TWI405566B - 薑黃素或其類似物於使用上皮細胞生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑之癌症醫療之用途 - Google Patents

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Description

薑黃素或其類似物於使用上皮細胞生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑之癌症醫療之用途
本申請案主張2010年2月11日申請之美國臨時專利申請案第61/303,593號之優先權，該案之全文以引用的方式併入本文中。
本發明係有關於薑黃素或其類似物於使用上皮細胞生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)之癌症醫療之用途，其減少治療導致之副作用，並減少需用於治療的EGFR-TKI劑量，特別是對單獨EGFR-TKI治療具抗性之病人。
癌症是世界上死亡的首要原因。近來，已發展了所謂的「標靶治療」，而選擇性作用在上皮細胞生長因子接受器(EGFR)的藥物已被證實在臨床上具有療效(Cancer Research 2004；64(15)：5355-62)。EGFR的訊息傳遞路徑為調控細胞生長及分化的主要因素之一，其經由調控內生性酪胺酸激酶的磷酸化而作用(Cancer Research 2003 ；63(1)：1-5)。在不同的惡性細胞中，發現到EGFR的過量表現發生，且伴隨著較差的預後(Oncologist 2004；9(1)：58-67)。然而，一些關鍵問題仍然限制了這些藥物之使用。
艾瑞莎(Iressa)，口服有效的EGFR-TKI，為第一個被核准治療非小細胞肺癌(NSCLC)的選擇性小分子藥物(Lung Cancer 2003；41 Suppl 1：S9-14；以及Expert Review of Anti Cancer Therapy 2004；4(1)：5-17)。先前涉及多機構的臨床試驗之研究已證實，亞洲病人對艾瑞莎之反應比白種病人更佳，且對未吸菸之腺癌婦女療效最佳(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004；101(36)：13306-11；以及Lancet 2005；366(9496)：1527-37)。近來研究已指出，NSCLC中EGFR 之外顯子19片段缺失(ΔE746-A750)和外顯子21之L858R取代，與艾瑞莎敏感度高度相關(New England Journal of Medicine 2004；350(21)：2129-39；Science 2004；304(5676)：1497-500；以及Oncologist 2008；13(12)：1276-84)。然而，NSCLC病人之EGFR 基因突變率已被發現在白種人中從10%至15%以及在亞洲人中從30%至40%之範圍內(Clinical Cancer Research 2008；14(10)：2895-9；以及Journal of the National Cancer Institute 2005；97(5)：339-46)。在全世界所有NSCLC案例中，具野生型EGFR之病人仍占大多數，且這些人顯試了對艾瑞莎治療相對較差的反應。此外，由第二位點取代，EGFR 之外顯子20中的T790M，造成的後天性抵抗力，導致較差的艾瑞莎活性(New England Journal of Medicine 2005；352(8)：786-92；以及PLoS Medicine/Public Library of Science 2005；2(3)：e73)。
副作用為使用EGFR-TKI之另一限制。已知艾瑞莎會導致之副作用如腹瀉(Journal of Clinical Oncology 2003；21(12)：2237-46；以及Clinical Cancer Research 2004；10(4)：1212-8)和皮疹。臨床試驗中由艾瑞莎導致之腹瀉頻率，在500 mg/日劑量組為67%，而在250 mg/日劑量組為48%。近期發表的案例已指出EGFR-TKI和放射療法之組合使用會導致轉移性NSCLC病人意外的毒性及致命的腹瀉(Lung Cancer 2008；61(2)：270-3)。這些副作用可能會造成身體和心理不適，其會導致劑量減少或治療中斷。
本發明係基於發現薑黃素係一潛力藥劑，其能減少由EGFR-TKI治療所導致之副作用，並減少需用於EGFR-TKI癌症治療的EGFR-TKI劑量，特別是對單獨EGFR-TKI治療具抗性之病人。
據此，在一方面，本發明提供一種用於減少由使用上皮細胞生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療導致的副作用之方法，包含施用能減少該等副作用之有效量的薑黃素或其類似物至接受此治療之病人。在一具體實施例中，該等副作用係EGFR-TKI誘發之腸胃道副作用，例如腸道細胞損傷或生長抑制。
在另一方面，本發明提供一種施用上皮細胞生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)至需要使用EGFR-TKI之癌症醫療之病人之方法，包含施用減少劑量之EGFR-TKI合併薑黃素或其類似物至該病人，而該EGFR-TKI在癌症醫療方面之功效，相較於在無施用薑黃素或其類似物而僅施用標準劑量之EGFR-TKI所達之功效，係實質上予以維持。在一具體實施例中，該病人係被診斷為具EGFR-TKI抗性的。在一具體實施例中，該減少劑量係EGFR-TKI之標準治療劑量的約50%或更少。
在一具體實施例中，待治療之病人患有非小細胞肺癌(NSCLC)。在另一具體實施例中，待治療之病人係具EGFR-TKI抗性的。
在一具體實施例中，該薑黃素類似物係選自於由下列所構成之群組：
在一具體實施例中，該EGFR-TKI係艾瑞莎(N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺)。
在一具體實施例中，該薑黃素或其類似物係與EGFR-TKI同時被施用。
本發明亦提供，一種用於治療具EGFR-TKI抗性之癌症病人的方法，其包含對前述病人共同施用有效量之EGFR-TKI和薑黃素或其類似物。
本發明之各種具體實施例詳述如下。本發明之其他特徵將由下列關於各種具體實施例及申請專利範圍的詳細敘述與圖式而清楚地呈現。
相信本發明所屬技術領域具有通常知識者可基於此處說明而利用本發明至其最廣範圍，而不需要進一步說明。因此，下列說明應可被理解作為示範之目的，而無意於以任何方式限制本發明之範圍。
除非另有定義，此處所有使用之技術及科學名詞具有與本發明所屬技術領域中熟習此藝者所一般性了解者相同的含意。所有在此提到的公開文獻以引用的方式併入本文中，以揭露及描述與該等所引用之公開文獻有關的方法和/或材料。
如在此所使用者，單數形「一」，「一種」，及「該」包括了複數指涉物，除非內容另有清楚指明。因此，舉例而言，關於「一樣本」包括了複數個此樣本及為此技術領域中熟習此藝者所知之相等物。
如前述，本發明發現，施用薑黃素或其類似物於進行EGFR-TKI治療之病人可減少由該治療導致之副作用。
因此，在一方面，本發明提供一種用於減少由使用上皮細胞生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療導致的副作用之方法，包含施用能減少該等副作用之有效量的薑黃素或其類似物至接受此治療之病人。
上皮細胞生長因子接受器(EGFR)係170 kDa之膜結合蛋白質，其表現於上皮細胞的表面，已知上皮細胞與細胞生長及分化之調節有關，且係經由調節內在酪胺酸激脢之磷酸化。EGFR大量表現已被報告係發生在各種惡性細胞中且與不良預後相關。如在此所使用者，所揭露之EGFR蛋白質係GenBank登錄號NM_005228(SEQ ID NO：1)。
「EGFR-TKI」乙詞在此處係指上皮細胞生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑。某些EGFR-TKI之實例包括艾瑞莎，亦即N-(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺(Iressa)，以及埃羅替尼，亦即N-(3-乙炔苯基)-6,7-雙(2-甲氧乙氧)喹唑啉-4-胺(Tarceva)，其為臨床上用於治療非小細胞肺癌之藥物。
「副作用」乙詞在此處係指由EGFR-TKI誘發之副作用，例如不良腸胃道影響(例如腹瀉、腸絨毛/細胞之損傷，或腸道細胞之生長抑制作用)或不利的皮膚狀況(例如皮疹或皮膚乾燥)。在一具體實施例中，副作用係EGFR-TKI誘發之腸道細胞損傷或生長抑制作用。
薑黃素(二阿魏酰甲烷diferuloylmethane)係高度活性成分，其由植物川薑黃(Curcuma longa )所萃取出，化學式(烯醇型)如下：
此處所使用的「薑黃素」乙詞係亦包含其類似物、衍生物，或鹽類。製自薑黃素之產品，例如食品添加物或補充劑，亦包含在內。在一具體實施例中，薑黃素類似物係選自由LL-17、LL-18、LL-68和LC-15所構成之群組，化學式如下所示：
此處使用之薑黃素或其類似物、衍生物或其鹽類可根據本技術領域所知的一般方法，例如Bioorganic & Medicinal Chemistry 2006；14(8)：2527-34；及Journal of Medicinal Chemistry 2006；49(13)：3963-72所述者，而自天然資源合成或分離出。
此處所使用的「病人」、「個體」及「個人」用詞可互換使用，具體而言係指一需要癌症醫療之人類個體。在一具體實施例中，該個體患有非小細胞肺癌(NSCLC)。
根據本發明，EGFR-TKI和薑黃素或其類似物可以一治療劑量形式、或分開治療劑量，如分開的膠囊、片劑、容器或注射。可同時(併行)或依序施用EGFR-TKI及薑黃素或其類似物。在一具體實施例中，EGFR-TKI及薑黃素或其類似物係被併行施用。
為有助於輸送，根據本發明EGFR-TKI及薑黃素可被，各別地或組合地，配製成具醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。此處使用之「醫藥上可接受」是指，該載劑係與含於該組合物中之活性成份相容的，較佳地可穩定該活性成份，且對被處理的個體無害。該載劑可作為該活性成份之稀釋劑、載體、賦形劑，或媒質。合適的賦形劑之例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、亞拉伯膠、磷酸鈣鹽、褐藻酸鹽、山羊刺樹、明膠、矽酸鈣、微晶型纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、無菌水、糖漿、及甲基纖維素。醫藥組合物可另外包括潤滑劑，如滑石、硬脂酸鎂，和礦物油；濕潤劑；乳化劑和懸浮劑；保藏劑，如羥苯甲酸甲酯和羥苯甲酸丙酯；甜味劑；及調味劑。
根據本發明之醫藥組合物可為片劑、丸劑、粉末、錠劑、小袋、藥包、藥酒、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、軟及硬膠囊、栓劑、無菌注射容易、以及包裝粉末形式。
本發明之醫藥組合物可經由任何生理上可接受的路徑而輸送，例如口、非腸道(例如肌肉、靜脈、皮下、腹腔)，透皮，直腸，吸入及其類似途徑。在一具體實施例中，本發明之組合物係口服的。
在本發明中，亦發現，當施用EGFR-TKI結合薑黃素至有其需要之病人時，可減少EGFR-TKI之有效量，而其醫療有效性，相較於單獨施用EGFR-TKI，係實質上予以維持。
因此，在另一方面，本發明提供一種施用上皮細胞生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)至需要使用EGFR-TKI之癌症醫療之病人之方法，包含施用減少劑量之EGFR-TKI合併薑黃素或其類似物至該病人，而該EGFR-TKI在癌症醫療方面之功效，相較於在無施用薑黃素或其類似物而僅施用標準劑量之EGFR-TKI所達至之功效，係實質上被維持的。
有關於施用一藥劑之一「有效量」或一「有效劑量」，係指導致所欲藥學結果之量或劑量，例如改善症狀、減少副作用、延長生命或改善生命品質；就一具惡性腫瘤之個體而言，舉例而言，腫瘤生長之速率被降低、此腫瘤的體積被減少，或該腫瘤被完整消除。一藥劑之有效量或劑量可依據所使用之特定活性成份、施用的模式、被治療之個體之年齡、體重及狀況，而不同。施用所需藥劑之精確量依照醫療從業人員之判斷且為每個個人所特有。
此處所使用的「標準劑量」乙詞係指治療劑之一有效劑量，其為製藥界中權威人士，包括食品和藥物管理局，所建議者，且常用於例行實作。此處所使用的「減少之劑量」乙詞係指低於標準劑量但仍實質上保留了相同治療劑之相同治療效果的劑量。特定而言，根據本發明，EGFR-TKI之減少之劑量係EGFR-TKI標準治療劑量的約90%或更少、80%或更少、70%或更少、60%或更少、50%或更少。在本發明一具體實施例中，該減少之劑量係EGFR-TKI標準治療劑量的約50%或更少。
已知，某些病人對EGFR-TKI治療具反應不良，而可能需要高劑量以達到所欲的治療效果，然而其會造成病人無法接受的毒性反應並最後導致治療中斷。出人意外的，本發明之方法在治療具EGFR-TKI抗性之病人特別有效。當施用於對EGFR-TKI具抵抗力之病人時，本發明之方法允許施用減少之劑量之EGFR-TKI至該病人，而其醫療有效性，相較於單獨施用EGFR-TKI，係實質上予以維持。在一具體實施例中，病人具有對EGFR-TKI具抵抗力之突變，例如，在EGFR(SEQ ID NO：1)中之T790M取代。
本發明亦提供一種用於治療具EGFR-TKI抗性之癌症病人的方法，其包含對前述病人共同施用有效量之EGFR-TKI和薑黃素或其類似物。
此處所使用的「治療」乙詞係指對一個體應用或施用一含有一或多個活性劑的組合物，具體而言該個體具有一將以EGFR-TKI治療之疾病，包括但不限於，腫瘤或癌、疾病的症狀、或對疾病的易患傾向，具有治癒、愈合、減輕、緩解、改變、補救、舒緩、改善、或影響該疾病、疾病的症狀、或對疾病的易患傾向之目的。
參照下列具體實施例，現在本發明將被更特定地描述，該等具體實施例係供用於實證之目的，而無非限制。
材料與方法
1.　試劑
用於活體外研究之薑黃素(以HPLC純化：98.0%)係購自Calbiochem(Darmstadt市，德國)。活體內，薑黃素(純度~70%)係來自Sigma(St Louis市，MO州，美國)。艾瑞莎()，ZD1839，係由Astra-Zeneca Pharmaceuticals(Macclesfield市，英國)善意提供。薑黃素及艾瑞莎之存料溶液係在二甲亞碸(DMSO)中製備並貯存在-20℃。於每個實驗，在新鮮的媒質中稀釋該等化合物，且DMSO之最終濃度係低於0.1%。用於動物之薑黃素及艾瑞莎係以在丙二醇(J.T.Baker，Phillipsburg美國)中徹底懸浮該藥物製備而成。
2.　細胞系及培養條件
已建立具高度侵襲性之人類肺腺癌細胞系(CL1-5)(American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology 1997；17(3)：353-60)。人類肺癌細胞系A549、H1299、H1650，及H1975係得自American Type Culture Collection(Manassas，VA)。PC-9係得自Dr. Chih-Hsin Yang(台大醫院，台灣)的善意贈與。這些細胞在RPMI 1640培養基(Life Technologies Rockville，MD)中生長。IEC-18大鼠腸道上皮細胞系(BCRC 60230)係於補充有10%胎牛血清(FBS)(Life Technologies)之DMEM培養基(Life Technologies Rockville，MD)中生長。上述培養基各含青黴素及鏈黴素(各100 mg/ml)且細胞系係在37℃、具5% CO2 之濕潤環境下培養。
3.　增生試驗
進行MTT[3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-溴化二苯四唑](Sigma，St Louis，MO)試驗以測定測定細胞增生。簡言之，CL1-5、A549、PC-9、H1650、H1975及IEC-18細胞被鋪在96-孔盤，密度為5×103 細胞/孔。在培養24小時後，以不同濃度之薑黃素及/或艾瑞莎處理細胞72小時。此外，以薑黃素、BIRB 796及/或艾瑞莎處理IEC-18細胞培養24小時。MTT溶液在培養基中的最終濃度為0.5 mg/ml，並被加入孔中。在又1.5小時培養後，該培養基被移除，並加入DMSO至盤中。使用多標示盤讀取器(multi-label plate reader)(Vector3；Perkin-Elmer，USA)於570 nm計量溶解之甲臢(formazan)的顯色強度。
4.　菌落形成試驗
CL1-5、A549及H1975細胞被鋪於具培養基之6-孔盤中(每孔100細胞)。在培養24小時後，艾瑞莎或薑黃素單獨處理細胞，或以所示的合併處理。以該等試劑培養細胞5天，接著完全更換培養基；接著再培養細胞9天。使用0.001%結晶紫染菌落，並計算每孔的菌落數。
5.　西方墨點法分析
使用西方墨點法以測定EGFR、pEGFR、Akt、pAkt、細胞週期素D1、PCNA、iNOS及多種細胞凋亡相關蛋白質(半胱天冬原酶-3、8、9及PARP)之蛋白質表現量。細胞被鋪在10-cm碟，密度1×106 。在培養整夜後，在無FBS之培養基中以血清飢餓法處理細胞24小時。接著在無血清條件下以不同濃度薑黃素及/或艾瑞莎處理細胞1小時，接著以20 ng/mL EGF刺激30分鐘。IEC-18細胞被鋪在10-cm碟中，密度1×106 。在培養整夜後，以不同濃度薑黃素及/或艾瑞莎或BIRB 796處理細胞又24小時。以冰冷的PBS清洗這些細胞三次，並萃取其蛋白質。此外，從各組中獲取CL1-5腫瘤組織(100 mg)並接著在裂解緩衝液中絞碎。使用哺乳類蛋白質萃取試劑(Pierce，Rockford)獲得蛋白質萃取物，該試劑含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑(Sigma，USA)。使用10%解析膠進行SDS/PAGE，以分離蛋白質(25 mg/膠道)。抗磷酸-EGFR(Tyr1068)、磷酸-Akt(Ser473)、Akt、c-MET、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、PARP、活性-p38及p38之抗體係購自於Cell Signaling Technology(Beverly，MA)。抗EGFR、細胞週期素D1、PCNA，及iNOS之兩種形式之抗體係購自於Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。該等抗體係根據製造商之建議而使用。使用增強的化學冷光系統(Santa Cruz，CA)偵測聯結的抗體。使用Fujifilm LAS 3000系統(Fujifilm，Tokyo，Japan)捕捉化學冷光信號。所有實驗皆重複進行三次。
6.　流動細胞計數法
種晶細胞於6-mm培養盤中，密度每碟105 細胞。在培養24小時後，以血清飢餓法處理細胞整夜。接著以薑黃素及/或艾瑞莎處理細胞又72小時。分別蒐集附著的與漂浮的細胞，並再懸浮於冷1×PBS中以進一步分析。以膜聯蛋白V-FITC細胞凋亡套組(BD Pharmingen，USA)染細胞，以監試凋亡細胞，並以碘化丙錠(PI)染細胞，以偵測死亡細胞。在一FC 500流動細胞計數系統(Beckman Coulter)分析樣本。未染色的細胞被分類為「活著」，只染上膜聯蛋白V之細胞被分類為「早期凋亡」，染上膜聯蛋白V及PI兩者的細胞被分類為「晚期凋亡」，而只染上PI的細胞被分類為「死亡」。
7.　實時定量RT-PCR
藉由實時PCR於ABI prism 7900序列偵測系統(Applied Biosystems)上偵測EGFR之表現量。使用的EGFR引子如下：前置引子EGFR-F，5’-GTGACCGTTTGGGAGTTGATGA-3’；反置引子EGFR-R，5’-GGCTGAGGGAGGCGTTCTC-3’。使用TATA-盒結合蛋白質(TBP)作為內部控制(GenBank X54993)。用於TBP mRNA之定量RT-PCR的引子與探針如前所述(24，25)。EGFR相較於TBP的相對表現量係定義為-ΔCT=-[CTEGFR -CTTBP ]。EGFR mRNA/TBP mRNA比係計算為2-ΔCT ×K，其中K係一常數。所有實驗皆重複進行三次。
8.　活體內研究實驗方案
我們根據國立陽明大學動物照護及使用委員會許可的實驗方案進行小鼠活體內研究。按照細胞存活及細胞數使用台盼藍計算CL1-5細胞，接著在100 μl HBSS中1×106 活CL1-5細胞被皮下注射至6週大SCID小鼠(由台灣大學醫學院動物中心，台北，台灣，所提供)。為了試驗是否薑黃素可增強艾瑞莎之抗瘤效果，小鼠在細胞注射一週後被任意分成五組(n=9)；這些是：(1)空載體控制組；(2)薑黃素單獨組(1 g/kg)；(3)艾瑞莎單獨組(120 mg/kg)；(4)60 mg/kg艾瑞莎加1 g/kg薑黃素組；以及(5)120 mg/kg艾瑞莎加1 g/kg薑黃素組。每日以口服將所示處理計量之薑黃素及艾瑞莎餵給動物。每四天監以電子游標卡尺視腫瘤尺寸並使用公式V=0.4×ab2 計算腫瘤體積，其中a及b分別為腫瘤的最長及最短直徑。3週後，犧牲小鼠，切除皮下腫瘤；接著凍於液態氮中，最後貯存於-80℃。使用布恩液(Bouin’s fluid)固定來自每組小鼠的腸道樣本並石蠟包埋，用於常規的蘇木精與曙紅染色。
9. PCNA免疫組織化學染色，及細胞的細胞凋亡偵測試驗
使用PCNA染色在石蠟包埋腫瘤組織樣本上進行細胞增生分析。簡言之，在一次反應中使用一兔抗-人類PCNA多株抗體(Santa Cruz，CA)。以3,3’-二胺聯苯胺使用DAKO EnVision系統，其含一個二次辣根過氧化酶-接合抗-鼠抗體複合物，以偵測PCNA。
用於凋亡細胞死亡的比色免疫組織化學染色(TUNEL)係在石蠟包埋腫瘤及腸道組織切片上進行，使用原位細胞死亡偵測套組，POD(Roche Diagnostics，德國)；亦以Gill之蘇木精對比染色該等切片。在來自每處理組的三個腸道的10隨機視野中試驗TUNEL-陽性細胞，接著陳述每高倍視野(×400倍率)TUNEL-陽性細胞平均數±SE。
10.半胱天冬酶活性之測量
藉由使用半胱天冬酶-Glo3/7試驗套組(Promega Corporation，澳洲)偵測半胱天冬酶活性。簡言之，種晶IEC-18細胞在96-孔白色光度計試驗盤中，密度為每孔1×104 細胞，並培養於37℃。在培養24小時後，以不同濃度之艾瑞莎及/或薑黃素處理細胞又24小時。每孔添加100 μl半胱天冬酶3/7試劑，於室溫在旋轉搖動器上培養1小時。使用多標示盤讀取器(Vector3；Perkin-Elmer，USA)來測量每孔的發光強度。
11.統計分析
所有的實驗皆重複三次並由ANOVA(Excel，Microsoft；台北，台灣)分析。使用雙尾司徒頓t檢定做比較，且顯著差異定義為p <0.05。在適當情況下，數據以平均數+標準差(mean±SD)表示。
結果
1.　薑黃素可抑制肺腺癌細胞增生，EGFR及AKT蛋白質表現及磷酸化
為了發展能增強抗癌效果、降低劑量，或克服NSCLC病人對艾瑞莎之抵抗力的新藥劑或化合物，應用具不同的對艾瑞莎具抵抗力之細胞系的高通量藥物篩選系統，以從本實驗室之藥草中篩選數以百計之化合物。表1顯示此處使用之EGFR狀態及NSCLC細胞系之種族。
選擇薑黃素做為潛在候選。我們確認，在對艾瑞莎具抵抗力之NSCLC細胞系中，包括CL1-5(wt-EGFR)、A549(wt-EGFR)、H1299(wt-EGFR)、H1650(EGFR 外顯子19片段缺失(ΔE746-A750)，但無PTEN蛋白質)、及H1975(EGFR之L858R及T790M突變)，薑黃素對細胞增生展現顯著地抑制效果。如圖1A所示，當以艾瑞莎培養72小時後，相較於對艾瑞莎敏感之細胞系PC-9(IC50<0.1 μM)，CL1-5、A549、H1299、H1650、及H1975顯示了增加的抗性的總體佈局(IC50>10 μM)(圖1A組)；不過，這些艾瑞莎抗性細胞的增生受到薑黃素以濃度依賴性方式之抑制(圖1右)。
已知EGFR訊息傳遞路徑與腫瘤發展高度相關，因此試驗了在CL1-5、A549及H1975細胞中薑黃素對EGFR及AKT的表現量及活性(磷酸化)的影響(圖1B)。結果指出，在CL1-5及A549細胞中薑黃素皆可濃度依賴性地減少EGFR、pEGFR、AKT，及pAKT蛋白質表現(圖1B)。雖然在H1975細胞中薑黃素並無改變AKT磷酸化，薑黃素仍顯著地減少了一個EGFR下游訊息傳遞因子，即細胞週期素D1之量(圖1B，右)。再者，RTQ-PCR結果顯示，薑黃素可濃度依賴性地減少EGFR mRNA表現(圖1C)。這些結果指出，薑黃素劑量藉由在艾瑞莎抗性NSCLC細胞中減弱EGFR訊息傳遞，展現了一潛在抗癌效果。
2.　薑黃素對EGFR之結合活性
我們研究了薑黃素對EGFR之結合活性，並將之與艾瑞莎比較。結果顯示，根據LIBDOCK，薑黃素之預測3-D構形結合至開形野生型EGFR蛋白質具有相對較高的分數(薑黃素分數=89.5；艾瑞莎分數=80.3)。此外，圖2顯示薑黃素結合至具T790M抗性突變之EGFR酪胺酸磷酸化處。綜言之，這些結果顯示，相較於艾瑞莎，薑黃素展現了對EGFR較高的結合活性，且T790M抗性突變不影響薑黃素對EGFR之結合活性。
3.　薑黃素促進EGFR降解並下調EGFR蛋白質量
我們測試了是否薑黃素可促進EGFR在轉譯階段之降解。以MG132前處理3小時或無前處理肺腺癌細胞，接著以所示之薑黃素處理。我們的數據顯示，薑黃素可劑量依賴性地抑制EGFR蛋白質表現；然而，當細胞以MG132前處理，其為蛋白酶體抑制劑，則EGFR蛋白質濃度可被回復(圖3A)。這些結果可指出，薑黃素可經由促進泛蛋白-蛋白酶體能力而降低EGFR蛋白質表現量。
我們亦發現，在艾瑞莎合併薑黃素組中之EGFR蛋白質濃度係低於薑黃素單獨組。因此，我們進行了免疫沉澱試驗以檢驗該觀察。結果顯示，艾瑞莎(10 μM)不改變EGFR泛蛋白量，然而，相較於其他單獨處理組，在合併處理組，艾瑞莎(1 μM)及薑黃素(10 μM)可增加EGFR蛋白質泛素化(圖3B)。此數據指出，薑黃素可藉由下調EGFR蛋白質濃度而增強艾瑞莎抗腫瘤性質。
4.　合併薑黃素及艾瑞莎可改善NSCLC細胞中艾瑞莎之抗腫瘤效果，具野生型或突變 EGFR 者皆然
使用具野生型或突變EGFR 之CL1-5、A549、H1299、H1650及H1975細胞系，以評估薑黃素能否增加多種具不同狀態EGFR 之艾瑞莎-抗性NSCLC細胞中之艾瑞莎抗瘤效果。細胞增生試驗顯示，艾瑞莎(10 μM)或薑黃素(15 μM)單獨處理僅產生輕微的細胞增生抑制作用(圖4A)。然而，當合併薑黃素(15 μM)與艾瑞莎(1 μM)時，在五個對艾瑞莎具抵抗力之NSCLC細胞系中，細胞增生皆有顯著減少，且抗增生效果係等同於高劑量艾瑞莎(20 μM)(圖4A)。當檢驗CL1-5、A549及H1299細胞中EGFR、pEGFR、AKT及pAKT表現量時，亦發現薑黃素與艾瑞莎合併處理顯著抑制了EGFR訊息傳遞。這些結果指出，艾瑞莎(1 μM)或薑黃素(10和15 μM)單獨組僅具有對pEGFR及pAKT最小的抑制效果(圖4B)，反之，合併艾瑞莎(1 μM)與薑黃素(15 μM)產生了對EGFR及AKT磷酸化顯著的屏障(圖4B)。這些結果建議，當使用艾瑞莎處理艾瑞莎-抗性癌細胞時，薑黃素可增強艾瑞莎之抗癌效果。
此外，我們研究了是否薑黃素可增加在CL1-5、A549及H1975細胞系中由艾瑞莎導致之細胞凋亡量。使用碘化丙錠/膜聯蛋白-V染色的動細胞計數法試驗指出，在CL1-5與A549細胞，合併艾瑞莎(1 μM)及薑黃素(15 μM)誘發了比起高濃度艾瑞莎單獨組(20 μM)較高量的細胞凋亡(圖5A，左及中)。在H1975細胞中，相較於艾瑞莎單獨組，薑黃素及艾瑞莎亦共同提高了膜聯蛋白V陽性細胞數，但此量係相似於薑黃素(15 μM)單獨組；15 μM薑黃素不論是否有艾瑞莎，皆可誘發約90%之H1975細胞的細胞凋亡(圖5A，右)，此事實可解釋兩藥劑並未一起誘發。綜上，這些結果似乎指出，薑黃素可增強艾瑞莎-抗性細胞中由艾瑞莎誘發之細胞凋亡。
下一步，我們使用菌落形成試驗，檢驗了是否薑黃素可增強CL1-5、A549及H1975細胞中艾瑞莎之抗致瘤性。結果係相似於MTT試驗，且發現，相較於無藥劑控制組及各藥劑單獨處理組，薑黃素與艾瑞莎之結合顯著地抑制了CL1-5、A549及H1975菌落形成(圖5B)。上述活體外研究支持了，當使用艾瑞莎處理艾瑞莎-抗性肺腺癌細胞時薑黃素可增強艾瑞莎之抗癌活性，此假設；此效果似乎不受EGFR 突變型之突變或任何其他基因變異之限制。
5.　異體移植活體內，薑黃素增強人類肺腺癌細胞中艾瑞莎抗瘤特性。
下一步為研究是否薑黃素可增強活體內艾瑞莎抗瘤活性。為此，以皮下植入CL1-5細胞至SCID小鼠。一週後，當可察覺到腫瘤時(3-5 mm)，小鼠被隨機分成五組(圖6A)。接著使這五組接受不同處理體系，其為：做為控制組的空載體、薑黃素(1 g/kg)組，艾瑞莎(120 mg/kg)組，薑黃素(1 g/kg)合併低劑量艾瑞莎(60 mg/kg)組，及薑黃素(1 g/kg)合併高劑量艾瑞莎(120 mg/kg)組。這些處理每日一次以口服給予，且在四週後犧牲小鼠。在此期間，每四天監視每組的腫瘤體積(圖6B)。在此研究末，控制組動物之腫瘤尺寸平均為638.55 mm3 。明顯地，薑黃素加上高劑量艾瑞莎合併處理組的腫瘤尺寸顯示了最大的縮減，至僅64.15 mm3 (p =0.0001對照控制組)，而薑黃素加上低劑量艾瑞莎組僅顯示縮減至平均為160.59 mm3 (p =0.0006對照控制組)。薑黃素單獨組及艾瑞莎單獨組之平均腫瘤尺寸分別為354.91(p =0.015對照控制組)及138.32 mm3 (p =0.0003對照控制組)。因此薑黃素合併艾瑞莎之抗瘤活性，相較於薑黃素及艾瑞莎單獨組，顯示增強了的效果(p <0.01對照薑黃素組，及p =0.015對照艾瑞莎組)。此外，以低劑量薑黃素(60 mg/kg)處理之組顯示了與120 mg/kg艾瑞莎單獨組相似程度的抗瘤活性(p =0.483)(圖6C)。因此，合併薑黃素與低劑量之艾瑞莎可節省半量艾瑞莎，且獲得相同的腫瘤進展之抑制作用。這些結果清楚地顯示，薑黃素增強了艾瑞莎之抗瘤活性。
6.　薑黃素藉由減少EGFR-相關訊息傳遞並影響細胞凋亡之調節，來增強活體內艾瑞莎之抗瘤效果。
為了研究牽涉薑黃素及艾瑞莎合併處理小鼠之抗瘤活性的分子機制，以西方墨點法分析來自各種腫瘤組織之蛋白質裂解液；此方法係用於測量腫瘤中EGFR、AKT、細胞週期素D1、c-MET、PCNA、及iNOS蛋白質量。圖7A顯示，在以薑黃素單獨或薑黃素及艾瑞莎合併處理後，SCID小鼠腫瘤中EGFR及AKT量減少了。此外，細胞週期素D1、c-MET、PCNA，及iNOS之蛋白質量在這些腫瘤中有顯著的改變(圖7A，左)。為了確認活體內薑黃素合併艾瑞莎之細胞凋亡誘導效果，研究細胞凋亡相關訊息傳遞，包括半胱天冬酶及PARP。結果顯示，薑黃素可增強半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9及PARP之活性程度，特別是薑黃素加上艾瑞莎組(圖7A，右)。這些結果指出，薑黃素似乎會藉由減少EGFR訊息傳遞、c-MET、PCNA及iNOS，及藉由上調細胞凋亡路徑，而強化活體內具抗性之細胞中艾瑞莎之抗癌活性。
我們接著使用免疫組織化學染色檢驗了增生標記PCNA，及藉由TUNEL試驗檢驗細胞死亡；於石蠟包埋組織樣本中完成。圖7B結果顯示，在薑黃素處理組樣本及薑黃素合併艾瑞莎組樣本中，PCNA標記(圖7A，左)減少了，其係相似於PCNA蛋白質表現。此外，原位細胞死亡偵測試驗指出，相較於控制組及艾瑞莎單獨組，薑黃素合併艾瑞莎處理組顯著地增加了細胞的細胞凋亡活性(圖7B)。這些結果亦顯示，相較於控制組，薑黃素單獨組誘發了細胞的細胞凋亡(圖7A，右)。這些結果確認了薑黃素活體內抗增生及細胞凋亡誘發能力。
7.　薑黃素減輕艾瑞莎之不良腸胃道影響
在研究活體內異體移植期間，艾瑞莎處理組小鼠顯示了驚人的體重減輕(數據未顯示)且亦有明顯的腹瀉副作用；此相似於臨床文獻中先前的報導，且組內嚴重者甚至死亡。有趣的是，當合併艾瑞莎與薑黃素，可避免體重減輕且亦顯著地減少了小鼠間死亡數(合併療法的存活率係78%，相較於艾瑞莎療法的33%)(圖8A，左)。接著檢驗腸道的形態與組織，以研究薑黃素減輕艾瑞莎之腸胃道副作用的效果。結果顯示，艾瑞莎組之腸道全長較合併療法組者短且細(圖8A，右)。控制組與薑黃素組間，或薑黃素加上艾瑞莎組間，則無明顯的不同。再者，當以H&E染色檢驗，得自薑黃素及艾瑞莎合併組的腸絨毛之長度，相較於艾瑞莎處理組，較長且具較大的完整性(p =0.0001)(圖8B)。再者，當以TUNEL試驗活體內評估，相較於艾瑞莎單獨組，薑黃素合併艾瑞莎亦可顯著減少絨毛內細胞凋亡(p =0.0015)(圖8C)。因此，薑黃素可改善以艾瑞莎處理之小鼠的存活率，且亦可減少艾瑞莎之GI副作用。
最後，我們研究了活體外薑黃素對艾瑞莎誘發之腸道上皮細胞之細胞凋亡的保護效果，使用未轉形上皮細胞系IEC-18。半胱天冬酶-Glo3/7試驗顯示，艾瑞莎(就IEC-18細胞分別為IC25 於30 μM及IC50 於40 μM之艾瑞莎)可誘發IEC-18細胞中半胱天冬酶3/7活性，然而，5 μM薑黃素(無毒性劑量)可顯著地抑制艾瑞莎誘發之半胱天冬酶3/7活性(圖9A)。結果顯示，薑黃素可避免腸道上皮細胞不被艾瑞莎誘發細胞凋亡；此效果明顯相似於在活體內的先前觀察。我們接著測定何種可能的機制牽涉到此薑黃素對艾瑞莎誘發細胞凋亡之保護效果。先前的報導已指出，艾瑞莎可經由依賴p38有絲分裂劑活化蛋白質激脢(MAPK)的活化作用，而誘發腸道上皮細胞之細胞凋亡(Gastrointestinal & Liver Physiology 2007；293(3)：G599-606)，此為艾瑞莎相關GI副作用之可能機制。在此，我們發現IEC-18細胞中，活性-p38顯著地隨艾瑞莎處理劑量依賴性地(0-20 μM)增加了，但在同樣培養條件下CL1-5細胞並不提高p38活化作用(圖9B)。此外，IEC-18細胞中艾瑞莎誘發之p38 MAPK活化作用係被薑黃素顯著地抑制了：結果指出，薑黃素(5 μM)及選擇性p38 MAPK抑制劑BIRB 796(10 nM)可顯著地降低艾瑞莎-處理IEC-18細胞中之活性-p38表現(圖9C，左)。再者，MTT試驗顯示，艾瑞莎(30及40 μM)可顯著地減少IEC-18細胞存活率，然而，薑黃素(5 μM)，以及BIRB 796(10 nM)，可顯著地將細胞從艾瑞莎之毒性效果中解救出來(圖9C，右)。亦測試了薑黃素類似物，LL-17、LL-18、LL68及JC-15，發現其等具有減少艾瑞莎誘發之腸道細胞死亡的保護效果(圖10)。綜言之；這些結果顯示，薑黃素可減輕腸道中艾瑞莎誘發之併發症。
結論是，我們的結果顯示，薑黃素做為艾瑞莎之抗腫瘤能力之增強劑的突出活性。此藥劑亦減輕艾瑞莎之腹瀉副作用，因此對於肺癌病人而言可為一良好的佐劑。臨床上，肺癌標靶療法之費用相當高，且在治療期間，副作用往往是關鍵問題。薑黃素係一普及且較便宜之藥劑，且其似乎能增強艾瑞莎之效果並因此減少醫療相關花費及病人經濟負擔。為了減少艾瑞莎之劑量，削減費用，並避免副作用，我們建議，對在艾瑞莎治療期間的NSCLC癌病人而言，薑黃素應為一良好的佐劑。
以說明本發明為目的，目前較佳的具體實施例顯示於圖式中。然而應理解的是，本發明並未被所示之較佳具體實施例所限制。
圖式中：
圖1顯示薑黃素在具艾瑞莎抗性之NSCLC細胞中潛在地抑制細胞增生並減少配體誘發之EGFR訊息傳遞活化。A部分，左，MTT試驗結果顯示，六個肺腺癌細胞系中都對艾瑞莎具易感性；右，MTT試驗顯示，在五個對艾瑞莎具抵抗力之NSCLC細胞系中，薑黃素皆造成劑量依賴性之細胞增生的抑制。柱，平均數(n=6)；條，標準差(SD)。數據係代表兩個獨立的實驗。B部分，西方墨點法顯示，薑黃素劑量依賴性地(1-20 μM)減少了CL1-5、A549和H1975細胞系中EGF(20 ng/ml)-誘發之EGFR表現、pEGFR濃度、AKT表現、pAKT濃度以及細胞週期素D1表現。數據係代表兩個獨立的實驗，使用β-肌動蛋白作為內部控制。C部分，實時定量RT-PCR顯示，在CL1-5細胞中，EGFR mRNA表現係被薑黃素濃度依賴性地(1-20 μM)在培養24小時後減少。柱，平均數(n=3)；條，SD。*，p<0.05，與空載體處理控制組(vehicle-treated control)相較具統計上顯著性。數據係代表三個獨立的實驗。
圖2顯示薑黃素結合至具T790M抗性突變之EGFR的酪胺酸磷酸化部位。
圖3顯示薑黃素加速EGFR之降解並下調EGFR之蛋白質濃度。A部分，西方墨點法顯示，薑黃素可劑量依賴性地抑制EGFR蛋白質表現，而當細胞係以MG132前處理，則EGFR蛋白質濃度恢復。B部分，免疫沉澱試驗顯示，相較於其他單一處理組，艾瑞莎(1 μM)及薑黃素(10 μM)可增加EGFR蛋白質泛素化。
圖4顯示活體外使用薑黃素增強由艾瑞莎造成之抗細胞增生並阻擋由艾瑞莎造成之EGFR訊息傳遞活化。A部分，MTT試驗顯示，在五個對艾瑞莎具抵抗力之肺腺癌細胞系中，薑黃素增強了艾瑞莎的抗增生效果。柱，平均數(n=6)；條，SD。**，p <0.01。數據係代表兩個獨立的實驗。B部分，西方墨點法顯示，在以艾瑞莎處理CL1-5、A549及H1299 NSCLC細胞系後，薑黃素增加阻擋EGF(20 ng/ml)誘發之EGFR並進一步減少pEGFR、AKT和pAKT蛋白質表現濃度。數據係代表兩個獨立的實驗，使用β-肌動蛋白作為內部控制。
圖5顯示在活體外NSCLC細胞中，薑黃素增強了艾瑞莎之細胞凋亡效果及菌落形成之抑制作用。A部分，膜聯蛋白(Annexin)V-FITC細胞凋亡試驗顯示，薑黃素增強了艾瑞莎之細胞凋亡效果；上部分，以所指示的藥劑處理CL1-5細胞。所有呈現的圖表中，x 軸係膜聯蛋白-V-FITC，y 軸係PI(碘化丙錠，propidium iodide)；下部分，計算正在進行細胞凋亡之CL1-5、A549及H1975細胞；總細胞之膜聯蛋白-V+和PI-(早期細胞凋亡)以及膜聯蛋白-V+和PI+(晚期細胞凋亡)濃度被發現在右下和右上方象限。柱，平均數(n=3)；條，SD。*，p<0.05，**，p<0.01及p=0.331(15 μM薑黃素對1 μM艾瑞莎加上15 μM薑黃素)。數據係代表各做過三次的獨立實驗。B 部分，菌落形成試驗顯示，在CL1-5、A549及H1975肺腺癌細胞中，薑黃素增強了艾瑞莎之菌落抑制能力。指示以藥劑作細胞處理；V：空載體控制組，G1、G5、G10、G15、C1、C5、C10、C15、G1+C1、G1+C5、G1+C10及G1+C15：G和C係指艾瑞莎和薑黃素，以及數字顯示藥劑之濃度(μM)。在兩週後計算菌落。柱，平均數(n=3)；條，SD。數據係代表兩個獨立的實驗。
圖6顯示薑黃素增強了活體內艾瑞莎之抗瘤活性。A部分，活體內實驗方案以一計劃表呈現。B部分，106 CL1-5肺腺癌細胞被皮下植入於SCID小鼠中，並隨時間監視五組的腫瘤體積。點，為每組至少六隻小鼠的平均；條，SD。C部分，上圖，自小鼠切下的皮下腫瘤攝影，其指出，相較於單獨處理的組，薑黃素增強了艾瑞莎抗腫瘤生長的活性；下表，實驗最後一天的腫瘤體積。柱 ，平均數(n=6)；條 ，SD。p =0.0003(控制組對照120 mg/kg艾瑞莎單獨組)，p =0.0006(控制組對照60 mg/kg艾瑞莎及1 g/kg結合組)，及p=0.484(120 mg/kg艾瑞莎單獨組對照60 mg/kg艾瑞莎及1 g/kg結合組)。
圖7顯示抗瘤增生活性的增強作用及使用異體移植腫瘤模型藉由複合艾瑞莎/薑黃素處理誘發之細胞凋亡。A部分，左，西方墨點法顯示，薑黃素結核艾瑞莎抑制了肺腺癌腫瘤組織中EGFR、AKT、c-MET、細胞週期素D1、PCNA，及iNOS之表現；右，西方墨點法顯示，薑黃素結合艾瑞莎抑制半胱天冬原酶-8、半胱天冬原酶-3及半胱天冬原酶-9之表現，並增強肺腺癌腫瘤組織中PARP片段全長的量。數據係以使用β-肌動蛋白作為內部控制而顯示。從每組中三隻動物匯集樣本並分析；顯示代表性的結果。B部分，H&E染色，增生標記PCNA及使用TUNEL試驗之細胞凋亡偵測之免疫組織化學染色。為此，使用每組的皮下腫瘤切片，其結果指出，薑黃素進一步抑制腫瘤細胞增生並增強由艾瑞莎誘發之凋亡性細胞死亡。
圖8顯示薑黃素減輕活體內艾瑞莎之腸胃道副作用。A部分，左，每組的動物存活率指出，薑黃素減少了由艾瑞莎副作用造成之小鼠死亡；右，每組小鼠腸道之攝影，呈現以顯示薑黃素減少了艾瑞莎之腸胃道副作用。B部分，左，各組的腸道切片之H&E染色顯示，薑黃素可預防絨毛損傷，其為艾瑞莎之主要副作用之一；右，量化絨毛長度(條=200μm)。柱，平均數(n=3)；條，SE。p=0.0001(120 mg/kg艾瑞莎單獨組對照120 mg/kg艾瑞莎加1 g/kg薑黃素組)。C部分，左，使用各組的腸道切片由TUNEL試驗偵測細胞凋亡；這些指出，薑黃素減弱了絨毛內由艾瑞莎造成之細胞死亡；右，如材料與方法所描述的TUNEL經染色陽性細胞之量化。柱，平均數(n=10)；條，SE。
圖9顯示薑黃素減輕活體外艾瑞莎之腸胃道副作用。A部分，半胱天冬酶-Glo3/7試驗結果顯示，在IEC-18細胞中，艾瑞莎造成半胱天冬酶3/7活性劑量依賴性之誘發，但薑黃素可反轉此艾瑞莎誘發之半胱天冬酶活性。柱，平均數(n=3)；條，SD。數據係代表兩個獨立的實驗。B部分，西方墨點法顯示，艾瑞莎劑量依賴性地(0-20 μM)增加活性的p38表現，但劑量濃度在CL1-5細胞並不影響。數據係代表兩個獨立的實驗，使用β-肌動蛋白作為內部控制。C部分，左，西方墨點法顯示，IEC-18中，薑黃素與BIRB 796減少了由艾瑞莎誘發之p38活性蛋白質濃度。數據係代表兩個獨立的實驗，使用β-肌動蛋白作為內部控制；右，MTT試驗顯示薑黃素與BIRB 796避免IEC-18細胞增生受到艾瑞莎誘發之毒性損傷。柱，平均數(n=6)；條，SD。數據係代表兩個獨立的實驗。
圖10顯示薑黃素及其類似物LL-17、LL-18、LL-68，及JC-15(柱3-7)可減輕艾瑞莎誘發之IEC-18腸道細胞增生抑制作用。柱，平均數(n=6)；條，SD。*，p <0.05且**p <0.01，相較於艾瑞莎處理組(柱2)。數據係代表兩個獨立的實驗。
圖11顯示EFGR蛋白質之胺基酸序列，即GenBank之登錄號NM_005228(SEQ ID NO：1)。
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  1. 一種使用薑黃素或其類似物於製造用於減少病人因接受上皮細胞生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療導致的副作用的藥物之用途，其中該類似物係選自於由下列所構成之群組：
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該等副作用係EGFR-TKI誘發之腸胃道副作用。
  3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該等副作用係EGFR-TKI誘發之腸道細胞損傷或生長抑制。
  4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該EGFR-TKI係艾瑞莎(N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺)。
  5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該病人患有非小細 胞肺癌(NSCLC)。
  6. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該藥物係與EGFR-TKI同時被施用。
  7. 如申請專利範圍第1-6項中任一項之用途，其中EGFR-TKI係以不低於標準劑量之量施予於該病人。
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