JP2007145745A - 変異型ＥＧＦＲ下流シグナルを抑制するＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を含む肺癌治療剤およびその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】レセプター型チロシンキナーゼの正常なシグナル伝達経路に影響を与えることなく肺癌細胞を治療する薬剤および方法を開発すること。
【解決手段】Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を含む肺癌治療剤を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、肺癌細胞を処置する薬剤およびその利用に関するものであり、より詳細には、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼドメインに変異を有する非小細胞肺癌細胞（例えば、ゲフィチニブ抵抗性を獲得した非小細胞肺癌細胞）を処置する薬剤およびその利用に関するものである。

ヒト癌に関して、非ウイルス性の内因性癌遺伝子の活性が関連すること、およびこれらの癌遺伝子の多くがチロシンキナーゼをコードすること、が知られている。レセプター型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、生体内でのシグナル伝達に特に重要であると考えられており、癌の治療に有望な標的の１つとして上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の研究が進んでいる。

ＥＧＦＲによる基質タンパク質のチロシン残基の可逆的リン酸化は、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性化のために必要である。よって、ＥＧＦＲに対する阻害剤（ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）を用いれば、腫瘍細胞の増殖および分裂を誘導する細胞シグナル伝達経路を遮断することができると考えられている。ＥＧＦＲはＥｒｂＢファミリーチロシンキナーゼに属し、広範な種々のヒト悪性腫瘍（肺癌を含む）において過剰発現されている。

ヒト癌の１つである肺癌は、気管から気管支、肺胞に至るまでの内粘膜（上皮）および分泌腺において発生する悪性腫瘍である。肺癌はその組織型より小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＮＳＣＬＣ）に分類され、ＮＳＣＬＣには、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＳＣＣ）、腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＡＣ）、大細胞癌（ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＬＣＣ）などが含まれる。

肺癌の治療法としては、外科的摘出手術、化学療法および放射線療法が挙げられるが、手術が不可能な非小細胞肺癌または再発した非小細胞肺癌に対して用いられる経口治療薬として、ＥＧＦＲチロシンキナーゼに対する阻害剤であるゲフィチニブが知られている。ゲフィチニブは、ＥＧＦＲ分子におけるチロシンキナーゼリン酸化を直接阻害することによって機能する、経口活性キナゾリンであり、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合部位に競合する。

ゲフィチニブはまた、アミノ酸７４６〜７５０位を欠失している変異型ＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌に対して非常に有効であることが報告されている（非特許文献１を参照のこと）。この変異型ＥＧＦＲにおけるアミノ酸欠失部位は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメイン内であり、このキナーゼドメインにおける変異が抗アポトーシスシグナリング（Ａｋｔにより媒介されるシグナリングおよびＳＴＡＴ５シグナリングを介するシグナリングを含む）を活性化することは、すでに明らかになっている（非特許文献２を参照のこと）。しかし、細胞生存の増加およびシグナリングの持続に関するメカニズムは未だ解明されていない。
特表２００５−５２９１６２公報（公表日：平成１７年９月２９日） Ｐａｅｚ ＪＧ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４；１４９７−１５００ Ｓｏｒｄｅｌｌａ Ｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４，３０５：１１６３−１１６７ Ｓｕｚｕｋｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００３， ６３：５０５４−５０６９ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００５，３５２：７８６−７９２ Ｊｏｈｎｓｏｎ ＦＭ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００５，１１：６９２４−６９３２

レセプター型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は癌細胞および正常細胞に共通して存在するので、これを治療標的とすると正常なシグナル伝達経路に対しても影響を与える可能性がある。

ゲフィチニブは、間質性肺炎という重篤な副作用を引き起こすことが知られている。この副作用のメカニズムについては、ゲフィチニブが肺胞上皮のＥＧＦＲの機能を障害してその増殖を抑制することによる、という仮説を論じた報告がある（非特許文献３を参照のこと）。

また、ゲフィチニブ感受性であった細胞がゲフィチニブに対する抵抗性を獲得することによりゲフィチニブの抗腫瘍効果が治療中に減弱してしまうことも知られている。例えば、アミノ酸７５０位付近を欠失している変異型ＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌に対してはゲフィチニブ治療が有効である（非特許文献１を参照のこと）。しかし、ゲフィチニブに対する抵抗性を獲得した非小細胞肺癌においては、アミノ酸７５０位付近を欠失以外に新たな変異を獲得していることが報告されている（非特許文献４を参照のこと）。この新たな変異によりＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ）の結合性が低下して、該阻害剤の抗腫瘍効果が減弱すると考えられている。よって、アミノ酸７５０位付近を欠失する変異型ＥＧＦＲのシグナル伝達における異常を明らかにすること、その下流シグナルを抑制する方法を開発することは、ゲフィチニブに対する抵抗性を獲得した非小細胞肺癌に対する治療に大いに役立つと考えられる。

特許文献１には、チロシンキナーゼインヒビター（ＴＫＩ）治療に対して抵抗性を獲得しているかまたは従来のＴＫＩ治療に対して初めから応答しない個体において癌を処置する方法が記載されているが、標的分子はあくまでもレセプター型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、そのレセプター型チロシンキナーゼの投与方法に特徴を有する。

チロシンキナーゼの他のファミリーとして、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼが挙げられる。このキナーゼは、癌、免疫系機能不全および骨のリモデリング疾患に関与することが知られている。哺乳動物のＳｒｃファミリーのメンバーとしては、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｆｇｒ、Ｌｙｎ、Ｈｃｋ、ＬｃｋおよびＢｌｋが知られている。これらは、５２ｋＤａ〜６２ｋＤａの分子量範囲の非レセプター型タンパク質キナーゼである。

Ｓｒｃファミリーキナーゼについては多くの研究がなされており、種々のヒト疾患に対する潜在的な治療標的と考えられている。これまでの研究の多くは、Ｓｒｃファミリーキナーゼの発現を、癌（例えば、結腸癌、乳癌、肝癌および膵臓癌）、特定のＢ細胞白血病、およびリンパ腫に関連付けている。さらに、Ｓｒｃキナーゼのアンチセンスを卵巣腫瘍細胞または結腸腫瘍細胞に発現させると、腫瘍増殖を阻害することが示されている。また、野生型ＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌においてもＳｒｃキナーゼの活性を抑制することによって腫瘍の浸潤抑制、細胞周期停止、およびアポトーシス誘導が生じることが報告されている（非特許文献５を参照のこと）。

また白血病に関してもＳｒｃファミリーキナーゼは、潜在的な治療標的であると考えられている。

しかし、非小細胞肺癌に対してこれまでになされた研究は、ゲフィチニブのようにＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害する薬剤の有効性に関する報告は存在するが、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を用いて、ゲフィチニブ感受性の非小細胞肺癌で高頻度に発現する変異型ＥＧＦＲの下流シグナルを制御することの有用性はこれまで何ら示唆されていない。

一般的に、非小細胞肺癌の治療法としての化学療法では、腫瘍の縮小効果が４０％程度の症例において観察され、統計学的には生存効果の延長が証明されている。しかし、上記化学療法では再発を伴うことが多く、再発した段階で癌細胞は使用した薬剤に対する耐性を獲得している。ゲフィニチブは生存延長効果が未だ明らかではない薬剤であり、多くの非小細胞肺癌症例においては、ゲフィニチブの効果が一旦観察されても治療抵抗性を伴って再発する。また、ゲフィニチブは、レセプター型チロシンキナーゼであるＥＧＦＲチロシンキナーゼに対する阻害剤として開発されたものであり、正常細胞における野生型ＥＧＦＲのシグナル伝達経路に影響を与える可能性を否定することができない。よって、化学療法では副作用の危険性を除外することは理論的に不可能である。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、レセプター型チロシンキナーゼであるＥＧＦＲの正常細胞におけるシグナル伝達経路に影響を与えることなく非小細胞肺癌細胞を処置する薬剤および方法を提供することにある。

本発明に係る肺癌治療剤は、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を含むことを特徴としている。

本発明に係る肺癌治療剤において、上記Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤は正常細胞における野生型ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害しないことが好ましい。

本発明に係る肺癌治療剤において、上記Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤は、アミノ酸第７４６〜７５０位を欠失するＥＧＦＲのシグナル伝達を特異的に抑制することが好ましい。

本発明に係る肺癌治療剤において、上記Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤は、ＰＰ１、ＰＰ２、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＳＫＩ−６０６、ＡＺＤ０５３０、ＡＺＭ４７５２７１、ＣＧＰ７７６７５またはＣＧＰ７６０３０であることが好ましい。

本発明に係る肺癌治療剤において、上記肺癌は非小細胞肺癌であることが好ましい。

本発明に係る肺癌治療剤において、上記非小細胞肺癌は、扁平上皮癌、腺癌、または大細胞癌であることが好ましい。

本発明に係る肺癌治療剤を用いて、化学療法によって縮小または退行した後に再発した肺癌を治療することが好ましい。

本発明に係る肺癌治療剤において、上記肺癌の癌細胞は変異型ＥＧＦＲを発現していることが好ましい。

本発明に係る肺癌治療剤において、上記変異型ＥＧＦＲは野生型ＥＧＦＲのアミノ酸配列の第７４６〜７５０位を欠失していることが好ましい。

本発明に係るスクリーニング方法は、変異型ＥＧＦＲ下流のシグナル伝達を抑制することにより変異型ＥＧＦＲ発現している癌細胞を処置するための薬剤をスクリーニングするために、該当変異型ＥＧＦＲを発現している細胞培養物に候補遺伝子を添加する行程；ＥＧＦを添加した細胞培養物を溶解して細胞調製物を得る工程；ならびに、該細胞調製物におけるＳｒｃファミリーチロシンキナーゼおよびＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性を測定する工程、を包含し、ただし、当該薬剤は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインに直接的に結合することによりキナーゼ活性を阻害するものではないことを特徴としている。

本発明に係るスクリーニング方法において、上記変異型ＥＧＦＲは野生型ＥＧＦＲのアミノ酸配列の第７４６〜７５０位を欠失していることが好ましい。

本発明を用いれば、ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメイン内に変異を有する肺癌において抗アポトーシスシグナルを強力に抑制することができる。これにより、ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメイン内に変異を有する肺癌に対して、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤と比較して、以下のような条件下において、より効果的な抗腫瘍効果を得ることができる。すなわち、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ）に対して感受性であった肺癌が再発した際に、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤による治療を行うことができる。あるいは、ＥＧＦＲに変異を有する肺癌患者に対して、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の代わりにＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤による治療を行えば、抗アポトーシスシグナルを抑制することによってより強力かつ腫瘍特異的な抗腫瘍効果を得ることができる。なお、治療に際しては正常細胞におけるＥＧＦＲシグナリングへの影響が極めて少ないので、副作用を軽減し得る可能性がある。

本発明者らは、日本で見出されたゲフィチニブ感受性ＮＳＣＬＣにおいて高頻度で観察されるＥＧＦＲ変異体（アミノ酸Ｅ７４６〜Ａ７５０を欠失する）により生成されるシグナリングの活性化を調べた。具体的には、本発明者らは、この変異型ＥＧＦＲを安定的に発現する形質転換細胞株を樹立し、生成される下流のシグナリングについて野生型ＥＧＦＲ（配列番号１）と比較し、さらに、変異型ＥＧＦＲとＳｒｃファミリーチロシンキナーゼとの間の相互作用を分析した。

その結果、以下のことが見出された：（１）変異型ＥＧＦＲにおいて、Ｃｂｌとの相互作用に関与する部位であるＴｙｒ−１０４５のリン酸化が減弱する；（２）変異型ＥＧＦＲのエンドサイトーシスが減少する；（３）この変異型ＥＧＦＲにより誘導されるシグナリングは、野生型ＥＧＦＲと比較して、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼとより協調しかつＳｒｃファミリーチロシンキナーゼに依存する；（４）ＥＧＦ刺激により誘導される抗アポトーシスシグナリングは、機能的Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ活性に依存する。

このように、本発明者らは、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼとの相互作用が、Ｅ７４６〜Ａ７５０のアミノ酸を欠く変異型ＥＧＦＲの下流での独特なシグナル伝達経路において重要な役割を担うことを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明は、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼの活性を阻害する化合物を含む薬学的組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼの活性を阻害する化合物」は、「Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤」と交換可能に使用される。

本発明に係る薬学的組成物は、肺癌治療目的であることが企図され、化学療法によって縮小または退行した後に再発した肺癌を治療する目的に使用されることが好ましい。本発明を適用するに好ましい肺癌は、非小細胞肺癌であることが好ましく、扁平上皮癌、腺癌、または大細胞癌であることがより好ましい。

本発明において、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼの活性を阻害する化合物は、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼを特異的に阻害することによって変異型ＥＧＦＲの下流シグナルを抑制するものが好ましく、このような化合物としては、例えば、ＰＰ１、ＰＰ２、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＳＫＩ−６０６、ＡＺＤ０５３０、ＡＺＭ４７５２７１、ＣＧＰ７７６７５、ＣＧＰ７６０３０などが挙げられるが、これらに限定されない。上記化合物は、正常細胞における野生型ＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性を阻害しないことが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「正常細胞における野生型ＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性を阻害しない」は、正常細胞における野生型ＥＧＦＲチロシンキナーゼに対して影響を与えないことが意図される。よって、上記化合物は、正常細胞において野生型ＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性を全く阻害しない化合物だけではなく、該細胞において野生型ＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性をわずかに阻害するがその阻害レベルが野生型ＥＧＦＲチロシンキナーゼ下流のシグナル伝達に対して影響を与えない程度である化合物もまた包含される。

一実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルを含み得る。好ましくは、本発明に係る薬学的組成物は、このような組成物を必要とする患者に投与するために処方される。本明細書中で使用される場合、用語「患者」は、「被験体」と交換可能に使用され、脊椎動物が意図され、好ましくは、哺乳動物が意図され、最も好ましくは、ヒトが意図される。

用語「薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクル」は、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼの活性を阻害する化合物の薬理学的活性を破壊しない、非毒性のキャリアまたはビヒクルが意図される。このようなキャリアまたはビヒクルとしては当該分野において公知の種々の物質が使用され得る。

本実施形態に係る薬学的組成物は、局所的に、鼻内に、頬内に、経口的に、非経口的に、吸入噴霧により、または移植したレザバを介して、投与され得る。本実施形態に係る組成物は、肺癌治療の観点から、鼻内にもしくは経口的に、または吸入噴霧により投与されることが好ましい。本発明に係る薬学的組成物は、治療の標的が局所的な適用により容易に到達可能な領域または器官である場合、これらの領域または器官のそれぞれに適切な局所処方物として容易に調製され得る。

本実施形態に係る薬学的組成物は、肺癌治療の観点から、直接的適用のための液体形態であっても、間接的適用のための鼻エアロゾルまたは鼻吸入に好ましい形態で投与されてもよい。このような組成物は、製薬処方の技術分野で周知の技術に従って調製され、そして生理食塩水中の溶液として、適切な防腐剤、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を使用して調製され得る。

本実施形態に係る薬学的組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定される。一般には、製剤中に含有される有効成分の投与量で、好ましくは成人１日当り０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本実施形態に係る薬学的組成物はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。

本発明に係る薬学的組成物中に含まれる化合物は、薬学的に受容可能な塩であってもよく、薬学的に受容可能な塩としては、薬学的に受容可能な無機酸および有機酸ならびに無機塩基および有機塩基から誘導されるものが挙げられる。

この状態を処置または予防するために、通常では単独療法で投与される付加的治療剤もまた、処置または予防されるべき特定の状態または疾患に依存して、本発明に係る薬学的組成物中に含まれ得る。本明細書中で使用される場合、通常、特定の疾患または状態を処置または予防するために投与される付加的治療剤は、「処置される疾患または状態に適切」であるとして公知である。例えば、本発明に係る薬学的組成物の効果を阻害しない限り、公知の他の化学療法剤または抗増殖性剤もまた、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼの活性を阻害する化合物と組合わされて使用され得る。

本発明に係る薬学的組成物中に存在する付加的治療剤の量は、活性薬剤としてのみこの治療剤を含む組成物中に通常投与される量よりも少ないことが好ましい。本発明に係る薬学的組成物中に含まれる付加的な治療剤の量は、当該付加的治療剤のみを活性成分として含む薬剤中に通常存在する量の１０％〜１００％、好ましくは２０〜１００％、最も好ましくは４０〜１００％の範囲である。なお、本発明は、付加的治療剤などが「Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼの活性を阻害する化合物」と一物質（すなわち、組成物）を形成しても別に梱包されている形態（すなわち、キット）であってもよい。

本発明はまた、肺癌を処置（治療または減少）する方法を提供する。本発明に係る方法は、上記薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する。本発明に係る方法は、付加的な治療剤をこの患者に別個に投与するさらなる工程を包含する。これらの付加的な治療剤が、別個に投与される場合、これらは、本発明に係る薬学的組成物の投与の前、連続、または後に患者に投与され得る。本発明に係る方法において、上記薬学的組成物を投与するために好ましい方法は、上述した方法に従えばよく、患部に向けて直接的に適用されても間接的に適用されてもよい。

本発明はさらに、変異型ＥＧＦＲ下流のシグナル伝達を抑制することにより変異型ＥＧＦＲを発現している癌細胞を処置するための薬剤をスクリーニングする方法を提供する。本発明において、上記薬剤は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインに直接的に結合することによりキナーゼ活性を阻害するものではない。本発明に係るスクリーニング方法は、該変異型ＥＧＦＲを発現している細胞培養物に候補因子を添加する工程；候補因子を添加した細胞培養物にＥＧＦを添加する工程；ＥＧＦを添加した細胞培養物を溶解して細胞調製物を得る工程；ならびに、該細胞調製物におけるＳｒｃファミリーチロシンキナーゼおよびＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性を測定する工程、を包含することが好ましい。本発明に係るスクリーニング方法において、上記変異型ＥＧＦＲが野生型ＥＧＦＲのアミノ酸配列の第７４６〜７５０位を欠失していることが好ましい。

本発明はまた、生物学的サンプルにおいて肺癌細胞を治療する方法を提供する。本発明に係る方法は、生物学的サンプルを、本発明に係る薬学的組成物と接触させる工程を包含する。本明細書中で使用される場合、用語「生物学的サンプル」は、限定されることなく、細胞培養物またはこれらの抽出物；哺乳動物から入手した生検物質またはこれらの抽出物；および血液、唾液、尿、便、精液、涙、もしくは他の体液またはこれらの抽出物が意図されるが、肺癌治療の観点から、摘出された肺組織であることが好ましい。一旦摘出された生物学的サンプルにおいて肺癌細胞が治療された後に当該サンプルが元の患者に戻されることもまた、本発明の範囲内として意図される。

本発明に係る薬学的組成物はまた、移植可能な医療デバイス（例えば、人工器官、人工弁、血管移植片、ステントおよびカテーテル）をコーティングするための組成物中に組み込まれ得る。コーティングは、組成物において徐放性を付与するための適切なトップコート（フルオロシリコーン、ポリサッカリド、ポリエチレングリコール、リン脂質またはこれらの組合せ）によってさらに覆われ得る。すなわち、本発明に係る薬学的組成物の有効成分であるＳｒｃファミリーチロシンキナーゼの活性を阻害する化合物によってコーティングされた移植可能な医療デバイスもまた、本発明の範囲内である。

変異型ＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌細胞株にＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤またはＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を適用して、抗アポトーシスシグナルの抑制効果を比較することにより、本発明に係る薬学的組成物の効果をより示すことができる。また、軟寒天培地でコロニーを形成するか否かを調べることにより、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤が、変異型ＥＧＦＲを導入した細胞の形質転換能を抑制するか否かを知ることができる。さらに、変異型ＥＧＦＲを発現する肺癌細胞株、または変異型ＥＧＦＲを導入した非小細胞肺癌細胞株を用いる軟寒天培地での検討、またはヌードマウスを用いた造腫瘍性の検討などを行えば、本発明に係る薬学的組成物の有効性を示すことができる。

第７４６〜７５０位のアミノ酸欠失に加えて、さらに第７９０位および／またはその他の部位にアミノ酸置換を生じた変異型ＥＧＦＲを導入した非小細胞肺癌細胞株に本発明に係る薬学的組成物を適用する治療実験を行うことにより、当該変異を有するＥＧＦＲ由来のシグナリングがＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ依存的であることを示すことができる。

なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

また、本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。

〔Ｉ：材料および方法〕
（１）プラスミドの調製（変異型ＥＧＦＲ発現ベクターの作成）
ＥＧＦＲ全長およびＣ末端のＶＳＶＧタグをコードする発現ベクターｐＭＶＥＧＦＲを、Kumagai T, et al. Proc Natl Acad Sci USA; 100: 9220-5 (2003)に記載の方法に従って構築した。アミノ酸７４６〜７５０を欠く変異型ＥＧＦＲをコードする発現ベクター（ｐＭＶＥＧＦＲ／Ｄｅｌ）を、Lynch TJ, et al. N Engl J Med; 350: 2129-39 (2004)に記載のＰＣＲベースの方法を使用してｐＭＶＥＧＦＲ中の５’−ｇｇａａｔｔａａｇａｇａａｇｃ−３’ （配列番号３）の塩基対を欠失させて構築した。

（２）抗体および試薬
組換えヒトＥＧＦをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より購入した。Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤（ＰＰ２）、ＥＧＦＲ阻害剤（ＡＧ１４７８）およびＨＲＰ複合体化ストレプトアビジンを、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＤＡ）より購入した。Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＥＺ−Ｌｉｎｋ）をＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）より購入した。ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ４７３−Ａｋｔ、ｔｏｔａｌ Ａｋｔ、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｙ６９４−ＳＴＡＴ５、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｙ８４５−ＥＧＦＲ、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｙ９９２−ＥＧＦＲ、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｙ１０４５−ＥＧＦＲ、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｙ１０６８−ＥＧＦＲ、ｐｈｏｓｈｏ−Ｙ１１７３−ＥＧＦＲ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２ Ｅｒｋ１／２ （Ｔ２０２／Ｙ２０４）、およびｐｈｏｓｐｈｏ−Ｙ４１６−Ｓｒｃに対する抗体を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）より購入した。ｔｏｔａｌ Ｅｒｋ１／２、ｔｏｔａｌ Ｓｒｃ、ｔｏｔａｌ ＳＴＡＴ５、およびａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＰＹ９９）をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）より購入した。抗ＶＳＶＧ抗体をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。

（３）細胞株、細胞培養物、およびトランスフェクション
マウス線維芽細胞株ＮＲ６（ＥＧＦＲを欠失している細胞株）、ＮＥ９９細胞株（ＥＧＦＲを安定的に発現しているＮＲ６）、ＣＯＳ７細胞を使用した。トランスフェクションを、Kumagai T, et al. Proc Natl Acad Sci USA; 100: 9220-5 (2003)およびKumagai T, et al. Proc Natl Acad Sci USA; 98: 5526-31 (2001)に記載の方法に従って行った。

ＮＲ６細胞を用いて、ｐＭＶＥＧＦＲをトランスフェクトして野生型ＥＧＦＲを安定的に発現するＮＥ２００２細胞、およびｐＭＶＥＧＦＲ／Ｄｅｌをトランスフェクトして変異型ＥＧＦＲを安定的に発現するＮＲ／Ｄｅｌ細胞を樹立した。野生型ＥＧＦＲまたは変異型ＥＧＦＲを一過性に発現させる目的で、ＣＯＳ７細胞を用いた。アミノ酸７４６〜７５０位を欠失している変異型ＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９、および、変異を有していない野生型ＥＧＦＲを発現している非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９を用いた。

（４）細胞溶解物調製、タンパク質ビオチン化およびイムノブロット
ＮＲ６細胞およびこれに由来する細胞を、適切な細胞密度で播種し、７２時間培養した。次いで、細胞を、２０時間無血清にて培養した。ＥＧＦ刺激の１時間前に、ＤＭＳＯ中のＰＰ２（Ｓｒｃキナーゼ阻害剤）もしくはＡＧ１４７８（ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤）または等量のＤＭＳＯを培地中に添加した。ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した細胞を、Kumagai T, et al. Proc Natl Acad Sci USA; 98: 5526-31 (2001)に記載の方法に従って溶解用緩衝液（Lysis buffer）中で溶解した。全細胞溶解物および免疫沈降物を等量ずつＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してイムノブロッティングを行った。細胞表面上のＥＧＦＲタンパク質のエンドサイトーシスを評価するために、細胞表面タンパク質のビオチン化を、製造業者のプロトコル（Ｐｉｅｒｃｅ）に従って細胞溶解前に行った。

（５）アポトーシスの評価
野生型ＥＧＦＲを発現している細胞株ＮＥ９９、アミノ酸７４６〜７５０位を欠失している変異型ＥＧＦＲを発現させたＮＥ／Ｄｅｌ、アミノ酸７４６〜７５０位を欠失している変異型ＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９、および、変異を有していない野生型ＥＧＦＲを発現している非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９において生じるＥＧＦ依存的アポトーシスの評価に、ＥＬＩＳＡによる細胞死検出キットを用いた。ＥＧＦおよびＳｒｃファミリーキナーゼの非存在下でのアポトーシスの程度を１として、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下にて種々の濃度のＳｒｃファミリーキナーゼを存在させた場合のアポトーシスの割合を調べた。

〔ＩＩ：変異型ＥＧＦＲが下流のシグナル伝達経路の活性化を増強する〕
変異型ＥＧＦＲが細胞内シグナル伝達をどのようにもたらしているのかを解析するために、アミノ酸７４６〜７５０を欠く変異型ＥＧＦＲを安定的に発現するＮＲ６細胞株（ＮＲ／Ｄｅｌ）を樹立した。ＮＲ／Ｄｅｌ細胞株における変異型ＥＧＦＲの発現量と実質的に同程度のレベルで野生型ＥＧＦＲを発現するＮＥ２００２細胞株、およびより高いレベルで野生型ＥＧＦＲを発現するＮＥ９９細胞株を、使用した。これらの細胞株を用いて、ＥＧＦ依存的に活性化する主要な細胞内シグナル伝達経路を調べた。これらの細胞において、ＥＧＦ刺激に応じて、Ａｋｔ、ＥｒｋおよびＳＴＡＴ５を含む下流のシグナル伝達経路が活性化された（図１（ａ）、（ｂ））。

図１（ａ）および（ｂ）は、リガンド刺激によって活性化される変異型ＥＧＦＲ下流シグナリングを、経時的に検討した結果を示す。具体的には、細胞を、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で図中に示した時間にわたって刺激した。ＥＧＦ刺激なしのサンプルを、０分とした。各パネルの左側に示した抗体を使用してウエスタンブロット分析を行った：pAkt, anti-phospho-S473-Akt; Akt, anti-total Akt; pErk, anti-phospho-p44/42 Erk1/2 (T202/Y204); Erk, anti-total Erk1/2; pSTAT5, anti-phospho-Y694-STAT5; STAT5, anti-total STAT5。

ＥＧＦ刺激６０分後または１２０分後において、変異型ＥＧＦＲを発現する細胞（ＮＲ／Ｄｅｌ）では、基底レベル（刺激前のリン酸化状態）と比較して高いリン酸化レベルを示したが、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞（ＮＥ９９またはＮＥ２００２）では、基底レベル以下であった。特に、変異型ＥＧＦＲを発現する細胞におけるＡｋｔ、ＥｒｋおよびＳＴＡＴ５のリン酸化のピークは、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞より弱かった（図１（ａ）のレーン２および８、図１（ｂ）のレーン２および７）。ＥＧＦ刺激による変異型ＥＧＦＲにおけるリン酸化量のピークは、野生型ＥＧＦＲにおけるリン酸化量のピークよりかなり低かった（図３（ｅ）のレーン２および８）。これらの結果は、変異型ＥＧＦＲの下流シグナル伝達経路の活性化が、野生型ＥＧＦＲの下流シグナル伝達経路と比較して、下流シグナルの活性化のピーク値を上昇させるのではなく、時間的にシグナルを遷延させることを特徴とすることが明らかになった。

〔ＩＩＩ：変異型ＥＧＦＲは、ＥＧＦ刺激により８４５位のチロシン残基にリン酸化を受けるが、Ｃｂｌ結合部位に関与する１０４５位のチロシン残基はリン酸化を受けない〕
ＥＧＦ刺激によって変異型ＥＧＦＲのチロシン残基のリン酸化が生じるか否かを調べたところ、変異型ＥＧＦＲと野生型ＥＧＦＲとの間で顕著な差異を見出した（図１（ｃ））。

図１（ｃ）は、ＥＧＦ刺激の際の変異型ＥＧＦＲチロシンリン酸化を分析した結果を示す。具体的には、ＥＧＦ刺激（５０ｎｇ／ｍｌ）ありまたはなしの細胞を使用した。抗ＶＳＶＧ抗体を使用してサンプルを免疫沈降し、次いで、等量で３つに分配して、３連でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。第１のメンブレンを、anti-phospho-Y845-EGFR (pY845)にてプローブし、次いで、anti-phospho-Y992-EGFR (pY992)にて再プローブした。第２のメンブレンを、anti-phospho-Y1045-EGFR (pY1045)にてプローブし、anti-phospho-Y1068-EGFR (pY1068)およびanti-phospho-Y1173-EGFR (pY1173)にて再プローブした。第３のメンブレンを、anti-VSVG (EGFR)にてプローブした。

ＥＧＦＲの８４５位のチロシン残基はＳｒｃファミリーチロシンキナーゼとの相互作用に重要であることが知られているが、図１（ｃ）に示すように、変異型ＥＧＦＲのこの部位は、ＥＧＦ非存在下でわずかにリン酸化を受けていたが（レーン１）、ＥＧＦ刺激によってリン酸化はさらに増強した（レーン２）。この結果は、ＥＧＦ刺激によって変異型ＥＧＦＲとＳｒｃファミリーチロシンキナーゼとの相互作用が増強する可能性を示唆する。

一方、野生型ＥＧＦＲでは、ＥＧＦ刺激によって８４５位のチロシン残基が顕著にリン酸化されたが、ＥＧＦ非存在下ではリン酸化を検出し得なかった（レーン３および４）。

さらに、Ｃｂｌ依存的なＥＧＦＲエンドサイトーシスに関与することが知られている１０４５位のチロシン残基については、野生型ＥＧＦＲではＥＧＦ刺激によって高レベルのリン酸化を生じたが、変異型ＥＧＦＲではリン酸化を生じなかった（レーン２および４）。

これらの結果から、野生型ＥＧＦＲと変異型ＥＧＦＲとは、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼと異なる様式にて相互作用すること、および、変異型ＥＧＦＲのエンドサイトーシスは減弱していることが示唆される。

〔ＩＶ：変異型ＥＧＦＲは野生型ＥＧＦＲと異なるエンドサイトーシス特性を有している〕
変異型ＥＧＦＲを介して生じたシグナリングが延長されている理由を明らかにするために、ＥＧＦ刺激時に分子量１７０ｋＤａとして検出されるＥＧＦＲの発現レベルを比較した。

（ａ）〜（ｃ）は、分子量１７０ｋＤａとして検出されるＥＧＦＲの変異型および野生型のリガンド依存性修飾の経時変化を示す。ＥＧＦＲの検出のためのイムノブロットを、抗ＶＳＶＧ抗体を用いて行った。（ａ）および（ｂ）は、変異型および野生型のＥＧＦＲを安定的に発現するＮＲ６細胞から得られた結果である。（ｃ）は、変異型および野生型のＥＧＦＲを一過性に発現するＣＯＳ７細胞から得られた結果である。

図２（ａ）および（ｂ）に示すように、タンパク質バンドの強度は、ＥＧＦ刺激によってＮＥ２００２およびＮＥ９９における野生型ＥＧＦＲ発現の基底レベル（刺激前の状態）より減少した。しかし、変異型ＥＧＦＲでのタンパク質バンドの強度は、わずかに減少しただけであった。ＥＧＦＲを一過性に発現させたＣＯＳ７細胞を用いた実験においても同様の結果を得た（ｃ）。このことは、野生型ＥＧＦＲと比較して変異型ＥＧＦＲの分解が抑制されていることを示す。

次いで、細胞表面タンパク質をビオチン標識させて、ＥＧＦＲが変異を獲得することによって、エンドサイトーシスが抑制されるのかを確認した（図２（ｄ））。図２（ｄ）は、各細胞の細胞表面上のＥＧＦＲをビオチン化して、アビジン−ビオチン法によって検出した結果を示す。抗ＶＳＶＧ抗体を用いてサンプルを免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に供した。ＨＲＰ複合体化ストレプトアビジン（Ａｖｉｄｉｎ）を、ビオチンで標識したＥＧＦＲの検出に使用した。

図２（ｄ）に示すように、ＥＧＦ刺激に伴って、細胞表面上の野生型ＥＧＦＲの量は減少した（レーン６から１０）。具体的には、野生型ＥＧＦＲの量はＥＧＦ刺激５分後では４７％、刺激１２０分後では１８％まで減少した。しかし、変異型ＥＧＦＲのエンドサイトーシスは制限されており、具体的には、細胞表面上の変異型ＥＧＦＲの量はＥＧＦ刺激５分後では８５％、刺激１２０分後では８６％残存した。

ＣｂｌはＥＧＦＲのユビキチン化を促進し、Ｃｂｌ−ＣＩＮ８５−エンドフィリン複合体を形成することによってリガンド依存的なクラスリン媒介性ＥＧＦＲエンドサイトーシスを促進することが、知られている。よって、ＥＧＦＲの１０４５位のチロシン残基におけるリン酸化の欠如によって生じるエンドサイトーシスの抑制が、変異型ＥＧＦＲによる遷延したシグナリング誘導に寄与している可能性が示唆された。

〔Ｖ：変異型ＥＧＦＲによるシグナル伝達はＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ活性に大きく依存する〕
図２（ｅ）は、ＥＧＦ刺激によるＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ活性化を解析した結果を示す。具体的には、細胞を、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で図中に示した時間にわたって刺激した。ＥＧＦ刺激なしのサンプルを、０時とした。各パネルの左側に示した抗体を使用してウエスタンブロット分析を行った：ｐＳｒｃ，ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｒｃ；Ｓｒｃ，ａｎｔｉ−ｔｏｔａｌ Ｓｒｃ。

図２（ｅ）に示すように、変異型ＥＧＦＲを発現する細胞（ＮＲ／Ｄｅｌ）において、ＳｒｃファミリーチロシンキナーゼはＥＧＦ刺激によってわずかに活性化している。そこで、変異型ＥＧＦＲにより開始される抗アポトーシスシグナリングに対するＳｒｃファミリーチロシンキナーゼの役割を調べた。

変異型ＥＧＦＲからの下流シグナリングにおけるＳｒｃファミリーチロシンキナーゼの関連を調べた結果を図３（ａ）に示す。（ａ）は、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤（ＰＰ２（１μＭ））の存在下または非存在下での変異型ＥＧＦＲにより誘導される下流のシグナル伝達経路がリガント依存的に活性化する様子を経時的に調べた結果を示す。変異型ＥＧＦＲを発現する細胞（ＮＲ／Ｄｅｌ）において、ＥＧＦ刺激によって生じる下流シグナリングの活性化は、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤であるＰＰ２によって劇的に減弱した（（ａ））。具体的には、ＡｋｔおよびＳＴＡＴ５のリン酸化がほぼ完全に抑制された。

一方、野生型ＥＧＦＲからの下流シグナリングにおけるＳｒｃファミリーチロシンキナーゼの関連を調べた結果を図３（ｂ）および（ｃ）に示す。（ｂ）および（ｃ）は、変異型ＥＧＦＲまたは野生型ＥＧＦＲによって生起されるシグナル伝達におけるＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ依存性を、ＰＰ２（１μＭ）を前処理した細胞を使用して比較した結果である。野生型ＥＧＦＲを発現する細胞（ＮＥ２００２およびＮＥ９９）においては、ＰＰ２によるシグナリング阻害効果は、変異型ＥＧＦＲの下流シグナリングに対する阻害効果と比較して軽微であった。また、図３（ｄ）に示すように同様の結果が得られた。

また、図３（ｄ）は、示した細胞でのＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性に対するＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ依存性を比較した結果を示す。ＰＰ２、ＡＧ１４７８またはＤＭＳＯ単独の存在下で細胞をＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）にて刺激した。示した抗体を用いてイムノブロットを行った。図３（ｅ）は、変異型ＥＧＦＲおよび野生型ＥＧＦＲにおけるリン酸化チロシン量に対するＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤の効果を調べた結果を示す。抗ＶＳＶＧ抗体を用いて免疫沈降を行い、示した抗体を用いてイムノブロットを行った：ｐＡｋｔ，ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ４７３−Ａｋｔ；Ａｋｔ，ａｎｔｉ−ｔｏｔａｌ Ａｋｔ；ｐＥｒｋ，ｐｈｏｓｐｈｏｐ４４／４２ Ｅｒｋ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）；Ｅｒｋ，ｔｏｔａｌ Ｅｒｋ１／２；ｐＳＴＡＴ５，ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｙ６９４−ＳＴＡＴ５；ＳＴＡＴ５，ｔｏｔａｌ ＳＴＡＴ５；ＰＹ９９，ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ。

図３（ｄ）および（ｅ）に示すように、ＥＧＦ刺激後に変異型ＥＧＦＲによって誘導されるシグナリングは、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤（ＰＰ２）によって顕著に抑制され、その抑制効果は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼに対する阻害剤（ＡＧ１４７８）と比較してより高度であった。

非小細胞肺癌細胞株において生じるＥＧＦ依存的な抗アポトーシスシグナリングに対するＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤の効果を、図４（ａ）および（ｂ）に示す。アミノ酸７４６〜７５０位を欠失した変異型ＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９、または変異を有していない野生型ＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９を用いた。ＥＧＦ刺激によって各細胞において誘導される抗アポトーシスシグナリング（Ａｋｔの活性化）を、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤（ＰＰ２（１μＭ））が抑制するか否かをウエスタンブロット法を用いて検討した。

図４（ａ）に示すように、ＰＣ９では、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤であるＰＰ２によって、Ａｋｔの活性化は著明に抑制された。しかし、図４（ｂ）に示すように、Ａ５４９ではその抑制効果は軽微であった：ｐＡｋｔ、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ；Ａｋｔ，ａｎｔｉ−ｔｏｔａｌ Ａｋｔ，ｐＥｒｋ，ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ４４／４２ Ｅｒｋ１／２；Ｅｒｋ，ａｎｔｉ−ｔｏｔａｌ Ｅｒｋ１／２。

種々の細胞において生じるＥＧＦ依存的なアポトーシスに対するＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤の効果を、図５（ａ）および（ｂ）に示す。図５ではＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤（ＰＰ２）が各細胞に与えるアポトーシスの影響をＥＬＩＳＡによる細胞死検出キットを用いて定量化した。

図５（ａ）に示すように、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞株ＮＥ９９にＥＧＦ刺激を加えた場合、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤によるアポトーシス誘導に対しては抵抗性を示した。しかし、この変異型ＥＧＦＲ発現細胞ＮＲ／Ｄｅｌにおいて、低濃度（０．１μＭ）のＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤存在下ではわずかに認められた抗アポトーシス効果は、より高濃度（１μＭ）のＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤によって消去された。この結果は、変異型ＥＧＦＲによる抗アポトーシスシグナリングが、野生型ＥＧＦＲと比較して有意にＳｒｃに依存していることを示す図３の結果に矛盾しない。

図５（ｂ）に示すように、非小細胞肺癌細胞株（ＰＣ９およびＡ５４９）を用いて同様の実験を行った。変異型ＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌細胞株ＰＣ９においては、低濃度（０．１μＭ）のＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤の存在下でＥＧＦ依存的な抗アポトーシス効果が観察された。しかし、１μＭのＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤の存在下では、ＥＧＦ依存的な抗アポトーシス効果が減弱し、細胞死が高度に誘導された。また、ＰＣ９では、野生型ＥＧＦＲを発現する非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９と比較して、低濃度のＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤によってアポトーシスが高度に誘導された。

本発明に従えば、レセプター型チロシンキナーゼの正常なシグナル伝達経路に影響を与えることなく肺癌細胞を処置する薬剤および方法を提供することとともに、さらなる薬剤をスクリーニングすることができるので、医薬分野における開発に寄与することができる。

図１は、変異型ＥＧＦＲおよびそのチロシンリン酸化により生起された下流シグナリングを分析したイムノブロッティングの結果である。 図２は、変異型ＥＧＦＲレセプターの安定性および延長された膜アンカリングを付与することを示すイムノブロッティングの結果である。 図３は、変異型ＥＧＦＲにより生起されるシグナリングがＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤によって強く抑制されることを示すイムノブロッティングの結果である。 図４は、非小細胞肺癌細胞株において生じるＥＧＦ依存的な抗アポトーシスシグナリングに対するＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤の効果を示すイムノブロッティングの結果である。 図５は、種々の細胞において生じるＥＧＦ依存的なアポトーシスに対するＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤の効果を示す図である。

Claims (10)

1. 正常細胞における野生型ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害しないＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤を含んでいることを特徴とする、変異型ＥＧＦＲを発現している癌細胞を有している肺癌を治療するための薬剤。
2. 前記Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤が、アミノ酸第７４６〜７５０位を欠失するＥＧＦＲのシグナル伝達を抑制することを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
3. 前記Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤が、ＰＰ１、ＰＰ２、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＳＫＩ−６０６、ＡＺＤ０５３０、ＡＺＭ４７５２７１、ＣＧＰ７７６７５またはＣＧＰ７６０３０であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
4. 前記肺癌が非小細胞肺癌であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
5. 前記非小細胞肺癌が、扁平上皮癌、腺癌、または大細胞癌であることを特徴とする請求項４に記載の薬剤。
6. 化学療法によって縮小または退行した後に再発した肺癌を治療することを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
7. 前記変異型ＥＧＦＲが野生型ＥＧＦＲのアミノ酸配列の第７４６〜７５０位を欠失していることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
8. 前記変異型ＥＧＦＲがさらに正常なＥＧＦＲのアミノ酸配列の７９０位にアミノ酸置換を有していることを特徴とする請求項７に記載の薬剤。
9. 変異型ＥＧＦＲ下流のシグナル伝達を抑制することにより変異型ＥＧＦＲ発現している癌細胞を処置するための薬剤をスクリーニングする方法であって、
   該変異型ＥＧＦＲを発現している細胞培養物に候補因子を添加する工程；
   候補因子を添加した細胞培養物にＥＧＦを添加する工程；
   ＥＧＦを添加した細胞培養物を溶解して細胞調製物を得る工程；ならびに
   該細胞調製物におけるＳｒｃファミリーチロシンキナーゼおよびＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性を測定する工程
   を包含し、
   ただし、当該薬剤は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインに直接的に結合することによりキナーゼ活性を阻害するものではないことを特徴とする、方法。
10. 前記変異型ＥＧＦＲが野生型ＥＧＦＲのアミノ酸配列の第７４６〜７５０位を欠失していることを特徴とする請求項９に記載の方法。