펙션시킨다. 각 세포주는 EGFR의 키나제 도메인내에 이형접합성 돌연변이를 가지고 있으므로, 제피티니브에 대해 민감성일 것으로 예측된다. 상기 NCI-1650에서의 EGFR 돌연변이는 엑손 19의 2235-2249 위치에서의 15개의 누클레오티드의 인프레임 결실(in-frame deletion)(delLE746-A750)에 의해 이루어지는 한편, NCI-1975는 엑손 21내의 누클레오티드 2573의 T를 G로 치환한 미스센스 돌연변이(L858R)를 갖는다. 여기서 나타낸 바와 같이, NCI-H1975에서의 상기 L858R 돌연변이는 활성화하여, 시험관내에서 제피티니브에 대한 증가된 민감성을 부여한다. EGFR 키나제 도메인 돌연변이를 보유하고 있는 다른 암 세포주를 이용할 수도 있다. 상기 암 세포주로는 폐암은 물론 이러한 돌연변이를 보유하는 것으로 알려진 다른 암을 들 수 있다.
상기 세포는 세포의 2차 돌연변이 획득 빈도를 증가시키기 위해서 돌연변이원(mutagen)으로 처리해도 좋다. 돌연변이원은 투여량 처방, 전달 모드, 및 돌연변이원 투여 시의 유기체 또는 세포의 발육 단계에 따라 다른 빈도로 돌연변이를 유발할 수 있으며, 이 모든 파라미터는 다른 돌연변이원 또는 돌연변이유발 기술에 대한 종래 기술에 개시되어 있다. 상기 돌연변이원은 에틸메탄설포네이트(EMS), N-에틸-N-니트로소우레아(MNU) 등의 알킬화제일 수 있다. 필요에 따라서, 상기 돌 연변이원은, 예를 들면, 포카르박신 히드로클로라이드(Prc), 메틸메탄설포네이트(MeMS), 클로르암부실(Chl), 멜팔란, 포르카르바진 히드로클로라이드, 시클로포스파미드(Cp), 디에틸설페이트(Et2SO4), 아크릴아미드 모노머(AA), 트리에틸렌 멜라민(TEM), 니트로겐 머스타드, 빈크리스틴, 디메틸니트로소아민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘(MNNG), 7,12-디메틸벤즈안트라센(DMBA), 에틸렌옥사이드, 헥사메틸포스포아미드, 비설판, 및 에틸메탄설포네이트(EtMs)일 수 있다.
돌연변이원으로 세포를 처치하는 방법은, 본 명세서에 참고로 기재한, 예를 들면, 미국특허 6,015,670에 기재되어 있다. 돌연변이유발 후, 세포(즉, EGFR 변이체로 트랜스펙트된 세포, 또는 인간 암 세포주 유래의 세포)를 제피티니브 보충 배지에서 배양하여, 성장한 내성 클론을 선별한다. 개개의 클론을 계대배양한 후, 예를 들면, EGFR 키나제 도메인에 대응하는 게놈 DNA를 특이적 PCR-매개 증폭하여, 그 EGFR 유전자의 누클레오티드 염기서열을 결정한다.
또 다른 태양에서는, 제피티니브 내성을 부여하는, EGFR 유전자내의 자발적으로 획득된 돌연변이를 선별하기 위해서, 세포(EGFR 변이를 가진 세포)를 제피티니브(또는 유사한 티로신 키나제 저해제)의 농도를 점차 증가시킨 배지에서 수주 또는 수개월에 걸쳐 연속 배양한다. 선별된 세포(상대적으로 높은 제피티니브 농도에서 지속적으로 증식한 세포)는 콜로니로서 단리할 수 있으며, 돌연변이는 상기와 같이 동정할 수 있다. 따라서, 이러한 변이는 생체내에서 티로신 키나제 저해제로 반복하여 처리한 후에 발생하는 것으로 예상할 수 있다(참조, Scappini et al., Cancer, April 1, 2004, Vol. 100, pg.1459.)
또 다른 태양에서, EGFR 유전자의 변이형은 그것을 안정하게 선별된 세포주에 재도입하기 전에 DNA 수복-결핍 박테리아 균주(DNA repair-deficient bacterial strain)내에서 증식시킬 수 있다. 이러한 박테리아에서의 복제는 돌연변이유발 빈도를 증가시킨다. 필요에 따라서, "오류가 일어나기 쉬운(error-prone)" PCR을 이용하여, 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여, 시험관내에서 상기 클로닝된 EGFR DNA의 돌연변이 빈도를 증가시킬 수 있다.
또 다른 태양에서는, 생체내(in vivo)에서, erbB1 유전자의 키나제 도메인내에 존재하는 변이를 예측한다. 예를 들면, 키나제 활성이 증가한 erbB1 유전자의 변이형을, 암 모델이 되는 동물(즉, 마우스)에 트랜스펙션시킨다. 그 다음, 상기 동물에, 화합물, 바람직하게는 아닐리노퀴나졸린, 합성 아닐리노퀴나졸린, 제피티니브 또는 에를로티니브를 유효 투여량으로 투여한다. 상기 화합물에 반복 노출시켰을 때, 상기 암은 처음에는 저해된다. 이러한 화합물로 치료한 인간에서와 마찬가지로, 동물에서의 종양 세포도 이러한 치료에 내성을 부여하는 돌연변이를 획득한다. 본 발명의 방법은 이러한 내성 종양의 erbB1 유전자의 단리 및 특성화를 고려한다. 이러한 새롭게 특성화된 변이를 특이적으로 표적으로 하는 화합물은 이러한 변이된 erbB1 유전자를 보유할 것으로 짐작되는 환자의 치료에 유용하다. 이러한 환자들로는, 예를 들면, 티로신 키나제 저해제에 의한 치료에 초기에는 반응하지만, 그 후에는 동일 또는 유사한 화합물에 대한 반응에 실패한 환자를 들 수 있다.
동물 모델을 만드는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 또한 예를 들면, 본 명세서에 참고로 기재한 Ohashi et al., Cell, 65:305-317(1991); Adams et al., Nature, 325;223-228(1987); 및 Roman et al., Cell, 61:383-396(1990)에 기재되어 있다. 수정된 난모세포의 경우, 바람직한 유전자 도입 방법은 미세주입(microinjection)에 의한 것인 반면(참조, Leder et al., 미국 특허번호 4,736,866 및 5,175,383), 배아줄기(ES)세포 경우의 바람직한 방법은 전기천공법(electroporation)이다. 하지만, 레트로바이러스 감염 등의 바이러스 전달 시스템, 또는 리포솜 융합을 포함한 다른 방법들도 사용할 수 있다. 상기 핵산의 단리 및 특성화는 상기 및 실시예에 기재되어 있다.
상기에 기재한 erbB1 유전자에 존재하는 키나제 활성 증가 변이는, 본 발명의 방법을 사용하여, 환자에서 스크리닝(진단에 의해 또는 예후에 의해)할 수 있다. 또한, 이러한 돌연변이의 존재 또는 부재는 EGFR을 표적으로 하는 화합물(예, 티로신 키나제 저해제)에 의한 치료에 내성을 가진 환자를 결정하기 위한 기준으로서 사용될 수 있다.
생체내 또는 시험관내에서 검출된, 이러한 새롭게 규정된 변이를 특이적으로 표적으로 하는 화합물은 당업자에게 공지된 방법 및 본 명세서에 기재한 방법을 사용하여 선별할 수 있다. 후보 약제 스크리닝법은 EGFR 변이형의 활성을 저해하는 생활성(bioactive) 후보 약제를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 인간 세포에 대한 독성이 낮은 약제에 대한 스크리닝법이 특히 중요하다. 이러한 목적으로, 시험관내에서 표지된 단백질-단백질 결합 측정법, 전기영동 이동성 시프트 측정법, 효소 활성 측정법, 단백질 결합에 대한 면역측정법 등을 포함한 다양한 측정법이 사용될 수 있다. 상기 정제된 돌연변이 EGFR 단백질은, 분자간 상호작용, 전달체 기능 등을 모델링하기 위해 사용될 수 있는 3차원적 결정(crystal) 구조를 결정하기 위해 사용될 수도 있다. 이러한 화합물은, 예를 들면, EGFR의 키나제 활성을 저해하는 티로신 키나제 저해제, 항체, 엡테이머(aptamer), siRNA, 및 벡터일 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 방법에 유용한 화합물은, 단일클론 항체, 사람 키메라 항체, 및 재조합 항체를 포함한, EGFR 변이체를 통하여 키나제 신호전달을 방해하는 항체 및 그들의 단편이며, 이들은 EGFR의 키나제 활성을 저해하는 능력에 의해 특징지어지며 독성이 낮다.
항체의 중화(neutralizing)는, 토끼 또는 마우스 등의 동물에서는, 키나제 도메인에 적어도 하나의 핵산 변이가 존재하는 EGFR로 면역접종(immunization)함으로써 쉽게 일어난다. 면역접종한 마우스는, 대량의 항-EGFR 단일클론 항체를 생성하기 위해 배양되는, 하이브리도마(hybridoma) 제조용 B세포의 근원(source)을 제공하는데 특히 유용하다. 키메라 항체(chimeric antibody)는 다른 동물 종으로부터 유래하는 2개 이상의 세그먼트 또는 부분에 의해 특징지어지는 면역글로빈 분자이다. 일반적으로, 상기 키메라 항체의 가변부위(variable region)는 생쥐의 단일클론 항체 등, 인간을 제외한 포유동물의 항체로부터 유래하고, 면역글로빈의 불변부위(constant region)는 인간 면역글로빈 분자에서 유래한다. 바람직하게는, 양 영역 및 상기 조합은 통상적으로 결정되는 바와 같이 낮은 면역원성(immunogenicity)을 갖는다. 인간화 항체(humanized antibody)는 생쥐의 항원 결합 부위는 그대로 유지한 채, 생쥐의 불변부위를 인간의 불변부위로 대체하는 유전공학 기술에 의해 만들어진 면역글로빈 분자이다. 그 결과 얻어진 마우스-인간 키메라 항체는 인간에 있어서 감소된 면역원성과 향상된 약물동태를 가져야 한다. 본 발명의 방법에 유용한, 고친화성 단일클론 항체 및 그들의 키메라 유도체의 바람직한 예는 유럽특허출원 EP 186,833; PCR 특허출원 WO 92/16553; 및 미국특허번호 6,090,923에 기재되어 있다.
상기한 바와 같은, 기존에 존재하는 또는 새롭게 동정된 화합물은 1차 및/또또는 2차 EGFR 돌연변이를 보유하는 환자의 치료에 유용하다.
바람직한 태양에서, 상기 화합물은 키나제 도메인에 적어도 하나의 변이가 존재하는 EGFR의 티로신 키나제 활성 저해제, 특히, 다른 티로신 키나제에 비해서 "변이된(mutated)" EGFR에서 선택적으로 작용하는 소분자 저해제이다.
EGFR의 저해제로는, 특히 제한은 없지만,
PID 153035, 4-(3-클로로아닐리노)퀴나졸린 등의 퀴나졸린류, 피리도피리미딘류, 피리미도피리미딘류, CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706 등의 피롤로피리미딘류, 피라졸로피리미딘류, 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘류(Traxler et al.,(1996) J. Med Chem 39:2285-2292), 쿠르쿠민(디페룰로일메탄)(Laxmin arayana, et al., (1995), Carcinogen 16:1741-1745), 4,5-비스(4-플루오로아닐리노)프탈이미드(Buchdunger et al.(1995) Clin . Cancer Res. 1:813-821; Dinney et al.(1997) Clin . Cancer Res . 3:161-168) 등의 티로신 키나제 저해제;
니트로티오펜 부위(moiety)를 함유하는 타이르포스틴류(tyrphostins) (Brunton et al. (1996) Anti Cancer Drug Design 11:265-296);
프로테인 키나제 저해제 ZD-1839(AstraZeneca);
CP-358774(Pfizer, Inc.);
PD-01 83805(Warner-Lambert), EKB-569(Torrance et al., Nature Medicine, Vol.6, No.9, Sept. 2000, p.1024), HKI-272 및 357(Wyeth); 또는
국제특허출원 WO99/09016(American Cyanamid), WO98/43960(American Cyanamid), WO97/38983(Warender Labert), WO99/06378(Warender Labert), WO99/06396(Warender Labert), WO96/30347(Pfizer, Inc.), WO96/33978(Zeneca), WO96/33977(Zeneca), 및 WO96/33980(Zeneca) 등을 들 수 있다.
또 다른 태양에서는, 안티센스 전략을 사용하여 EGFR 변이체의 키나제 활성을 저해할 수 있다. 이러한 접근법은, 예를 들면, 안티센스 핵산으로 특이적 mRNA를 매스킹(masking)하거나 또는 리보자임으로 절단(cleaving)함으로써, 그 특이적 mRNA의 번역(translation)을 블로킹하는 안티센스 핵산 또는 리보자임을 이용할 수 있다. 안티센스 기술의 일반적인 내용에 대해서는, 예를 들면, Antisense DNA 및 RNA(Cold Spring Harbor Laboratory, D. Melton, ed., 1988)를 참고한다.
변이 EGFR 유전자 전사의 가역적 단시간 저해(reversible short inhibition)도 유용할 수 있다. 이러한 저해는 siRNA를 사용하여 성취할 수 있다. RNA 간섭(RNA interference: RNAi) 기술은 소간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA) 등의 소 RNA 분자를 사용하여 유전자 발현을 방해한다. 이러한 기술은, 이번에는, RNAi가 식물에서 곤충, 포유동물에 이르기까지 많은 살아있는 생물의 대부분의 세 포에서 유전자 발현을 저해(silencing)하는 자연적인 생물학적 메카니즘이라는 사실을 이용한다(McManus et al., Nature Reviews Genetics, 2002, 3(10) p.737). RNAi는, 유전자의 분자 중간체인 mRNA 카피가 파괴되는 것을 보장함으로써, 유전자가 기능적 단백질을 생성하는 것을 방해한다. siRNA는, 하기한 바와 같이, 그 형태 그대로(naked form) 또는 벡터에 도입된 형태로 사용될 수 있다. 또한, 돌연변이 EGFR 유전자 전사를 특이적으로 저해하는 엡테이머(aptamer)를 이용할 수 있다(참고, 예를 들면, 미국특허 6,699,843). 본 발명에 유용한 엡테이머는 SELEX 프로세스를 사용하여 동정할 수 있다(참고, 예를 들면, 미국특허출원 5,707,796, 5,763,177, 6,011,577, 5,580,737, 5,567,588, 및 5,660,985).
"안티센스 핵산" 또는 "안티센스 올리고누클레오티드"는 단일 가닥(single stranded) 핵산 분자로서, 세포질내 조건(cytoplasmic conditions)하에서 RNA 또는 DNA 분자 중의 상보적인 염기와 혼성화 시에 그 상보적인 염기의 역할을 저해한다. 상기 RNA가 mRNA 전사체인 경우, 상기 안티센스 핵산은 상대전사체 (countertranscript)이거나 또는 mRNA를 간섭하는 상보적인 핵산(mRNA-interfering complementary nucleic acid)이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "안티센스"는, 광범위하게, RNA-RNA 상호작용, RNA-DNA 상호작용, 리보자임, RNAi, 엡테이머 및 Rnase-H 매개 정지(Rnase-H mediated arrest)를 포함한다.
리보자임은 DNA 제한 엔도뉴클리아제(restriction endonuclease)와 다소 유사한 방식으로 다른 단일가닥 RNA 분자를 특이적으로 절단할 수 있는 능력을 가진 RNA 분자이다. 리보자임은, 그들 자신의 인트론을 잘라내는 능력을 가진 특정한 mRNA의 관찰에서 발견되었다. 이러한 리보자임의 누클레오티드 염기서열을 수식(modify)함으로써, 연구자들은 RNA 분자 중의 특이적 누클레오티드 염기서열을 인식하여 그들을 절단하는 분자를 설계할 수 있었다(Cech, 1989, Science 245 (4915) p.276). 이들은 염기서열-특이적이기 때문에, 특정 염기서열을 가진 mRNA만을 불활성화시킨다.
안티센스 핵산 분자는 세포내 발현용 재조합 유전자에 의해 코딩될 수 있고(예, 미국 특허번호 5,814,500; U.S.5,811,234), 또는 필요에 따라서 합성하여 제조할 수도 있다(예, 미국 특허번호 5,780,607).
또한, 본 발명은 암에 걸린 환자, 특히, EGFR의 키나제 도메인내에 적어도 하나의 핵산 변이가 존재하는 환자의 치료 방법을 제공한다. 상기 치료법은 적합한 시간창(time window)내에 siRNA-함유 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 siRNA는 화학적으로 합성해도 좋으며, 시험관내 전사(in vitro transcription) 등을 이용하여 생성할 수 있다. 또한, 상기 siRNA 분자는 환자의 종양에서 동정된 돌연변이에 정확하게 대응하는 방식으로 개개의 환자에 맞춰 제작할 수 있다. siRNA는 단지 단일 누클레오티드에 차이가 있는, 누클레오티드 염기서열 간을 구별할 수 있기 때문에, 단일 누클레오티드 치환 또는 수개의 누클레오티드의 소결실 중 어느 하나와 관련된 EGFR 유전자의 변이형(둘다 여기서 기재한 바와 같이 종양에서 동정된 것임)을 특이적으로 표적으로 하는 siRNA를 설계할 수 있다. siRNA는 Brummelkamp et al., Science 296;550-553, 2002; Jaque et al., Nature 418;435-438, 2002; Elbashir S.M. et al.(2001), Nature, 411:494-498; MaCaffrey et al.,(2002), Nature, 418:38-39; Xia H. et al.(2001), Nat . Biotech. 20:1006-1010; Novia et al. (2002), Nat. Med. 8:681-686; 및 미국 특허출원번호 20030198627에 기재되어 있다.
변이된 수용체 및 정상 수용체 둘다를 저해하는 제피티니브 등의 약제의 사용과 관련된, 이러한 치료 전략의 중요한 이점은, 상기 변이된 EGFR에 대해 특이적으로 검출된 siRNA가 야생형 EGFR을 저해하지 않는다는 점이다. 이것은, 설사 및 피부염을 포함한 제피티니브 치료의 "부작용"이, EGFR의 기능이 필요한 정상조직에서의 EGFR 저해 결과로서 일어난다고 일반적으로 알려져 있기 때문에, 중요하다.
siRNA의 종양으로 전달은 현재 이용할 수 있는 유전자 전달 "운반체 (vehicle)" 중 어느 하나를 통해 성취할 수 있다. 이들로는 아데노바이러스, 렌티바이러스, 단순포진 바이러스, 우두 바이러스, 및 레트로바이러스 등의 바이러스 벡터 뿐만 아니라, 화학적 매개 유전자 전달 시스템(예, 리포솜), 또는 기계적인 DNA 전달 시스템(DNA guns)을 들 수 있다. 이러한 siRNA-매개 유전자 발현 저해용으로 발현되는 올리고누클레오티드는 길이가 18∼28개인 누클레오티드이다.
또 다른 태양에서, 상기 화합물은 키나제 도메인에 적어도 하나의 변이가 존재하는 EGFR을 코딩하는 인간 염기서열에 특이적인 안티센스 분자이다. 상기 투여 치료제는 안티센스 올리고누클레오티드, 특히, 원래의 핵산으로부터 화학적 수식이 있는 합성 올리고누클레오티드, 또는 그러한 안티센스 분자를 RNA로서 발현하는 핵산 구조체일 수 있다. 상기 안티센스 염기서열은 표적 EGFR 유전자의 mRNA에 상보적이며, 표적 유전자 산물의 발현을 저해한다(참고, Nyce et al. (1997) Nature 385:720). 안티센스 분자는, Rnase H의 활성화 또는 입체장애(steric hinderance)를 통해, 번역(translation)에 유용한 mRNA의 양을 감소시킴으로써, 유전자 발현을 저해한다. 안티센스 분자 한개 또는 조합물이 투여될 수 있으며, 이 안티센스 분자 조합물의 경우, 단일 표적 유전자와는 상이한 다중 염기서열, 또는 여러 상이한 유전자에 상보적인 염기서열을 포함할 수 있다.
바람직한 표적 유전자는 그 키나제 도메인에 적어도 하나의 핵산 변이가 존재하는 EGFR이다. 상기 유전자 염기서열은, 예를 들면, 도 5A-5D 등에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 안티센스 염기서열은 동물 숙주와 동일한 종 기원을 갖는다.
안티센스 분자는 적합한 벡터 중의 표적 유전자 염기서열 전부 또는 일부의 발현에 의해 생성할 수 있으며, 이때, 상기 벡터는 표적 세포에 도입되어 발현된다. 전사 개시는 안티센스 가닥이 RNA 분자로서 생성되도록 맞춰진다.
상기 안티센스 RNA는 내인성 센스 가닥 mRNA와 혼성화하여, 표적 유전자의 발현을 막는다. 상기 원래의 전사 개시 영역, 또는 외인성 전사 개시 영역이 사용될 수 있다. 프로모터(promoter)는 시험관내에서 재조합법에 의해 도입되거나, 또는 상기 염기서열의 염색체로의 상동 삽입(homologous integration)의 결과로서 도입될 수 있다. 근육세포에서 활성이 있는 다수의 강력한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있으며, O-엑틴 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터(early and late promoter), 인간 사이토르네갈로바이러스(cytornegalovirus) 프로모터, 레트로바이러스 LTR 등을 들 수 있다. 전사 벡터는, 일반적으로, 핵산 염기서열의 삽입용으 로 제공되는, 프로모터 서열 부근에 위치한 알맞은 제한 부위(restriction site)를 갖는다. 전사 카세트(cassettes)는 전사개시 부위, 표적 유전자 또는 그들의 단편, 및 전사종결 부위를 포함하도록 제조될 수 있다. 상기 전사 카세트는 플라스미드, 레트로바이러스(예, 렌티바이러스), 아데노바이러스 등의 다양한 벡터에 도입될 수 있으며, 이 벡터들은 세포내에서 일반적으로 적어도 거의 하루동안, 더 일반적으로는 거의 수일동안, 일시적으로 또는 안정적으로 유지될 수 있다.
또한, 엡테이머도 유용하다. 엡테이머는 유망한 새로운 군의 치료 올리고누클레오티드 또는 펩티드이며, 시험관내에서 예를 들면 리간드 수용체 등의 높은 친화성을 가진 소정의 표적과 특이적으로 결합시켜 선별한다. 그들의 결합 특성은 분자내에서 핵염기 쌍을 이룸에 의해 함께 결합되어 3차원 구조를 형성하는 올리고누클레오티드의 능력을 반영한 것이다. 엡테이머는, 정상 및 수식될 수 있는 합성 DNA, RNA 또는 펩티드 서열(예, 펩티드 핵산(PNA), 티오인산화 DNA 등)로서, 표적 단백질 및 리간드(리피드, 탄수화물, 대사산물 등)와 상호작용한다. 다른 태양에서는, EGFR 변이체에 특이적인 RNA 엡테이머를 치료제로서 세포에 도입하여 발현시킬 수 있다.
펩티드 핵산(PNA)은, 어떤 면에서는, 올리고누클레오티드 및 그 유사체와 유사한 화합물이며 따라서 모방(mimic) DNA 및 RNA일 수 있다. PNA에서는, 올리고누클레오티드의 데옥시리보스 골격(backbone)이 슈도-펩티드 골격으로 대체되어 있다(Nielsen et al. 1991 Science 254, 1457-1500). 각 서브유니트, 또는 모노머는 이 골격에 부착된 자연스럽게 발생한 또는 부자연스럽게 발생한 핵염기를 갖는다. 하나의 이러한 골격은 아미드 결합을 통하여 결합된 N-(2-아미노에틸)글리신의 반복 단위로 구성된다. PNA는 왓슨과 크릭의 염기쌍 및 나선구조 형성을 통해 상보적인 핵산과 혼성화한다. 상기 슈도-펩티드 골격은 더 뛰어난 혼성화 특성(Egholm et al., Biochem . Pharmacol.(1993)365, 566-568), 효소 분해에 대한 저항성(Demmidov et al. Biochem . Pharmacol.(1994) 48, 1310-1313) 및 다양한 화학적 수식에 대한 접근로(Nielsen and Haaima Chemical Society Reviews(1997) 73-78)를 제공한다. EGFR 변이체에 특이적인 PNA는 치료제로서 세포에 도입되어 발현될 수 있다.
EGFR 변이체를 표적으로 하는 화합물로 치료할 환자들로는, 예를 들면, EGFR에 1차 또는 2차 돌연변이가 존재하는 것으로 진단된 환자, 티로신 키나제 저해제에 의한 치료에 대해 처음에는 반응하지만 동일 또는 유사 화합물에 의한 후속 치료에 대해서는 반응에 실패한 환자를 들 수 있다. 필요에 따라서, 2차 EGFR 돌연변이를 표적으로 하는 화합물은, 병용치료로서, 1차 EGFR 돌연변이를 표적으로 하는 화합물(예를 들면, 제피티니브)과 함께 암환자에게 투여할 수도 있다. 1차 및 2차 EGFR 돌연변이 둘다를 표적으로 하는 화합물을 병용함으로써, 내성 가능성을 줄일 수 있다.
EGFR 티로신 키나제 저해제인 제피티니브, 에를로티니브 등을 포함한, 현재 공지된 항암치료제에 내성을 부여하는 부가적인 EGFR 돌연변이는 본 발명의 범위에 포함된다.
내성 EGFR 변이체는, 이 키나제 영역에 높은 상동성을 가진 단백질을 포함 한, 관련 티로신 키나제 도메인의 키나제 도메인에서 동정된 돌연변이와 유사한 돌연변이를 갖는 것으로 예상된다. 유사 단백질에서의 돌연변이를 기재하고 있는 논문으로는 BCR-ABL에 관련된 공지의 논문들을 들 수 있다(참조, 예를 들면, Bradford et al. Blood. 2003 Jul 1;102(1):276-83, Epub 2003 Mar 06; Hochhaus et al., Leukemia. 2002 Nov;16(11):2190-6; 및 Al-Ali et al., Hematol J. 2004;5(1):55-60).
공지된 EGFR 티로신 키나제 저해제에 내성이 있는 EGFR 변이체로는, 이미티니브 내성 표현형을 나타내는(confirm) c-able(BCR-ABL) 잔기와 유사한 비야생형 잔기를 하나 이상의 위치에 가진, 어떠한 하나 이상의 EGFR 폴리펩티드 또는 그것을 코딩하는 누클레오티드를 들 수 있다. EGFR에 돌연변이가 일어났을 때 약제 내성을 부여하는 잔기로는 특히, 제한은 없지만, 예를 들면, P-루프 및 활성화 루프 등을 포함한, 키나제 도메인 유래의 잔기를 들 수 있으며, 상기 EGFR 폴리펩티드내의 변이된 잔기는 c-able 잔기와 유사하다. 고려된 내성 EGFR 변이체는 BCR-ABL 중의 적어도 Met 244, Leu 248, Gly 250, Gln 252, Tyr 253, Glu 255, Asp 276, Thr 315, Phe 317, Met 351, Glu 355, Phe 359, His 396, Ser 417, 및 Phe 486의 위치와 유사한 아미노산 위치에 비야생형 잔기를 갖는다(참조, 예를 들면 표 S3C 및 도 9). 이 BCL-ABL 잔기들은 EGFR의 Lys 714, Leu 718, Ser 720, Ala 722, Phe 723, Thr 725, Ala 750, Thr 790, Leu 792, Met 825, Glu 829, Leu 833, His 870, Thr 892, Phe 961 잔기에 각각 대응한다(참조, 예를 들면, 표 S3C, 도 9).
예후 시험( Prognostic Testing )
본 발명의 방법은 암 발병의 예후 지표(prognostic indicator)로 사용된다. 필요에 따라, 본 발명은 존재하지만 아직 진단되지 않은 암 또는 검출할 수 없는 단계의 암을 검출하기 위해 사용된다. 암이 발병할 위험이 있는 환자는, 본 발명의 방법을 이용하여, 키나제 활성이 증가하는 erbB1 유전자내의 핵산 변이의 존재에 대해 스크리닝된다. erbB1 유전자의 키나제 도메인 내에서의 변이의 존재는 암이 존재하거나 또는 곧 생길 것을 나타낸다. 따라서, erbB1 유전자의 키나제 도메인 내에서의 변이의 존재는 환자가 EGFR 표적 치료에 유리함을 나타낸다. 여기서 기재한 바와 같이, EGFR 표적 치료법은 티로신 키나제 저해제에 의한 바람직한 치료법이다.
본 발명의 바람직한 태양에서는, 환자로부터 생물학적 시료를 얻어, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 핵산 변이의 존재 또는 부재에 대해 스크리닝한다. 상기 시료는, 예를 들면, 혀, 입, 뺨, 기관(trachea), 기관지튜브, 폐 등에서 얻은 조직, 또는 가래나 폐흡인액으로부터 얻은 체액을 포함한, 환자로부터 얻은 어떠한 시료일 수 있다. 이러한 생물학적 표본을 얻는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
따라서, 본 발명은, 피험자로부터 시험시료를 얻어 EGFR 변이체 단백질 또는 핵산(mRNA, 게놈 DNA)을 검출하여, EGFR 변이체의 비정상적인 발현 및 활성과 관련된 질병 또는 장애를 동정하는 방법을 제공하며, 이 방법에서, EGFR 변이체 단백질 또는 핵산의 존재는 EGFR 변이체의 발현 또는 활성과 관련된 질병 또는 장애를 가 졌거나 또는 발병할 위험이 있는 피험자에 대한 진단이다. 여기서 사용되는 "시험시료"는 관심있는 피험자로부터 얻은 생물학적 시료이다. 예를 들면, 시험 시료는 생체액(예, 혈청), 세포 시료, 또는 조직, 특히 조직생검 시료일 수 있다.
또한, 본원에서 기재하는 예후 측정법은, EGFR 변이체의 비정상적인 발현 또는 활성과 관련된 질병 또는 장애를 치료하기 위해, 피험자에게 약제(예를 들면, 작용제, 길항제, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 단백질, 펩티드, 핵산, 소분자, 또는 기타 약제 후보)를 투여해야하는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 피험자가 장애에 대해 약제로 효과적으로 치료할 수 있는지의 여부를 결정하는 데 사용된다. 따라서, 본 발명은, 피험자로부터 시험 시료을 얻어서 돌연변이 EGFR 단백질 또는 핵산을 검출함으로써, EGFR 변이체의 비정상적인 발현 및 활성과 관련된 질병에 대하여 약제를 사용하여 효과적으로 치료할 수 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다(예, 돌연변이 EGFR 단백질 또는 핵산이 존재하는 경우, EGFR 변이체의 발현 또는 활성과 관련된 장애를 치료하기 위해 약제를 투여할 수 있는 환자로 진단한다.).
[실시예 1]
종양 표본의 누클레오티드 염기서열분석
IRB에서 승인한 프로토콜 하에, 제피티니브로 후속 치료를 받은 NSCLC를 가진 환자로부터, 초기 진단 또는 외과적 처치로 얻은 종양 표본을 수집(collect)하 였다. 4개의 사례에 대해서는, 대응하는 정상 조직과 함께, 동결(frozen) 종양 표본을 사용할 수 있었고, 나머지 표본에 대해서는 파라핀 포매(paraffin-embedded) 재료를 사용하였다. 또한, 원발성 NSCLC의 25개의 비선별 사례(unselected case)(15개는 기관지폐포암, 7개는 선암종, 3개는 대세포 폐암)는, 대응하는 정상 조직과 함께, 메사추세츠 제너럴 하스피탈 종양 은행(Messachusetts General Hospital tumor bank)으로부터 입수하였다. 전체 EGFR 코딩 서열의 돌연변이를 분석하기 위해, 표본으로부터 DNA를 추출하여, 모두 28개의 엑손을 증폭시킨 다음, 클로닝하지않은 PCR 단편(uncloned PCR fragment)을 자동염기서열분석한 후, 이형접합성 돌연변이의 존재에 대해 센스 및 안티센스 방향 둘다에서의 전기영동도(electropherogram)를 분석하였다. 모든 염기서열 변이체는 다중 독립 PCR 증폭(multiple independent PCR amplification)에 의해 확인하였다. 프라이머 염기서열 및 증폭 조건은 Supplementary Material에서 제공한다. 또한, 엑손 19 및 21에서의 EGFR 돌연변이는, 다양한 세포조직(histology)(하기에 기재함)을 나타내는 78개의 암 유래 세포주 패널과 함께, 유방(15개의 사례), 직장(20개의 사례), 신장(16개의 사례), 및 뇌(4개의 사례)의 원발성 종양에서 찾아내었다.
돌연변이 EGFR 구조체의 기능적 분석( Functional Analysis of Mutant EGFR Constructs )
L858R 및 delL747-P753insS 돌연변이를, 지정부위 돌연변이유발법(site-directed mutagenesis)을 이용하여 전장 EGFR 코딩 서열에 도입하여, 시스토메갈로 바이러스(cytomegalovirus)-유래 발현 구조체(pUSE, Upstate)에 삽입하였다. Cos-7 세포를, 상기 발현 구조체 1㎍을 사용하여 트랜스펙션시킨 다음, 18시간 후, DMEM 결핍 소태아혈청내에서 5×104 세포/웰(12웰 플레이트, Coster)로 재평판배양하였다. 16시간의 혈청기아(serum starvation) 후, 10ng/㎖의 EGF(SIGMA)로 세포를 자극하였다. 제피티니브 저해를 확증하기 위해, EGF 첨가(10ng/㎖의 EGF로 30분 자극) 3시간 전에, 상기 약제를 배양 배지에 첨가하였다. 100㎕의 Laemmli 용해 완충액(lysis buffer)을 사용하여 세포용해물(cell lysate)를 제조한 후, 10% SDS-PAGE 상에서 단백질을 확인(resolution)한 다음, PVDF 막에 전달(transfer)한 후, 증강된 화학발광시약(Amersham)을 사용하여 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 행하였다. EGFR의 자가인산화는 포스포티로신 Y-1068에 대한 항체를 사용하여 측정하고, 필적하는 단백질 발현은 항-EGFR 항체(anti-EGFR antibody)를 사용하여 나타내었다(조작 농도 1:1000; Cell Signaling Technology)
돌연변이 분석
중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction:PCR)을 이용하여, 원발성 종양 조직 또는 종양 유래 세포주로부터 단리한 DNA를 사용하여, EGFR 유전자를 포함하는 28개의 엑손을 증폭시켰다. 사용된 프라이머쌍은 다음과 같다: 엑손 1,
Figure 112006079008015-PCT00001
Figure 112006079008015-PCT00002
Figure 112006079008015-PCT00003
결합(anealing) 온도는 58℃(엑손 1, 3, 4, 7-10, 12-25, 27, 및 28), 56℃(엑손 2, 5, 6, 및 26), 또는 52℃(엑손 11)이었다.
보관 종양 조직(archival tumor tissue)으로부터 추출한 DNA의 네스티드(nested) PCR 증폭은 다음과 같이 수행하였다. 엑손 2, 5, 6, 7, 11, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 및 27에 대한 초기 PCR은 상기한 프라이머 및 조건을 이용하여 행하였다. 이어서, 이 반응액의 2㎕를, 하기의 안쪽(internal) 프라이머쌍을 사용하여 2차 PCR에 의해 증폭시켰다: 엑손 2,
Figure 112006079008015-PCT00004
Figure 112006079008015-PCT00005
나머지 엑손에 대한 네스티드 PCR 증폭은 하기 프라이머를 사용하여 1차 PCR에 의해 수행되었다: 엑손 1,
Figure 112006079008015-PCT00006
2차 PCR 증폭은 하기 프라이머쌍을 사용하여 수행하였다: 엑손 1,
Figure 112006079008015-PCT00007
Figure 112006079008015-PCT00008
엑손 1의 증폭을 위한 결합 온도는 54℃였다. 1차 및 2차 증폭 둘다에서의 결합온도는 58℃(엑손 3, 4, 7-10, 12-17, 19-25, 27, 및 28), 56℃(엑손 2, 5, 6, 및 26), 또는 52℃(엑손 11 및 18)였다.
PCR 엠프리콘(amplicon)은 서열분석하기 전에 엑소누클레아제 I(United States Biochemical, Cleveland, OH), 및 쉬림프 알칼린 포스파타제(United States Biochemical, Cleveland, OH)를 사용하여 정제하였다. 그 다음, 정제된 DNA를 희석하여, ABI BigDye Terminator kit v1.1(ABI, Foster City, CA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 사이클-염기서열분석을 행하였다. 염기서열분석 반응액을 ABI3100 유전자 분석기 상에서 전기영동하였다. 이형접합성 위치를 확인하기 위해 Factura와 Sequence Navigator software를 함께 사용하여, 센스 및 안티센스 양방향으로 돌연변이이의 존재에 대하여 전기영동도를 분석하였다. 모든 염기서열 변이는 다중 독립 PCR 증폭 및 염기서열분석에 의해 확인하였다.
암 유래 세포주( Cancer - Derived Cell Lines ):
14개의 폐암 유래 세포주 패널의 EGFR 돌연변이에 대해 분석하였다. 이들은 NSCLC(N=5), 소세포 폐암(N=6), 선편평상피 세포암(N=1), 기관지 유암종(N=1), 및 알려지지 않은 세포조직(N=1)의 종양으로부터 유래한 것이다. 특이적 세포주는 NCI-H460, NCI-522, HOP-92, NCI-H841, NCI-H734, NCI-H2228, NCI-H596, NCI-H727, NCI-H446, NCI-H1781, NCI-H209, NCI-H510, NCI-H82, NCI-H865 였다. 또한, 64개의 암 유래 세포주가 엑손 19 및 21에서 돌연변이를 갖는 것으로 스크리닝되었다. 이들은 하기의 세포조직을 나타내었다: 유방암(BT549, BT483, UACC893, HS467T, HS578T, MCF7, MCF7-ADR, MDA-MB-15, MDA-MB-175, MDA-MB-231, MDA-MB-415, MDA-MB-436, MDA-MB-453, MDA-MB-468, T47D), 난소암(ES-2, IGROV-1, MDAH2774, OV1063, OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5, SKOV3, SW626), CNS 암류(SF-295, SNB-19, U-251, CCF-STTG1, SW-1088, SW-1783, T98G, M059K, A172, SK-N-DA, SK-N-MC), 백혈병(CCRF-CEM, K562, MOLT-4, RPMI8226, SR), 전립선암(DU-145, PC-3), 직장암(COLO-205, HCT-116, HCT-15, HT-29, SW-620), 신장암(786-O, ACHN, CAKI-1, SN-12C, UO-31), 악성흑색종(LOX-IMVI, M14, SKMEL2, UACC-62), 뼈육종(SAOS-2), 및 머리 및 목암(O11, O13, O19, O28, O22, O29, O12). 상기 머리 및 목암 세포주는 메사추세츠 제너럴 하스파탈/메사추세츠 눈 및 귀 진료소(Massachusetts Eye and Ear Infirmary)의 제임스 로코 박사로부터 제공받았다. 모든 다른 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)(Manassa, VA)를 통해서 얻을 수 있다.
게놈 DNA는 스냅-동결(snap-frozen) 종양 표본으로부터 단리하였다. 종양 표본은 먼저 미리차게해서 살균해둔 막자사발을 사용하여 미세 분말로 파쇄하였다. 파쇄한 종양조직을, 즉시 100mM 염화나트륨, 10mM Tris pH7.5, 25mM EDTA(소디움 에틸렌디아민 테트라아세테이트) pH8.0, 및 0.5%(w/v) 소디움도데실설페이트, 및 100㎍/㎖ 프레쉬 프로테나제 K로 구성된 DNA 추출용액에 옮겨넣고, 37℃에서 하룻밤 배양, 또는 50℃에서 3시간 동안 배양하였다. 그 다음, DNA는 표준 페놀-클로로포름법을 사용하여 추출하여, 에탄올에 침전시킨 후, 70% 에탄올로 세정하여, 풍건한 다음, TE 완충액에 재현탁시켰다. 상기 DNA 농도는 분광광도분석에 의해 결정하였다. 인간 EGFR의 엑손 19 및 21은 하기 프라이머쌍을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다:
엑손 19 센스 프라이머, 5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3'(서열번호 505);
엑손 19 안타센스 프라이머, 5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3'(서열번호 506);
엑손 21 센스 프라이머, 5'-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3'(서열번호 507);
엑손 21 안티센스 프라이머, 5'-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3'(서열번호 508).
각 시료에 대해서, 1X Expand Long Template 완충액 1(Roche, Mannhein Germany), 50μM의 서열분석 등급 dATP(Amersham Biosciences, Cleveland OH), 50μM의 서열분석 등급 dCTP(Amersham Biosciences, Cleveland OH), 50μM의 서열분석 등급 dGTP(Amersham Biosciences, Cleveland OH), 50μM의 서열분석 등급 dTTP(Amersham Biosciences, Cleveland OH), 0.2μM의 센스 프라이머, 0.2μM 안티센스 프라이머, 1/6 용량의 TaqStart 항체(1.1㎍/㎕)와 함께 얼음속에서 5분간 전배양한 1.25 유니트 Expand Long Template 효소 혼합액(Taq DNA 폴리머라제/Tgo DNA 폴리머라제)(Roche, Mannhein Germany), 및 물로 구성된 최종 용량 25㎕의 PCR 반응액에서, 20ng의 게놈 DNA를 증폭시켰다. 또한, 각각의 일련의 증폭반응은 DNA 주형을 뺀 음성 대조군을 포함한다. 양 엑손에 대한 PCR 반응 조건은, MJ-Research PTC-200 또는 PTC-225 thermal-cycler(MJ-Research, Waltham MA) 상에서, 95℃에서 2분간 1주기 반응한 후; 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 및 72℃에서 45초를 1주기로 하여 40주기 반응시킨 다음; 72℃에서 10분간 최종 연장 반응 후, 4℃에서 유지하는 것으로 하였다.
환자 재료로부터의 증폭 및 음성 대조군으로부터의 미증폭을 확인하기 위해, PCR 산물을 0.8% 아가로스 겔상에서 전기영동하여 분석하였다. PCR 산물은 염기서열 분석 전에, 각 PCR 엠프리콘 10㎕와 0.5㎕의 엑소누클레아제 I(10U/㎕)(Amersham Biosciences, Cleveland OH), 및 1㎕의 쉬림프 알칼린 포스파타제(1U/㎕)(Amersham Biosciences, Cleveland OH)를 혼합하고, 37℃에서 20분간 배양한 후, thermal-cycler(MJ-Research, Waltham MA) 상에서 80℃에서 15분 동안 불활성화시켜, 정제하였다. 정제된 DNA는, 상기 엠프리콘의 강도에 따라, 물에 희석시킨 다음, ABI BigDye Terminator kit v1.1(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 사이클-염기서열분석을 수행하였다. 사이클-염기서열분석은 MJ-Research thermal-cycler상에서 하기 사이클링 조건으로 수행하였다: 염기서열 분석용 프라이머는 다음과 같다:
엑손 19 센스 프라이머, 5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3'(서열번호 505);
엑손 19 안티센스 프라이머, 5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3'(서열번호 506);
엑손 21 센스 프라이머, 5'-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3'(서열번호 507) 또는 5'-CGTGGAGAGGCTCAGAGCCTGGCATG-3'(서열번호 687);
엑손 21 안티센스 프라이머, 5'-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3'(서열번호 508).
염기서열분석 반응액은 ABI3100 유전자 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA)상에서 전기영동하였다. Factura 및 Sequence Navigator(Applied Biosystems, Foster City, CA) 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 잠정적인 이형접 합성 위치를 표시하고 그들을 평가 결과를 표시하였다(display). 2차 피크의 높이가 1차 피크의 높이보다 높거나, 또는 동등하거나, 30%인 누클레오티드 위치는 이형접합성으로 표시하였으며, 센스 및 안티센스 판독 둘다를 분석하여 확인하였다. 돌연변이의 존재를 나타내는 서열을 가진 시료는 다시 증폭시킨 후, 확인용 염기서열분석을 행하였다.
엑손 19 및 21에 대한 염기서열분석에 사용된 프라이머의 위치
인트론 프라이머는 소문자로 아래에 줄을 그어서 나타내었다.
인트론 염기서열은 소분자로 나타내었다.
엑손 염기서열은 대문자로 나타내었다.
EGFR 엑손 19(5'-3')(서열번호 641)
Figure 112006079008015-PCT00009
EGFR 엑손 21(5'-3')(서열번호 642) 또는 (서열번호 687)
Figure 112006079008015-PCT00010
결과
제피티니브 반응자의 임상적 특성
메사추세츠 제너럴 하스피탈에서 2000년 이후, 진행성, 화학요법-난치성 NSCLC를 가진 환자는 단일 약제 제피티니브로 치료해왔다. 총 275명의 환자가, FDA에 의해 2003년 5월에 승인받기 전, 동정적 사용의 확장된 접근 프로그램(compassinate use expended access program)의 일부로서 치료받았다. 후에 그 날짜를 시판공급(commercial supply)일로 사용하였다. 이 기간 동안, 25명의 환자가 유의한 임상 반응을 갖는 것으로 임상의에 의해 확인되었다. 유의한 임상 반응은, RECIST 기준을 이용하여 측정가능한 병변을 가진 환자, 또는 이 기준을 이용하여 측정할 수 없는 종양 존재량을 가진 환자에 대해 부분 반응(partial response)으로서 규정하였으며, 평가가능한 반응은 두명의 의사가 평가하였다. 표 1은 초기 진단 시에 얻어진 이용가능한 종양 표본 9개의 사례에 대한 임상 특성을 나타낸다. 나머지 제피티니브 반응자에 대해서는, 조직(tissue)을 이용할 수 없으며, 그 이유 는 대부분 진단 표본이 바늘 흡인액으로부터 얻은 세포검사에 제한되었기 때문이었다. 군(group)으로서, 9명의 환자는 제피티니브로부터 실질적인 이점을 경험하였다. 약물 치료의 개시로부터의 정중 생존율(median survival)은 18개월이 넘었으며, 치료의 정중 지속기간(median duration)은 16개월보다 길었다. 이전 보고서와 마찬가지로, 제피티니브 반응자는 여성, 흡연이력의 부재, 및 기관지폐포 조직을 가진 종양에서 높은 유병율(prevalence)을 갖는다(11, 12). 사례 6은 제피티니브 반응성 코호트(gefitinib-responder cohort)를 나타낸다. 이 환자는 32살 남자로, 흡연이력이 없고, 다발성 뇌 병변 및 오른쪽 폐에 기관지폐포 선암종으로 진단된 병변이 존재하였다. 이 남자는 전체 뇌 방사선요법으로 치료받은 다음, 그 종양이 반응하지 않은 일련의 화학요법(카르보플라틴 및 겜시타빈; 도세탁셀; 비노렐빈)에 의해 치료받았다. 쇠퇴하는 기능 상태 및 진행성 폐암 종양 존재량에 따라서, 1일당 250mg의 제피티니브로 치료를 시작하였다. 그의 숨참이 급속히 개선되었으며, 치료 개시 6주 후, 폐 CT 스캔에서는 도 1에 나타내는 바와 같이 극적인 개선을 나타내었다.
제피티니브 반응자에서의 EGFR 돌연변이
본 발명자들은, 제피티니브에 현저한 반응성을 가진 NSCLC의 사례들은 이들 종양에서 성장인자 신호전달 경로에 의해 필수적인 역할을 하는 것으로 지적된 EGFR에서의 체세포 돌연변이를 보유한다는 가설을 세웠다. 이러한 돌연변이를 찾기 위해, 본 발명자들은 먼저, 신경아교종(glioma) 특성을 가진 EGFR의 세포외 도 메인(extracellular domain)내에서의 재배열(rearrangement)에 대해 시험하였다: 그 결과, 아무것도 검출되지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 개별 엑손의 PCR 증폭을 이용하여 유전자의 전체 코딩 영역의 염기서열을 분석하였다. 9개 중 8개의 사례에서 이형접합성 돌연변이가 확인되었으며, 이들 모두 EGFR의 키나제 도메인내에 군집되어 있었다(표 2 및 도 2). 4개의 종양은 아미노산 746∼750(delE756-A750; 사례 1), 747∼750(delL747-T751insS; 사례 2), 및 747∼752(delL747-P753insS; 사례 3 및 4)를 제거하는 인프레임 결실(in-frame deletion)을 가지고 있었다. 상기 결실 중 후자 2개는 결실 변곡점(deletion breakpoint)에서의 신규 코돈의 생성 결과 일어난, 세린 잔기의 삽입(insertion)과 관련이 있었다. 특히, 이들 4개의 결실은 중첩되어있으며, 모든 사례에서 공유하는 엑손 19내에 4개의 아미노산 결실(류신, 아르기닌, 글루탐산 및 알라닌, 코돈 747∼750)을 가지고 있었다. 또 다른 세개의 종양은 엑손 21에 아미노산 치환을 가지고 있었다: 코돈 858의 류신이 아르기닌으로 치환(L858R; 사례 5 및 6), 코돈 861의 류신을 글루타민으로 치환(L861Q; 사례 7). 상기 L861Q 돌연변이는, 마우스 egfr 유전자에서의 동일한 아미노산의 변화가 다크 스킨(dsk5) 성향의 원인이 되기 때문에, 변경된 EGFR 신호전달(altered EGFR signaling)과 관련하여, 특히 중요하다(18). 키나제 도메인내의 4번째 미스센스 돌연변이는 엑손 18내의 코돈 719의 글리신이 시스테인으로 치환된 것이다(G719C; 사례 8). 사례 1, 4, 5 및 6에 대해서는 대응하는 정상 조직을 이용할 수 있었으며, 이 정상조직은 단지 야생형 염기서열만을 나타내었으며, 이는 종양을 형성하는 동안, 상기 돌연변이가 체세포적으로 일어남을 의미한다. 제피티니브에 대한 응답에 실패한 NSCLC의 7개의 사례에서는 돌연변이가 확인되지 않았다(P=0.0007; 2-면 피셔 정확검증(2-sided Fisher's exact test)).
NSCLC 및 기타 암 종류에서의 특이적 EGFR 돌연변이의 유병율
EGFR 세포외 도메인에 영향을 미치는 재배열에 대해 집중적으로 연구된 신경아교종(gliomas)과 달리(15), NSCLC에서의 EGFR 돌연변이 빈도는 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 발명자들은, 앞선 임상시험에서는 제피티니브 반응성과 관련있었던, 기관지폐포 세포조직을 가진 15개의 사례를 포함하여, 제피티니브 연구와 관련없는 NSCLC의 25개의 1차 사례들에 대해 유전자의 전체 코딩 영역의 염기서열을 분석하였다(11,12). 이형접합성 돌연변이는 두개의 기관지폐포암에서 검출되었다. 두 사례는 제피티니브 반응자에서 발견되었던 것과 동일한 키나제 도메인에서의 인프레임 결실, 즉 delL747-P753insS 및 delE746-A750(표 2)을 가지고 있었다. EGFR 돌연변이의 확실한 군집화(clustering)가 보이면, 총 55개의 원발성 종양 및 78개의 암 유래 세포주의 엑손 19 및 21의 염기서열을 분석하였다(보충 재료 참조). 돌연변이가 검출되지 않은 경우에는, 이들이 암의 서브세트(subset)에서만 일어났음을 암시하며, 이때, EGFR 신호전달은 종양발생에 결정적인 역할을 할 수 있다.
돌연변이 EGFR 단백질의 EGF -유도 활성화 및 제피티니브 저해의 증가
이 돌연변이들에 의해 코딩되는 기능적 특성을 연구하기 위해, L747-S752insS 결실 및 L858R 미스센스 돌연변이를 배양세포에서 발현시켰다. 야생형 및 돌연변이 구조체(construct)의 Cos-7 세포로의 과도 트랜스펙션(transient transfection)은 등가의 발현 수준을 나타내었으며, 이는 상기 돌연변이가 단백질의 안정성에 영향을 미치지 못함을 나타낸다. EGFR 활성화는 수용체 자가인산화의 표지자로서 통상 사용되는 티로신1068잔기의 인산화를 측정함에 의해 정량화하였다(19). 혈청 및 관련 성장인자의 부재 시, 야생형 EGFR이나 돌연변이 EGFR 어느 것도 자가인산화를 나타내지 않았다(도 3a). 그러나, EGF를 첨가하면, 야생형 수용체와 비교하여, 미스센스 및 결실 EGFR 돌연변이 둘다에 대해서는 2~3배 증가된 수용체 활성화가 유도되었다. 또한, 정상 EGFR 활성화는 15분 후에, 수용체 내재화(internalization)와 맞춰, 하향조절(downregulate)된 반면, 상기 두개의 돌연변이 수용체는 3시간까지 활성화가 지속된 것으로 나타났다(도 3a). EGF 첨가 후에 항체로 EGFR 인산화를 측정했을 때 동일한 결과가 얻어졌다(도시하지 않음).
EGFR 키나제 돌연변이 8개 중 7개는, 제피티니브의 표적으로 되는 ATP 틈(cleft) 부근에 존재하기 때문에, 본 발명자들은 상기 돌연변이 단백질이 상기 저해제에 대한 민감성을 변경시켰는지의 여부를 결정하였다. EGF-유도 수용체 자가인산화가 다양한 농도의 제피티니브로 전처리한 세포에서 측정되었다. 특히, 양 돌연변이 수용체는 제피티니브에 의한 저해에 증가된 민감성을 나타내었다. 야생형 EGFR은 0.1μM의 IC50을 가졌으며, 2μM의 제피티니브에서 자가인산화가 완전히 저해된 반면, 상기 두개의 돌연변이 단백질은 0.015μM의 IC50을 가졌으며, 0.2μM에서 자가인산화가 폐기되었다(도 3b). 약물동태 연구에 의하면, 400∼600mg의 제 피티니브를 매일 경구 투여하면 1.1∼1.4μM의 평균 항정상태 최저 혈장농도(mean steady-state trough plasma concentration)로 되지만, 현재 추천되는 250mg의 1일 투여량은 0.4μM의 평균 최저 농도로 됨이 나타나 있으므로, 약제 민감성에 있어서의 상기한 차이는 임상적으로 의미가 있다(20).
[실시예 2]
EGFR의 키나제 도메인내에 돌연변이를 보유하고 있고, 그 결과 제피니티브 치료에 의한 성장 저해에 민감한 종양 세포는 그 키나제 도메인내에서 "두번째 부위(second-site)" 돌연변이가 일어날 수 있으며, 이는 제피티니브에 대한 내성을 부여하는 반면, 야생형 EGFR에 비해 증가된 EGFR 신호전달(signaling)을 나타낸다는 의미에서 여전히 "활성화(activating)" 한다. 이러한 제피티니브 내성 돌연변이는 2개의 산발성(sporadic) 인간 NSCLC 세포주, 즉 NCI-1650 및 NCI-1975로부터 얻는다. 각 세포주는 상기 EGFR의 키나제 도메인을 가진 이형접합성 돌연변이(heterozygous mutation)를 포함하며, 그 결과, 제피티니브에 대해 민감성을 나타낼 것으로 예측된다. NCI-1650에서의 EGFR 돌연변이는 엑손 19내의 2235-2249 위치(delLE746-A750)에서의 15개의 누클레오티드의 인프레임 결실(in-frame deletion)로 이루어지고, 한편 NCI-1975는 엑손 21에 누클레오티드 2573의 T가 G로 치환된 미스센스 돌연변이(L858R)를 갖는다. 여기서 NCI-H1975에서의 L858R 돌연변이는 시험관내에서 활성화 상태이고, 제피티니브에 대한 증가된 민감성을 나타낸다.
NCI-1650 및 NCI-1975 유래의 제피티니브 내성 세포주는, EMS(ethyl methanesulfonate)를 사용하여 무작위로 화학적 돌연변이를 유발한 다음, 제피티니브 보충 배지에 배양하여 증식한 내성 클론(clone)을 선별하여 분리한다. 개개의 클론을 계대배양한 다음, 상기 EGFR 키나제 도메인에 대응하는 게놈 DNA의 특이적 PCR 매개 증폭(specific PCR-mediated amplification)을 행한 후, 그 EGFR 유전자의 누클레오티드 염기서열을 결정한다.
이 방법의 하나의 변화로서, 제피티니브에 대한 내성을 부여하는 EGFR 유전자내에 자연적으로 획득된 돌연변이를 선별하기 위해서, 수주일 또는 수개월에 걸쳐 점차 증가된 농도의 제피티니브의 존재하에, 상기 두 세포주를 연속계대배양하는 것이 포함된다. 선별된 세포(상대적으로 높은 제피티니브 농도에서 지속적으로 증식하는 세포)는 콜로니로서 단리하고, 돌연변이는 상기한 바와 같이 동정하였다.
[실시예 3]
수용체 티로신 키나제의 돌연변이가 NSCLC에서 원인되는 역할(causal role)을 하는지의 여부를 결정하기 위해서, 일본의 나고야 시립대학병원으로부터 얻은 58개의 시료와 메사추세츠주 보스톤의 브리검 여성병원(Brigham and Woman's Hospital)으로부터 얻은 61개의 시료로 이루어지는 119개의 원발성 NSCLC 종양 세트내에서의 체세포 유전자 변화(somatic genetic alteration)을 조사하였다. 상기 종양은, EGFR 키나제 저해제에 의한 치료 기록이 없는 74명의 남성과 45명의 여성으로부터 얻은 70개의 폐선암종(lung adernocarcinoma)과 49개의 다른 NSCLC 종양 을 포함하였다.
초기 스크린으로서, 41개의 폐선암종을 포함한 58개의 NSCLC 시료의 서브세트 유래의 게놈 DNA로부터 얻은 58개의 인간 수용체 티로신 키나제 유전자(*) 중 47개의, 활성화 루프를 코딩하는 엑손을 증폭시켜 염기서열을 분석하였다. 이 종양들 중 3개는, 모두 폐선암종이며, 동일한 환자의 정상 폐조직으로부터 얻은 DNA에서는 존재하지 않는 이형접합성 미스센스 돌연변이가 EGFR에 나타났다(표 S2:S0361, S0388, S0389). 다른 수용체 티로신 키나제 유전자 유래의 엠프리콘(amplicon)에서는 돌연변이가 검출되지 않았다. 세개의 종양 모두 동일한 EGFR 돌연변이를 가졌으며, 858 위치의 류신("L")이 아르기닌("R")으로 변화된것으로 예측하였다(도 6A; CTG→CGG;"L858R"). 여기서 모든 숫자는 인간 EGFR에 관련된 것이다.
다음에, 119개의 NSCLC 종양의 전체 콜렉션내의 EGFR의 엑손 2∼25를 시험하였다. 게놈 DNA의 엑손 염기서열분석 결과, 총 16개의 종양에서 EGFR의 미스센스 및 결실 돌연변이가 확인되었고, 돌연변이는 모두 키나제 도메인의 엑손 18∼21내에 있었다. 이러한 군내에서의 모든 염기서열 변화는 종양 DNA내에서 이형접합성이었으며; 각각의 경우, 동일한 환자로부터 얻은 쌍을 이루는 정상 폐조직은 야생형 염기서열을 나타내었고, 상기 돌연변이는 체세포를 기원으로 함이 확인되었다. 누클레오티드와 단백질 서열 변화의 분포, 및 이들의 비정상성과 관련된 환자의 특성은 표 S2에 요약하여 나타내었다.
치환 돌연변이 G719S 및 L858R은 각각 두개 및 세개의 종양에서 검출되었다. "G719S" 돌연변이는 719 위치의 글리신(G)이 세린(S)으로 변화한다(도 6b). 이 돌연변이들은 각각, 누클레오티드 트리포스페이트 결합 도메인 또는 P-루프의 GXGXXG 모티프(motif)내와, 활성화 루프(52)의 상당히 보존된 DFG 모티프에 인접한 부위에 위치하고 있다(참조, 예를 들면 도 7). 상기 돌연변이가 일어난 잔기들은 모든 단백질 키나제에서 거의 변화하지 않으며, B-Raf 단백질 세린-트레오닌 키나제내의 유사 잔기들(G463 및 L596)은 직장, 난소 및 폐 암종에서 체세포적으로 변이된다(41, 53)(도 6A, 6B).
또한, EGFR의 키나제 도메인내의 코돈 746∼759를 포함하는 영역에 모여있는 다중 결실 돌연변이(multiple deletion mutation)를 검출하였다. 10개의 종양은, 누클레오티드 2235 또는 2236 위치에서 시작하여, EGFR 코돈 746∼750을 제거하는 두개의 중첩된 15-누클레오티드 결실 중의 하나를 보유하고 있었다(Del-1; 도 6C 및 8C; 표 S2). 다른 종양으로부터 얻은 EGFR DNA는 코돈 752∼759의 결실에 의한 이형접합성 24-누클레오티드 갭을 나타내었다(Del-2; 도 6c). 대표적인 크로마토그램(chromatogram)은 도 8a∼8f에 나타낸다.
EGFR 키나제 도메인의 활성 형태의 3차원적 구조(54)내에서의 치환 돌연변이 및 Del-1 결실의 위치는 도 7에 나타낸다. 상기 서열 변화는 상기 키나제의 활성 부위 주변에 군집(cluster)되어 있으며, 상기 치환 돌연변이는 활성화 루프와 글리신이 풍부한 P-루프, 즉 많은 단백질 키나제에서의 자동조절에 중요한 것으로 알려진 구조적인 요소 주변에 위치한다(52).
두개의 다른 종양 종류에서 두개의 부가적인 EGFR 돌연변이가 동정되었다. 즉, 급성 골수성 백혈병(AML)에서는 EGFR 돌연변이 G857V가, 전이성 육종에서는 EGFR 돌연변이 L883S가 동정되었다. 상기 "G857V" 돌연변이는 857 위치의 글리신(G)이 발린(V)으로 치환된 것이며, "L883S" 돌연변이는 883 위치의 류신(L)이 세린(S)로 치환된 것이다. 이러한 발견은, EGFR에서의 돌연변이가 여러 종류의 종양에서 일어나며, 무엇보다는 중요한 것은, EGFR 저해제가 이러한 돌연변이를 가진 환자를 치료함에 있어서 유효함을 암시한다. 이것은 예를 들면 티로신 키나제 저해제인 제피티니브(상표명 이레사(IressaTM)로 시판됨), 에를티니브(상표명 타르세바(TarcevaTM)로 시판됨) 등의 사용, 및 NSCLC 이외의 종양 종류를 치료할 가능성을 확장시킨다.
상기 EGFR 돌연변이는 일본계 및 미국계 환자 집단에서 기재된 상이한 환자 특성과 두드러진 상관 관계를 나타낸다. 상기한 바와 같이, 임상 시험 결과, 일본계 환자에서는 유럽계 우세 집단(predominantly European-derived population)에서보다 더 높은 반응성을 나타내고(27.5% 대 10.4%, in multi-institutional phase II trial); 부분적인 반응은 미국계의 여성, 비흡연자, 및 선암종을 가진 환자에서 더 빈번하게 보이는(49-51) 등의, 티로신 키나제 저해제 제피티니브(상표명 이레사)에 대한 응답에 있어서 유의한 변이성(variability)이 드러났다. EGFR 돌연변이는 다른 NSCLC(1/49 또는 2%)에서 보다 선암종(15/70 또는 21%)에서 더 빈번하게 일어나고; 남성(7/74 또는 9%) 보다는 여성(9/45 또는 20%)에서 더 빈번하게 일어나고; 미국계 환자(1/61 또는 2%, 및 선암종 1/29 또는 3%)보다 일본계 환자(15/58 또는 26%, 및 선암종 14/41 또는 32%)에서 더 빈번하게 일어났다. EGFR 돌연변이의 가장 높은 분율은 선암종을 가진 일본계 여성(8/14 또는 57%)에서 관찰되었다. 특히, EGFR 돌연변이의 존재와 상관관계가 있는 환자의 특성은 제피티니브 치료에 대한 임상적인 응답과 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
EGFR 돌연변이가 제피티니브 민감성의 결정인자 인가를 조사하기 위해서, 제피티니브로 치료하는 동안 응답성으로 나타난 환자 5명과 진행성으로 나타난 환자 4명으로부터 사전치료 NSCLC 시료를 얻었으며, 이 환자들은, 제피티니브의 동정적 약물사용승인 프로그램(expanded access program)상 또는 규제 승인(regulatory approval) 후에 다나-파버 암연구소(Dana-Farber Cancer Institute)에서 치료받은 125명 이상의 환자 중에서 선별하였다. 환자들 중의 4명은 부분적인 방사선 반응성(치료 2달 후 CT 스캔에서 50% 이상의 종양이 퇴행함)을 나타내었고, 5번째 환자는 2달 이내에 현저한 증상 개선을 경험하였다. 모든 환자들은 미국계 백인(Caucasian)이었다.
상기 키나제 도메인(엑손 18∼24)의 염기서열분석 결과, 제피티니브상에서 진행한 종양을 가진 4명의 환자로부터 얻은 종양에서는 돌연변이가 확인되지 않은 반면, 제피티니브 반응성 환자로부터 얻은 5개의 종양은 모두 EGFR 키나제 도메인 돌연변이를 보유하고 있었다. 카이제곱검정(Chi-squared test) 결과, 제피티니브 반응자(5/5)와 무반응자(0/4)간의 EGFR 돌연변이 빈도에 있어서 통계학적으로 유의한 차이(p=0.0027)가 확인된 한편, 제피티니브 반응자와 비선별 미국계 NSCLC 환자 간에도 p<10-12(*)의 유의한 차이가 확인되었다. 한개의 제피티니브 민감성 폐선암종에서는 앞서 비선별 종양에서 관찰된 EGFR L858R 돌연변이가 동정되었다(도 6a; 표 S3A, IR3T). 3개의 제피티니브 민감성 종양은 이형접합성 인프레임 결실을 보유하고 있었으며(도 6c 및 표 S3A 및 S3B, 두 사례에서는 Del-3, 한 사례에는 Del-4), 하나는 동형접합성 인프레임 결실을 보유하고 있었다(도 6c 및 표 S3A 및 S3B, Del-5). 이 결실들 각각은, 비선별 종양에서 발견된 경우에도, EGFR의 코돈 746∼753 영역내에 있었다. 이들 3개의 결실 각각은 아미노산 치환과도 관련이 있다(표 S3A-S3C). 4개의 시료 모두를 정상 조직에 대응시켜 보면, 이들 돌연변이가 체세포 돌연변이인 것으로 확인되었다.
실시예 3A : 프라이머 설계
수용체 티로신 키나제의 cDNA 염기서열을 유전자은행(GeneBank)(서열등록번호가 표 S1에 나열되어 있음)으로부터 얻은 다음, BLAT 정렬을 이용하여 인간 게놈 어셈블리(http://genome.ucsc.edu)에 적용시켜 엑손/인트론 경계(exon/intro boundaries)를 동정하였다. 프라이머3 프로그램(Primer3 Program)(http://frodo. wi.mit.edu/primer3/primer3_code.html)을 이용하여, 엑손 서열 및 각 측면부에 위치하는 적어도 250bp의 인트론 서열 또는 인접한 엑손 서열을 증폭하도록, 바깥쪽 유전자(external gene) 특이적 프라이머쌍을 설계하였다. 그 결과 예상되는 엠프리콘을 사용하여, 엑손측에 접해 있고(통상 엑손/인트론 경계 부분으로부터 50bp 이상) M13 정방향 또는 역방향 프라이머 꼬리가 첨부되어 있는 안쪽 프라이머(internal primer)를 설계하였다. 이러한 네스티드 프라이머 세트(nested primer set)는 DNA 대조군으로부터 적당한 엠프리콘 사이즈의 고품질의 서열(high-quality sequence)을 얻기 위해 시험하였다. 나고야 시립 대학교 의과대학으로부터 얻은 58개의 원발성 폐암 시료 세트를 이용하여, 47개의 티로신 키나제의 수용체 티로신 키나제 활성화 루프를 코딩하는 엑손을 포함하는 엠프리콘을 증폭시켜 서열분석하였다. 또한, 전장 EGFR(full length EGFR)을 포함하는 엠프리콘도 증폭시켰다.
실시예 3B : 게놈 DNA 의 PCR 및 염기서열분석 방법
384-웰 포멧 네스티드 PCR 기구(384-well format nested PCR setup)를 이용하여, 특이적 프라이머를 사용하여 티로신 키나제 엑손 및 인접한 인트론 염기서열을 증폭시켰다. 각 PCR 반응은 5ng DNA, 1X HotStar 완충액, 0.8mM dNTPs, 1mM MgCl2, 0.2U HotStar 효소(Qiagen, Valencia, CA), 및 0.2μM 정방향 및 역방향 프라이머를 함유하는 10μL 반응 용량으로 시행하였다. PCR 주기 파라미터는 95℃에서 15분간 1주기(cycle); 95℃에서 20분간, 60℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간을 1주기로 하여 35주기; 72℃에서 3분간 1주기로 하였다.
상기 시험 결과 얻어진 PCR 산물은 고체상 가역 고정화 화학법(solid phase reversible immobilization chemistry)으로 정제한 다음, 범용의 M13 프라이머를 이용하여 양방향 염료-전사종결인자 형광 염기서열분석(bi-directional dye-terminator fluorescent sequencing)을 행하였다. 염기서열분석할 단편은 ABI Prism 3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 통해 검출하였다. PCR과 염기서열분석은 주식회사 에이전코트 바이오사이언스(Agencourt Bioscience Coporation)(Beverly, MA)에서 수행하였다.
실시예 3B : 염기서열 분석 및 확인( validation )
정방향(F) 및 역방향(R) 크로마토그램은 Mutation Surveyor 2.03 (SoftGenetics, State College, PA)에 의해 일괄적으로 분석한 다음, 매뉴얼 재검토를 행하였다. 한 방향 또는 양방향에서 확인된 고품질 염기서열 변이는 후보 돌연변이(candidate mutation)로서 평가하였다. 후보 돌연변이를 가진 엑손은 상기한 바와 같이 오리지날 DNA 시료로부터 다시 증폭시켜 다시 염기서열분석을 행하였다.
실시예 3C : 환자
폐종양 표본은 임상시험심사위원회(Institutional Review Board)의 연구 승인 하에 나고야 시립 대학병원 및 브리검 여성 병원에서 치료받은 비소세포 폐암에 걸린 환자(비선별 일본계 환자 종양 및 제피티니브-처리 미국계 환자 종양), 및 브리검 여성 병원의 익명의 종양 은행(tumor bank)(비선별 미국계 환자 종양)으로부 터 얻었다. 성별, 나이, 및 조직적합성(histology)에 대한 정보는 대부분의 시료로부터 얻을 수 있었다. 또한, 환자 시료는 다나-파버 암연구소에서의 제피티니브의 개방표지 임상시험(open-label clinical trial)이 행해진 환자들로부터도 얻었다(13). 제피티니브에 대한 응답성은 표준 기준을 이용하여 규정하였다(참조, 예, A. B. Miller, B. Hoogstraten, M. Staquet, A. Winkler, 1981 Cancer 47, 207-14). 이 연구에 대해서는 IRB 승인을 얻었다.
상기 제피티니브 응답성 환자 중에서, 2명은 사전에 적어도 1주기(cycle)의 화학요법을 받았으며, 1명은 사전에 방사선 요법을 받았고, 1명은 화학요법을 병행하였으며, 1명은 다른 어떠한 치료도 받지 않았다. 제피티니브 무감응성 환자에 대해서, 제피티니브 치료 2개월 후, 기준 CT 스캔과 비교하여, CT 스캔 상에 새로운 종양 병변이 출현하거나 또는 현존 종양 병변이 증식하는 경우는 치료 실패로 규정하였다.
실시예 3D : 환자 시료의 cDNA 염기서열분석
Trizo TM(Invistrogen, Valencia, CA)을 사용하여 조직 시료로부터 총 RNA(total RNA)를 분리하여 RN easyTM mini-elute cleanup kit(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 정제하였다. cDNA는 총 RNA 2㎍으로부터 수퍼스크립트 II 역전사효소(Invitrogen Life technologies, Carlsbad, CA)를 제조자의 권장요건에 따라 사용하여 역전사시켜 얻었다. 얻어진 cDNA는 후속 EGFR의 PCR 증폭용 주형(template)으로서 사용된다.
PCR의 구성 성분은 20mM Tris-HCl(pH 8.4), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.1mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각, 0.2μM의 각 프라이머, 및 0.05units/㎕ Taq 폴리머라제(Taq Platinum, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)이다. 단편 "a"를 증폭시키기 위해서는 상기 반응에 4%의 DMSO의 첨가가 요구된다. 프라이머 염기서열은 표 S4에 열거하였다. 상기 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 18개 염기쌍의 돌출형(overhanging) M13 정방향 및 역방향 염기서열을 이용하여 합성한다. 열변화(thermocycling) 조건은 94℃, 4분간 반응시킨 후; 변성단계 94℃에서 20초간, 연장단계 72℃에서 20초간, 주기1 60℃로부터 주기11 50℃까지 주기당 1℃씩 감소된 결합(anealing) 단계 20초를, 11주기를 행한 다음; 주기 11을 25회 반복하였다. 그 다음, 72℃에서 6분간 배양한 다음 4℃에 넣어 프로그램을 종료한다.
PCR 반응의 분취표본(aliquot)은 물과 1:50으로 희석시킨다. 희석된 PCR 산물은 M13 Forward Big Dye Primer kit(Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 제조자의 권장요건에 따라, 염기서열분석을 행하였다. 염기서열분석할 산물은 형광 서열분석기(Applied Biosystems제 모델 3100, Foster City, CA)상에서 분리하였다. 기본값(base call)은 기기의 소프트웨어에 의해 형성하고, 육안으로 관찰하여 재검토한다. 각 염기서열은 Sequencher 4.1 소프트웨어(Gene Code Corp.)를 사용하여 대응하는 정상 염기서열과 비교한다.
실시예 3E : EGFR 변이체를 발현하는 종양 종류
두개의 다른 종류의 종양에서, EGFR에서의 2개의 부가적인 돌연변이가 확인되었다. 857 위치의 발린(V)이 글리신(G)으로 치환된 EGFR 돌연변이("G857V")가 급성 골수종 백혈병(AML)에서 동정되었으며, 883 위치의 류신(L)이 세린으로 치환된 EGFR 돌연변이("L883S")가 전이성 육종에서 확인되었다.
실시예 3F : 세포주( Cell line )
시험관내의 NSCLC 세포주에 대한 제피티니브의 효과를 시험하였다. 1개의 세포주, H3255는 제피티니브에 특히 민감하였다(IC50 40nM). 나머지 세포주들은 훨씬 높은 IC50을 가지고 있었다. 예를 들어, 야생형 세포주 H1666은 돌연변이 세포주보다 50배 높은 2μM의 IC50을 가지고 있다. 이 세포주 유래의 EGFR을 서열분석하면, L858R 미스센스 돌연변이를 포함하는 한편, 다른 세포주들은 EGFR에 대해 야생형이었다. EGFR의 저해 또는 EGFR에 의한 AKT 및 ERK의 인산화에는 EGFR 야생형 세포주와 비교하여 훨씬 더 낮은 농도의 제피티니브가 필요하며, EGFR 야생형 세포는 동일한 효과를 얻기 위해서 적어도 100배 이상의 높은 농도의 제피티니브를 필요로 한다. 이러한 발견은 돌연변이 수용체는 제피티니브의 효과에 더 민감함을 암시한다.
실시예 3G: 병행 치료
에를로티니브를 사용하거나 또는 사용하지 않고 카르보플라틴/파클리탁셀의 무작위 임상시험 치료를 받은 진행성 NSCLC을 가진 환자의 종양 표본을 분석하였다. 이 시험의 임상적 값(portion)은 두개의 치료군에서 동등한 생존율을 나타내었다. 1076명의 환자 중 228명으로부터 얻은 종양 표본을 염기서열분석에 이용할 수 있었다. 이 환자들의 전임상 특성은, 기본 인구학적 자료(baseline demographics), 반응율, 정중 및 전체 생존율 면에서, 상기 치료군 전체적으로 차이가 없었다.
티로신 키나제 도메인의 엑손 18∼21의 염기서열을 분석하였으며, 12.7퍼센트의 돌연변이 빈도에 해당하는 29개의 돌연변이가 동정되었다.
전체적으로 EGFR 돌연변이를 가진 환자는 화학요법 단독 치료를 받았는지 또는 에를로티니브와 병행 치료를 받았는지 여부에 관계없이 더 높은 생존율을 갖는다. 이러한 차이는 p값이 0.001 이하로 통계학적으로 유의하다. 이러한 발견은, EGFR 돌연변이가 제피티니브 및 에를로티니브에 대한 반응성의 예측변수가 되는 것 외에, 향상된 생존율에 대한 예후가 될 수 있는 가능성을 높인다.
(*)상기 비선별 미국계 환자들에서의 EGFR 돌연변이 빈도(1/16)는 보고된 제피티니브 반응 빈도 10.4%에 비해서 낮게 나타난다. 이러한 차이는 통계학적으로 적정한 유의성을 갖는다(카이제곱검정법에 의한 p=0.025). 따라서 이러한 결과는 여전히 가능성(chance)에 기인한 것이거나, EGFR 돌연변이를 갖지 않은 반응자 부분(fraction)에 기인한 것이거나, 또는 이 종양 콜렉션에서 EGFR 돌연변이를 실험적으로 검출하는데 실패함에 기인한 것일 수 있다. 제피티니브 반응성 미국계 환자의 EGFR 돌연변이 빈도(5/5)를 제피티니브 반응성의 예측빈도(10.4%)와 비교해 보면, 카이제곱확률은 다시 10∼12 미만으로 된다.
[실시예 4]
연구 설계:
2004년 8월부터 2005년 1월까지, 메사추세츠 제너럴 하스피탈(MGH), 다나-파버 암연구소(DFCI), 및 브리검 여성 병원(BWH)에, 체세포 EGFR 키나제 도메인 서열분석이 의뢰된 NSCLC 환자의 후향성 코오트 연구(retrospective cohort study)를 수행하였다. 이들 세 기관은 1년에 약 1200명의 폐암 환자를 치료하는, 산학 연계 벤처 암센터인, 다나-파버/파트너스 캔서케어(Dana-Farber/Parters CancerCare: DF/PCC)를 구성한다. 2004년 8월에는, EGFR 키나제 도메인 염기서열분석이 DF/PCC에서 임상적 용도로 유용하게 사용되었다. 임상의는 시험을 의뢰할 환자를 선별할 수 있으나, 환자들은 충분히 적합한 이용가능한 종양 표본을 가질 것이 요구되었다. 종양 세포는 MGH 및 BWH 병리전문의에 의한 조직접합성 검사에 의거하여 표본의 적어도 50%를 구성해야하며, 그 표본은 원발성 또는 전이성 종양의 절제(resection), 기관지경 생검(bronchoscopic biopsy), 또는 중심부 바늘 생검(core needle biopsy), 또는 흉수 유래의 세포 군집으로부터 얻은 것이어야 한다. 드문 경우에는, 미세 바늘 흡인액 시료가 적당한 것으로 결정되었다. 시료는 파라핀 포매 조직 또는 동결 조직이었다. 편평세포종양(62)에서의 EGFR 돌연변이 발생율이 낮기 때문에, 이것을 가진 것으로 진단된 환자는 시험에 적격하지 않았다.
본 발명자들은, 모든 염기서열분석이 수행되고 판독되는 진단 시험 시설인, 하버드 의과대학/파트너스 헬스케어센터 포 제네틱스 앤드 게노믹스(CLIA# 22D1005307)의 분자의학실험실(LMM)에서 보유하고 있는 EGFR 케이스 로그(EGFR case log)를 사용하여, EGFR 시험을 경험한 환자를 동정(identify)하였다. 그리고, 본 연구기간 동안 NSCLC으로 진단되어 DF/PPC로부터 EGFR 시험을 의뢰받은 모든 환자들을 포함하였다.
환자의 나이, 성별, 및 인종은 전자 의학 기록 시스템으로부터 수집하였다. 흡연상태, 암병력, EGFR 키나제 도메인 서열분석 결과, 및 후속 EGFR-TKI 치료 계획은 지정된 의사의 챠트 리뷰를 이용하여 기록하였다. 특히, 흡연상태 및 암병력은 의사와 간호사의 노트로부터 얻었다. 폐암 진단 전 1년이상 흡연을 중단한 사람을 이전 흡연자(former smoker)로 규정하고, 평생동안 100개피 미만을 피운 사람을 비흡연자(never-smokers)로 규정하였다. 진단 1년 이내에 흡연을 중단하였거나 또는 진단 시에 흡연중이었던 흡연자는 현재 흡연자(current smoker)로 분류하였다. 흡연 갑년(Pack-year)은 하루에 피운 갑(pack)의 수와 흡연 년도수를 곱하여 계산하였다. 종양 세포조직(histology) 및 EGFR 키나제 도메인 염기서열분석 결과는 병리 보고서로부터 얻었다. 모든 병리 표본은 MGH 또는 BWH에서 중점적으로 검토하였으며, 세포조직은 세계보건기구(WTO) 분류 시스템(63)을 이용하여 범주를 나누었다. 후속 치료 계획은 의사의 노트로부터 얻었다.
완성된 데이터(complete data)로부터 나이, 성별, 종양 세포조직, 및 EGFR 돌연변이 상태(status)를 입수할 수 있었다. 인종(12%), 시험 당시의 종양 단 계(stage), 흡연상태(6%), 선행치료(5%), 및 후속 EGFR-TKI 치료계획(11%)에 대해서 누락된 데이터가 있었다. 이 연구는 DF/PCC의 임상시험심사위원회(IRB)에 의해 승인받았다.
EGFR 유전자 염기서열분석:
동결되고, 포르말린 고정된, 또는 파라핀 포매된(FFPE) 종양 조직의 연속 절편을 잘라내어 글라스 슬라이드에 올려놓았다. 병리전문의가 적어도 50%의 생존 종양 세포로 이루어진 종양 조직 부분을 동정하였다. FFPE 시료를 크실렌과 에탄올로 추출하여 파라핀을 제거하였다. FFPE 시료 및 동결 조직 시료 둘다를 프로테나제 K로 하룻밤 분해시켰다(digest). 표준 방법을 사용하여 조직 및 말초 전혈(peripheral whole blood)로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA는 DNA Genetek-OrageneTM 키트를 사용하여 타액 시료로부터 추출하였다.
개개의 네스티드 PCR 반응 세트를 이용하여 EGFR의 키나제 도메인(엑손 18∼24 및 인접한 인트론 영역)을 증폭시켰다. 상기 네스티드 PCR 증폭에 사용된 프라이머는 표 S1A 및 S1B 및 서열번호 1∼424에 기재되어 있으며 이 프라이머의 5' 말단에 범용 서열(5'tgtaaaacgacggccagt)(서열번호 645)이 부가된다. 얻어진 PCR 산물은 염료-전사종결인자 염기서열분석(dye-terminator sequencing)에 의해 직접 양 방향으로 서열분석하였다. PCR은 5ng의 게놈 DNA, 2mM의 MgCl2, 0.75㎕의 DMSO, 1M의 베타인, 0.2mM의 dNTPs, 20pmol의 프라이머들, 0.2㎕의 AmpliTaq GoldTM(Applied Biosystems), 1X 완충액(AmpliTaq Gold와 함께 제공됨)을 함유하는 반응용량 15㎕으로 384-웰 플레이트에서 수행하였다. 열변화 조건은 다음과 같다: 95℃에서 10분; 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1주기로 하여 30주기; 및 72℃에서 10분. PCR 산물은 AmpureTM 마그네틱 비드(Agencourt)로 정제하였다.
염기서열분석할 산물은 CleanseqTM 마그네틱 비드(Agencourt)를 사용하여 정제한 다음, ABI 3730 DNA Analyzer 상에서의 모세관 전기영동에 의해 분리하였다. 염기서열 분석(sequence analysis)은 2명의 재검토자가 Mutation Surveyor (SoftGenetics, State College, PA)을 이용하여 매뉴얼에 따라 수행하였다. 비동의(nonsynonymous) DNA 염기서열 변이체는 오리지날 게놈 DNA(original genomic DNA)의 3∼5회 독립 PCR 반응의 분석에 의해 확인하였다. 비동의 DNA 염기서열 변이체를 가진 개체로부터 얻은 혈액 또는 타액 시료를 분석하여, 그 염기서열 변화가 종양 조직에만 특이한(unique)지의 여부를 결정하였다.
통계학적 분석:
환자의 인구학적 임상적 특성과 EGFR 돌연변이 상태 사이의 일변량 연관성(univariate association)을 평가하기 위해서 로지스틱 회귀 모델(logistic regresstion model)을 구성하였다. 돌연변이 양성 상태의 유의한 예측변수를 확인하기 위해, 앞선 연구에서 돌연변이의 예측변수로 확인되었던 독립 변수, 특히 성별, 인종, 세포조직, 및 흡연 상태를 포함하는 다변량 로지스틱 회귀 모 델(multivariable logistic regression model)을 구성하였다. 6명은 환자는 PCR에 실패하여 EGFR 돌연변이 데이터가 없기 때문에 이 분석에서 제외하였다. 모든 분석은 통계 소프트웨어 SAS(버젼 8.02, SAS Institute, Cary, NC)를 사용하여 수행하였다.
결과:
환자의 특성:
본 연구 기간 동안 암의 임상 치료의 한 부분으로서 체세포 EGFR 키나제 돌연변이 염기서열분석이 의뢰된, NSCLC를 가진 환자 100명의 평균 연령은 60.7세이고 여성이 63%였다(표 4). 환자 대부분은 백인(76%) 또는 아시아인(7%)였고, 시험 당시 전이성으로 진단된 병변을 가지고 있었다(67%). EGFR 돌연변이에 대해 시험한 거의 모든 환자들(94%)은 선암종, 기관지폐포 암종(bronchiolo-alveolar carcinoma:BAC) 특징을 가진 선암종, 또는 순수 BAC를 가지고 있었다. 환자 중의 대략 1/3이 비흡연자였다. EGFR 시험 의뢰에 앞서 처치된 치료법으로는 수술(50%), 가슴 방사선요법(22%), 화학요법(47%), 및 EGFR 직접 표적 치료(11%)를 들 수 있다.
동정된 돌연변이:
시험 의뢰로부터 사용가능성 있는 결과를 얻는데 걸리는 평균 시간은 12 영업일(business day)이었다. 제출된 표본의 대다수는 파라핀 포매 표본이었 다(74%). 74개의 파라핀 포매 표본 중의 6개(7%)는 PCR 증폭을 실패한 반면, 26개의 동결 표본은 모두 성공적으로 증폭되었다. 총 25개의 동정된 돌연변이에 대해서, 해석가능한 결과를 가진 94명의 환자 중, 23명(24%)은 EGFR 키나제 도메인내에 적어도 하나의 돌연변이를 가짐이 확인되었으며, 이 환자들 중 2명은 각각 2점 돌연변이를 나타내었다(표 5). 상기 돌연변이를 가진 23명의 환자 중에서, 9명(39%)은 하나 이상의 점 돌연변이를 가지고 있었으며, 12명(52%)은 엑손 19에 인프레임 중첩 결실을 가지고 있었고, 2명의 환자(9%)는 엑손 20에 중복(duplication)을 가지고 있었다. 상기 점 돌연변이는 엑손 18 및 21에 존재하였으며, 5개의 2573T>G(L858R)와, 2126A>T(E709V), 2155G>A(G719S), 2156G>C(G719A), 2327G>A(R776H), 2543C>T(P848L), 및 2582TA(L861Q)를 각각 한개씩 포함하였다. 상기 점 돌연변이 중의 하나(P848L)는 종양 표본 및 볼점막 면봉으로부터 얻은 단핵세포 둘다에서 검출되었다. 엑손 22, 23, 또는 24에서는 돌연변이가 검출되지 않았다.
돌연변이의 예측변수:
본 발명의 시료 중에서, EGFR 돌연변이 상태와, 나이(p=0.61), 여성(p=0.92), 아시아인종(p=0.08), 또는 의뢰 당시의 전이성 병변(p=0.43, 표 4) 사이에 유의한 연관성은 없었다. 비선종성(non-adenocarcinoma) 종양 세포조직을 가진 6명의 환자 중, 돌연변이를 가진 것으로 확인된 환자는 없었다. 선암종, BAC 특징을 가진 선암종 및 순수 BAC를 가진 환자 중, BAC/BAC 특징과 EGFR 돌연변이 상태 사이에는 연관성이 없었다(p=0.35).
17명의 현재 흡연자 중, 돌연변이를 가진 것으로 확인된 환자는 없었다. 비흡연자는 이전 흡연자보다 EGFR 돌연변이를 가질 가능성이 유의하게 높았다(교차비(odds ratio)[OR]=3.08, 95% 신뢰구간[CI] 1.09∼8.76). 흡연 갑년의 평균수는, EGFR 돌연변이 양성 환자(0.7 갑년)가 EGFR 돌연변이 음성 환자에 비해서(25.0 갑년, p < 0.001) 유의하게 낮았다. 각각의 부가적인 흡연 갑년에 대해서는, 돌연변이를 가질 가능성(likelihood)면에서 4% 감소하였다(OR=0.96, 95% CI 0.93-0.99).
상기 흡연 갑년 수는, 성별, 인종, 및 종양 조직접합성에 대하여 조절한 후, 돌연변이 상태의 유의한 예측변수였다(OR=0.96, 95% CI 0.93-0.99).
시험 정보의 후속 사용:
EGFR 돌연변이 양성 환자는 후속 EGFR-TKI 치료 계획이 보고될 가능성(86%)이 EGFR 돌연변이 음성 환자(11%, p < 0.001)보다 유의하게 높았다. 임상의는, 38%의 사례에서 EGFR 결과가 그들의 우선적인 추천 치료법에 영향을 미친다고 보고하였다. 이러한 사례들로는, 시험결과 음성(negative)으로 진단받기 전에 EGFR-TKI 치료를 추천받은 돌연변이 양성 환자 23명 중 14명(61%)과, EGFR-TKI 치료를 추천받지 않았거나, 또는 시험결과 양성으로 진단을 받은 후에 EGFR-TKI 치료를 추천받은 71명의 돌연변이 음성 환자 중의 24명(34%)이 포함된다.
EGFR 돌연변이 상태에 의해, 전이성 병변(54%)을 가진 환자에서의 우선 치료 옵션을 변경할 가능성이 국소 또는 국소적으로 진행된 병변을 가진 환자(19%, p=0.003)에서 보다 높았다. 이러한 조사결과를 얻은 경우, 전이성 환자에서의 의사결정 과정(decision-making process)을 더 분석하였다(도 10). 시험 결과가 치료법 추천에 영향을 미친, 전이성 병변을 가진 31명의 환자 중에서, 5명의 돌연변이 양성 환자는 1차(first-line) EGFR-TKI 치료를 받았고 6명의 돌연변이 양성 환자는 화학요법 대신에 2차 EGFR-TKI 치료를 받았다. 20명의 돌연변이 음성 환자는 그들의 음성 EGFR 시험 결과에 근거하여 3차 치료 또는 그 이상까지 EGFR-TKI 치료를 연기하도록 권고받았다. 시험 결과가 치료 추천에 영향을 미치지 않은 전이성 병변을 가진 26명의 환자 중에서, 2명의 돌연변이 음성 환자는 그들의 음성 결과에도 불구하고, 1차 EGFR-TKI 치료를 받았고, 4명의 돌연변이 양성 환자를 포함한 9명의 환자는 2차 또는 3차 EGFR-TKI 치료를 받았으며, 2명의 돌연변이 양성 환자를 포함한 15명의 환자는 EGFR-TKI 치료 추천을 받지 않았다. 전이성 병변을 가진 환자들 중 3명은 1차 EGFR-TKI 치료를 평가(evaluate)하는 시험에 참여하였다. 전이성 병변을 가진 환자 중의 9명은 미리 또는 EGFR 시험 시에 EGFR-TKI를 받았다.
토의:
본 발명자들은 본 연구에서 NSCLC를 가진 100명의 환자들에게 암의 임상 치료의 일부분으로서 체세포 EGFR 돌연변이 스크리닝을 행하는 연구를 수행하여, 이 시험이 실행가능하고 NSCLC 환자의 치료에 유의하게 영향을 미침을 알아내었다. EGFR 돌연변이를 보유한 환자는 돌연변이가 없는 환자보다 EGFR-TKI 치료법을 추천 받을 가능성이 유의하게 높았다. 의사들은 1/3 이상의 사례에서 시험 결과에 근거하여 치료 추천을 조정하였으며, 전이성 병변을 가진 환자는 조정할 가능성이 더 높았다. 본 연구의 환자 시료에서, 의사들은 양성 EGFR 시험 결과를 이용하여, 몇몇 환자, 특히 1차, 2차 치료 중인 환자에 대해서, 화학요법보다 EGFR-TKI를 우선적으로 시행하도록 하였다. 그러나, 음성 EGFR 시험 결과에 의해, 의사가 선별한 환자에게 EGFR-TKI를 투여하는 것을 막은 것은 아니었다. 상기 시험 결과가 임상적 의사 결정에 영향을 미치지 않은 많은 환자들은 시험당시 초기 단계였거나, 병변을 잘라내었거나 또는 전이성 병변에 대해 이미 EGFR-TKI를 받은 상태였다. 이것은, EGFR-TKI의 보조치료법으로서의 유용성이 알려져 있지 않고, 동정된 EGFR 돌연변이를 갖지 않는 소수의 환자에게도 EGFR-TKI 치료의 이점이 있기 때문에, 타당하다(65, 66-70, 71).
또한, 본 연구는, 분자 진단법이 EGFR 돌연변이를 가진 환자를 동정하는 임상적 능력을 향상시킬 수 있다는 증거를 제공한다. 많은 종약학자들은, NSCLC를 가진 환자에 대한 의사결정과정을 가이드하기 위해, 현재 EGFR 돌연변이와 연관된 임상적 특징과 EGFR-TKI에 대한 반응성을 이용한다. 실제로, EGFR 시험이 의뢰된 본 연구의 환자 집단은 이러한 특징이 더 우세한 것으로 나타났다. 예를 들면, 의뢰된 환자의 95%가 선암종 또는 BAC 종양 세포조직을 가졌으나, 이에 비해, 일반 NSCLC 집단에서는 45%의 환자가 선암종 또는 BAC 종양 세포조직을 가졌다(72). 본 연구 집단의 29%가 흡연자인 반면, 일반 NSCLC 집단의 비흡연자 범위는 2∼10%로 보고되어 있으며, NSCLC를 가진 여성에서는 27% 만큼 높아질 수 있다(73-75). 마 찬가지로, 본 연구 집단은 단지 17%만이 현재 흡연자로 이루어졌으나, 이에 비해 새롭게 진단된 NSCLC 환자 중의 현재 흡연자 비율은 38∼75%였다(75, 78-80). 본 연구의 임상적으로 선별된 집단은 결론적으로 EGFR 돌연변이 비율이 24%였으며, 이 비율은 비선별 가용 NSCLC 종양 시료를 시험한 본 연구 또는 다른 미국계 환자 군에 의해 보고된 비율보다 실질적으로 더 높았다(65-66, 81). 하지만, 임상의들이 EGFR 돌연변이로 예측되는 임상적 특징을 가진 시험용 환자를 선별하기 위해서 시도한 것으로 나타났으나, 돌연변이 빈도는 여전히 단지 24%였으며, 분자 진단법이 임상적 결정에 대한 정보의 가용성을 증가시킨다는 사실이 부각됨을 인지하는 것은 중요하다.
앞서 기재한 돌연변이 상태의 예측변수를 조절한 이후, 본 연구 환자에서의 EGFR 돌연변이 상태의 가장 강력한 예측변수는 흡연 상태이며, 흡연 이력의 증가는 EGFR 돌연변이를 보유할 현저히 감소된 가능성과 관련이 있었다. 본 연구 결과는 EGFR 돌연변이 가능성면에서 흡연 상태의 중요성을 보고하고 있는 다른 일련의 사례들과 일치한다(66, 69, 70, 81, 82). 편평세포 종양에서는 EGFR 돌연변이 유병률이 매우 낮아, 선암성 종양에 대한 시험에 수고가 많이 들어가므로, 흡연 이력이 짧거나 없는 환자에 대해 장차 노력을 집중하는 것이 적합할 수 있다. 하지만, 전형적인 임상적 특징을 보이지 않는 환자에서의 EGFR 돌연변이의 보고는 엄격한 시험 제한에 반하여 권고한다(83). 본 발명자들은, 돌연변이와 관련있는 것으로 생각되는 다른 임상적 특징을 조사한 결과, 아시아인종과 BAC 종양 세포조직은 EGFR 돌연변이 상태를 예측하는데 유의하지 않은 경향을 가짐을 알아내었다. 이러한 연 관성면에서의 통계학적 유의성의 부족은 시료 사이즈가 작은 것에 기인한 것일 수 있다.
상기 시험은 실행가능하였으며 암의 임상 치료의 시간적 제약면에서 적합하였다. 거의 모든 종양들은 분석을 위해 제공되어 해석가능한 결과가 도출되었다. PCR 증폭에 실패한 6개의 표본은 모두 파라핀 포매 표본이었으며, 이에 반해 PCR 증폭에 실패한 동결 표본은 없었다. 가능한 한, 신선한 동결 표본이 EGFR 돌연변이 시험용으로 바람직한 기재(substrate)이다.
부분적인 또는 완전한 EGFR 염기서열 분석을 행한 것으로 보고된 NSCLC 시료는 2500개에 가까웠다. 본 연구의 환자들은, 엑손 19의 9∼23개의 염기쌍의 결실과 엑손 18 및 21에서의 단일 아미노산이 치환을 유도한 점 돌연변이가 중첩된, 이전 보고와 유사한 돌연변이를 나타내었다. 본 발명자들은 5개의 점 돌연변이를 찾아내었다(E709V, G719S, G719A, L858R, 및 L861Q). 이 점 돌연변이 중의 한개는 앞서 다른 아미노산 치환이 기재되었던 코돈에서 아미노산 치환(R776H)을 일으킴이 확인되었다. E709V 및 R776H 변이체는 각각 코돈 719를 포함하는 공지의 제피티니브 민감성 돌연변이(geftinib-sensitizing mutation)와 함께 확인되었다. 엑손 21에서의 P848L 돌연변이는 체세포 시료 또는 볼점막 시료 둘다에서 확인되었으며, 이것은 분명하지 않지만 배계열 변이체(germline variant)일 수 있음을 암시한다. 상기 환자는 EGFR 돌연변이 시험 전에, 제피티니브 치료를 받은 15개월 동안 안정성 병변(stable disease)을 가진 선암종을 보유한 비흡연 여성이었다. 상기 P848L 돌연변이가 밝혀졌을 경우, 이 여성은 최근 진행성 병변을 가졌던 것으로 확인되었 으며 에를로티니브 치료를 시작하였다. 이때는 에를로티니브에 대한 반응성에 관한 정보를 이용할 수 없다.
상기 (2253_2276 del) 결실은 앞서 기재한 엑손 19 결실과 중첩된다. 본 연구의 환자들에서의 결실은 그 범주를 2개의 그룹 중의 하나로 나눌 수 있다: 최소한 코돈 747-759에 걸쳐있는 것(아미노산 서열 LRE); 및 코돈 752-759에 걸쳐있는 것(도 11). 데이터에 기록된 모든 엑손 19 결실의 분석결과는 코돈 747-759에 걸쳐있는 TK 영역으로부터 다양한 아미노산이 결실될 수 있음을 암시한다. 필수 공통 코돈(required common codon)이 결실된 것은 나타나지 않았다; 그러나 모든 결실에서 745 위치의 리신 잔기는 유지되는 것으로 검출되었다.
본 연구의 두개의 엑손 20 돌연변이 중의 하나는, EGFR 시험을 수행한 후 에를로티니브 치료를 받아서 이때 두달동안 안정성 병변을 가졌던, 재발된 선암종을 가진 비흡연 여성에서 확인된다. 나머지 하나는 EGFR-TKI 치료를 받았으나, 심한 발진 때문에 그것을 견뎌내지 못한, 전이성 암종을 가진 이전 흡연 남성에서 확인되었다. 임상적으로 관련 있는 엑손 20에서의 EGFR 돌연변이의 동정은 EGFR의 TK 영역의 포괄적인 염기서열분석의 중요성을 강조한다.
결론적으로, 본 연구는 NSCLC 환자에 있어서, 암의 임상 치료의 일부로서, 체세포 돌연변이에 대한 EGFR 유전자의 TK 영역의 포괄적인 스크리닝의 실행가능성 및 유용성을 나타낸다. 그 시험 결과는 EGFR-TKI 응답의 임상적 예측변수에 관한 유용한 정보를 제공한다. 현재 흡연자는 흡연 이력의 갑년 수가 높은 이전 흡연자 만큼, 돌연변이를 보유할 가능성이 적다.
[실시예 5]
비소세포 폐암에 대한 EGFR 유전자 시험
표준 시행 과정
임상적 표시( Clinical Indication ):
이 시험은 비소세포 폐암을 가진 개체에 대해서 나타낸다.
분석 원리:
EGFR 유전자 시험은 EGFR의 키나제 도메인내의 돌연변이를 검출하는 유전자 검사이다. 먼저, 종양 생검으로부터 DNA를 얻는다. 그 다음, 직접 양방향 유전자 염기서열분석법(direct bi-directional gene sequencing)을 이용하여, EGFR의 7개의 엑손(18, 19, 20, 21, 22, 23, 24)의 DNA 염기서열을 결정한다. 다음, 얻어진 염기서열을 공지의 EGFR 염기서열과 비교하여 DNA 염기서열의 변화를 확인한다. 종양 조직에서 DNA 염기서열 변화가 검출되는 경우, 오리지날 조직 시료(original tissue sample)에 대하여 상기 시험을 반복한다. 상기 변화가 제피티니브 또는 에를로티니브 반응자에 있어서 이미 보고된 것이 아닌 경우에는, 돌연변이가 종양조직에서 구성적(constitutive)인지(그 결과 정상적으로 일어나는 다형성(polymorphism)일 수 있음) 또는 체세포적으로 일어난 것인지를 결정하기 위해, 그 개체의 혈액 시료를 이용하여 상기 시험을 또 수행한다.
시료 요건:
최소한 100ng의 DNA가 조직 시료로부터 얻어질 것이 요구된다.
주(note): 매우 적은 양의 DNA가 조직 시료로부터 얻어질 수 있다. 이러한 DNA의 농도는 정확하게 정량화할 수 없다.
질 조정( Quality Control ):
사용된 대조군
각 엑손에 대해서 2개의 음성 대조군(물) 및 양성 대조군(인간 DNA)이 PCR 반응에 포함된다. 상기 음성 대조군은 얻어진 서열이 오염된 결과가 아님을 확증하기 위해 전 과정을 통해 처리된다. pGEM 양성 대조군 및 ABI 어레이(array) 대조군은 염기서열분석 단계에 포함된다.
대조군 제조 및 저장:
PCR에 대한 양성 대조군은 클론테크 인간 DNA(Clontech human DNA) 또는 익명의 혈액 시료로부터 얻은 인간 DNA이며 4℃에 저장된다. PCR 반응에 대한 음성 대조군은 실온에서 저장한 고순도 분자생물학 등급(HyPure Molecular Biology Grade)의 물이다. 상기 pGEM 양성 염기서열분석 반응 대조군 및 ABI 어레이 대조군은 -20℃에 저장된다.
허용 한계( Tolerance Limit ) 및 개체 대조군이 실패한 경우에 취하는 단계:
상기 양성 PCR 대조군이 실패(fail)하고 음성 대조군 및 시료가 패스(pass)하는 경우, 그 PCR 결과는 패스로 지정하여 염기서열분석을 수행한다. 음성 대조군이 DNA 증폭의 증거를 나타내는 경우, 환자 DNA의 새로운 분취표본(aliquot)을 이용하여 전체 반응을 반복한다. 상기 pGEM 대조군이 실패하고 시험 반응액이 실패한 경우, PCR 산물의 두번째 분취표본을 이용하여 염기서열분석 반응을 반복한다. 염기서열분석 대조군은 실패하고 시험 반응액은 패스한 경우, 염기서열분석을 반복할 필요는 없다. 주: 파라핀 포매 조직 시료로부터 DNA 추출하는 것은 효율이 낮기 때문에, 바깥쪽 PCR 반응(external PCR 반응)은 종종 가시적인 산물을 생성하지 못한다. 안쪽(internal) PCR 반응은 가시적 산물을 생성해야 한다. 적당한 PCR 산물이 얻어졌음을 확인하기 위해 겔상에서 검출된 산물의 사이즈를 예상되는 사이즈(하기 참조)와 비교해야한다. 안쪽 PCR 산물이 겔상에 가시적으로 보이지 않으면, 엑손 특이적 PCR 실패가 반복될 것이다.
개별 시료에 대한 PCR 증폭이 실패한 경우, 첨가 DNA 시료를 두배로 증가하여 새로운 라운드의 PCR를 시도해야 한다. PCR 증폭이 다시 실패하면, 가능하다면 환자로부터 새로운 DNA 시료를 얻어야 한다. 상기 시료가 파라핀 포매 조직 시료인 경우, 부가 슬라이드를 벗겨내야 한다. 가능하다면, 오리지날 시료 생성에 사용된 것보다 더 많은 슬라이드를 벗겨내고, 프로테이나제 K를 3일밤 동안 반응시켜야 한다.
장치와 시약(모든 시약은 특별하게 언급하지 않는 한 1년 동안 안정함):
PCR 및 염기서열분석(통상, PCR 및 염기서열분석 장치 및 시약은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 또한 상기에 기재하였음.)
·프라이머: (하기 표 6 및 7 참조)
<표 6 > 바깥쪽 PCR 프라이머
Figure 112006079008015-PCT00011
<표 7> 안쪽 PCR 프라이머
Figure 112006079008015-PCT00012
·주의 사항
<표 8>
작업(task) 지시사항(instructions) 위험요인(risk)
1. PCR 셋업(setup) -PCR 후드를 사용할 것 -전용 피펫 및 여과 팁을 사용할 것 -PCR 후드내에서만 시약을 개봉할 것 -PCR 반응의 오염
2. PCR 후드(hood)의 사용 -후드내에서 PCR 이후 시료 또는 시약은 사용하지 말 것. -PCR 반응의 오염
·바깥쪽 PCR을 위한 PCR 반응 혼합액(mix) 제조
모든 과정은 클린 후드가 아니라, 게놈 DNA용 PCR 후드에서 수행하였다.
1. Taq Gold와 dNTP를 얼음속에서 녹인다.
2. 튜브(15㎖짜리 에펜도르프 튜브)에서 하기 표9의 조성으로 매스터 혼합액(master mix)을 제조한다. 물, 베타인, 10X 완충액, MgCl2, DMSO, Taq Gold 및 dTNP를 이 순서로 첨가한다. 각 시약을 첨가하는 동안 조심스럽게 피펫 누르기(pipetting up-and-down)를 반복하여 시약들을 혼합하는 것이 매우 중요하다.
3. DNA는 분취(aliquoting)하기 전에 매스터 혼합물에 첨가해야 한다. 대용량의 매스터 혼합액를 제조한 다음, 각 환자 또는 대조군에 대한 개개의 튜브에 96㎕씩 분취한다(8 rxn에 대해 충분함). 이 96㎕의 매스터 혼합액에 5ng/㎕의 DNA 8㎕를 첨가한다. 그 다음, 13㎕를, 플레이트의 개개의 웰(well)에 첨가하거나 또는 스트립 튜브(strip tube)에 넣고 멀티채널 피펫터를 사용하여 피페팅한다.
4. 전체 384-웰 반응 플레이트용으로, 약 415개 반응에 충분한 매스터 혼합액를 제조한다.
5. 기포를 제거하기 위해 매스터 혼합액 플레이트를 회전(spin)시킨다.
6. 많은 세트의 프라이머를 사용하는 경우, 개개의 플레이트내에 정방향 프 라이머와 역방향 프라이머를 갖도록, 96-웰 플레이트에 프라이머 세트를 첨가해야 한다.
7. 멀티채널 피펫을 사용하여 상기 프라이머들을 첨가한다. 조심스럽게 피펫 누르기를 반복하여 확실히 혼합한다.
8. 플레이트를 회전시켜 기포를 제거한다.
9. 하기 표 10의 주기(cycle)를 이용하여 증폭시킨다.
주: PCR은 384-웰 플레이트에서 행한다.
<표 9>
Figure 112006079008015-PCT00013
<표 10> PCR 증폭 주기
Figure 112006079008015-PCT00014
주: 바깥쪽 PCR을 수행한 후에는 클린업(cleanup)이 필요없다.
·안쪽 PCR을 위한 PCR 반응 혼합액(mix) 제조
안쪽 PCR 셋업은 몇가지 예외사항을 제외하고는 바깥쪽 PCR과 거의 동일하다.
1. PCR 후드에서 바깥쪽 PCR에서 기재한 바와 같은 대용량의 매스터 혼합액를 제조한다.
2. 매스터 혼합액를 7개의 스트립 튜브로 분취하고, 멀티채널 피펫으로 12㎕씩 384-웰 플레이트내로 분취한다.
3. 정방향 및 역방향 안쪽 프라이머 각각을 1㎕씩 첨가한다. 일시적으로 플레이트를 밀봉한다.
4. 후드로부터 꺼내어, 플레이트를 회전시키고 후속 PCR 셋업 부위로 이동시킨다.
5. 전용 피펫을 사용하여 바깥쪽 PCR 산물 1㎕를 각 반응액으로 분취한다.
6. 가열 밀봉하고 다시 회전시킨다.
7. 바깥쪽 PCR과 동일한 증폭 주기를 행한다.
·클린업 이전에 1% 겔상에서 PCR 산물 전개. 반복 PCR을 위한 패스/실패 엑손 결정
·Ampure 마그네틱 비드 클린업을 이용한 안쪽 PCR의 클린업
- 클린업
1. Ampure 마그네틱 비드 플레이트를 비드 침전물이 없어질 때까지 진탕혼합(vortex)한다.
2. Ampure 비드의 온도는 실온인 것이 매우 중요하다.
3. 클린업용으로 사용되는 시약으로 조정하기 위해, Biomek사의 384-웰 Ampure 프로토콜을 이용하여, 반응 용량을 12㎕로 변경한다. 이것이 안되면, 오류가 생긴다.
4. 상기 프로그램이 완성된 후, 웰 당 20㎕의 멸균한 ddH2O로 플레이트를 수화시킨다. 물을 첨가하는 동안, 조심스럽게 피펫 누르기를 하여 확실히 혼합한다.
5. 플레이트를 회전시켜 기포를 제거한다.
6. 상기 플레이트를 마그네트(magnet)상에 올려놓고 비드를 분리한다. 염기서열분석 반응을 셋업하기 위해 DNA 1㎕를 취한다. 나머지는 나중에 사용하기 위해 -20℃에서 저장한다.
· 염기서열분석 프로토콜
- 염기서열분석 반응 혼합액 제조
1. BigDye 3.1을 암소(dark place)의 얼음 중에서 녹인다.
2. 튜브(15㎖ 에펜도르프 튜브)에서 하기 표 11의 조성으로 매스터 혼합액을 제조한다. 물, 완충액, DMSO 및 BigDye는 이 순서로 첨가해야 한다.
3. 각 시약을 첨가할 때는 조심스럽게 피펫 조작을 반복하여 시약을 혼합하는 것이 매우 중요하다.
4. 염기서열분석용 범용 프라이머를 사용하는 경우, 상기 프라이머는 매스터 혼합액에 동시에 첨가할 수도 있다. 상기 프라이머가 특이적인 경우에는, 상기 매스터 혼합액을 384-웰 플레이트에 넣은 후에 개별적으로 첨가해야 한다.
5. 통상 전체 384-웰 플레이트 반응용으로, 약 415개의 반응에 충분한 매스터 혼합액을 제조한다.
6. 상기 매스터 혼합액이 셋업되는 즉시, 그 혼합액을 8 웰의 스트립 튜브에 나누어 넣는다(매스터 혼합액을 분취하는데 저장액을 사용하지 말 것. 그것은 폐시약일 수 있음.)
7. 멀티채널 피펫을 사용하여 상기 매스터 시약을 384-웰 플레이트로 분취할 수 있다.
8. 매스트 혼합액 플레이트를 회전시켜 기포를 제거한다.
9. 멀티채널 피펫을 사용하여, 염기서열분석할 PCR 산물을 첨가한다. 피펫 조작을 반복하여 확실히 혼합한다.
10. 플레이트를 회전시켜 기포를 제거한다.
11. 하기 표 12의 주기를 이용하여 증폭시킨다.
<표 11>
Figure 112006079008015-PCT00015
<표 12> 염기서열분석용 증폭 주기
Figure 112006079008015-PCT00016
·Cleanseq 마그네틱 비드 클린업을 통한 클린업
1. Cleanseq 마그네틱 비드 플레이트를 비드 침전물이 없어질 때까지 진탕혼합한다.
2. Biomek사의 Cleanseq 384-웰 플레이트 프로그램을 이용하여 시료를 클린업한다.
3. 상기 프로그램이 수행되는 즉시, 오리지널 플레이트를 -20℃에 보관한다. ABI 3730상에서의 진행을 위해, 상기 클린업 시료를 포함하는 새로운 플레이트를 을 준비한다.
(주: PCR 산물이 300bp보다 짧은 경우, 그것을 ABI 3730상에 넣기 전에 시료를 희석해야 한다.)
·EGFR 시험용 돌연변이 조사 주형(Mutation Surveyor Template)을 제조하여 LMM/Sequencing/Sequences-MS Review/EGFR 상에 보관한다.
·반복 결과 기준
모든 양성 결과는, 오리지널 조직 시료 유래의 환자 DNA의 두번째 분취표본으로부터 DNA 서열 변화가 검출된 특이적인 엑손을 증폭 및 염기서열분석함에 의해, 반복된다. 또한, 상기 검출된 서열 변화가 제피티니브 또는 에를티니브-반응자에게서 사전에 검출되지 않은 경우, 환자의 혈액 시료로부터 추출한 DNA를 종양 조직과 비교하기 위해 병행하여 증폭시켜야 한다.
분명한 염기서열을 생성하지 못한 엑손은, 특정한 기술적 문제점에 근거하여, 추출, PCR 또는 염기서열분석 중 어느 하나를 반복한다.
·평가 파라미터
시험의 민감성 - 체세포 EGFR 키나제 도메인 돌연변이는 NSCLC를 가진 개체 의 대략 13% 정도에서 확인되었다(Paez JG et al., 2004). 또한, 체세포 EGFR 키나제 도메인 돌연변이는 제피티니브 반응성이 있는 NSCLC를 가진 14명의 개체 중 13명(92.8%)에서 확인되었다(Paez JG et al, 2004, Lynch, et al., 2004). 알려진 돌연변이에 대해 100% 민감성을 나타낸 상기 시험의 기술적 민감성의 확인 및 본 발명자 실험실의 염기서열분석대(sequencing platform)의 확인은 100% 민감성을 보인다(하기 "방법의 정확성" 참조).
모자이크 시료의 돌연변이 검출을 위한 민감성은 25%인 것으로 결정되었다(즉, 이형접합성 돌연변이는 세포 혼합물 중 50% 존재하는 경우에 검출될 수 있다.). 본 발명자들은 파라핀 포매 조직 중의 20% 정도는 고품질의 DNA를 얻지 못함을 알아내었다. 이들 시료로부터는 서열 정보를 얻을 수 없었다.
시험의 특이성 - 공개된 문헌에서는 EGFR에 체세포 돌연변이가 없는 개체는 제피티니브에 대한 응답성이 없음을 기재하고 있다(11/11). 양방향 염기서열분석의 결과에 기인하여 돌연변이를 발견할 가능성(chance)은 0%에 가깝다(하기 "방법의 정확성" 참조). 이처럼, 본 발명의 시험의 특이성은 거의 100%이다.
방법의 정확성 - DNA 염기서열분석 방법은 분자적 진단에 있어서의 금본위제(gold standard)에 해당한다. 본 발명자의 실험실은 98.5%의 정확도를 갖는 것으로 보고된 ABI 3730 DNA 애널라이저를 사용한다. 본 발명자들은, 이것과 양방향 염기서열분석, 자동 크로마토그램 분석과 돌연변이 조사(Mutation Surveyor), 및 위양성의 매뉴얼 분석을 조합하여, 100%의 정확도를 얻었다. 이것은 10만 염기 이상의 원료 염기서열 분석을 기준으로 한다. 이 측정법의 상세한 내용에 대해서는, 본 발명의 품질 보장 프로그램 매뉴얼을 참고한다.
주: 본 발명자들은 이러한 결과들이 본 발명의 실험대의 100% 정확성을 보장한다고는 생각하지 않는다. 염기서열분석 오류는 일어날 수 있으며, 따라서, 대용량 염기서열분석 프로젝트에 의해 99.99%의 정확성이 확인되었음을 보고한다.
시험의 재현성 - 시험의 정확성에 기인하여, 결과를 얻은 경우, 그 결과들은 시험의 정확성(99.99%)에 필적하는 재현성이 있다. 그러나, 경우에 따라서, 하기에 열거한 인자들(하기 '방법의 한계' 참조) 또는 설명할 수 없는 기술적 이유에 의한 PCR 또는 염기서열분석의 실패에 의해 시험이 실패할 수 있다. 이러한 경우, 아무런 결과가 얻어지지 않으며, 결과가 얻어질 때까지 측정(assay)을 반복하거나 또는 환자 표본을 적용불가(unacceptable)로 간주한다. 본 발명의 품질 보장 프로그램 매뉴얼(Quality Assurance Program manual)에 따른 확인 보고서에서는 각 측정 단계 및 표본이 특정한 비율로 실패함을 확인할 수 있다.
결과들의 정상 범위 - EGFR 유전자의 정상 염기서열은 유전자은행 접근법(GenBank accession)을 사용하여 온라인 상에서 확인할 수 있다: NT_033968.5(게놈 염기서열) 및 NM_005228.3(mRNA 염기서열).
·방법의 한계
하나 이상의 엑손에 걸쳐있는 대량의 결실은, 특히 그것이 이형접합체에 존재하는 경우, 상기 염기서열분석법으로는 검출되지 않는다. 상기 키나제 도메인의 EGFR 유전자 바깥쪽(outside)에서의 돌연변이는 이 측정법에 의해 검출되지 않는다. PCR에 의한 증폭을 방해하는 저해제가 DNA 시료 중에 존재할 수 있다. 분해된 DNA(degrated DNA)는 분석가능한 데이터를 생성하지 못할 수 있으며 표본을 다시 제출해야 할 수도 있다. 드문 염기서열 변이(rare sequence variation)나 표적 프라이머 염기서열의 2차 구조는 PCR 증폭에 영향을 미칠 수 있으며 그 결과 돌연변이(들)가 하나의 대립유전자 영역내에서 빠져버릴 수 있다.
[실시예 6]
제피티니브(IressaTM)는 표피성장인자 수용체(EGFR)를 표적으로 하는 티로신 키나제 저해제이며, EGFR 키나제 도메인내에 활성화 돌연변이를 가진 비소세포 폐암(NSCLC)에서 극적인 임상적 반응을 유도한다. 본 발명자들은, 이러한 EGFR 변이체는 세포 생존(cell survival)을 촉진하는 Akt 및 STAT 신호전달 경로를 선택적으로 활성시키지만, 세포 증식(proliferation)을 유도하는 Erk/MAPK 신호전달에 대해서는 효과가 없는 것으로 보고한다. EGFR 변이체를 발현하는 NSCLC는 EGFR 변이체의 siRNA-매개 넉다운(knockdown) 또는 Akt 및 STAT 신호전달의 약리작용 저해제로 치료 후에, 심한 세포사멸(apoptosis)을 경험하였으며, 종래의 화학요법 약제에 의 해 유도된 세포사멸에 대해서는 비교적 내성을 나타내었다. 따라서, EGFR 변이체는 생존 신호를 선택적으로 전달(transduce)하며 NSCLC는 이 생존신호에 좌우된다; 결국, 제피티니브에 의한 그들의 신호 저해는 현저한 임상적 반응의 근간이 된다.
EGFR 군(EGFR family)의 수용체 티로신 키나제는 증식, 생존, 이동, 및 분화를 포함하는 세포의 필수적인 기능을 조절하며, 고형 종양의 병인 및 진행에 있어서 중심적인 역할을 한다(R. N. Jorissen et al. Exp . Cell . Res. 284, 21(2003), H. S. Earp, T. L. Dawson, X. Li, H. Yu, Breast Cancer Res . Treat. 35, 115(1995)). EGFR은 유방, 폐, 직장, 난소, 및 뇌 종양에서 빈번하게 과다발현되며, 이는 촉매 도메인 내의 ATP 포켓과 결합함으로써 EGFR 키나제 활성을 저해하는 제피티니브 등의 특정 약리작용 저해제의 발달(development)을 촉진한다(A. E. Wakeling et. al., Cancer Res. 62, 5749(2002)). 제피티니브는 화학요법-난치성 NSCLC를 가진 환자의 대략 10%에서 극적인 임상 반응을 유도하였다(J. Baselga et al., J. Clin . Oncol. 20, 4292(2002), M. Fukuoka et al., J. Clin . Oncol. 21, 2237(2003), G. Giaccone et al., J Clin Oncol. 22, 777(2004), M. G. Kris et al., JAMA 290, 2149(2003)). 실질적으로 모든 제피티니브 반응성 폐암은 EGFR 키나제 도메인내에 체세포 돌연변이를 보유하는 반면, 비반응성 사례에서는 돌연변이가 확인되지 않았다(T. J. Lynch at al., N. Engl . J. Med. 350, 2129(2004), J. G. Paez et al., Science 304, 1497(2004)). 이러한 이형접합성 돌연변이들은 ATP-결합 포켓에 군집되어 있는 작은 인프레임 결실 및 미스센스 치환을 포함한다.
본 발명자들은, EGFR 돌연변이의 과도 트랜스펙션(transient transfection) 을 이용하여, 두 종류의 돌연변이가 증가된 EGF-의존적 수용체 활성화를 유도하며, 이는 EGFR의 두드러진 C-말단 인산화 부위 중의 하나인 Y1068의 자가인산화에 의해 측정되었음을 앞서 보고하였다(T. J. Lynch et al. N. Engl . J. Med. 350, 2129 (2004)).
EGFR 변이체에 의한 신호전달에 있어서 질적 차이 연구를 가능하게 하기 위해서, 본 발명자는 야생형 EGFR 또는 EGFR 변이체를 발현하는 비형질전환 마우스의 유방 표피 세포(NMuMg)의 안정한 세포주를 생성하여, 별개의 하류 영향인자(downstream effector)의 활성화에 관련된 다중 티로신 키나제의 EGF-매개 자동 인산화를 분석하였다(R. N. Jorissen et al. Exp . Cell Res. 284, 31(2003)). 제피티니브 반응성 환자 유래의 종양에서 검출된 두개의 재발 돌연변이 중의 하나 또는 야생형 EGFR 중의 어느 하나를 발현하는 세포주가 생성되었다: 미스센스 돌연변이 L858R 및 18bp 인프레임 결실, delL747-P753insS. 야생형 EGFR과 상기 두개의 EGFR 변이체 사이에, 여러 C-말단 부위에서, 현저하게 다른 티로신 인산화 패턴이 관찰되었다. Y1045와 Y1173의 EGFR-유도 인산화는 실질적으로 EGFR 야생형과 EGFR 변이체 사이에 구별할 수 없는 반면, Y992 및 Y1068의 인산화는 실질적으로 변이체 둘다에서 증가하였다. 흥미롭게도, Y845는 L858R 미스센스 변이체에서 고도로 인산화되었으나 야생형 또는 결실 변이체에서는 인산화되지 않았으며, 따라서, 상기 두 종류의 EGFR 돌연변이 사이를 구별하는데 특이적인 것으로 나타났다. 야생형 및 돌연변이 수용체에서 보이는 상이한 EGF-유도 티로신 인산화 패턴은 과도 트랜스펙트된 COS7 세포에서 재현가능하였으며, 세포종류에 특이적인 잠정적인 효과를 확보하였다.
따라서, 제피티니브 민감성 EGFR 변이체는 야생형 EGFR에 의해 매개되는 것들과는 질적으로 다른 신호를 전달한다. 이러한 차이는 기질 특이성에 영향을 미치는 촉매 포켓내에서의 구조적 변화, 또는 EGFR 신호전달을 조절하는 보조 단백질과의 변경된 상호작용으로부터 직접 일어날 수 있다.
EGFR 변이체에 의해 안정적으로 트랜스펙트된 세포주를 확립함으로써, 공유한(shared) 세포 배경에서의 EGFR의 주요 하류(downstream) 표적의 인산화 상태를 비교할 수 있다. Ras를 통한 Erk1 및 Erk2, PLCγ/PI3K를 통한 Akt, 및 JAK2를 통한 STAT3 및 STAT5의 EGF-유도 활성화는 EGFR의 발암 효과를 매개하는 필수적인 하류(downstream) 경로이다(R. N. Jorissen et al., Exp . Cell Res. 284, 31(2003)). EGF-유도 Erk 활성화는, 야생형 EGFR 또는 2개의 활성화 EGFR 변이체 중의 어느 하나를 발현하는 세포 중에서는 본질적으로 구별할 수 없었다. 대조적으로, Akt 및 STAT5 둘다의 인산화는 상기 EGFR 변이체 중 어느 하나를 발현하는 세포에서 실질적으로 증강되었다. STAT3의 증가된 인산화는 EGFR 변이체를 발현하는 세포에서도 마찬가지로 관찰되었다. 상기 EGFR 변이체에 의한 상기 비변경 Erk 활성화(unaltered Erk activation)는, Ras 활성화 및 후속 Erk 인산화를 유도하는 Shc 및 Grb-2 어뎁터(adaptor)에 대한 중요 도킹 부위인, Y1173의 증가된 인산화의 부재와 일치한다(R. N. Jorissen et al., Exp . Cell Res. 284, 31(2003)). 상기 EGFR 변이체의 활성화 후에 증가된 Akt 및 STAT 인산화는, 이미 Akt 및 STAT 활성화에 연결되어있는 Y992 및 Y1068 인산화의 증가와 일치하였다(R. N. Jorissen et al., Exp . Cell Res. 284, 31(2003)). 따라서, EGFR 변이체내의 C-말단 잔기의 선택적 EGF-유도 자가인산화는 하류 신호전달 경로의 선택적 활성화와 상당히 상관관계가 있다.
이러한 관찰을, EGFR 돌연변이가 종양발생을 유도하는 것으로 나타난 폐암세포로 확장시키기 위해서, 본 발명자들은 5개의 NSCLC 종양으로부터 유래하는 세포주를 연구하였다. NCI-H1975는 재발 이형접합성 미스센스 돌연변이 L858R을 보유하며, NCI-H1650은 인프레임 결실 delE746-A750를 갖는 반면, NCI-H358, NCI-H1666, 및 NCI-H1734는 야생형 EGFR를 발현한다. 트랜스펙트된 세포에서와 같이, Y992 및 Y1068의 EGF-유도 자가인산화는 내인성 EGFR 돌연변이를 가진 두개의 세포주에서 현저히 증강하였으며, 이는 Erk가 아니라, Akt 및 STAT5의 인산화였다.
EGFR의 발암 활성은 세포 증식과 세포 생존 모두를 촉진시키는 신호의 활성화를 나타낸다(S. Grant, L. Qiao, P. Dent, Front . Biosci. 7, d376(2002)). 이러한 경로가 중첩(overlap)되어 나타나지만, Erk 키나네의 Ras-매개 활성화는 실질적으로 EGFR의 증식 활성에 기여하는 반면, Akt 및 STAT의 활성화는 항 세포사멸 기능(anti-apoptotic function)과 상당히 연관되어 있다(S. Grant, L. Qiao, P. Dent, Front . Biosci. 7, d376(2002), F. Chang et al., Leukemia 17, 1263(2003), F. Chang et al., Leukemia 17, 590(2003), F. Chang et al., Int . J. Oncol. 22, 469(2003), V. Calo et al., J. Cell Physiol. 197, 157(2003), T. J. Ahonen et al., J. Biol . Chem . 278, 27287(2003)). EGFR 돌연변이를 보유하고 있는 상기 두개의 폐암 세포주는, 야생형 수용체를 가진 세포에서는 관찰되지 않은, 낮은 혈 청(serum) 농도에서의 EGF에 대한 증식 반응을 나타내었다. 그러나, 그들의 증식율 및 세포충실도(confluence)에서의 세포 밀도는 정상 혈청 농도에서와 거의 동등하였다.
SiRNA
반대로, 세포사멸 경로는 EGFR 변이체를 가진 폐암세포에서 현저히 다르다: 이들 세포주내에서의 EGFR 변이체의 siRNA-매개 특이적 불활성화 결과, 빠르게 대량의 세포사멸이 일어난다. delE746-A750-특이적 siRNA로 트랜스펙트된 NCI-H1650 세포와 마찬가지로, L858R-특이적 siRNA로 트랜스펙트된 NCI-H1975 세포의 약 90%가 96시간내에 죽었다. EGFR 돌연변이에 특이적인 siRNA는 상기 선택적 돌연변이(alternative mutation)를 발현하는 세포에서는 효과가 없었으며, 야생형과 돌연변이 EGFR 둘다를 표적으로 하는 siRNA는 단지 야생형 수용체만을 발현하는 세포의 생육성(viability)에 대해 최소한의 영향을 미치지만, EGFR 변이체를 발현하는 세포주에서는 급격한 세포사(cell death)를 유도하였다. 그 대응 EGFR 대립 유전자를 특이적으로 표적으로 삼는 siRNA의 능력은, 면역블로팅에 의해, 트랜스펙트된 COS7 세포에서 확인되었다. 따라서, EGFR 변이체의 발현은 이들 돌연변이를 보유하고 있는 폐암에서의 프로-세포사멸(pro-apoptotic) 신호의 억압(suppression)에 필수적인 것으로 나타난다. 또한, 야생형 수용체만을 발현하는 폐암세포는 EGFR 발현 시 유사한 의존성을 나타내지 않는다는 사실은, 야생형 EGFR을 과다발현하는 인간 종양의 상대적인 제피티니브-무감응성에 대해서 설명한다. EGFR 변이체를 보 유하는 폐암에서의 제피티니브의 유효성은, 이 세포들이 절대적으로 의존하고 있는 결정적인 항-세포사멸 경로의 저해는 물론, 돌연변이 수용체의 변경된 생화학적 특성을 모두 반영할 수 있다. 본 발명자들은 EGFR 변이체가 야생형 수용체보다 EGF-의존적 자가인산화의 제피티니브 저해에 더 민감함을 앞서 보고하였다(T. J. Lynch et al., N. Engl. J. Med. 350, 2129(2004)). 돌연변이 수용체에 의한 이러한 증가된 약제 민감성은 Erk 및 STAT5 활성화 둘다에서도 관찰되었다. 따라서, 돌연변이 수용체에 의한 EGF-유도 신호전달은 특정 자가인산화 반응을 거쳐 하류 영향인자의 선택적 활성화를 나타내지만, 그들의 제피티니브에 의한 증강된 저해는 균일하며, 변경된 약제의 ATP 포켓 변이체 대한 결합을 반영할 수 있다.
본 발명자들은, EGFR-매개 NSCLC 생존에 있어서의 증가된 Akt 및 STAT 신호전달의 관련성을 확립하기 위해서, 특이적인 약리작용 저해제를 이용하여 이 경로들을 표적으로 하였다. EGFR 돌연변이를 보유하고 있는 폐암세포는 야생형 수용체를 가진 세포보다 제피티니브에 100배 이상 민감하였다. 또한, EGFR 변이체를 발현하는 세포는 야생형 EGFR만을 발현하는 세포보다 Akt 또는 STAT 신호전달의 약리작용 저해에 더 민감하였다. EGFR 돌연변이 폐암 세포는 Akt/STAT-매개 항-세포사멸 신호의 교란(disruption)에 대한 증가된 민감성을 나타내었지만, 그들은 통상 사용되는 화학요법 약제인 독소루비신(doxorubicin) 및 시스플라틴(cisplatin), 및 프로-세포사멸 Fas-리간드에 의해 유도되는 세포사 신호에 대해 현저히 증가된 내성을 나타내었다.
EGFR 변이체를 가진 세포에서의 증강된 Akt/STAT 신호전달에 의해, 부가적인 치료 표적을 제공할 수 있는 한편, 종래의 화학요법이 이 종양들에 대해 덜 효과적일 수 있는 가능성을 높였다.
"종양유전자 중독(oncogene addiction)"은, 그들이 의존하고 있는 증식 신호를 억압한 후 종양 세포의 세포사멸을 설명하기 위해서 제안되었다(I. B. Weinstein, Science 297, 63(2002)). 흥미롭게도, 이마티니브(Imatinib)(GleevecTM)는 BCR-ABL 전위(translocation) 산물을 발현하는 만성 골수성 백혈병 및 활성화 c-Kit 돌연변이를 발현하는 위장관 기질 종양에서, 효율적으로 세포사를 야기하며, 둘다 상기 약제에 의해서 효과적으로 저해되는 구성적 STAT를 빈번하게 나타낸다(T. Kindler et al., Leukemia 17, 999(2003), G. P. Paner et al., Anticancer Res. 23, 2253(2003)). 마찬가지로, EGFR 키나제 돌연변이를 가진 폐암세포에 있어서, 제피티니브 반응성은 수용체 변이체에 의해 전달된 필수적인 항-세포사멸 신호의 효과적인 저해면에서 큰 부분을 차지할 수 있다.
재료 및 방법
면역블로팅( Immunoblotting )
배양 세포로부터 얻은 세포용해물(lysate)은, 프로테아제 저해제를 함유하는, 얼음속에서 차게한 RIPA 용해 용액(ice-cold RIPA lysis solution)(1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 10mM β-글리세롤 포스페이트, 10mM NaF, 1mM Na-오르토바나데이트)으로 제조하였다. 조직파편(debris)은 마이크로퓨저에서 4℃에서 12000 xg로 10분간 원심분리하여 제거하였다. 맑아진 용해물을 겔 로딩 완충액(gel loading buffer) 중에서 끓여서 10% SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 단백질은 니트로셀룰로스에 전기전달(electrotransfer)시킨 후, 특이적 항체를 이용하여 검출한 다음, 당근과산화효소-접합 2차 염소항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary goat antibody)와 배양하여(Cell signaling(Beverly, MA; 1:2000)), 증강된 화학발광(DuPont NEN)으로 현상하여 자가방사기록법(autoradiography)을 행한다. 포스포-EGFR Y845, Y992, Y1045, Y1068, 포스포-STAT5(tyr694), 포스포-AKT(Ser473), 포스포-ERK1/2(Thr202/Tyr204), AKT, STAT5, 및 ERK1/2 항체는 New England Biolab(Beverly, MA)으로부터 얻었다. 총 EGFR Ab-20 항체는 NeoMarkers(Fremont, CA)로부터 얻었다. 포스포-EGFR Y1173 항체는 Upstate Biotechnology(Lake Placid, NY)으로 부터 얻었고 총 포스포티로신 항체 PY-20은 Transduction Laboratories(Lexington, KY)로부터 얻었다. 모든 항체는 1:1000으로 희석하여 사용하였다.
EGFR 발현 벡터
야생형, L858 또는 del L747-P753insS 돌연변이를 코딩하는 전장 EGFR 야생형 발현 구조체를, 표준 방법을 사용하여 플라스미드 pUSEamp내로 서브클로닝하였다. 모든 구조체는 DNA 염기서열 분석에 의해 확인하였다.
세포주 및 트랜스펙션
COS7 세포 및 NMuMg(정상 마우스 유방 상피) 세포를, 2mM L-글루타민 및 50U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신의 존재 하에 10%의 소태아혈청을 함유하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's media)에서 성장시켰다. 상기 NCI-H358, NCI-H1650, NCI-H1734, NCI-H1666, 및 NCI-H1975 인간 폐암 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)의 콜렉션으로부터 얻은 후, 10% 소태아혈청, 2mM L-글루타민, 50U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 및 1mM 피루브산나트륨을 함유하는 RPMI1640에서 성장시켰다. 이들은, 본 명세서내에서, H358, H1650, H1734, H1666, 및 H1975와 같이 각각 약칭한다. COS7 세포의 과도 트랜스펙션은 Lipopectamin 2000(Invitrogen; Carlsbad, CA)을 사용하여 수행하였다. 플라스미드(1㎍)는 10cm 디쉬상에서 80%의 세포충실도(confluence)로 세포내에 트랜스펙션시켰다. 12시간 후, 상기 세포를 수확하여 혈청이 없는 12-웰 플레이트에 재접종하였다. 다음날, 30ng/㎖의 EGF로 세포를 자극하였다. 안정한 NMuMg 세포주는 EGFR 발현 구조체와 약제-선별가능 플라스미드 pBABE puro를 함께 트랜스펙션시켜 제조한 다음, 3㎍/㎖ 푸로마이신(puromycin) 중에서 선별하였다. 약제 내성 세포의 풀(pool)을 분석용으로 사용하였다. 안정하게 트랜스펙트된 세포내에서의 EGFR 발현은 면역블로팅에 의해 확인하였다.
EGFR 발현의 SiRNA -매개 "녹다운( knockdown )"
EGFR L858R에 대한 siRNA는 누클레오티드 염기서열 CACAGATTTTGGGCGGGCCAA (서열번호 688)를 표적으로 하여 설계하였으며, GCTATCAAAACATCTCCGAAA(서열번호 689) 염기서열은 delE745-A750(Qiagen; Valencia, CA)용으로 사용하였다. EGFR의 모든 형태를 표적으로 하기 위해서는, 인간 야생형 EGFR에 대응하는 시판 siRNA를 Dharmcon(Lafayette.co)으로부터 입수하였다. siRNA의 트랜스펙션은 리포펙타민 2000(Lipofactamine 2000)(Invitrogen)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 세포는 MTT 측정법을 사용하여 96시간 후의 생존율에 대하여 측정하였다.
세포사멸 측정( Apoptosis assay )
10,000 세포를 96-웰 플레이트의 개별 웰에 접종하였다. 6시간 후, 배지를 바꾸어, 증가된 농도의 독소루비신(Sigma; St.Louis, MO), 시스플라틴(Sigma), Fas-리간드(인간 활성화, 클론 CH11; Upstate Biotechnology), Ly294002(Sigma), 또는 AG490(Calbiochem; La Jolla, CA) 존재 하에 세포를 유지하였다. 96시간 후, 세포의 생존율은 MTT 측정법을 이용하여 결정하였다. 카스파제 면역염색(caspase immunostaining)을 위해, 10mm 커버슬립(coverslip)상에 10,000개의 세포를 접종하였다. 다음날 siRNA로 트랜스펙션시켰다(상기에 상세히 기재되어 있음). 72시간 후, 실온에서 10분간 4% 파라포름알데히드 중에서 세포를 고정시켰다. 이어서, 0.5% 트리톤 X-100에서 5분간 침투시킨(permeabilized) 다음, 5% 정상염소혈청(NGS)에서 1시간 동안 블럭(block)시켰다. 그 다음, 상기 커버슬립을, 1:100으로 희석한 1차 항체(Cell Signaling사제의 분할(cleaved) 카스파제-3 Asp175 5A1) 중에서, 4℃에서, 하룻밤 배양하였다. 다음날 상기 커버슬립을 PBS로 3회 세정하 고, 5% 정상염소혈청 및 0.5μg/㎖의 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 중에서, 1:250으로 희석한 2차 항체(염소 항-토기 텍사스-레드 접합; Jackson Immunoresearch 사제; West Grove, PA) 와 함께 1시간 동안 배양하였다. 상기 커브슬립을 PBS로 3회 세정한 후, 그 위에 Molecular Probes(Eugene, OR)사제의 ProLong Gold anti-fade 시약을 올려놓았다.
세포 생존율 측정
5mg/㎖ MTT(티아졸릴블루; Sigma) 용액 10㎕를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 배양한 후, 상기 배지를 제거하고, 각 웰에 100㎕의 산성 이소프로판올(0.1N HCl)을 첨가하여 상기 MTT를 가용화(solubilize)시켰다. 흡광도는 570nm에서의 분광광도 분석에 의해 결정하였다.
성장 곡선
H-358, H-1650, H-1734, H-1666, 및 H-1975 세포의 성장 곡선은 96-웰 플레이트의 개별 웰에 1000개의 세포를 접종하여 얻었다. 각 세포주는 8개의 별개의 웰에서 평판배양하였다. 수일이 경과한 후, 상기 세포를 4% 포름알데히드 중에서 고정시킨 후 0.1%(w/v)의 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 상기 크리스탈 용액은 10% 아세트산 100㎕에 용해시켰으며, 상대 세포수를 결정하기 위해 플레이트 리더를 사용하여 570nm에서의 흡광도를 측정하였다.
돌연변이 동정
EGFR 내에 돌연변이를 보유하고 있는 산발성 NSCLC 세포주를 동정하기 위해, 본 발명자들은 15개의 NSCLC 세포주 패널(panel)내의 엑손 19 및 21을, 상기한 바와 같이, 염기서열분석하였다. 세포주는 흡연이력에 관계없는 기관지폐포 세포조직(bronchoalveolar histology)을 가진 종양(NCI-H358, NCI-H650, NCI-H1650) 또는 비흡연자 중에서 발생한 선암종으로부터 유래한 것에 근거하여 분석용으로 선별하였다(NCI-H1435, NCI-H1563, NCI-H1651, NCI-H1734, NCI-H1793, NCI-H1975, NCI-H2291, NCI-H2342, NCI-H2030, NCI-H1838, NCI-H2347, NCI-H2023). NCI-H1666은 단지 야생형 EGFR만을 보유하는 것으로 보고되었다(상기 실시예 참조). 모든 세포주는 미국의 ATCC으로부터 얻을 수 있다.
명세서 전반에 걸쳐 여기에 인용된 참고자료는 전체적으로 참고로서 기재하였다.
[참 조]
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<표 1> 비소세포 폐암을 가진 9명의 환자의 특성 및 제피티니브에 대한 반응성
환자 번호 성별 제피티니브 치료시작 나이(년) 병리 종류 * 사전 치료 수 흡연 상태 † 치료 기간 (개월) 전체 생존 ‡ EGFR 돌연변이 ∫ 반응성¶
1 F 70 BAC 3 비흡연 15.6 18.8 있음 주요(major): 개선된 폐 병변
2 M 66 BAC 0 비흡연 >14.0 >14.0 있음 주요: 개선된 양측 폐 병변
3 M 64 Adeno 2 비흡연 9.6 12.9 있음 일부(partial): 개선된 폐병변 및 소프트-조직 덩어리
4 F 81 Adeno 1 이전흡연 >13.3 >21.4 있음 소수(minor): 개선된 흉막병변
5 F 45 Adeno 2 비흡연 >14.7 >14.7 있음 부분: 개선된 간 병변
6 M 32 BAC 3 비흡연 >7.8 >7.8 있음 주요: 개선된 폐 병변
7 F 62 Adeno 1 이전흡연 >4.3 >4.3 있음 부분 : 개선된 간 및 폐 병변
8 F 58 Adeno 1 이전흡연 11.7 17.9 있음 부분 : 개선된 간 병변
9 F 42 BAC 2 비흡연 >33.5 >33.5 없음 부분 : 개선된 폐 결절
* 기관지폐포 암종(BAC)의 요소를 가진 선암종(Adeno)은 BAC로서 기재한다.
†흡연상태는 시험개시 12개월내에 담배를 전혀 피우지 않은 환자는 이전흡연으로, 일생동안 100개피 이하로 피운 사람을 비흡연자로 규정하였다.
‡전체 생존은 제피티니브 치료시작부터 죽음까지 측정하였다,
∫EGFR은 표피성장인자 수용체 유전자를 나타낸다.
¶부분(partial)반응은 고형 종양에서의 반응 평가 기준을 사용하여 평가하였다; 주요(major) 및 소수(minor) 반응은 이러한 기준을 사용하여 반응이 측정할 수 없었던 환자에서는 두명의 의사에 의해서 평가하였다.
<표 2> 비소세포 폐암을 가진 환자의 EGFR의 티로신 키나제 도메인에서의 체세포 돌연변이
환자 돌연변이 돌연변이 효과
제피티니브에 대한 반응성을 가진 환자
환자 1 15개의 누클레오티드 결실 (2235-2249) 인프레임 결실(746-750)
환자 2 12개의 누클레오티드 결실 (2240-2251) 인프레임 결실(747-751) 및 세린 잔기의 삽입
환자 3 18개의 누클레오티드 결실 (2240-2257) 인프레임 결실(747-753) 및 세린 잔기의 삽입
환자 4 18개의 누클레오티드 결실 (2240-2257) 인프레임 결실(747-753) 및 세린 잔기의 삽입
환자 5 누클레오티드 2573의 T가 G로 치환 아미노산 치환(L858R)
환자 6 누클레오티드 2573의 T가 G로 치환 아미노산 치환(L858R)
환자 7 누클레오티드 2582의 T가 A로 치환 아미노산 치환(L861Q)
환자 8 누클레오티드 2155의 G가 T로 치환 아미노산 치환(G719C)
제피티니브에 노출하지 않은 환자 *
환자 A 18개의 누클레오티드 결실 (2240-2257) 인프레임 결실(747-753) 및 세린 잔기의 삽입
환자 B 15개의 누클레오티드 결실 (2235-2249) 인프레임 결실(746-750)
* 제피티니브에 노출하지 않은 25명의 환자(15명은 기관지폐포암, 7명은 선암종, 및 3명은 대세포 암종) 중에서, 2명(환자 A 및 B : 둘다 기관지폐포암을 가짐)은 EGFR 돌연변이를 갖는다. 다양한 조직 타입을 나타내는 14개의 폐암 세포주에서는 돌연변이가 발견되지 않았다: 비소세포 폐암(6개의 표본), 소세포 폐암(6개의 표본), 기관지 카르시노이드(1개의 표본), 및 불명 타입(1개의 표본). EGFR내에서 동정된 다형성 변이체(polymorphic variant)는 다음을 포함한다: 티로신 키나제 도메인 내의, 누클레오티드 1562의 G가 A로 치환, 누클레오티드 1887의 T가 A로 치환, 및 기능적 중요성이 알려지지 않은 배계열 변이체, 누클레오티드 2885의 G가 A로 치환.
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<110> THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC. <120> METHOD TO DETERMINE RESPONSIVENESS OF CANCER TO EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR TARGETING TREATMENTS <130> 030258-55145 <140> PCT/US05/10645 <141> 2005-03-31 <150> 60/558,218 <151> 2004-03-31 <150> 60/561,095 <151> 2004-04-09 <150> 60/565,753 <151> 2004-04-27 <150> 60/565,985 <151> 2004-04-27 <150> 60/574,035 <151> 2004-05-25 <150> 60/577,916 <151> 2004-06-07 <150> 60/592,287 <151> 2004-07-29 <160> 762 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggaaatatag ggaagggaag gaa 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ttgacagggt accaggagat ga 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctgaaccgcc aaggactcat 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ttttccctcc ctactaacac acg 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 actgatgccc tgaccctgtt 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cccatggttc cccactctt 19 <210> 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19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggttcaactg ggcgtccta 19 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ccttctccga ggtggaattg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 cgcaccatgg catctcttta 20 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 aaaacgatct ctatgtccgt ggt 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 cagccagcca aacaatcaga 20 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 tctttggagt cttcagaggg aaa 23 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tgtggtttcg ttggaagcaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 aattgacagc tcccccacag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 ggctttctga cgggagtcaa 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 ccacccaaag actctccaag a 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 cctttccatc acccctcaag 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 agtgccttcc cattgcctaa 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> 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<400> 43 gctttcccca ctcacacaca 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 caaacctcgg caatttgttg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 ccaccaatcc aacatccaga 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 tggcccagag ccatagaaac 20 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 ttccaagatc attctacaag atgtca 26 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 gcacattcag agattctttc tgc 23 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 tccaaatgag ctggcaagtg 20 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 tcccaaacac tcagtgaaac aaa 23 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 gtgcatcgct ggtaacatcc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 tgtggagatg agcagggtct 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 atcgcattca tgcgtcttca 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 atccccatgg caaactcttg 20 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 gctcagagcc tggcatgaa 19 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 catcctcccc tgcatgtgt 19 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 tggctcgtct gtgtgtgtca 20 <210> 58 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 cgaaagaaaa tacttgcatg tcaga 25 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 tgaagcaaat tgcccaagac 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 tgacatttct ccagggatgc 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 aagtgtcgca tcaccaatgc 20 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 atgcgatctg ggacacagg 19 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 ggcacctgct ggcaatagac 20 <210> 64 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 tgacttcata tccatgtgag tttcact 27 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 tataccctcc atgaggcaca 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 gggaaaaacc cacacaggaa 20 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 tcagaaccag 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atggggatta actgggatgt tg 22 <210> 316 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 316 cgtagctcca gacatcacta gca 23 <210> 317 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 317 gcaacctggt ctgcaaagtc tc 22 <210> 318 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 318 acccagcagt ccagcatgag 20 <210> 319 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 319 gagtttcagt gagccaagat cg 22 <210> 320 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 320 ttacaggctt gagccactag gc 22 <210> 321 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 321 aagcttccag gagacgaggt c 21 <210> 322 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 322 gtccctgaaa tccctcaaac c 21 <210> 323 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 323 tgctccataa acgtgactat tgc 23 <210> 324 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 324 gtaagagggt gggctggaat ct 22 <210> 325 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 325 cttagaccat gtccgggaaa ac 22 <210> 326 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 326 cacatcactc tggtgggtga ac 22 <210> 327 <211> 22 <212> DNA 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aaagccaac 39 <210> 496 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 496 tttgggctgg ccaaactgct gggt 24 <210> 497 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 497 aaaattcccg tcgctatcaa ggaatcatct ccgaaagcca ac 42 <210> 498 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 498 tttgggctgg ccaaactgct gggt 24 <210> 499 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 499 aaaattcccg tcgctatcaa ggaatcgaaa gccaac 36 <210> 500 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 500 tttgggctgg ccaaactgct gggt 24 <210> 501 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 501 aaaattcccg tcgctatcaa ggaattaaga gaagcaacat ctccgaaagc caac 54 <210> 502 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 502 tttgggcggg ccaaactgct gggt 24 <210> 503 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 503 aaaattcccg tcgctatcaa ggaattaaga gaagcaacat ctccgaaagc caac 54 <210> 504 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 504 tttgggctgg ccaaacagct gggt 24 <210> 505 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 505 gcaatatcag ccttaggtgc ggctc 25 <210> 506 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 506 catagaaagt gaacatttag gatgtg 26 <210> 507 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 507 ctaacgttcg ccagccataa gtcc 24 <210> 508 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 508 gctgcgagct cacccagaat gtctgg 26 <210> 509 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 509 Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys 1 5 10 15 Ala Asn <210> 510 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 510 Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly 1 5 <210> 511 <211> 3878 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (246)..(3875) <400> 511 cccggcgcag cgcggccgca gcagcctccg ccccccgcac ggtgtgagcg cccgacgcgg 60 ccgaggcggc cggagtcccg agctagcccc ggcggccgcc gccgcccaga ccggacgaca 120 ggccacctcg tcggcgtccg cccgagtccc cgcctcgccg ccaacgccac aaccaccgcg 180 cacggccccc tgactccgtc cagtattgat cgggagagcc ggagcgagct cttcggggag 240 cagcg atg cga ccc tcc ggg acg gcc ggg gca gcg ctc ctg gcg ctg ctg 290 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 gct gcg ctc tgc ccg gcg agt cgg gct ctg gag gaa aag aaa gtt tgc 338 Ala Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys 20 25 30 caa ggc acg agt aac aag ctc acg cag ttg ggc act ttt gaa gat cat 386 Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His 35 40 45 ttt ctc agc ctc cag agg atg ttc aat aac tgt gag gtg gtc ctt ggg 434 Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly 50 55 60 aat ttg gaa att acc tat gtg cag agg aat tat gat ctt tcc ttc tta 482 Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu 65 70 75 aag acc atc cag gag gtg gct ggt tat gtc ctc att gcc ctc aac aca 530 Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr 80 85 90 95 gtg gag cga att cct ttg gaa aac ctg cag atc atc aga gga aat atg 578 Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met 100 105 110 tac tac gaa aat tcc tat gcc tta gca gtc tta tct aac tat gat gca 626 Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala 115 120 125 aat aaa acc gga ctg aag gag ctg ccc atg aga aat tta cag gaa atc 674 Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile 130 135 140 ctg cat ggc gcc gtg cgg ttc agc aac aac cct gcc ctg tgc aac gtg 722 Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val 145 150 155 gag agc atc cag tgg cgg gac ata gtc agc agt gac ttt ctc agc aac 770 Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn 160 165 170 175 atg tcg atg gac ttc cag aac cac ctg ggc agc tgc caa aag tgt gat 818 Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp 180 185 190 cca agc tgt ccc aat ggg agc tgc tgg ggt gca gga gag gag aac tgc 866 Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys 195 200 205 cag aaa ctg acc aaa atc atc tgt gcc cag cag tgc tcc ggg cgc tgc 914 Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys 210 215 220 cgt ggc aag tcc ccc agt gac tgc tgc cac aac cag tgt gct gca ggc 962 Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly 225 230 235 tgc aca ggc ccc cgg gag agc gac tgc ctg gtc tgc cgc aaa ttc cga 1010 Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg 240 245 250 255 gac gaa gcc acg tgc aag gac acc tgc ccc cca ctc atg ctc tac aac 1058 Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn 260 265 270 ccc acc acg tac cag atg gat gtg aac ccc gag ggc aaa tac agc ttt 1106 Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe 275 280 285 ggt gcc acc tgc gtg aag aag tgt ccc cgt aat tat gtg gtg aca gat 1154 Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp 290 295 300 cac ggc tcg tgc gtc cga gcc tgt ggg gcc gac agc tat gag atg gag 1202 His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu 305 310 315 gaa gac ggc gtc cgc aag tgt aag aag tgc gaa ggg cct tgc cgc aaa 1250 Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys 320 325 330 335 gtg tgt aac gga ata ggt att ggt gaa ttt aaa gac tca ctc tcc ata 1298 Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile 340 345 350 aat gct acg aat att aaa cac ttc aaa aac tgc acc tcc atc agt ggc 1346 Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly 355 360 365 gat ctc cac atc ctg ccg gtg gca ttt agg ggt gac tcc ttc aca cat 1394 Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His 370 375 380 act cct cct ctg gat cca cag gaa ctg gat att ctg aaa acc gta aag 1442 Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys 385 390 395 gaa atc aca ggg ttt ttg ctg att cag gct tgg cct gaa aac agg acg 1490 Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr 400 405 410 415 gac ctc cat gcc ttt gag aac cta gaa atc ata cgc ggc agg acc aag 1538 Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys 420 425 430 caa cat ggt cag ttt tct ctt gca gtc gtc agc ctg aac ata aca tcc 1586 Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser 435 440 445 ttg gga tta cgc tcc ctc aag gag ata agt gat gga gat gtg ata att 1634 Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile 450 455 460 tca gga aac aaa aat ttg tgc tat gca aat aca ata aac tgg aaa aaa 1682 Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys 465 470 475 ctg ttt ggg acc tcc ggt cag aaa acc aaa att ata agc aac aga ggt 1730 Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly 480 485 490 495 gaa aac agc tgc aag gcc aca ggc cag gtc tgc cat gcc ttg tgc tcc 1778 Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser 500 505 510 ccc gag ggc tgc tgg ggc ccg gag ccc agg gac tgc gtc tct tgc cgg 1826 Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg 515 520 525 aat gtc agc cga ggc agg gaa tgc gtg gac aag tgc aac ctt ctg gag 1874 Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu 530 535 540 ggt gag cca agg gag ttt gtg gag aac tct gag tgc ata cag tgc cac 1922 Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His 545 550 555 cca gag tgc ctg cct cag gcc atg aac atc acc tgc aca gga cgg gga 1970 Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly 560 565 570 575 cca gac aac tgt atc cag tgt gcc cac tac att gac ggc ccc cac tgc 2018 Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys 580 585 590 gtc aag acc tgc ccg gca gga gtc atg gga gaa aac aac acc ctg gtc 2066 Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val 595 600 605 tgg aag tac gca gac gcc ggc cat gtg tgc cac ctg tgc cat cca aac 2114 Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn 610 615 620 tgc acc tac gga tgc act ggg cca ggt ctt gaa ggc tgt cca acg aat 2162 Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn 625 630 635 ggg cct aag atc ccg tcc atc gcc act ggg atg gtg ggg gcc ctc ctc 2210 Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu 640 645 650 655 ttg ctg ctg gtg gtg gcc ctg ggg atc ggc ctc ttc atg cga agg cgc 2258 Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg 660 665 670 cac atc gtt cgg aag cgc acg ctg cgg agg ctg ctg cag gag agg gag 2306 His Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu 675 680 685 ctt gtg gag cct ctt aca ccc agt gga gaa gct ccc aac caa gct ctc 2354 Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu 690 695 700 ttg agg atc ttg aag gaa act gaa ttc aaa aag atc aaa gtg ctg ggc 2402 Leu Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly 705 710 715 tcc ggt gcg ttc ggc acg gtg tat aag gga ctc tgg atc cca gaa ggt 2450 Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly 720 725 730 735 gag aaa gtt aaa att ccc gtc gct atc aag gaa tta aga gaa gca aca 2498 Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr 740 745 750 tct ccg aaa gcc aac aag gaa atc ctc gat gaa gcc tac gtg atg gcc 2546 Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala 755 760 765 agc gtg gac aac ccc cac gtg tgc cgc ctg ctg ggc atc tgc ctc acc 2594 Ser Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr 770 775 780 tcc acc gtg cag ctc atc acg cag ctc atg ccc ttc ggc tgc ctc ctg 2642 Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu 785 790 795 gac tat gtc cgg gaa cac aaa gac aat att ggc tcc cag tac ctg ctc 2690 Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu 800 805 810 815 aac tgg tgt gtg cag atc gca aag ggc atg aac tac ttg gag gac cgt 2738 Asn Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg 820 825 830 cgc ttg gtg cac cgc gac ctg gca gcc agg aac gta ctg gtg aaa aca 2786 Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr 835 840 845 ccg cag cat gtc aag atc aca gat ttt ggg ctg gcc aaa ctg ctg ggt 2834 Pro Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly 850 855 860 gcg gaa gag aaa gaa tac cat gca gaa gga ggc aaa gtg cct atc aag 2882 Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys 865 870 875 tgg atg gca ttg gaa tca att tta cac aga atc tat acc cac cag agt 2930 Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser 880 885 890 895 gat gtc tgg agc tac ggg gtg act gtt tgg gag ttg atg acc ttt gga 2978 Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly 900 905 910 tcc aag cca tat gac gga atc cct gcc agc gag atc tcc tcc atc ctg 3026 Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu 915 920 925 gag aaa gga gaa cgc ctc cct cag cca ccc ata tgt acc atc gat gtc 3074 Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val 930 935 940 tac atg atc atg gtc aag tgc tgg atg ata gac gca gat agt cgc cca 3122 Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro 945 950 955 aag ttc cgt gag ttg atc atc gaa ttc tcc aaa atg gcc cga gac ccc 3170 Lys Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro 960 965 970 975 cag cgc tac ctt gtc att cag ggg gat gaa aga atg cat ttg cca agt 3218 Gln Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser 980 985 990 cct aca gac tcc aac ttc tac cgt gcc ctg atg gat gaa gaa gac atg 3266 Pro Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met 995 1000 1005 gac gac gtg gtg gat gcc gac gag tac ctc atc cca cag cag ggc ttc 3314 Asp Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe 1010 1015 1020 ttc agc agc ccc tcc acg tca cgg act ccc ctc ctg agc tct ctg agt 3362 Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser 1025 1030 1035 gca acc agc aac aat tcc acc gtg gct tgc att gat aga aat ggg ctg 3410 Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu 1040 1045 1050 1055 caa agc tgt ccc atc aag gaa gac agc ttc ttg cag cga tac agc tca 3458 Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser 1060 1065 1070 gac ccc aca ggc gcc ttg act gag gac agc ata gac gac acc ttc ctc 3506 Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu 1075 1080 1085 cca gtg cct gaa tac ata aac cag tcc gtt ccc aaa agg ccc gct ggc 3554 Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly 1090 1095 1100 tct gtg cag aat cct gtc tat cac aat cag cct ctg aac ccc gcg ccc 3602 Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro 1105 1110 1115 agc aga gac cca cac tac cag gac ccc cac agc act gca gtg ggc aac 3650 Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn 1120 1125 1130 1135 ccc gag tat ctc aac act gtc cag ccc acc tgt gtc aac agc aca ttc 3698 Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe 1140 1145 1150 gac agc cct gcc cac tgg gcc cag aaa ggc agc cac caa att agc ctg 3746 Asp Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu 1155 1160 1165 gac aac cct gac tac cag cag gac ttc ttt ccc aag gaa gcc aag cca 3794 Asp Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro 1170 1175 1180 aat ggc atc ttt aag ggc tcc aca gct gaa aat gca gaa tac cta agg 3842 Asn Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg 1185 1190 1195 gtc gcg cca caa agc agt gaa ttt att gga gca tga 3878 Val Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1200 1205 1210 <210> 512 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 512 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu 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aaccccgcgc 3600 ccagcagaga cccacactac caggaccccc acagcactgc agtgggcaac cccgagtatc 3660 tcaacactgt ccagcccacc tgtgtcaaca gcacattcga cagccctgcc cactgggccc 3720 agaaaggcag ccaccaaatt agcctggaca accctgacta ccagcaggac ttctttccca 3780 aggaagccaa gccaaatggc atctttaagg gctccacagc tgaaaatgca gaatacctaa 3840 gggtcgcgcc acaaagcagt gaatttattg gagcatga 3878 <210> 761 <211> 3878 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 761 cccggcgcag cgcggccgca gcagcctccg ccccccgcac ggtgtgagcg cccgacgcgg 60 ccgaggcggc cggagtcccg agctagcccc ggcggccgcc gccgcccaga ccggacgaca 120 ggccacctcg tcggcgtccg cccgagtccc cgcctcgccg ccaacgccac aaccaccgcg 180 cacggccccc tgactccgtc cagtattgat cgggagagcc ggagcgagct cttcggggag 240 cagcgatgcg accctccggg acggccgggg cagcgctcct ggcgctgctg gctgcgctct 300 gcccggcgag tcgggctctg gaggaaaaga aagtttgcca aggcacgagt aacaagctca 360 cgcagttggg cacttttgaa gatcattttc tcagcctcca gaggatgttc aataactgtg 420 aggtggtcct tgggaatttg gaaattacct atgtgcagag gaattatgat ctttccttct 480 taaagaccat ccaggaggtg gctggttatg 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agcccctcca cgtcacggac tcccctcctg agctctctga 3360 gtgcaaccag caacaattcc accgtggctt gcattgatag aaatgggctg caaagctgtc 3420 ccatcaagga agacagcttc ttgcagcgat acagctcaga ccccacaggc gccttgactg 3480 aggacagcat agacgacacc ttcctcccag tgcctgaata cataaaccag tccgttccca 3540 aaaggcccgc tggctctgtg cagaatcctg tctatcacaa tcagcctctg aaccccgcgc 3600 ccagcagaga cccacactac caggaccccc acagcactgc agtgggcaac cccgagtatc 3660 tcaacactgt ccagcccacc tgtgtcaaca gcacattcga cagccctgcc cactgggccc 3720 agaaaggcag ccaccaaatt agcctggaca accctgacta ccagcaggac ttctttccca 3780 aggaagccaa gccaaatggc atctttaagg gctccacagc tgaaaatgca gaatacctaa 3840 gggtcgcgcc acaaagcagt gaatttattg gagcatga 3878

Claims (118)

  1. 야생형 erbB1 유전자에 대한, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 적어도 하나의 핵산 변이(nucleic acid variance)의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 적어도 하나의 핵산 변이의 존재는 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor:EGFR) 표적 치료가 유효 가능성이 있음을 나타내는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 변이가 키나제(kinase) 활성을 증가시키는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 erbB1 유전자는 상기 환자 유래의 생물학적 시료로부터 얻은 것인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 변이가 ATP 결합 포켓(ATP-binding porket)의 입체 구조(conformational structure)에 영향을 미치는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 변이가 엑손 18, 19, 20 또는 21로 이루어지는 군에서 선택되는 erbB1 유전자의 엑손에 존재하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 변이가 엑손 18, 19 또는 21에 존재하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 변이가 인프레임(in-frame) 결실(deletion), 치환(substitution), 또는 삽입(insertion)인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결 정 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 인프레임 결실이 erbB1 유전자의 엑손 19에 존재하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 erbB1 유전자의 엑손 19에서의 인프레임 결실이, 적어도 서열번호 512의 코돈 747, 748, 749 및 750의 아미노산인 류신, 아르기닌, 글루탐산 및 알라닌의 결실을 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 erbB1 유전자의 엑손 19에서의 인프레임 결실이, 적어도 서열번호 512의 코돈 747, 748 및 749의 아미노산인 류신, 아르기닌 및 글루탐산의 결실을 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 인프레임 결실이 서열번호 511의 2235∼2249, 2240∼2251, 및 2240∼2257로 이루어지는 군에서 선택된 누클레오티드를 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 치환이 erbB1 유전자의 엑손 21에 존재하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 엑손 21에서의 치환이 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 엑손 21에서의 치환이 서열번호 511의 누클레오티드 2573의 티민이 구아닌으로의 치환, 및 서열번호 511의 누클레오티드 2582의 티민이 아데닌으로의 치환으로 이루어지는 군에서 선택한 치환을 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  15. 제7항에 있어서,
    상기 치환이 erbB1 유전자의 엑손 18에 존재하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 엑손 18에서의 치환은 서열번호 511의 누클레오티드 2155의 구아닌이 티민으로의 치환 또는 세린으로의 치환인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 변이의 존재 또는 부재의 검출이 핵산의 세그먼트(segment)를 증폭시키는 단계를 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 증폭시킬 세그먼트의 길이가 1000개의 누클레오티드 이하인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 증폭시킬 세그먼트가 복수의 변이를 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 변이의 존재 또는 부재의 검출이 erbB1 핵산과 적어도 하나의 핵산 프로브를 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 적어도 하나의 프로브는 선택적 혼성화(hybridization) 조건 하에서 상기 변이를 포함하는 핵산 염기서열과 우선적으로 혼성화하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 변이의 존재 또는 부재의 검출이 적어도 하나의 핵산 염기서열을 분석하는 단계를 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 변이의 존재 또는 부재의 검출이 적어도 하나의 핵산 염 기서열의 질량분석결정(mass spectrometric determination)을 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 변이의 존재 또는 부재의 검출이, erbB1 코딩 서열을 포함하는 핵산을 증폭시키기 위한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계, 및 그 증폭된 핵산의 누클레오티드 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 증폭된 핵산의 누클레오티드 염기서열 결정 단계는 적어도 하나의 핵산 세그먼트의 서열 분석 단계를 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 증폭된 핵산의 누클레오티드 염기서열 결정 단계는 그 증폭된 핵산 세그먼트를 겔상에서 전개(running)하여 세그먼트의 크기를 결정하는 단계를 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표 적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  26. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 변이의 존재 또는 부재의 검출은 유전자내의 복수의 변이의 하플로타입(haplotype)을 결정하는 단계를 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  27. erbB1 유전자내에 적어도 하나의 변이를 포함하는 핵산 염기서열에, 선택적 결합 조건 하에 특이적으로 결합하는 프로브로서, 상기 변이가 ATP 결합 포켓에서의 구조적 변화를 부여하는 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 돌연변이(mutation)인, 프로브(probe).
  28. 제27항에 있어서,
    상기 변이가 엑손 18, 19, 20 또는 21로 이루어지는 군에서 선택되는 erbB1 유전자의 엑손에 존재하는, 프로브.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 프로브는 뉴클레오티드 염기가 500개 이하인 핵산 염기서열로 구성되는 프로브.
  30. 제27항에 있어서,
    상기 프로브가 DNA로 구성되는 프로브.
  31. 제27항에 있어서,
    상기 프로브가 DNA와 적어도 하나의 핵산 유사체(analog)로 구성되는 프로브.
  32. 제27항에 있어서,
    상기 프로브가 펩티드 핵산(peptide nucleic acid: PNA)으로 구성되는 프로브.
  33. 제27항에 있어서,
    검출가능 표지(detectable label)를 더 포함하는 프로브.
  34. 제27항에 있어서,
    상기 검출가능 표지가 형광 표지(fluorescent label)인 프로브.
  35. 제27항에 있어서,
    상기 프로브가 적어도 서열번호 495의 핵산 15∼25으로 이루어지는 적어도 10개의 연속적인 핵산, 또는 그 상보체를 포함하는 프로브.
  36. 제27항에 있어서,
    상기 프로브가 적어도 서열번호 497의 핵산 20∼30으로 이루어지는 적어도 10개의 연속적인 핵산, 또는 그 상보체를 포함하는 프로브.
  37. 제27항에 있어서,
    상기 프로브가 적어도 서열번호 499의 핵산 20∼30으로 이루어지는 적어도 10개의 연속적인 핵산, 또는 그 상보체를 포함하는 프로브.
  38. 환자로부터 얻은 생물학적 시료 중의 erbB1 유전자의 키나제 활성을 결정하는 단계를 포함하는 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성을 결정하는 방법으로서, 대조군에 비한, 표피성장인자 수용체 리간드에 의한 자극 후의 키나제 활성의 증가는 표피성장인자 수용체 표적 치료가 유효 가능성이 있음을 나타내는, 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  39. 제1항 또는 제38항에 있어서,
    상기 표피성장인자 수용체 표적 치료가 티로신 키나제 저해제인, 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 티로신 키나제 저해제가 아닐리노퀴나졸린인, 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 아닐리노퀴나졸린이 합성 아닐리노퀴나졸린인, 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 합성 아닐리노퀴나졸린이 제피티니브(gefitinib) 및 에를로티니브(erlotinib)로 이루어지는 군에서 선택되는, 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  43. a) 엑손 18, 19, 20 또는 21의 부분을 증폭시키는 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행함에 의해, 엑손 18, 19, 20 또는 21에서의 적어도 하나의 핵산 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 및
    b) 증폭된 엑손 18, 19, 20 또는 21의 적어도 한 부분의 염기서열을 분석함에 의해 증폭된 핵산의 누클레오티드 염기서열을 결정하는 단계, 이때, 야생형 erbB1 대조군과 비교하여 엑손 18, 19, 20 또는 21에서의 적어도 하나의 누클레오티드 변이의 존재는 표피성장인자 수용체 표적 치료가 유효 가능성이 있음을 나타 냄,
    를 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체(EGFR) 표적 치료의 유효 가능성을 결정하는 방법.
  44. 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 적어도 하나의 핵산 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 환자는 상기 적어도 하나의 핵산 변이의 존재가 검출되는 경우 EGFR 표적 치료를 받게 되는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  45. a) 엑손 18, 19, 20 또는 21의 부분을 증폭시키는 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행함에 의해, 엑손 18, 19, 20 또는 21에서의 적어도 하나의 핵산 변이의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
    b) 상기 증폭된 엑손 18, 19, 20 또는 21의 적어도 한 부분의 염기서열을 분석함에 의해 그 증폭된 핵산의 누클레오티드 염기서열을 결정하는 단계; 및
    c) 상기 적어도 하나의 핵산 변이의 존재가 검출되는 경우 환자에게 EGFR 표적 치료를 행하는 단계
    를 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서,
    상기 EGFR 표적 치료가 티로신 키나제 저해제인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 티로신 키나제 저해제가 아닐리노퀴나졸린인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 아닐리노퀴나졸린이 합성 아닐리노퀴나졸린인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    상기 합성 아닐리노퀴나졸린이 제피티니브 및 에를로티니브로 이루어지는 군에서 선택되는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  50. 제44항 또는 제45항에 있어서,
    상기 erbB1 유전자가 상기 환자 유래의 생물학적 시료로부터 얻은 것인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  51. 제44항 또는 제45항에 있어서,
    상기 암이 위장관암, 전립선암, 난소암, 유방암, 머리 및 목암, 폐암, 비소 세포 폐암, 신경계암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 췌장암, 생식-비뇨기암 및 방광암으로 이루어지는 군에서 선택되는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 암이 비소세포 폐암인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  53. 제44항 또는 제45항에 있어서,
    상기 핵산 변이가 키나제 활성을 증가시키는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  54. 제44항 또는 제45항에 있어서,
    상기 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 변이가 ATP-결합 포켓의 입체 구조에 영향을 미치는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  55. 제44항 또는 제45항에 있어서,
    상기 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 변이가 엑손 18, 19, 20 또는 21로 이루어지는 군에서 선택되는 erbB1 유전자의 엑손에 존재하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    상기 변이가 엑손 18, 19 또는 21에 존재하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  57. 제44항 또는 제45항에 있어서,
    상기 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 변이가 인프레임 결실 또는 치환인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 인프레임 결실이 erbB1 유전자의 엑손 19에 존재하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  59. 제58항에 있어서,
    상기 erbB1 유전자의 엑손 19에서의 인프레임 결실은 적어도 코돈 747, 748, 749 및 750의 아미노산인 류신, 아르기닌, 글루탐산 및 알라닌의 결실을 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  60. 제58항에 있어서,
    상기 erbB1 유전자의 엑손 19에서의 인프레임 결실은 적어도 서열번호 512의 코돈 747, 748 및 749의 아미노산인 류신, 아르기닌 및 글루탐산의 결실을 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  61. 제59항에 있어서,
    상기 인프레임 결실이 서열번호 511의 2235∼2249, 2240∼2251, 및 2240∼2257로 이루어지는 군에서 선택되는 누클레오티드를 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  62. 제57항에 있어서,
    상기 치환이 erbB1 유전자의 엑손 21에 존재하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  63. 제62항에 있어서,
    상기 엑손 21에서의 치환이 서열번호 511의 누클레오티드 2573의 티민이 구아닌으로의 치환, 서열번호 511의 누클레오티드 2582의 티민이 아데닌으로의 치환으로 이루어지는 군에서 선택되는 치환을 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  64. 제62항에 있어서,
    상기 엑손 21에서의 치환이 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 암에 걸렸 거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  65. 제57항에 있어서,
    상기 치환이 erbB1 유전자의 엑손 18에 존재하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  66. 제65항에 있어서,
    상기 엑손 18에서의 치환이 서열번호 511의 누클레오티드 2155의 구아닌이 티민으로의 치환인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 치료 방법.
  67. a) EGFR 키나제 도메인의 엑손 18, 19, 20 또는 21의 경계 부분 또는 내의 핵산 영역에 결합(anealing)하도록 설계된 적어도 하나의 축퇴성 프라이머쌍 (degenerate primer pair);
    b) PCR 증폭의 수행에 필요한 산물 및 시약;
    c) 사용설명서(instructions)
    를 포함하는 키트.
  68. 제67항에 있어서,
    상기 프라이머는, 서열번호 505∼508, 및 모든 정방향 프라이머의 5'말단에 서열번호 645와 모든 역방향 프라이머의 5'말단에 서열번호 674를 가진 서열번호 646∼673로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열분석 프라이머를 포함하는 키트.
  69. a) EGFR 키나제 도메인의 엑손 18, 19, 20 또는 21내의 핵산 영역에 결합하도록 설계된 적어도 하나의 프로브;
    b) 상기 결합 반응의 수행에 필요한 산물 및 시약; 및
    c) 사용설명서
    를 포함하는 키트.
  70. 제69항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 프로브가 고체 지지체(solid support)에 결합되어 있는, 키트.
  71. a) EGFR 키나제 도메인 단백질의 ATP-결합 포켓에 결합하도록 설계된 적어도 하나의 프로브;
    b) 상기 결합 반응의 수행에 필요한 산물 및 시약; 및
    c) 사용설명서
    를 포함하는 키트.
  72. 제71항에 있어서,
    상기 프로브가 항체, 항체 단편(fragment), 또는 키메라(chimeric) 항체인, 키트.
  73. 제72항에 있어서,
    상기 프로브가 검출가능 표지를 더 포함하는, 키트.
  74. a) 표피성장인자 수용체(EGFR) 변이체와 화합물을 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 EGFR 변이체의 얻어진 키나제 활성을 검출하는 단계, 이때, EGFR 변이체의 키나제 활성을 저해하는 화합물이 선별됨,
    를 포함하는, 표피성장인자 수용체 변이체의 키나제 촉매활성 저해 화합물의 선별 방법.
  75. 제74항에 있어서,
    상기 EGFR 변이체는 표지되어 있는, 표피성장인자 수용체 변이체의 키나제 촉매활성 저해 화합물의 선별 방법.
  76. 제74항에 있어서,
    상기 EGFR 변이체가 고체 지지체에 결합되어 있는, 표피성장인자 수용체 변이체의 키나제 촉매활성 저해 화합물의 선별 방법.
  77. 제74항에 있어서,
    상기 고체 지지체가 단백질 칩(chip)인, 표피성장인자 수용체 변이체의 키나제 촉매활성 저해 화합물의 선별 방법.
  78. 항체, 항체 단편, 소분자(small molecule), 펩티드, 단백질, 안티센스 핵산, 리보자임, PNA, siRNA, 올리고누클레오티드 엡테이머(oligonucleotide aptamer), 및 펩티드 엡테이머로부터 선택되는, 제74항에서 동정된 표피성장인자 수용체 변이체의 키나제 촉매 활성 저해 화합물.
  79. 제74항에 있어서,
    상기 EGFR 변이체가 erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 2차 돌연변이를 포함하는, 표피성장인자 수용체 변이체의 키나제 촉매활성 저해 화합물의 선별 방법.
  80. 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에서 동정된 표피성장인자 수용체 키나제 활성의 저해제를 포함하는 약제 조성물.
  81. 제80항에 기재된 약제 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 표피성장인자 수용체 매개 질병(EGFR mediated disease)을 가진 환자의 치료 방법.
  82. 제81항에 있어서,
    상기 표피성장인자 수용체 매개 질병이 암인, 표피성장인자 수용체 매개 질 병을 가진 환자의 치료 방법.
  83. 제82항에 있어서,
    상기 암이 위장관암, 전립선암, 난소암, 유방암, 머리 및 목암, 폐암, 비소세포 페암, 신경계 암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 췌장암, 생식-비뇨기암 및 방광암으로 이루어지는 군에서 선택되는, 표피성장인자 수용체 매개 질병을 가진 환자의 치료 방법.
  84. 제83항에 있어서,
    상기 암이 비소세포 폐암인, 표피성장인자 수용체 매개 질병을 가진 환자의 치료 방법.
  85. a) 준치사량(sublethal dose)의 티로신 키나제 저해제를, erbB1 유전자의 변이형을 가진 세포와 접촉시키는 단계;
    b) 티로신 키나제 저해제의 성장 저지 효과에 내성을 가진 세포를 선별하는 단계; 및
    c) erbB1 키나제 도메인에서의 2차 돌연변이의 존재 여부에 대해 상기 내성 세포의 erbB1 핵산을 분석하는 단계
    를 포함하는, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 2차 돌연변이 획득의 예측 방법.
  86. 제85항에 있어서,
    상기 세포가 시험관내(in vitro)에 존재하는, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 2차 돌연변이 획득의 예측 방법.
  87. 제85항에 있어서,
    상기 세포가 유전자도입 동물(transgenic animal)로부터 얻은 것인, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 2차 돌연변이 획득의 예측 방법.
  88. 제87항에 있어서,
    상기 유전자도입 동물이 마우스인, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 2차 돌연변이 획득의 예측 방법.
  89. 제87항에 있어서,
    상기 세포가 종양 생검(tumor biopsy)으로부터 얻은 것인, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 2차 돌연변이 획득의 예측 방법.
  90. 제85항에 있어서,
    맨처음 상기 세포와 유효량의 돌연변이유발제(mutagenizing agent)를 접촉시키는 단계를 더 포함하는, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 2차 돌연변이 획득 의 예측 방법.
  91. 제90항에 있어서,
    상기 돌연변이유발제는 에틸메탄설포네이트(EMS), N-에틸-N-니트로소우레아(ENU), N-메틸-N-니트로소우레아(MNU), 포카르박신 히드로클로라이드(Prc), 메틸 메탄설포네이트(MeMS), 클로르암부실(Chl), 멜팔란, 포르카르바진 히드로클로라이드, 시클로포스파미드(Cp), 디에틸설페이트(Et2SO4), 아크릴아미드 모노머(AA), 트리에틸렌 멜라민(TEM), 니트로겐 머스타드, 빈크리스틴, 디메틸니트로스아민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘(MNNG), 7,12-디메틸벤즈안트라센(DMBA), 에틸렌옥사이드, 헥사메틸포스포아미드, 비설판, 및 에틸메탄설포네이트(EtMs)로 이루어지는 군에서 선택되는, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 2차 돌연변이 획득의 예측 방법.
  92. 제85항에 있어서,
    EGFR 유전자 변이형을 세포에 도입하기 전에, DNA 수복-결핍 박테리아 균주(DNA repair-deficient bacterial strain)내에서 그 EGFR 유전자의 변이형을 증식시키는 단계를 더 포함하는, erbB1 유전자의 키나제 도메인에서의 2차 돌연변이 획득의 예측 방법.
  93. 키나제 도메인에 2차 돌연변이를 가진 표피성장인자 수용체(EGFR) 변이체를 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    얻어진 키나제 활성을 검출하는 단계, 이때 표피성장인자 수용체 변이체의 키나제 활성을 저해하는 화합물이 선별됨,
    를 포함하는, 화합물의 선별 방법.
  94. 제93항에 있어서,
    상기 2차 돌연변이에 의해 제피티니브 또는 에를로티니브에 대한 내성이 생기는, 화합물의 선별 방법.
  95. 서열번호 495를 포함하는, 단리된 핵산.
  96. 서열번호 511을 포함하고 누클레오티드 2235∼2249가 결실된, 단리된 핵산.
  97. 서열번호 497을 포함하는, 단리된 핵산.
  98. 서열번호 511을 포함하고 누클레오티드 2240∼2251이 결실된, 단리된 핵산.
  99. 서열번호 499를 포함하는, 단리된 핵산.
  100. 서열번호 511을 포함하고 누클레오티드 2240∼2257이 결실된, 단리된 핵산.
  101. 서열번호 502를 포함하는, 단리된 핵산.
  102. 서열번호 511을 포함하고 누클레오티드 2573의 티민이 구아닌으로 치환된, 단리된 핵산.
  103. 서열번호 504를 포함하는, 단리된 핵산.
  104. 서열번호 511을 포함하고 누클레오티드 2582의 티민이 아데닌으로 치환된, 단리된 핵산.
  105. 서열번호 511을 포함하고 누클레오티드 2155의 구아닌이 티민으로 치환된, 단리된 핵산.
  106. 서열번호 512의 아미노산 서열을 갖고 아미노산 746∼750이 결실된, 단리된 단백질.
  107. 서열번호 512의 아미노산 서열을 갖고 아미노산 747∼751이 결실된, 단리된 단백질.
  108. 서열번호 512의 아미노산 서열을 갖고 아미노산 747∼753이 결실된, 단리된 단백질.
  109. 서열번호 512의 아미노산 서열을 갖고 아미노산 858의 류신이 아르기닌으로 치환된, 단리된 단백질.
  110. 서열번호 512의 아미노산 서열을 갖고 아미노산 861의 류신이 글루타민으로 치환된, 단리된 단백질.
  111. 서열번호 512의 아미노산 서열을 갖고 아미노산 719의 글리신이 시스테인으로 치환된, 단리된 단백질.
  112. 제1항에 있어서,
    erbB1 유전자의 핵산 변이는 서열번호 511의 누클레오티드 2155의 구아닌이 티민으로의 치환 또는 구아닌이 세린으로의 치환, 서열번호 511의 누클레오티드 2235∼2249, 2240∼2251, 2240∼2257, 2236∼2250, 2254∼2277, 또는 2236∼2244의 결실, 및 서열번호 511의 누클레오티드 2573의 티민이 구아닌으로의 치환 또는 누클레오티드 2582의 티민이 아데닌으로의 치환으로 이루어지는 군에서 선택되는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 인간 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료 의 유효 가능성 결정 방법.
  113. a) 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자로부터 생물학적 시료를 얻는 단계; 및
    b) 상기 환자에서 Akt, STAT5, 또는 STAT3이 활성화 되는지의 여부를 결정 단계, 이때 활성화된 Akt, STAT5, 또는 STAT3는 EGFR 표적 치료의 유효 가능성이 있음을 나타냄,
    를 포함하는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 표피성장인자 수용체(EGFR) 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  114. 제113항에 있어서,
    상기 생물학적 시료가 생검 또는 흡인액(aspirate)인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  115. 제113항에 있어서,
    상기 활성화된 Akt, STAT3 또는 STAT5는 인산화되어 있는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  116. 제113항에 있어서,
    상기 활성화된 Akt, STAT3 또는 STAT5는 면역학적으로 결정되는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  117. 제116항에 있어서,
    상기 면역학적 검출 방법이 면역조직화학법, 면역세포화학법, FACS 스캐닝, 면역블로팅법, 방사면역측정법, 웨스턴 블로팅법, 면역침전법, 또는 효소결합 면역흡착법(ELISA)로 이루어지는 군에서 선택되는, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
  118. 제116항에 있어서,
    상기 면역학적 검출 방법이 항포스포 Akt(anti-phospho Akt), 항포스포 STAT3 또는 항포스포 STAT5 항체를 사용하는 면역조직화학법 또는 면역세포화학법인, 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험이 있는 환자의 표피성장인자 수용체 표적 치료의 유효 가능성 결정 방법.
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