JP5881746B2 - mRNAの局在インサイチュー検出のための方法 - Google Patents
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Description
(a) Y1-X1-Z1-A
(b) Y1-X1-Z1-T
(c) Y1-X1-Z1-C
(d) Y2-X1-Z2-A
(e) Y2-X1-Z2-T
(f) Y2-X1-Z2-C、および
(g) Y3-X1-Z3-A
式中:
X1は5〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜40ヌクレオチドであり;
Y2+Z2=20〜40ヌクレオチドであり;
Y3+Z3=20〜40ヌクレオチドであり;
Y1は、
であり;
Y2は、
であり;
Y3は、
であり;
Z1は、
、または結合であり;
Z2は、
、または結合であり;かつ
Z3は、
、または結合である。
(h) Y1-X2-Z1-G
(i) Y2-X2-Z2-G
(j) Y3-X2-Z3-G
式中、X2は10〜50ヌクレオチドである。
(h) Y1-X2-Z1-G
(i) Y2-X2-Z2-G
(j) Y3-X2-Z3-G
式中、X2は10〜50ヌクレオチドであり、X1とは異なる。
(k) Y1-X1-Z1-A
式中:
X1は5〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜40ヌクレオチドであり;
Y1は、
であり;かつ
Z1は、
、または結合である。
(l) Y1-X2-Z1-T
式中、X2は10〜50ヌクレオチドである。
(l) Y1-X2-Z1-T
式中、X2は10〜50ヌクレオチドであり、X1とは異なる。
(m) Y1-X1-Z1-W
式中:
X1は5〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜40ヌクレオチドであり;
Y1は、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異に対して3'側の5〜20ヌクレオチドを含み;
Z1は、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異に対して5'側の5〜20ヌクレオチドを含み;かつ
Wは、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異と相補的なヌクレオチドである。
(n) Y1-X2-Z1-V
式中、X2は10〜50ヌクレオチドであり;かつ
Vは、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異の部位における野生型配列と相補的なヌクレオチドである。
(n) Y1-X2-Z1-V
式中、X2は10〜50ヌクレオチドであり、X1とは異なり;および
Vは、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異の部位における野生型配列と相補的なヌクレオチドである。
(i) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約25〜約60%における結腸直腸癌の存在;
(ii) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約25〜約60%における肺癌の存在;
(iii) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約80〜約90%における膵癌の存在;
(iv) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約25%における前立腺癌の存在;
(v) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約25%における皮膚癌の存在;
(vi) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約60%における甲状腺癌の存在;
(vii) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約10〜約25%における肝癌の存在;
(viii) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約50%における卵巣癌の存在;
(ix) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約10〜40%における子宮内膜癌の存在;
(x) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約50%における腎癌の存在;
(xi) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約15%における脳癌の存在;
(xii) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約10〜45%における精巣癌の存在;
(xiii) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約15%における急性非リンパ性白血病の存在;
(xiv) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5%における膀胱癌の存在;
(xv) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約10%における頭頸部癌の存在;もしくは
(xvi) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約10%における乳癌の存在
を決定することを可能にする、例えば上記のようなそれらの使用を提供する。いくつかの態様において、プローブの上記の集合は、以下のうちの1つまたは複数と共にキット内に提供される:
(ii) 1個もしくは複数個のロックド核酸を含みかつ前記標的RNAとハイブリダイズできる、逆転写酵素プライマー;
(iii) 逆転写酵素;
(iv) リボヌクレアーゼ;
(v) リガーゼ;
(vi) 3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ;
(vii) 前記パドロックプローブの相補体とハイブリダイズできる検出プローブ;または
(ix) ヌクレオチド。
(a) 試料中のmRNAからcDNAを作製する段階であって、プライマーに、細胞もしくは細胞成分に結合できるか細胞もしくは細胞成分と反応できる機能的部分、または細胞もしくは細胞成分に結合できるアフィニティー結合基が提供される、段階;
(b) 該cDNAとハイブリダイズしているmRNAを消化するために、該試料にリボヌクレアーゼを添加する段階;
(c) 該試料を、KRAS遺伝子に対する変異に特異的な1つまたは複数のパドロックプローブと接触させる段階であって、各パドロックプローブが、例えば上記のような、KRAS遺伝子に対する変異に特異的な、Braf遺伝子に対する変異に特異的な、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTRに対する変異に特異的なパドロックプローブの集合、および任意で、対応する野生型配列に特異的なパドロックプローブの集合より選択される配列を含む、段階。
(a) 試料中のmRNAからcDNAを作製する段階であって、プライマーに、細胞もしくは細胞成分に結合できるか細胞もしくは細胞成分と反応できる機能的部分、または細胞もしくは細胞成分に結合できるアフィニティー結合基が提供される、段階;
(b) 該cDNAとハイブリダイズしているmRNAを消化するために、該試料にリボヌクレアーゼを添加する段階;
(c) 該試料を、KRAS遺伝子に対する変異に特異的な1つまたは複数のパドロックプローブと接触させる段階であって、各パドロックプローブが、以下からなる群より選択される配列を含む、段階:
(a) Y1-X1-Z1-A
(b) Y1-X1-Z1-T
(c) Y1-X1-Z1-C
(d) Y2-X1-Z2-A
(e) Y2-X1-Z2-T
(f) Y2-X1-Z2-C、および
(g) Y3-X1-Z3-A
式中:
X1は5〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜40ヌクレオチドであり;
Y2+Z2=20〜40ヌクレオチドであり;
Y3+Z3=20〜40ヌクレオチドであり;
Y1は、
であり;
Y2は、
であり;
Y3は、
であり;
Z1は、
、または結合であり;
Z2は、
、または結合であり;かつ
Z3は、
、または結合である;
(d) 該パドロックプローブの末端を直接的または間接的に連結する段階;
(e) 3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて、該環状化パドロックプローブをRCAに供する段階であって、必要に応じて該エキソヌクレアーゼ活性がcDNAを消化して、ローリングサークル増幅(RCA)のプライマーとして働く遊離の3'末端を生成する、段階;ならびに
(f) ローリングサークル増幅産物を検出する段階。
(h) Y1-X2-Z1-G
(i) Y2-X2-Z2-G、および
(j) Y3-X2-Z3-G
式中、X2は10〜50ヌクレオチドである。
(h) Y1-X2-Z1-G
(i) Y2-X2-Z2-G、および
(j) Y3-X2-Z3-G
式中、X2は10〜50ヌクレオチドであり、X1とは異なる。
(a) 試料中のmRNAからcDNAを作製する段階であって、プライマーに、細胞もしくは細胞成分に結合できるか細胞もしくは細胞成分と反応できる機能的部分、または細胞もしくは細胞成分に結合できるアフィニティー結合基が提供される、段階;
(b) 該cDNAとハイブリダイズしているmRNAを消化するために、該試料にリボヌクレアーゼを添加する段階;
(c) 該試料を、Braf遺伝子に対する変異に特異的な1つまたは複数のパドロックプローブと接触させる段階であって、各パドロックプローブが、以下からなる群より選択される配列を含む、段階:
(k) Y1-X1-Z1-A
式中:
X1は5〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜40ヌクレオチドであり;
Y1は、
であり;かつ
Z1は、
、または結合である
(d) 該パドロックプローブの末端を直接的または間接的に連結する段階;
(e) 3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて、該環状化パドロックプローブをRCAに供する段階であって、必要に応じて該エキソヌクレアーゼ活性がcDNAを消化して、ローリングサークル増幅(RCA)のプライマーとして働く遊離の3'末端を生成する、段階;ならびに
(f) ローリングサークル増幅産物を検出する段階。
(l) Y1-X2-Z1-T
式中、X2は10〜50ヌクレオチドである。
(l) Y1-X2-Z1-T
式中、X2は10〜50ヌクレオチドであり、X1とは異なる。
(a) 試料中のmRNAからcDNAを作製する段階であって、プライマーに、細胞もしくは細胞成分に結合できるか細胞もしくは細胞成分と反応できる機能的部分、または細胞もしくは細胞成分に結合できるアフィニティー結合基が提供される、段階;
(b) 該cDNAとハイブリダイズしているmRNAを消化するために、該試料にリボヌクレアーゼを添加する段階;
(c) 該試料を、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTRに対する変異に特異的な1つまたは複数のパドロックプローブと接触させる段階であって、各パドロックプローブが、以下からなる群より選択される配列を含む、段階:
(m) Y1-X1-Z1-W
式中:
X1は5〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜40ヌクレオチドであり;
Y1は、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異に対して3'側の5〜20ヌクレオチドを含み;
Z1は、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異に対して5'側の5〜20ヌクレオチドを含み;かつ
Wは、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異と相補的なヌクレオチドである。
(n) Y1-X2-Z1-V
式中、X2は10〜50ヌクレオチドであり;かつ
Vは、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異の部位における野生型配列と相補的なヌクレオチドである。
(n) Y1-X2-Z1-V
式中、X2は10〜50ヌクレオチドであり、X1とは異なり;および
Vは、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異の部位における野生型配列と相補的なヌクレオチドである。
以下の段階を含む、1つまたは複数の細胞の試料中の少なくとも1つの標的RNAを局在インサイチュー検出するための方法:
試料中のRNAと相補的なcDNAを作製する段階;
該cDNAとハイブリダイズしているRNAを消化するために、該試料にリボヌクレアーゼを添加する段階;
該試料を、該cDNAと相補的な末端領域を含む1つまたは複数のパドロックプローブと接触させる段階、および該パドロックプローブを該相補的末端領域においてcDNAとハイブリダイズさせる段階;
該パドロックプローブの末端を直接的または間接的に連結することにより、該パドロックプローブを環状化する段階;
該環状化パドロックプローブをローリングサークル増幅(RCA)に供する段階;
ローリングサークル増幅産物を検出する段階。
[本発明1002]
RNAがmRNAである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
試料中のRNAと相補的なcDNAを作製する段階が、該試料を逆転写酵素および逆転写プライマーと接触させる段階を含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
逆転写プライマーがリボヌクレアーゼ耐性である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
逆転写プライマーが、前記細胞内に固定化され得るように修飾される、本発明1003または1004の方法。
[本発明1006]
逆転写プライマーが、細胞もしくは細胞成分に結合できるか細胞もしくは細胞成分と反応できる機能的部分、または細胞もしくは細胞成分に結合できるアフィニティー結合基を有する、本発明1005の方法。
[本発明1007]
逆転写プライマーが、2'O-Me RNA、メチルホスホナート、もしくは2' Fluor RNA塩基、ロックド核酸残基、またはペプチド核酸残基を含む、本発明1004〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
逆転写プライマーが1個または複数個のロックド核酸残基を含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
逆転写プライマーが、プライマー配列中に、1個または複数個の天然または合成ヌクレオチドによって分離された2個またはそれ以上のロックド核酸を含む、本発明1007の方法。
[本発明1010]
リボヌクレアーゼがRNase Hである、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
ローリングサークル増幅が、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを使用し、必要に応じて該エキソヌクレアーゼ活性がcDNAを消化して、該RCAのプライマーとして働く遊離の3'末端を生成する、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記DNAポリメラーゼがφ29ポリメラーゼである、本発明1011の方法。
[本発明1013]
cDNAを消化して、前記RCAのプライマーとして働く遊離の3'末端を生成させるために、試料をエキソヌクレアーゼと接触させる段階をさらに含む、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記接触させる段階において、前記試料を少なくとも第1および第2パドロックプローブと接触させ、第1パドロックプローブが前記cDNA上の隣接した領域と相補的な末端領域を含み、第2パドロックプローブが、第2パドロックプローブの5'または3'終端において第1パドロックプローブの末端領域と単一ヌクレオチドだけ異なる末端領域を含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
第1パドロックプローブが、野生型mRNAと相補的なcDNAとハイブリダイズするように構成され、第2パドロックプローブが、該mRNAの単一ヌクレオチド変種と相補的なcDNAとハイブリダイズするように構成される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
第1パドロックプローブが第1検出プローブ結合領域を含み、第2パドロックプローブが第2検出プローブ結合領域を含む、本発明1014または1015の方法。
[本発明1017]
前記試料を少なくとも、第1パドロックプローブの第1検出プローブ結合領域と同一の配列を含む第1標識検出プローブ、および第1パドロックプローブの第2検出プローブ結合領域と同一の配列を含む第2標識検出プローブと接触させる段階、ならびに第1および第2標識検出プローブをローリングサークル増幅産物とハイブリダイズさせる段階をさらに含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
ローリングサークル増幅産物とハイブリダイズしている第1標識検出プローブからのシグナルを検出する段階、またはローリングサークル増幅産物とハイブリダイズしている第2標識検出プローブからのシグナルを検出する段階、またはローリングサークル増幅産物とハイブリダイズしている第1および第2標識検出プローブの両方からのシグナルを検出する段階をさらに含み、第1標識検出プローブの検出により、細胞内の野生型mRNAの存在が示され、かつ第2標識検出プローブの検出により、細胞内の変種mRNAの存在が示される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
標識検出プローブが、異なる蛍光標識、発色標識、放射性標識、発光標識、磁性標識、または電子密度標識を含む、本発明1017または1018の方法。
[本発明1020]
複数の異なるパドロックプローブを用いて、複数の異なるRNAが検出される、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
RNAが単一細胞において検出される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
試料が、1つまたは複数の細胞を含む固定組織切片、捺印試料、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織切片、または細胞学的調製物を含む、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
試料が新鮮凍結組織を含む、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1024]
試料がホルマリン固定されたパラフィン包埋組織切片である、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記試料が、身体の組織もしくは器官、または体液に由来する、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記試料が、結腸、肺、膵臓、前立腺、皮膚、甲状腺、肝臓、卵巣、子宮内膜、腎臓、脳、精巣、リンパ液、血液、血漿、膀胱、または乳房試料である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
試料が、癌細胞中に見出されるRNAを含むと疑われる、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記癌が、結腸直腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、甲状腺癌、肝癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、脳癌、精巣癌、急性非リンパ性白血病、骨髄異形成、膀胱癌、頭頸部癌、もしくは乳癌、またはそれらの任意の早期発症段階、またはそれらの任意の前形態である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
RNAが、KRAS、HER2、cMyc、TERT、APC、Braf、PTEN、PI3K、EGF、およびβ-アクチンをコードするmRNAを含むか該mRNAからなる群より選択される、少なくとも1つのmRNAである、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
RNAがKRASをコードするmRNAである、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記パドロックプローブが、12AGT、12CGT、12TGT、12GAT、12GCT、12GTT、および13GAC、KRASコドン61の変異体、KRASコドン146の変異体、ならびにKRASの3'非翻訳領域の変異体からなる群より選択される1つまたは複数の変異体KRAS mRNA配列に対応するcDNAとハイブリダイズするように構成される、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記変異体KRAS mRNA配列の1つまたは複数に対応するローリングサークル増幅産物の有無を検出する段階を含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記パドロックプローブが、12GGTおよび13GGC、KRASコドン61、KRASコドン146、およびKRASの3'非翻訳領域の野生型配列からなる群より選択される1つまたは複数の野生型KRAS mRNA配列に対応するcDNAとハイブリダイズするように構成される、本発明1030の方法。
[本発明1034]
前記野生型KRAS mRNA配列の1つまたは複数に対応するローリングサークル増幅産物の有無を検出する段階を含む、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記パドロックプローブが、12AGT、12CGT、12TGT、12GAT、12GCT、12GTT、および13GAC、KRASコドン61の変異体、KRASコドン146の変異体、ならびにKRASの3'非翻訳領域の変異体からなる群より選択される1つまたは複数の変異体KRAS mRNA配列;ならびに12GGTおよび13GGC、KRASコドン61、KRASコドン146、およびKRASの3'非翻訳領域の野生型配列からなる群より選択される1つまたは複数の野生型KRAS mRNA配列に対応するcDNAとハイブリダイズするように構成される、本発明1030〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記変異体および野生型KRAS mRNA配列の1つまたは複数に対応するローリングサークル増幅産物の有無を検出する段階を含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
RNAがEGFRをコードするmRNAである、本発明1029の方法。
[本発明1038]
1つまたは複数の変種EGFR mRNA配列に対応するローリングサークル増幅産物の有無を検出する段階を含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記変種EGFR mRNA配列の1つまたは複数が挿入変異または欠失変異を含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
RNAが、Braf、APC、PTEN、またはPI3KをコードするmRNAである、本発明1029の方法。
[本発明1041]
前記パドロックプローブが、1つまたは複数の変異体Braf、APC、PTEN、および/またはPI3K mRNA配列に対応するcDNAとハイブリダイズするように構成される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
1つまたは複数の変異体Braf、APC、PTEN、および/またはPI3K mRNA配列に対応するローリングサークル増幅産物の有無を検出する段階を含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記パドロックプローブが、1つまたは複数の野生型Braf、APC、PTEN、および/またはPI3K mRNA配列に対応するcDNAとハイブリダイズするように構成される、本発明1040の方法。
[本発明1044]
前記野生型Braf、APC、PTEN、および/またはPI3K mRNA配列に対応するローリングサークル増幅産物の有無を検出する段階を含む、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記パドロックプローブが、1つまたは複数の変異体Braf、PTEN、および/またはPI3K mRNA配列、ならびに1つまたは複数の野生型Braf、APC、PTEN、および/またはPI3K mRNA配列に対応するcDNAとハイブリダイズするように構成される、本発明1040〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記変異体および野生型のBraf、APC、PTEN、および/またはPI3K mRNA配列の1つまたは複数に対応するローリングサークル増幅産物の有無を検出する段階を含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
RNAが、BrafおよびKRASをコードするmRNA、またはKRASおよびAPCをコードするmRNA、またはKRASおよびPTENをコードするmRNA、またはKRASおよびPI3KをコードするmRNAである、本発明1029の方法。
[本発明1048]
前記パドロックプローブが、本発明1031の1つもしくは複数の変異体KRAS mRNA配列、および1つもしくは複数の変異体Braf mRNA配列;または本発明1031の1つもしくは複数の変異体KRAS mRNA配列、および1つもしくは複数の変異体APC mRNA配列;または本発明1031の1つもしくは複数の変異体KRAS mRNA配列、および1つもしくは複数の変異体PTEN mRNA配列;または本発明1031の1つもしくは複数の変異体KRAS mRNA配列、および1つもしくは複数の変異体PI3K mRNA配列に対応するcDNAとハイブリダイズするように構成される、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記変異体KRASおよびBraf mRNA配列に対応するか;または前記変異体KRASおよびAPC mRNA配列に対応するか;または前記変異体KRASおよびPTEN mRNA配列に対応するか;または前記変異体KRASおよびPI3K mRNA配列に対応するローリングサークル増幅産物の有無を検出する段階を含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記パドロックプローブが、野生型KRASおよびBraf mRNA配列に対応するか;または野生型KRASおよびAPC mRNA配列に対応するか;または野生型KRASおよびPTEN mRNA配列に対応するか;または野生型KRASおよびPI3K mRNA配列に対応するcDNAとハイブリダイズするように構成される、本発明1047の方法。
[本発明1051]
前記野生型KRASおよびBraf mRNA配列に対応するか;または前記野生型KRASおよびAPC mRNA配列に対応するか;または前記野生型KRASおよびPTEN mRNA配列に対応するか;または前記野生型KRASおよびPI3K mRNA配列に対応するローリングサークル増幅産物の有無を検出する段階を含む、本発明1050の方法。
[本発明1052]
前記パドロックプローブが、(i) 本発明1031の1つもしくは複数の変異体KRAS mRNA配列、および1つもしくは複数の変異体Braf mRNA配列に対応するか;または本発明1031の1つもしくは複数の変異体KRAS mRNA配列、および1つもしくは複数の変異体APC mRNA配列に対応するか;または本発明1031の1つもしくは複数の変異体KRAS mRNA配列、および1つもしくは複数の変異体PTEN mRNA配列に対応するか;または本発明1031の1つもしくは複数の変異体KRAS mRNA配列、および1つもしくは複数の変異体PI3K mRNA配列に対応し;かつ(ii) 野生型KRASおよびBraf mRNA配列に対応するか;または野生型KRASおよびAPC mRNA配列に対応するか;または野生型KRASおよびPTEN mRNA配列に対応するか;または野生型KRASおよびPI3K mRNA配列に対応するcDNAとハイブリダイズするように構成される、本発明1047〜1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記変異体および野生型のKRASおよびBraf mRNA配列の1つもしくは複数に対応するか;または前記変異体および野生型のKRASおよびAPC mRNA配列の1つもしくは複数に対応するか;または前記変異体および野生型のKRASおよびPTEN mRNA配列の1つもしくは複数に対応するか;または前記変異体および野生型のKRASおよびPI3K mRNA配列の1つもしくは複数に対応するローリングサークル増幅産物の有無を検出する段階を含む、本発明1052の方法。
[本発明1054]
以下を含む、KRAS遺伝子に対する変異に特異的なパドロックプローブの集合:
(a) Y1-X1-Z1-A
(b) Y1-X1-Z1-T
(c) Y1-X1-Z1-C
(d) Y2-X1-Z2-A
(e) Y2-X1-Z2-T
(f) Y2-X1-Z2-C、および
(g) Y3-X1-Z3-A
式中:
X1は5〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜40ヌクレオチドであり;
Y2+Z2=20〜40ヌクレオチドであり;
Y3+Z3=20〜40ヌクレオチドであり;
Y1は、
であり;
Y2は、
であり;
Y3は、
であり;
Z1は、
、または結合であり;
Z2は、
、または結合であり;かつ
Z3は、
、または結合である。
[本発明1055]
以下をさらに含む、本発明1054のプローブの集合:
(h) Y1-X2-Z1-G
(i) Y2-X2-Z2-G
(j) Y3-X2-Z3-G
式中、X2は10〜50ヌクレオチドである。
[本発明1056]
以下を含む、Braf遺伝子に対する変異に特異的なパドロックプローブの集合:
(k) Y1-X1-Z1-A
式中:
X1は5〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜40ヌクレオチドであり;
Y1は、
であり;かつ
Z1は、
、または結合である。
[本発明1057]
以下をさらに含む、本発明1056のプローブの集合:
(l) Y1-X2-Z1-T
式中、X2は10〜50ヌクレオチドである。
[本発明1058]
以下を含む、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTRに対する変異に特異的なパドロックプローブの集合:
(m) Y1-X1-Z1-W
式中:
X1は5〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜40ヌクレオチドであり;
Y1は、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異に対して3'側の5〜20ヌクレオチドを含み;
Z1は、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異に対して5'側の5〜20ヌクレオチドを含み;かつ
Wは、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異と相補的なヌクレオチドである。
[本発明1059]
以下をさらに含む、本発明1058のプローブの集合:
(n) Y1-X2-Z1-V
式中、X2は10〜50ヌクレオチドであり;かつ
Vは、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異の部位における野生型配列と相補的なヌクレオチドである。
[本発明1060]
X2がX1とは異なる、本発明1055、1057、または1059のいずれかのプローブの集合。
[本発明1061]
各プローブが少なくとも40%のGC含量を有する、本発明1054〜1060のいずれかのプローブの集合。
[本発明1062]
Xが25〜50である、本発明1054〜1061のいずれかのプローブの集合。
[本発明1063]
Xが少なくとも1個の標識ヌクレオチドを含む、本発明1054〜1062のいずれかのプローブの集合。
[本発明1064]
(a)〜(g)、(k)、および(m)より選択される各プローブが同じX1を有する、本発明1054〜1063のいずれかのプローブの集合。
[本発明1065]
(h)〜(j)、(l)、および(n)より選択される各プローブが同じX2を有する、本発明1054〜1064のいずれかのプローブの集合。
[本発明1066]
Y1+Z1、Y2+Z2、およびY3+Z3のそれぞれが少なくとも約25ヌクレオチドである、本発明1054〜1065のいずれかのプローブの集合。
[本発明1067]
(i) KRAS遺伝子、(ii) KRAS遺伝子およびBraf遺伝子、(iii) KRAS遺伝子およびAPC遺伝子、(iv) KRAS遺伝子およびPTEN遺伝子、または(v) KRAS遺伝子およびPI3K遺伝子における複数の変異を検出することができ、該複数の変異が、癌と関連するKRAS変異の少なくとも40%を構成する、本発明1054〜1066のいずれかのプローブの集合。
[本発明1068]
(i) KRAS遺伝子、(ii) KRAS遺伝子およびBraf遺伝子、(iii) KRAS遺伝子およびAPC遺伝子、(iv) KRAS遺伝子およびPTEN遺伝子、または(v) KRAS遺伝子およびPI3K遺伝子に対する変異の検出により、癌の存在または癌の素因を決定することが可能になる、本発明1054〜1066のいずれかのプローブの集合。
[本発明1069]
癌の存在または癌の素因が、腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者の少なくとも約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、または約95%において決定される、本発明1068のプローブの集合。
[本発明1070]
患者または患者群におけるKRAS変異体腫瘍の有無を決定するためまたはKRAS変異体腫瘍の素因を決定するための、本発明1054〜1069のいずれかのプローブの集合の使用。
[本発明1071]
腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、または約95%において、癌の存在を決定することを可能にする、本発明1070の使用。
[本発明1072]
前記癌が、結腸直腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、甲状腺癌、肝癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、脳癌、精巣癌、急性非リンパ性白血病、骨髄異形成、膀胱癌、頭頸部癌、または乳癌であり、かつ癌の前記素因が該癌のうちの1つの素因である、本発明1067〜1069のいずれかのプローブの集合、または本発明1070もしくは1071の使用。
[本発明1073]
以下を決定することを可能にする、本発明1072のプローブの集合または使用:
(i) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約25〜約60%における結腸直腸癌の存在;
(ii) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約25〜約60%における肺癌の存在;
(iii) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約80〜約90%における膵癌の存在;
(iv) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約25%における前立腺癌の存在;
(v) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約25%における皮膚癌の存在;
(vi) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約60%における甲状腺癌の存在;
(vii) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約10〜約25%における肝癌の存在;
(viii) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約50%における卵巣癌の存在;
(ix) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約10〜40%における子宮内膜癌の存在;
(x) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約50%における腎癌の存在;
(xi) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約15%における脳癌の存在;
(xii) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約10〜45%における精巣癌の存在;
(xiii) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約15%における急性非リンパ性白血病の存在;
(xiv) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5%における膀胱癌の存在;
(xv) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約10%における頭頸部癌の存在;または
(xvi) 腫瘍発生と関連するKRAS変異体を有する患者群の少なくとも約5〜約10%における乳癌の存在。
[本発明1074]
以下の段階を含む、スライド表面上の細胞の試料中のKRAS遺伝子の1つまたは複数の変異をコードするmRNAを局在インサイチュー検出するための方法:
(a) 試料中のmRNAからcDNAを作製する段階であって、プライマーに、細胞もしくは細胞成分に結合できるか細胞もしくは細胞成分と反応できる機能的部分、または細胞もしくは細胞成分に結合できるアフィニティー結合基が提供される、段階;
(b) 該cDNAとハイブリダイズしているmRNAを消化するために、該試料にリボヌクレアーゼを添加する段階;
(c) 該試料を、KRAS遺伝子に対する変異に特異的な1つまたは複数のパドロックプローブと接触させる段階であって、各パドロックプローブが、本発明1054〜1066のいずれかのパドロックプローブの集合より選択される配列を含む、段階。
[本発明1075]
以下の段階を含む、スライド表面上の細胞の試料中のKRAS遺伝子の1つまたは複数の変異をコードするmRNAを局在インサイチュー検出するための方法:
(a) 試料中のmRNAからcDNAを作製する段階であって、プライマーに、細胞もしくは細胞成分に結合できるか細胞もしくは細胞成分と反応できる機能的部分、または細胞もしくは細胞成分に結合できるアフィニティー結合基が提供される、段階;
(b) 該cDNAとハイブリダイズしているmRNAを消化するために、該試料にリボヌクレアーゼを添加する段階;
(c) 該試料を、KRAS遺伝子に対する変異に特異的な1つまたは複数のパドロックプローブと接触させる段階であって、各パドロックプローブが、以下からなる群より選択される配列を含む、段階:
(a) Y1-X1-Z1-A
(b) Y1-X1-Z1-T
(c) Y1-X1-Z1-C
(d) Y2-X1-Z2-A
(e) Y2-X1-Z2-T
(f) Y2-X1-Z2-C、および
(g) Y3-X1-Z3-A
式中:
X1は5〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜40ヌクレオチドであり;
Y2+Z2=20〜40ヌクレオチドであり;
Y3+Z3=20〜40ヌクレオチドであり;
Y1は、
であり;
Y2は、
であり;
Y3は、
であり;
Z1は、
、または結合であり;
Z2は、
、または結合であり;かつ
Z3は、
、または結合である;
(d) 該パドロックプローブの末端を直接的または間接的に連結する段階;
(e) 3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて、該環状化パドロックプローブをRCAに供する段階であって、必要に応じて該エキソヌクレアーゼ活性がcDNAを消化して、ローリングサークル増幅(RCA)のプライマーとして働く遊離の3'末端を生成する、段階;ならびに
(f) ローリングサークル増幅産物を検出する段階。
[本発明1076]
段階(c)が、前記試料を、それぞれが野生型KRAS遺伝子に特異的でありかつ以下の配列を有するパドロックプローブ(h)、(i)、および(j)と接触させることをさらに含む、本発明1075の方法:
(h) Y1-X2-Z1-G
(i) Y2-X2-Z2-G、および
(j) Y3-X2-Z3-G
式中、X2は10〜50ヌクレオチドである。
[本発明1077]
以下の段階を含む、スライド表面上の細胞の試料中のBraf遺伝子の1つまたは複数の変異をコードするmRNAを局在インサイチュー検出するための方法:
(a) 試料中のmRNAからcDNAを作製する段階であって、プライマーに、細胞もしくは細胞成分に結合できるか細胞もしくは細胞成分と反応できる機能的部分、または細胞もしくは細胞成分に結合できるアフィニティー結合基が提供される、段階;
(b) 該cDNAとハイブリダイズしているmRNAを消化するために、該試料にリボヌクレアーゼを添加する段階;
(c) 該試料を、Braf遺伝子に対する変異に特異的な1つまたは複数のパドロックプローブと接触させる段階であって、各パドロックプローブが、以下からなる群より選択される配列を含む、段階:
(k) Y1-X1-Z1-A
式中:
X1は5〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜40ヌクレオチドであり;
Y1は、
であり;かつ
Z1は、
、または結合である;
(d) 該パドロックプローブの末端を直接的または間接的に連結する段階;
(e) 3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて、該環状化パドロックプローブをRCAに供する段階であって、必要に応じて該エキソヌクレアーゼ活性がcDNAを消化して、ローリングサークル増幅(RCA)のプライマーとして働く遊離の3'末端を生成する、段階;ならびに
(f) ローリングサークル増幅産物を検出する段階。
[本発明1078]
段階(c)が、前記試料を、それぞれが野生型Braf遺伝子に特異的でありかつ以下の配列を有するパドロックプローブ(l)と接触させることをさらに含む、本発明1077の方法:
(l) Y1-X2-Z1-T、
式中、X2は10〜50ヌクレオチドである。
[本発明1079]
以下の段階を含む、スライド表面上の細胞の試料中のAPC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTRの1つまたは複数の変異をコードするmRNAを局在インサイチュー検出するための方法:
(a) 試料中のmRNAからcDNAを作製する段階であって、プライマーに、細胞もしくは細胞成分に結合できるか細胞もしくは細胞成分と反応できる機能的部分、または細胞もしくは細胞成分に結合できるアフィニティー結合基が提供される、段階;
(b) 該cDNAとハイブリダイズしているmRNAを消化するために、該試料にリボヌクレアーゼを添加する段階;
(c) 該試料を、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTRに対する変異に特異的な1つまたは複数のパドロックプローブと接触させる段階であって、各パドロックプローブが、以下からなる群より選択される配列を含む、段階:
(m) Y1-X1-Z1-W、
式中:
X1は5〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜40ヌクレオチドであり;
Y1は、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異に対して3'側の5〜20ヌクレオチドを含み;
Z1は、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異に対して5'側の5〜20ヌクレオチドを含み;かつ
Wは、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異と相補的なヌクレオチドである。
[本発明1080]
段階(c)が、前記試料を、それぞれが野生型APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTRに特異的でありかつ以下の配列を有するパドロックプローブ(n)と接触させることをさらに含む、本発明1079の方法:
(n) Y1-X2-Z1-V、
式中、X2は10〜50ヌクレオチドであり;かつ
Vは、APC遺伝子、PTEN遺伝子、PI3K遺伝子、KRAS遺伝子コドン61もしくはコドン146、またはKRAS遺伝子3'UTR中の点変異の部位における野生型配列と相補的なヌクレオチドである。
[本発明1081]
X2がX1とは異なる、本発明1076、1078、または1080のいずれかの方法。
[本発明1082]
プライマーが、2'O-Me RNA、メチルホスホナート、もしくは2' Fluor RNA塩基、ペプチジル核酸残基、またはロックド核酸残基を含む、本発明1074〜1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
プライマーが1個または複数個のロックド核酸残基を含む、本発明1074〜1082のいずれかの方法。
[本発明1084]
プライマーが、プライマー配列中に、1個または複数個の天然または合成ヌクレオチドによって分離された2個またはそれ以上のロックド核酸を含む、本発明1083の方法。
[本発明1085]
リボヌクレアーゼがRNase Hである、本発明1074〜1084のいずれかの方法。
[本発明1086]
X1およびX2がそれぞれ、少なくとも1個の標識ヌクレオチドを含む、本発明1074〜1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
(a)〜(g)、(k)、および(m)より選択される各プローブが同じX1を有する、本発明1074〜1086のいずれかの方法。
[本発明1088]
(h)〜(j)、(l)、および(n)より選択される各プローブが同じX2を有する、本発明1074〜1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
標識ヌクレオチドがフルオロフォアまたは発色団を含む、本発明1074〜1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
試料が、1つまたは複数の細胞を含む固定組織切片、捺印試料、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織切片、または細胞学的調製物を含む、本発明1074〜1089のいずれかの方法。
[本発明1091]
試料が新鮮凍結組織を含む、本発明1074〜1089のいずれかの方法。
[本発明1092]
(i) 本発明1054〜1066のいずれかのパドロックプローブの集合
と、以下のうちの1つまたは複数とを含む、キット:
(ii) 1個もしくは複数個のロックド核酸を含みかつ前記標的RNAとハイブリダイズできる、逆転写酵素プライマー;
(iii) 逆転写酵素;
(iv) リボヌクレアーゼ;
(v) リガーゼ;
(vi) 3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ;
(vii) 前記パドロックプローブの相補体とハイブリダイズできる検出プローブ;
(ix) ヌクレオチド。
[本発明1093]
以下の段階を含む、生物学的試料中の細胞中の遺伝子配列の存在および位置を決定するための方法:
(a) 該遺伝子配列を有するDNA相補体をRNAとハイブリダイズさせる段階;
(b) DNA相補体とハイブリダイズしているRNAを消化する段階;
(c) 第1パドロックプローブをDNA相補体の少なくとも一部とハイブリダイズさせる段階であって、該パドロックプローブが、DNA相補体の別々だが隣接した領域と相補的である2つの終末端のうちの一方の上に該遺伝子配列を含む、段階;
(d) パドロックプローブの2つの終末端を連結する段階;
(e) 環状化プローブを複製して、複製されたプローブの複数のコピーを含む核酸分子を得る段階;および
(f) 該核酸分子とハイブリダイズするプローブを用いて、細胞中の該遺伝子配列の有無を検出する段階。
[本発明1094]
DNA相補体を作製する段階をさらに含む、本発明1093の方法。
[本発明1095]
DNA相補体が、プライマーおよび逆転写酵素を含む処理によって生成される、本発明1094の方法。
[本発明1096]
プライマーがリボヌクレアーゼ耐性である、本発明1093〜1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
プライマーが細胞内に固定化される、本発明1093〜1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
環状化プローブが、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて複製される、本発明1093〜1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
環状化プローブを複製するためのプライマーとして働くDNA相補体上で遊離の3'末端を生成する条件下で、環状化プローブがインキュベートされる、本発明1098の方法。
[本発明1100]
ポリメラーゼがファイ29である、本発明1093〜1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
第2遺伝子配列と相補的である第2パドロックプローブを添加する段階をさらに含む、本発明1093〜1100のいずれかの方法。
[本発明1102]
遺伝子配列が点変異である、本発明1093〜1101のいずれかの方法。
[本発明1103]
遺伝子配列が野生型配列である、本発明1093〜1102のいずれかの方法。
[本発明1104]
以下の段階を含む、特定の核酸配列を有する組織試料中の細胞を同定するための方法:
(a) RNA-DNAハイブリッドを作製するために、細胞を、特定の核酸配列を含むDNA相補体と共にインキュベートする、段階;
(b) RNA-DNAハイブリッドの少なくとも一部を消化する条件下で、RNA標的分子をリボヌクレアーゼと共にインキュベートする段階;
(c) パドロックプローブを、特定の核酸配列を含むDNA相補体とハイブリダイズさせる条件下で、DNA相補体を該パドロックプローブと共にインキュベートする段階であって、該パドロックプローブが、DNA相補体の別々だが隣接した領域と相補的である2つの終末端を含む、段階;
(d) パドロックプローブの終末端を結合させる条件下で、DNA相補体およびパドロックプローブをリガーゼと共にインキュベートする段階;
(e) DNA相補体によりパドロックプローブの複製をプライミングしかつ複製されたパドロックプローブの複数コピーを含む核酸を作製する条件下で、連結されたパドロックプローブをポリメラーゼおよびヌクレオチドと共にインキュベートする段階、ならびに
(f) 複製されたパドロックプローブの複数コピーを含む核酸を1つまたは複数の相補的オリゴヌクレオチドと共にインキュベートして、特定の配列の有無を検出する段階。
[本発明1105]
以下の段階を含む、特定の核酸配列を有する細胞試料中の細胞を同定するための方法:
(a) RNAのDNA相補体を作製する条件下で、細胞試料を、該試料に固定化されたリボヌクレアーゼ耐性プライマーおよび逆転写酵素と共にインキュベートする段階であって、該DNA相補体が特定の核酸配列を含む、段階;
(b) RNAの少なくとも一部を消化する条件下で、細胞試料をリボヌクレアーゼと共にインキュベートする段階;
(c) パドロックプローブを、特定の核酸配列を含むDNA相補体とハイブリダイズさせる条件下で、DNA相補体を該パドロックプローブと共にインキュベートする段階であって、該パドロックプローブが、DNA相補体の別々だが隣接した領域と相補的である2つの終末端を含む、段階;
(d) パドロックプローブの終末端を結合させる条件下で、DNA相補体およびパドロックプローブをリガーゼと共にインキュベートする段階;
(e) DNA相補体によりパドロックプローブの複製をプライミングしかつ複製されたパドロックプローブの複数コピーを含む核酸を作製する条件下で、連結されたパドロックプローブをポリメラーゼおよびヌクレオチドと共にインキュベートする段階、ならびに
(f) 特定の配列の有無を検出するために、複製されたパドロックプローブの複数コピーを含む核酸を1つまたは複数の核酸プローブと共にインキュベートする段階。
[本発明1106]
以下の段階を含む、スライド上の生物学的試料中の細胞中の核酸配列をインサイチューで位置特定するための方法:
(a) 該核酸配列を含みかつ該細胞中の相補的RNA分子とハイブリダイズしてRNA-DNAハイブリッドを形成する核酸分子を作製する条件下で、固体支持体上の固定化された生物学的試料を逆転写酵素およびリボヌクレアーゼ耐性プライマーと共にインキュベートする段階;
(b) リボヌクレアーゼを添加する段階、およびRNA-DNAハイブリッド中のRNAを消化する条件下でリボヌクレアーゼをインキュベートする段階;
(c) 相補的パドロックプローブを、消化されたRNA-DNAハイブリッドのDNA部分とハイブリダイズさせる条件下で、消化されたRNA-DNAハイブリッドをインキュベートする段階であって、該パドロックプローブが該核酸配列を含み、かつ、該DNAの別々だが隣接した領域と相補的である2つの終末端を有する、段階;
(d) パドロックプローブの終末端を連結させる条件下で、RNA-DNAハイブリッドのDNA部分とハイブリダイズしているパドロックプローブをリガーゼと共にインキュベートする段階;
(e) パドロックプローブを複製するために用いられるDNA由来のプライマーを作製しかつ複製されたパドロックプローブの複数コピーを含む核酸を作製する条件下で、連結されたパドロックプローブをポリメラーゼおよびヌクレオチドと共にインキュベートする段階;ならびに
(f) 特定の配列の有無を検出するために、該核酸を1つまたは複数の相補的核酸プローブと共にインキュベートする段階。
[本発明1107]
試料がホルマリン固定されたパラフィン包埋組織切片である、本発明1104〜1106のいずれかの方法。
[本発明1108]
段階(c)において、パドロックプローブの末端領域が、該末端領域間にギャップが存在するように、cDNAの非連続領域とハイブリダイズする、本発明1001〜1053のいずれかの方法。
[本発明1109]
ギャップが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ヌクレオチドのギャップ、または11〜60ヌクレオチドのギャップ、好ましくは3〜40ヌクレオチドのギャップである、本発明1108の方法。
[本発明1110]
末端領域間のギャップが、ギャップオリゴヌクレオチドによって、またはパドロックプローブの3'末端を伸長させることによって埋められる、本発明1108または1109の方法。
[本発明1111]
前記結腸直腸癌が、転移性結腸直腸癌、腺癌、平滑筋肉腫、結腸直腸リンパ腫、黒色腫、または神経内分泌腫瘍である、本発明1028〜1053のいずれかの方法、または本発明1073もしくは1074のプローブの集合もしくは使用。
[本発明1112]
前記肺癌が非小細胞肺癌(NSCLC)または小細胞肺癌(SCLC)である、本発明1028〜1053のいずれかの方法、または本発明1072もしくは1073のプローブの集合もしくは使用。
[本発明1113]
前記試料が組織切片を含み得るが、ただし該組織切片は、新鮮凍結組織の調製物ではなく、該調製物を含んでもいない、本発明1001〜1053、1074〜1091、または1093〜1106のいずれかの方法。
[本発明1114]
前記試料が組織切片を含み得るが、ただし該組織切片は、Superfrost Plusスライド上への播種を含む調製物ではなく、該調製物を含んでもいない、本発明1001〜1053、1074〜1091、または1093〜1106のいずれかの方法。
[本発明1115]
段階(c)において、パドロックプローブの末端領域が、cDNA上の隣接した領域とハイブリダイズする、本発明1001〜1053のいずれかの方法。
本発明のその他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲の範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかとなるであろうから、詳細な説明および具体例は、本発明の具体的な態様を示しながら、例示として与えられているに過ぎないことが理解されるべきである。
A. インサイチューでのRNA標的からのcDNAの局在合成
上記のように、本発明は、細胞内のRNA、特にmRNAの検出に関する。本方法は、パドロックプローブによる相補的DNA(cDNA)の標的化の前の、RNAのcDNAへの変換を含む。cDNAは、鋳型RNAの位置においてインサイチューで合成される。逆転写酵素(RT) プライマーは、固定化、特に細胞に固定化し得るように修飾することができる。したがって、プライマーに、プライマーが試料中の成分、例えば細胞または細胞成分に固定化されることを可能にする、またはプライマーをそれらに固定化できるようにする機能的部分または機能的手段(すなわち、「官能性」)が提供され得ることが企図される。これは、例えば、細胞または試料もしくは細胞成分に結合し得るか、またはこれと反応し得る機能的部分であってよい。試料に(例えば、細胞にまたは細胞内に)固定化されるそのようなプライマーの使用は、cDNA産物(RTプライマーの伸長によって生成され、そのためそれと連続している)もまた試料に(例えば、細胞にまたは細胞内に)固定化されるという結果を有する。
上記のように、cDNAはパドロックプローブの標的として働く。パドロックプローブは周知であり、広く用いられており、先行技術において十分に報告され記載されている。したがって、パドロックプロービングの原理は十分に理解されており、パドロックプローブの設計および使用は、当技術分野において公知であり、記載されている。例えばWO 99/49079を参照することができる。パドロックプローブは本質的に、連結に利用可能な遊離の5'および3'末端を有する直鎖状の環状化可能なオリゴヌクレオチドであり、環状高次構造の採用をもたらす。環状化(連結)が起こるために、パドロックプローブが遊離の5'リン酸基を有することが理解される。連結の目的で、パドロックプローブの末端を近位にするために、パドロックプローブは、その5'および3'末端において、その標的配列(この場合、解析される細胞試料中の合成cDNA分子)に対する相補性の領域を有するように設計される。したがって相補性のこれらの領域によって、標的中の特異的配列とのハイブリダイゼーションにより、その標的配列に対するパドロックプローブの特異的結合が可能になる。したがってパドロックプローブは、所望のまたは特定の標的に特異的に結合するように設計することができる。本発明の方法の場合、cDNA標的の配列は、標的RNA、すなわち検出が所望されるRNA分子の配列によって規定される。cDNA標的とのハイブリダイゼーションにより、パドロックプローブの末端は連結のために近位になる。以下により詳細に記載するように、連結は直接的または間接的であってよい。言い換えれば、パドロックプローブの末端は相互に直接連結され得るか、またはそれらは、介在する核酸分子/ヌクレオチドの配列に連結され得る。したがってパドロックプローブの末端領域は、段階(a)のcDNA産物中の隣接したもしくは連続した領域に相補的であってよく、またはそれらはcDNAの非隣接(非連続)領域と相補的であってもよい(この場合、連結が起こるためには、ハイブリダイズしたパドロックプローブの2つの末端間の「ギャップ」は介在分子/配列によって埋められる)。
試料がインサイチュー検出に適している限り、本明細書に開示される方法および組成物を用いて、RNA分子が存在し得る細胞の任意の試料中のRNAを評価することができる。代表的な試料は、1つまたは複数の細胞を含む固定組織切片、新鮮凍結組織、または細胞学的調製物を含み得る。試料は、RNAに到達できるようにするために、透過処理することができる。細胞を透過処理するための適切な手段は当技術分野で周知であり、これには例えば、界面活性剤、例えば、適切に希釈されたTriton X-100溶液、例えば0.1% Triton X-100、もしくはTween、0.1% Tweenの使用、または例えば0.1 M HClによる酸処理が含まれる。組織試料の透過処理はまた、1つまたは複数の酵素、例えば、ペプシン、プロテイナーゼK、トリプシノーゲン、またはプロナーゼ等による試料の処理を含み得る。また、当技術分野において記載されるように、試料のマイクロ波処理を行うこともできる。
RCA段階に続く本方法の次の段階は、試料中の標的RNAを検出するために、反応混合物中の伸長産物(すなわち、RCA産物またはRCP)の存在を判定することである。言い換えれば、試験される試料中の標的RNAの存在を検出するために、得られた任意のRCPの存在について、試料をスクリーニングなどする(すなわち、アッセイする、評価する(assessed)、評価する(evaluated)、試験する等)。本明細書に記載される方法によって生成されたRCPは、最も広い意味において、任意の簡便なプロトコールを用いて検出することができる。特定の検出プロトコールは、所望される感度、および本方法が実施される適用に応じて異なり得る。1つの態様において、RCP検出プロトコールは、例えば特定のアッセイの感度を増強するために、その中でRCA産物(またはその一部)のコピー数が増加する増幅成分を含み得るが、これは一般的には必要ではない。したがってRCPは、任意の増幅なしに直接検出することができる。
本明細書においてより詳細に記載されるように、本発明の方法を用いて、KRASをコードするmRNA配列中の点変異を検出することができる。KRASは、最も頻繁に活性化される癌遺伝子の1つである。本明細書で用いられる場合、「KRAS」とは、v-Ki-ras2カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子相同体を指す。KRASは、当技術分野において、NS3、KRAS1、KRAS2、RASK2、KI-RAS、C-K-RAS、K-RAS2A、K-RAS2B、K-RAS4A、およびK-RAS4Bとしても知られている。本遺伝子、哺乳動物ras遺伝子ファミリーからのカーステンras癌遺伝子相同体は、低分子量GTPアーゼスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質をコードする。単一アミノ酸置換は、活性化変異の原因となり得る。生成される形質転換タンパク質は、肺癌、結腸癌、甲状腺癌、および膵癌を含む様々な悪性腫瘍に関与し得、上皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤療法に対する耐性と強く関連している。例えば、転移性結腸直腸癌において、KRAS遺伝子の変異の存在が日常的に解析され、陽性変異状態は、腫瘍がEGFR抗体療法に反応しないことを示す。肺線癌において、KRAS変異は、喫煙、予後不良、およびEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対する非反応性と関連しているのに対して、EGFR変異を伴うKRAS野生型腫瘍は、非喫煙、予後良好、およびEGFR-TKI療法に対する反応と関係している。
上皮成長因子受容体(EGFR)は、いくつかの癌の治療における重要な標的である。したがって、これらの癌の治療において、抗EGFR抗体と化学療法の併用がよく用いられる。KRASタンパク質は、EGFRによって調節されるシグナル伝達カスケードにおける重要なメディエーターである。KRAS遺伝子の変異は、EGFRに対して標的化される分子生物学的治療選択肢の選択における非常に重要な因子である。その変異が存在する場合、セツキシマブ(Erbitux)およびパニツムマブ(Vectibix)などの抗EGFR薬物療法が、それらの使用を保証するのに十分に有効ではないことが、研究から示された。したがって、本明細書において論じられるように、KRASをコードするmRNA中の点変異の有無を検出するために、本方法を有利に用いることができ、KRAS野生型mRNAの同定により、癌をEGFR阻害剤で治療できることが示される。
本発明の方法はさらに、Braf、APC、PTEN、またはPI3KをコードするmRNA配列中の1つまたは複数の点変異を検出するために用いることができる。適切なBraf変異は当業者に公知であり、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる、Rajagopalan et al., 2002, Nature, 418 (29), 934、およびMonticone et al., 2008, Molecular Cancer, 7(92)に記載されている。特に好ましいのは、変異V600Eの検出である(実施例18もまた参照されたい)。本発明の方法はさらに、KRASおよびBraf中の1つまたは複数の点変異の検出を想定する。BrafとKRASの変異は、下流経路エレメントの機能に関して相互に排他的であると記載されている。したがって、BrafおよびKRASの変異を同時に判定することにより、経路機能が遺伝子変異によって損なわれているかどうかが解明され得る。
本発明はまた、本発明の方法において用いるためのキットを提供する。キットは、上記のように、特定のcDNAに特異的な少なくとも1つの(1種の)パドロックプローブを含み得る。そのようなキットはまた、RTプライマー、RT酵素、リボヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、リガーゼ、および/またはRCA産物の検出の手段を含み得る。
(i) 該標的RNAから転写されたcDNAに対して相補性を有する3'および5'末端領域を含むパドロックプローブ(そのような領域はあるいは、該標的RNAの領域と配列において対応すると定義され得、上記で定義された領域は隣接的であっても非隣接的であってもよい);
(ii) 該標的RNAとハイブリダイズし得る(例えば、該RNAと特異的にハイブリダイズし得る)逆転写酵素プライマー;
(iii) 逆転写酵素;
(iv) リボヌクレアーゼ;
(v) リガーゼ;
(vi) 3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ;
(vii) 該標的RNAから転写されたcDNAの一部とハイブリダイズし得るギャップオリゴヌクレオチド;
(viii) (i)のパドロックプローブの相補体と;または(vii)のギャップオリゴヌクレオチドの相補体とハイブリダイズできる検出プローブ;
(ix) 取り込みのためのヌクレオチド、例えばdNTP。
(表1)オリゴヌクレオチド配列
オリゴヌクレオチドは5'-3'の順に示され、+記号はLNA塩基を意味する
オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies3、DNA technology A/Sb、Biomersc、およびEurogentecdから購入した
オリゴヌクレオチドは5'-3'の順に示される。+記号はLNA塩基を意味する。
LNA含有オリゴヌクレオチドはすべて、Integrated DNA Technologyから購入した。非修飾プライマーは、Biomerから購入した。
オリゴヌクレオチドは5'-3'の順に示される。+記号はLNA塩基を意味する
オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologyから購入した。
プライマー名は、それぞれのcDNAプライマーに関して生成されるcDNAの最大長を示す。
+=LNA修飾塩基、下線=標的相補的配列、イタリック体=検出プローブ相補的配列
オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologiesa、Exiqonb、Biomersc、およびEurogentecdから購入した。
以下の非限定的な実施例を参照して、本発明をこれよりさらに説明する。これらの実施例が、本発明の態様を示す一方で、単に例示として提供されることが理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行って、それを様々な使用および条件に適合させることができる。したがって、本明細書に示され記載されているものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正もまた、添付の特許請求の範囲の範囲に入ることが意図される。本明細書で参照された文書はすべて、参照により組み入れられる。
細胞培養:
細胞株GM08402(Coriell Cell Repositories)およびBJhTERTは、10% FBS(Sigma)、1×非必須アミノ酸(Gibco)、2 mM l-グルタミン(Sigma)、および1×ペニシリン-ストレプトマイシン(PEST、Sigma)を補充したフェノールレッドおよびl-グルタミン不含MEM(Gibco)中で培養した。マウス胎仔線維芽細胞(MEF)は、10% FBS、2 mM l-グルタミン、および1×PESTを補充したフェノールレッドおよびl-グルタミン不含DMEM(Gibco)中で培養した。ONCO-DG-1、SW-480、A-427、およびHCT-15(4つすべてDSMZによる)、SKOV3、ならびにSKBR3は、10% FBS、2 mM l-グルタミン、および1×PESTを補充したRPMI培養液(Sigma)中で培養した。A-549(DSMZ)は、10% FBS、2 mM L-グルタミン、および1×PESTを補充したフェノールレッドおよびL-グルタミン不含DMEM(Gibco)中で培養した。HUP-T3(DSMZ)は、10% FBS、2 mM L-グルタミン、および1×PESTを補充したMEM-イーグル培養液(Sigma)中で培養した。
E14.5マウス胚の新鮮凍結9-μm切片は、Superfrost Plus Goldスライド(Thermo Scientific)上に載せた。HER2陽性乳癌由来の完全に匿名化された新鮮凍結ヒト組織切片は、スウェーデンバイオバンク法(Swedish Biobank Legislation)に従って、Department of Pathology, Uppsala University Hospitalの新鮮組織バイオバンク(Fresh Tissue Biobank)から入手した。4μm厚の乳房組織切片は、Starfrost顕微鏡スライド(Instrumedics)上に載せた。
細胞をSuperfrost Plusスライド(Thermo Scientific)上に播種し、接着させた。細胞が所望のコンフルエンシーに達した時点で、それらをPBS中の3%(w/v) パラホルムアルデヒド(Sigma)中で室温(20〜23℃)にて30分間固定した。固定後、スライドをDEPC処理PBS(DEPC-PBS)で2回洗浄し、一連のそれぞれ3分間の70%、85%、および99.5%エタノールにより脱水した。分子反応は、スライド上に付着させたSecure-seal(Grace Bio-Labs、直径9 mmおよび深さ0.8 mm)中で行った。各試料に対して、50-μl反応容積を使用した。RNAをより容易にcDNA合成に利用できるようにするために、細胞に0.1 M HClを室温で10分間適用した。これに続き、DEPC-PBSでの短時間の洗浄を2回行った。組織は、わずかな例外を除いて、細胞株と同様に処理した。組織固定は、PBS中の2%(w/v) パラホルムアルデヒド中で行った。次に、組織を0.1 M HCl中の0.01%ペプシン(Sigma)で37℃にて2分間透過処理した。分子反応は、組織上に載せたSecure-seal(直径13 mm、深さ0.8 mm;Grace Bio-Labs)中で100μlの反応容積で行った。逆転写は一晩行い、連結、RCA、および検出プローブハイブリダイゼーションのためのインキュベーション時間は倍にした。マウス組織について、連結はT4 DNAリガーゼを用いて行った。
オリゴヌクレオチド配列(表1〜3)は、GenBankアクセッション番号NM_001101.3(ACTB)、NM_007393.3(Actb)、NM_198253.2(TERT)、NM_002467(MYC),NM_001005862.1(ERBB2)、NM_009606(Acta1)、NM_009609(Actg1)、およびNM_033360(KRAS)を用いて設計した。パドロックプローブはすべて、製造業者の緩衝液A中の0.2 U μl-1 T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Ferments)+1 mM ATPを用いて2μMの濃度で37℃にて30分間かけて5'リン酸化し、その後65℃で10分間処理した。培養細胞におけるβ-アクチン転写物検出については、他の指示のない限り、検出のためにプライマーP-βe1をパドロックプローブPLP-βe1と共に、プライマーP-βe6をパドロックプローブPLP-βe6と共に、プライマーP-βhumをパドロックプローブPLP-βhumと共に、およびプライマーP-βmusをパドロックプローブPLP-βmusと共に使用した。TERTはプライマーP-TERTおよびパドロックプローブPLP-TERTを用いて、cMycはプライマーP-cMycおよびパドロックプローブPLP-cMycを用いて、ならびにHER2はプライマーP-HER2およびパドロックプローブPLP-HER2を用いて検出した。マウス組織における転写物の検出に関して、β-アクチンについてはパドロックプローブPLP2-βmusと共に、およびα1-アクチンについてはパドロックプローブPLP-α1musと共にプライマーP-α1βmusを使用し、ならびにγ1-アクチン検出についてはプライマーP-γ1musをパドロックプローブPLP-γ1musと共に使用した。KRAS遺伝子型同定については、プライマーP-KRASをパドロックプローブPLP-KRAS-wtGGT、PLP-KRAS-mutGTT、およびPLP-KRAS-mutGATと組み合わせて使用した。
細胞株ONCO-DG-1、A-427、SW-480、HCT-15、A-549、およびHUP-T3(すべてDSMZ)をコラーゲンI 8-ウェル培養スライド(BD BioCoat)上に播種し、接着させた。細胞が所望のコンフルエンシーに達した時点で、それらをDEPC処理PBS(DEPC-PBS)中の3%(w/v) パラホルムアルデヒド(Sigma)中で室温(20〜23℃)にて30分間固定した。固定後、スライドをDEPC-PBSで2回洗浄し、スライドからプラスチックウェルを除去した。その後スライドを、それぞれ1分間の70%、85%、および99.5%エタノールというエタノール系列により脱水した。
試料をM-MuLV反応緩衝液中でプレインキュベートした。次に、M-MuLV反応緩衝液中、1μMのcDNAプライマーを20 U μl-1のRevertAid HマイナスM-MuLV逆転写酵素(Fermentas)、500 nM dNTP(Fermentas)、0.2μg μl-1 BSA(NEB)、および1 U μl-1 RiboLock RNase阻害剤(Fermentas)と共にスライドに添加した。スライドを37℃で3時間〜一晩インキュベートした。インキュベーション後、スライドをPBS-T(0.05% Tween-20(Sigma)を含むDEPC-PBS)で短時間洗浄し、続いてDEPC-PBS中の3%(w/v) パラホルムアルデヒド中で室温にて30分間の後固定段階を行った。後固定後、試料をPBS-Tで2回洗浄した。標的cDNA鎖をパドロックプローブハイブリダイゼーションに利用できるようにするために、生成されたRNA-DNAハイブリッドのRNA部分をリボヌクレアーゼHで分解した。これは、パドロックプローブのハイブリダイゼーションおよび連結と同じ段階で行った。大部分の反応について、連結にはAmpligase(Epicentre)を使用した。試料をまず、Ampligase緩衝液(20 mM Tris-HCl、pH 8.3、25 mM KCl、10 mM MgCl2、0.5 mM NAD、および0.01% Triton X-100)中でプレインキュベートした。次に、0.5 U μl-1 Ampligase、0.4 U μl-1 RNase H(Fermentas)、1 U μl-1 RiboLock RNase阻害剤、Ampligase緩衝液、50 mM KCl、および20%ホルムアルデヒドの混合物中で100 nMの各パドロックプローブを用いて、連結を行った。最初に37℃で30分間、その後45℃で45分間のインキュベーションを行った。マウス胚組織切片においてアクチン転写物アイソフォームを検出する場合、連結は代わりにT4 DNAリガーゼ(Fermentas)を用いて行った。試料を次にまず、T4 DNAリガーゼ緩衝液(Fermentas)中でプレインキュベートした。次に、0.5 mM ATPおよび250 mM NaClを補充したT4 DNAリガーゼ緩衝液中で、100 nMの各パドロックプローブを、0.1 U μl-1 T4 DNAリガーゼ、0.4 U μl-1 RNase H、1 U μl-1 RiboLock RNase阻害剤、および0.2μg μl-1 BSAと共に添加した。次いで、スライドを37℃で30分間インキュベートした。AmpligaseまたはT4 DNAリガーゼによる連結後、スライドを、0.05% Tween-20を含むDEPC処理2×SSCで37℃にて5分間洗浄し、PBS-Tでリンスした。スライドを、φ29 DNAポリメラーゼ緩衝液(Fermentas)中で短時間プレインキュベートした。次に、提供される反応緩衝液中の1 U μl-1 φ29 DNAポリメラーゼ(Fermentas)、1 U μl-1 RiboLock RNase阻害剤、250μM dNTP、0.2μg μl-1 BSA、および5%グリセロールを用いて、RCAを行った。インキュベーションを37℃で60分間行った。インキュベーションに続いて、PBS-Tで洗浄した。2×SSCおよび20%ホルムアミド中の100 nMのそれぞれ対応する検出プローブを用いて、37℃で30分かけてRCPを可視化した。次にスライドをPBS-Tで洗浄し、Secure-sealを除去し、一連のそれぞれ3分間の70%、85%、および99.5%エタノールを用いてスライドを脱水した。100 ng ml-1 DAPIを含むVectashield(Vector)で乾燥スライドを封入して、細胞核を対比染色した。図5中の細胞膜の対比染色のためのプロトコールは、以下の「WGA染色」に記載する。
細胞質を対比染色するため、1×PBS中に希釈した2.5μg ml-1 WGA 488(Invitrogen)を添加して、室温で60分間置いた。この後、PBS-Tで2回洗浄して、脱水してから、先に記載されるように封入およびDAPIによる核染色を行った。
図6中の単一細胞定量化に関しては、個々の細胞に印をつけ、印のつけられた領域内のRCPを計数するために、特注のMatLabスクリプトを使用した。MatLabでのRCPの定量化は、本明細書で他の実施例において定量化のために用いられたBlobFinderソフトウェアと比較して、RCPが定義される方法が異なる。結果として、その結果は、BlobFinder解析と比較して約30%少ないRCPを示す。
培養細胞の画像は、100 W水銀ランプ、CCDカメラ(C4742-95、Hamamatsu)、ならびにDAPI、FITC、Cy3、Cy3.5、およびCy5を可視化するための励起および発光フィルターを含むコンピュータ制御フィルターホイールを備えたAxioplan II落射蛍光顕微鏡(Zeiss)を用いて取得した。画像を捕獲するために、×20(Plan-Apocromat、Zeiss)、×40(Plan-Neofluar、Zeiss)、または×63(Plan-Neofluar、Zeiss)対物レンズを使用した。画像は、Axiovisionソフトウェア(4.3版、Zeiss)を用いて収集した。細胞画像のための露出時間は、DAPIに関して、260〜340 ms(×20倍率において)、10〜80 ms(×40)、または220 ms(×63);FITCに関して、40 ms(×40)または220 ms(×63);Cy3に関して、560〜640 ms(×20)、110〜160 ms(×40)、または200 ms(×63);Texas Redに関して、110 ms(×40)または250 ms(×63);およびCy5に関して、6,350 ms(×20)、180 ms(×40)、または350 ms(×63)であった。SKBR3およびSKOV3細胞については、すべてのRCPが画像化されることを確実にするために、画像をz-stackとして収集した。実施例3における新鮮凍結マウス胚組織切片でのα1-アクチンおよびβ-アクチンの画像化は、CCDカメラ(AxioCam MRm、Zeiss)および×20 Plan-Apochromat対物レンズを備えたMirax Midiスライドスキャナー(3D Histech)を用いて画像化した。スライドスキャナーにおける露出時間は、DAPIに関して45 ms、Cy3に関して270 ms、Texas Redに関して340 ms、およびCy5に関して3,200 msであった。定量化のため、画像中のRCPおよび細胞核の数を、BlobFinderソフトウェア(バージョン3.0_β)を用いてデジタル的に計数した。培養細胞については、5つの20×顕微鏡画像において定量化を行った(各試料につきおよそ20〜30個の細胞)。各画像について、RCPの総数を核の数で除した。次に、5つの画像の結果から各試料の平均値を算出し、これを細胞当たりのRCPとして報告する。図6において用いられた単一細胞定量化のための手順は、上記の「単一細胞定量化」に記載されている。
細胞株GM08402の2つの別個の継代物を、細胞を計数した後に収集し、全細胞溶解物からRNAを単離するためのプロトコールと共にPARISキット(Ambion)を用いて、細胞から全RNAを精製した。DNAフリーキット(Ambion)を用いて、精製RNAから微量のDNAを除去した。対応する酵素緩衝液中の20 U RevertAid HマイナスM-MuLV逆転写酵素(Fermentas)、0.5μgオリゴ(dT)プライマー(20マー)、1 mM dNTP、および1 U μl-1 RiboLock RNase阻害剤を含む混合物中で、700 ngの鋳型RNAを用いて、第1鎖cDNA合成を行った。試料を37℃で5分間、その後42℃で60分間インキュベートした。70℃で10分間加熱することによって、反応を停止した。検量線作成のための鋳型を合成するために、予備PCRを行った。このPCRでは、細胞継代物のうちの1つに由来する1μlのcDNAを、全量50μlにおいて、0.02 U μl-1 Platinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)、PCR緩衝液、2 mM MgCl2、200μM dNTP、200 nM ACTBfwdプライマー、および200 nM ACTBrevプライマーの混合物中で増幅した。PCRは、95℃で2分、続いて45回のサイクル(95℃で15秒、50℃で15秒、および72℃で1分)、および最後の72℃で5分で行った。溶液からDNAを精製するためのプロトコールに従って、Illustra GFX PCRおよびゲルバンド精製キット(GE Healthcare)を用いて、PCR産物を精製した。Nanodrop 1000分光光度計(Thermo Scientific)を用いて精製PCR産物の濃度を測定し、マイクロリットル当たりの分子数を算出した。全量30μl中、2μlの鋳型cDNAまたは希釈した検量線PCR産物を、SYBR Green(Invitrogen)、0.02 U μl-1 Platinum Taq DNAポリメラーゼ、PCR緩衝液、2 mM MgCl2、200μM dNTP、200 nM ACTBfwdプライマー、および200 nM ACTBrevプライマーと共に用いて、qPCRを実行した。qPCRは、予備PCRと同じプログラムを用いて実行した。検量線試料は同一試料の2つ組で実行し、細胞の2つの継代物によるcDNA試料は3つ組で実行した。2つの細胞継代物に関する転写物コピー数の計数は、回収時に計数された細胞の数に基づいた。次いで、細胞株の平均β-アクチンmRNAコピー数を決定した。インサイチュー多重検出実験のためのqPCRによる効率推定のプロトコールは、以下の通りである。
分子インサイチュー反応はすべてSecure-seal(Grace Bio-Labs Inc.)中で行い、組織または捺印の反応容積は、試料のサイズに応じて100μl(直径13 mm、深さ0.8 mmのサイズ)または350μl(直径22 mm、深さ0.8 mmのサイズ)のいずれかであった。細胞に用いられたSecure-sealは、50μlの全容積(直径9 mmおよび深さ0.8 mmのサイズ)を有した。Secure-sealを細胞または組織上に載せ、PBS-T(0.05% Tween-20(Sigma)を含むDEPC-PBS)で短時間洗い流すことによってウェルを脱水した。
オリゴヌクレオチド配列(表4)は、GenBankアクセッション番号NM_033360(KRAS)、NM_005228(EGFR)、NM_001126114.1(TP53)、およびNM_001101.3(ACTB)用いて設計した。パドロックプローブはすべて、PNK緩衝液A中の0.2 U μl-1 T4 PNK(Ferments)および1 mM ATPを用いて10μMの濃度で37℃にて30分間かけて5'リン酸化し、その後65℃で10分間処理した。異なる組織試料および細胞株に適用されたプライマー、パドロックプローブ、および検出プローブを、表6に要約する。
パドロックプローブハイブリダイゼーションに利用可能な一本鎖標的cDNA鎖を作出するために、生成されたRNA-DNAハイブリッドのRNA部分をRNase Hで分解した。これは、パドロックプローブのハイブリダイゼーションおよび連結と同じ段階で行った。反応は、Ampligase緩衝液中の1 U μl-1 Ampligase(Epicentre)、0.4 U μl-1 RNase H(Fermentas)、1 U μl-1 RiboLock RNase阻害剤、50 mM KCl、20%ホルムアルデヒドの混合物中で100 nMの各パドロックプローブを用いて行った。最初に37℃で30分間、その後45℃で45分間のインキュベーションを行った。連結後、PBS-Tでチャンバーを洗い流して、スライドを洗浄した。未知組織試料の前向きKRAS変異検出については、KRASコドン12および13パドロックプローブのすべてのカクテルを、10 nMの最終濃度で混合した。
提供される反応緩衝液中の1 U μl-1 φ29 DNAポリメラーゼ(Fermentas)を、1 U μl-1 RiboLock RNase阻害剤、250μM dNTP、0.2μg μl-1 BSA、および5%グリセロールと共に用いて、RCAを行った。インキュベーションは、37℃で、腫瘍捺印および細胞株については2時間、ならびに新鮮凍結およびFFPE組織についてはおよそ5時間行った。RCA後、PBS-TでSecure-sealチャンバーを洗い流して、試料を洗浄した。2×SSCおよび20%ホルムアミド中の100 nMのそれぞれ対応する検出プローブを用いて、37℃で15分かけてRCPを可視化した。次に、PBS-Tでチャンバーを洗い流すことによってスライドを再度洗浄し、Secure-sealを除去し、一連のそれぞれ30秒間の70%、85%、および99.5%エタノールを用いてスライドを脱水した。100 ng ml-1 DAPIを含むVectashield(Vector)で乾燥スライドを封入して、細胞核を対比染色した。
画像は、100 W水銀ランプ、CCDカメラ(C4742-95、Hamamatsu)、ならびにDAPI、FITC、Cy3、およびCy5を可視化するための励起および発光フィルターを含むコンピュータ制御フィルターホイールを備えたAxioplanII落射蛍光顕微鏡(Zeiss)を用いて取得した。画像を捕獲するために、新鮮凍結およびFFPE組織に対して×10(Plan-Apocromat、Zeiss)対物レンズを使用し、腫瘍捺印に対して×20(Plan-Apocromat、Zeiss)対物レンズを使用し、ならびに最後に細胞に対して×63(Plan-neofluar、Zeiss)対物レンズを使用した。画像は、Axiovisionソフトウェア(4.8版、Zeiss)を用いて収集した。説明のために提示される画像は、印刷を明確にするために画像編集ソフトウェアを用いて加工した。異なるカラーチャネルの閾値は、ImageJ 1.42qを用いて設定し、Cy3およびCy5でのKRASシグナルのより明らかな可視化のために、最大値フィルターを適用した。
パドロックプローブを用いた培養ヒト細胞におけるβ-アクチン(ACTB)転写物の検出
培養ヒト細胞におけるβ-アクチン(ACTB)転写物を検出するために、それぞれ第1エキソンおよび最終エキソン中の配列を標的化する2つの異なるパドロックプローブを使用した。この転写物に関する以前の報告と一致するこの転写物の以前の知見と一致して、細胞の細胞質に局在する多くの明るい点状シグナルが可視化された。検出効率は2つのパドロックプローブについて同様であり、この場合、検出が、転写物に沿った標的位置に大きく依存しないことが示された(図5)。対照的に、cDNA合成反応から逆転写酵素を除いた場合には、シグナルは検出されず、シグナルがcDNA依存的であることが検証された(図5)。GM08402細胞株におけるβ-アクチンmRNAの定量的PCR(qPCR)データ(細胞当たり2,000コピー)との比較に基づいて、全体的なインサイチュー検出効率は、利用可能な転写物の約30%であると推定された。β-アクチンmRNA発現における細胞間変動の他の報告と一致して、細胞間のシグナル数にかなりの変動があった(図6)。
インサイチューでの培養細胞における転写物の単一ヌクレオチド変化の検出
検出の高い選択性を実証するために、アッセイを用いて、インサイチューで転写物の単一ヌクレオチド変化を検出した。β-アクチンにおいて発現される多型は稀であり、そのため遺伝子型同定標的として、ヒトとマウスのβ-アクチン配列間の単一塩基の違いを使用した。共培養したヒトおよびマウス線維芽細胞を、パドロックプローブPLP-βhum(ヒト)およびPLP-βmus(マウス(Mus musculus))ならびに標的プライミングRCAを用いるcDNAのインサイチュー遺伝子型同定に供した。共培養物中の細胞の2つの亜集団間に、明確な区別が認められた。環状化段階における完全に一致したパドロックプローブの優先選択により、リガーゼによる2つの標的間の区別が確実になる。
インサイチューでの新鮮凍結組織における転写物の単一ヌクレオチド変化の検出
固定化組織切片における方法を試験するために、頸部の高さで横断切断されたE14.5マウス胚由来の新鮮凍結組織において、近縁の骨格筋α1-アクチン(Acta1)および細胞質β-アクチン(Actb)転写物を標的化した。単一塩基だけ異なる標的配列を考慮して設計されたパドロックプローブを用いて、2つのアクチン転写物は組織中でうまく検出された。α1-アクチンシグナルは主に骨格筋に分布したのに対して、β-アクチンシグナルは広く分布したが、非筋肉組織においてわずかにより多くのシグナルを示した。細胞質α1-アクチン(Acta1)転写物に特異的なプローブを含めることにより、同じ遺伝子ファミリーに由来する3つの転写物を識別する能力が実証された。
発現プロファイリングのための転写物の検出
発現プロファイリングのための転写物の多重検出に関する本方法の能力を試験するために、3つの癌関連転写物、HER2(ERBB2としても知られる)、cMyc(MYCとしても知られる)、およびTERTに対してパドロックプローブを設計した。参照転写物としてβ-アクチンを用いて、これらの転写物を4つの細胞株(ヒト卵巣癌細胞株、ヒト乳癌細胞株、TERT不死化ヒト包皮線維芽細胞細胞株、および初代線維芽細胞培養物)においてアッセイした。癌関連遺伝子の発現レベルは、細胞株間で異なった(図2a〜d)。卵巣癌および乳癌細胞株が、HER2およびcMyc転写物の発現の類似のパターンを示したのに対して、TERT不死化線維芽細胞は、TERT転写物の検出可能なレベルを有する唯一の細胞型であった。4つの細胞株はすべてβ-アクチンを発現し、正常線維芽細胞株において、これは検出可能なレベルで発現された、調べられた中で唯一の転写物であった。これらの結果をqPCRデータおよび入手可能な文献と比較し、異なる細胞株において予測された相対発現レベルとの良好な相関関係、および異なる転写物間の検出効率の著しい一貫性が認められた(実施例5)。調べたすべての転写物について、発現の大きな細胞間変動が認められたが、これは培養物中の単一細胞における発現の以前の研究と一致する。
ヒト細胞株における癌関連転写物の発現
実施例4に記載されるように、3つの癌関連転写物、TERT、HER2、およびcMycを4つの細胞株においてアッセイした。インサイチューデータによると、細胞株はすべてハウスキーピング遺伝子β-アクチンを発現したが、癌関連転写物の発現において異なった。次に、インサイチュー実験における検出効率の変動を評価できるようにするため、GM08402、BJhTERT、およびSKBR3細胞株においてqPCR測定を行って、異なる転写物を定量化した。TERT発現のqPCR測定から、BJhTERT細胞株における比較的高い発現(247分子/細胞)、およびSKBR3乳癌細胞株における低発現(6分子/細胞)が示された。qPCRにより、TERT発現は正常初代線維芽細胞において検出されなかった。TERTのqPCRデータは、文献中に見出されるTERTのmRNA発現レベルと良好に相関する(BJhTERTに関して220分子/細胞、およびSKBR3に関して0.57分子/細胞(Yi et al., 2001))。したがって、BJhTERTにおいて細胞当たり39個のRCPが検出されたというインサイチュー結果は、qPCRデータに基づいて16%の検出効率に相当する。HER2転写物は、卵巣癌および乳癌細胞株において過剰発現されることが知られている。SKBR3細胞株において、HER2 mRNA数/細胞は168〜336分子であると報告されており、本明細書に記載されるqPCR測定は177分子/細胞であった。インサイチューで検出されたHER2 mRNA数/細胞は25であった。これにより、SKBR3細胞におけるHER2転写物の検出効率は14%となる。HER2発現は、正常初代線維芽細胞またはBJhTERT細胞株において、qPCRによって検出され得なかった。SKOV3細胞におけるcMycの発現レベルは、同じ細胞株におけるHER2転写物の数の約4分の1と推定され、これは本明細書に記載されるインサイチュー測定と良好に相関する。単独でアッセイした場合、培養線維芽細胞におけるβ-アクチンの検出効率は、転写物のqPCR測定およびインサイチュー検出に基づいて、30%であると推定された。これらの多重実験において、検出効率は、同じqPCR推定に基づいて、わずかに低く約15%である。同様の影響が癌転写物においても認められ、それらは多重において約15%の検出効率を示す一方で、個々ではより良好に機能する。特にcDNAプライマーのLNA修飾塩基は相互に非常に強力に結合する能力を有するため、多重実験における標的について観察されたより低い検出効率は、異なるパドロックプローブおよび/またはcDNAプライマー間の相互作用に起因する可能性が高い。多重反応の検出プロトコールは、プローブおよび/またはプライマーの濃度を最適化することによって、改善することができる。さらに、qPCR測定は、細胞株間の相対的β-アクチン発現レベルに関して、インサイチュー測定と良好な相関関係を示す。まとめると、これらのデータから、異なる細胞型におけるRCPの相対レベルは、細胞集団における真の相対転写物レベルの優れた推定値であることが示される。したがって、本方法は、異なる試料における相対発現プロファイリングに適していると考えられる。qPCRによるmRNA定量化において、逆転写反応は変化を導入することが知られているが、このことはインサイチューでの逆転写についても当てはまる可能性が高い。
新鮮凍結HER2陽性ヒト乳癌組織における転写物分布の検出
本発明の技法はまた、新鮮凍結HER2陽性ヒト乳癌組織切片においてHER2転写物分布を評価するために使用した。腫瘍組織において予測される癌細胞および正常間質の存在と一致して、発現は細胞間で大きく異なった。
KRAS野生型および変異体細胞におけるKRAS点変異の遺伝子型同定
本発明の方法はまた、KRAS野生型および変異体細胞におけるKRAS点変異を遺伝子型同定するために使用した(図7)。それらの対応するRCPの色に基づいて、異なる細胞型を明らかに識別することができた。KRAS癌遺伝子の活性化変異は、全ヒト腫瘍の17%〜25%において見出され、組織標本においてこれらの変異および他の腫瘍細胞特異的マーカーをインサイチューでモニターするためのアッセイは、臨床病理学研究にとって大いに価値があると考えられる。KRASにおける点変異についてヘテロ接合性である細胞株に由来する77個の細胞を解析することにより、対立遺伝子発現の研究の可能性をさらに調べた。かなりの細胞間変動を伴って、48%が野生型転写物という平均対立遺伝子比が認められ(図6bおよび7)、均衡のとれた対立遺伝子転写が示された。本実験において、7個を超えるRCPを有するすべてのヘテロ接合性細胞は、両対立遺伝子からのシグナルを示した。7個未満のシグナルを示す細胞については、単一細胞において2対立遺伝子発現の可能性および不均衡な対立遺伝子発現の程度を決定することは難しい。
cDNAプライマーへのLNA塩基取り込みの効果
逆転写段階の効率を高めるために、ロックド核酸(LNA)塩基が取り込まれたRTプライマーを使用した。LNA修飾オリゴヌクレオチドは、これまでにFISHで用いられており、2塩基または3塩基ごとにLNAと置換されたDNA/LNAミックスマー(mixmer)が最もよく機能する。標的に対するハイブリダイゼーション効率の増加に加えて、プライマーのLNA含量は、RNase Hによる分解から標的RNAを保護するように設計することができる。このことは、本方法において、インサイチューで合成されたcDNAが、cDNAプライマーのハイブリダイゼーションにより、細胞内で、検出されるmRNA分子に対する局在性を維持し得ることを意味する(図1)。異なるLNA置換を有するcDNAプライマー(表2)を、PLP-βe1パドロックプローブ標的部位のその後の検出に関して、インサイチューで試験した。5'末端において2塩基ごとにLNAで置換されたプライマーが、3塩基ごとの置換を有するプライマーよりも良好に機能することが判明した(図3)。合計して5個、7個、または9個のLNA塩基を含むプライマーもまた調べ、9個のLNA塩基を付加することで、インサイチューにおけるシグナルの量がわずかに減少することが判明した。LNAが、逆転写酵素がプライマーからcDNAを合成する能力を妨げないことを確実にするために、LNA塩基はプライマーの5'側に配置し、3'側は未修飾のままにした。プライマーの全長を30ヌクレオチドから25ヌクレオチドに短くしても、結果に影響しないことが判明し、したがってプライミングはプライマー中のLNA塩基の存在によって妨げられないと結論づけられた。
cDNA合成効率
ハイブリダイズするcDNAプライマーとパドロックプローブの標的配列との間の最適な距離を確実にするために、細胞において生成されたcDNA分子の長さを調べた。β-アクチンmRNAの5'末端から異なる距離に位置するcDNAプライマーを用いて、インサイチュー検出実験を設定した。次にインサイチューで逆転写を行い、得られたcDNA分子を、逆転写されたcDNAの3'末端近傍に標的配列を有するPLP-βe1で検出した。次に、異なるプライマーに関して、細胞当たり形成されたRCPの数を定量化した。試験したプライマーは、プライマー部位の始めから転写物の末端まで測定して、およそ90〜500 nt長の範囲のcDNA分子をもたらすためのものであった(プライマー配列については表3を参照されたい)。主に短い分子が形成されること、およびcDNAプライマー部位はパドロックプローブ標的部位に近接して位置すべきであることが判明した(図4)。逆転写のためのプライマーを設計する方法に関する詳細を提供するばかりでなく、cDNA合成長が限定されることに関する知識は、RCA反応の遂行にとって実際的関連性を有する。本プロトコールでは、インサイチューの内因性ミトコンドリアDNA分子について最初に記載された標的プライミング戦略(Larsson et al. (2004) Nat. Methods, 1, 227-232,)が用いられた。標的プライミングは、標的分子の近接3'末端からプライマーを作出するために、一本鎖DNAに対してφ29 DNAポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を利用する。RCA反応の効率は、ミトコンドリアDNAの突出3'末端の長さが0ヌクレオチドから130ヌクレオチドに増加するにつれて減少することが示された。本方法において非常に短いcDNA分子が生成されたため、標的プライミングRCAアプローチを、標的鎖のさらなる調製なしに、cDNA検出のためのシグナル増幅にも効率的に適用することができる。
パドロックプローブの連結のための異なるリガーゼ
これまでにパドロックプローブ連結に用いられてきた主に2種類の酵素が存在する;ATP依存性T4 DNAリガーゼおよびNAD+依存性Ampligase(商標)である。両リガーゼを、パドロックプローブを用いるcDNAのインサイチュー検出について試験し、優れた検出効率が得られた。しかしながら、ヒトおよびマウス細胞において、単一ヌクレオチド分解能を伴う配列を検出するための実験を行う場合に、Ampligaseが、非一致プローブからより低い割合のシグナルを生成することが判明した。T4 DNAリガーゼによる正しいシグナルの割合は、ヒト細胞について87%(ヒトRCP/全RCP)であり、マウス細胞について98%(マウスRCP/全RCP)であった。これはAmpligase(商標)と対照的であり、この酵素は、マウス標的配列についてはT4 DNAリガーゼと比較して変化しなかったものの、ヒト標的配列についてはるかにより高い選択性を有した(98%正しい)。異なるアクチンアイソフォームの転写物は高い割合の類似性を共有し、多くの偽遺伝子が存在するため、これらの予期せぬ陽性シグナルのいくつかは、単純なインシリコ配列解析を行った場合には現れない、パドロックプローブ標的配列と類似した配列から生成されると考えられる。これらの観察に加えて、Ampligase(商標)は、T4 DNAリガーゼよりも、一致した基質に対してより特異的であることが知られている。
インサイチュー変異検出のためのアッセイ設計
コドン12および13(G12S、G12R、G12C、G12D、G12A、G12V、およびG13D)およびコドン61(Q61H)におけるKRASの点変異、ならびにEGFRの点変異(G719A、G719C、S768I、およびL858R)、およびTP53の点変異(S127FおよびP190S)について、パドロックプローブを設計した。異なる標的の野生型形態のためのパドロックプローブも同様に設計した。変異特異的パドロックプローブは、遺伝子型に応じて異なる3'末端の最終ヌクレオチドを除いて、同一標的配列を有して設計した。この位置のミスマッチは用いられるDNAリガーゼによって許容されず、そのため点変異のような単一ヌクレオチドの違いは効率的に識別される。さらに、例えば緑色および赤色といった異なる蛍光色素で標識された検出プローブを用いてRCPを相互に識別するために、野生型および変異体パドロックには検出プローブのための2つの異なる部位が存在する。また、細胞型間で比較的一定した発現を有する内部参照として、付加的なフルオロフォアによって検出されるACTB転写物の検出をこれらのアッセイに含めた。試料にわたってACTBシグナルを比較することにより、異なる試料における検出効率の推定が提供された。ACTBデータは本研究の開発段階において有用であったが、変異スコアリングおよび組織分類には不必要であることが判明した。
KRAS状態が公知である新鮮凍結結腸組織および肺組織における変異検出
パドロックプローブの選択性は、最初に野生型および変異特異的KRAS細胞株においてインサイチューで試験した。プローブの質を確認した後、本発明者らのインサイチュー遺伝子型同定法を、KRAS状態が公知である10個の新鮮凍結ヒト結腸癌組織および肺癌組織に適用した。この検証段階では、各プローブ対(一方のプローブは特定の変異に対し、もう一方は対応する野生型変種に対する)を、KRAS状態が公知である新鮮凍結組織試料の集合において個々に試験した。野生型プローブは、緑色蛍光RCPを生成するように設計し、変異特異的プローブは赤色蛍光RCPを生成するように設計した。試料は、最も稀な変異であるG12Rを除いたすべてのコドン12および13変異を示した。しかしながら、試験した細胞株のうちの1つにおいて、G12R変異のパドロックプローブ対の性能をやはり特異性について検証した。このようにして、KRAS野生型腫瘍組織を、通常の蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)と同様の様式で顕微鏡可視化によって、活性化KRAS変異を保有する腫瘍を有する組織と識別することができた。KRAS変異を有する結腸および肺切片は、パドロックプローブ対中のプローブの両方から生成されるシグナルの混合物を示したのに対して、正常組織は野生型パドロックプローブからのみシグナルを示した。10個の試料を視覚的に調べることにより、組織内および組織間の両方のKRAS発現レベルにおいて、変動が明らかに見られ得る。全体として、KRASのわずかにより高い発現レベルが、結腸と比較して肺において認められた。結果から、ほとんどの症例が、腫瘍細胞領域内で野生型および変異体KRASシグナルの両方を示すことが示され、ヘテロ接合性発現が示唆された。対照的に、1つの肺試料は、腫瘍領域においてほぼ変異体シグナルのみを示し、わずかに存在する野生型シグナルは正常な周囲の間質に属した。これは、KRASホモ接合性変異またはヘテロ接合性消失(LOH)を反映し得た。
FFPE組織における変異検出
インサイチューパドロックプローブ技法がFFPE組織に適用できるかどうかを評価するために、これを試験した。この種の組織材料に適用されるプロトコールは、前処理手順を除いて、本質的に新鮮凍結組織と同様であった。それぞれのパドロックプローブ対を適用して、コドン12および13中に公知のKRAS変異を有する14個の結腸直腸FFPE癌組織の集合において、KRAS変異解析を行った。組織はすべて、野生型および変異体パドロックプローブの両方から生成されるシグナルの混合物を示したが、シグナル数(KRASおよびACTBの両方に関する)の変動が組織間で顕著であり、これはおそらくはFFPE試料間で予測される組織の質の差を反映している。さらに、野生型シグナルと変異体シグナルの比率もまた、同じKRAS変異を保有する組織間で異なることが認められ、これはおそらくは腫瘍特異的な特性を反映している。コドン61で最もよく見られる変異(Q61H)についてもプローブを設計し、2つの結腸腫瘍FFPE試料において試験し、これらは変異体としてうまくスコア化された。
変異状態が未知である前向き臨床試料におけるKRASのインサイチュー検出
パドロックプローブが選択的であることを最初に検証した後、すべてのプローブを混合して、症例がKRAS陽性であるか否かという最初の診断的質問に答え得る単一反応物にした。これを、KRAS変異特異的パドロックプローブの単一対を用いるインサイチュー変異検出と、KRASコドン12および13変異に関するすべてのプローブを含むパドロックプローブカクテルを用いる多重検出アプローチを比較することによって試験した。組織の可視化検査に基づく結果から、複数のプローブが2コドン標的部位をめぐって競合する場合に、効率も選択性も失われないことが示された。したがって、この解析は、腫瘍が活性化KRAS変異を有するか否かの迅速な答えを提供する。それにもかかわらず、必要であれば、この技法を用いて、連続切片においてすべての変異について個々に単純に試験することにより、正確な配列変化を明らかにする可能性がなお存在する。
組織マイクロアレイにおけるハイスループット変異スクリーニング
組織マイクロアレイ(TMA)を用いて、1枚のスライド上で何百もの患者FFPE腫瘍試料を解析することができ、これは、大きな患者コホートにおいてタンパク質発現(免疫組織化学(IHC)による)および遺伝子コピー数変化(FISHによる)を特徴づけるために用いられてきた。ここでは、25個のFFPE結腸試料(2つ組)を含むTMAを、KRASコドン12および13変異の可能性についてアッセイした。アレイは、すべてKRASについて変異状態が未知である正常結腸粘膜、管状腺腫、鋸歯状腺腫、原発腫瘍、および一致する転移由来の試料からなった。全試料のうち11個が、KRAS陽性であることが判明した‐腺腫2個、鋸歯状腺腫1個、原発腫瘍4個、およびそれらの一致する転移。対応するFFPEブロックにおけるパイロシーケンシングによる変異解析は、インサイチューデータと完全に一致した。
腫瘍進行および組織学的不均一性に関連する変異癌遺伝子対立遺伝子の差次的発現
腫瘍にわたる変異癌遺伝子の可変発現は、潜在的に、単一癌病変の異なる領域において標的療法に対する可変反応をもたらし得る。そのため、インサイチューアッセイを用いて、症例を、発現された変異の異なるパターンについてスクリーニングした。コドン61変異を有する1つの結腸癌症例では、正常結腸粘膜から低度および高度異形成ならびに浸潤癌への組織学的進行が、単一スライド上で可視化され得た。腫瘍進行に沿って、変異の発現の明らかな増加が存在した。したがって、EGFR阻害剤に対する耐性のレベルが、異なる新生物区画における該発現レベルに従うかどうかを推測することができる。
複数の変異を有する腫瘍における発現パターン
腫瘍内不均一性をさらに研究するために、複数の点変異を有することが公知である腫瘍に対してプローブを設計した。個別化療法とは、患者の個々の特徴に合わせた療法を意味する。次世代配列決定技術の出現は、これから次第に、研究者およびおそらくは間もなく臨床医に、総合して個別化療法の改善された機会を提供し得る個々の腫瘍の変異プロファイルを提供しつつある。腫瘍の一部から調製されたDNAを配列決定することで、その試料中のすべての変異が明らかになるが、それらが腫瘍の異なるサブクローン中に存在する場合には明らかとはならない。本発明者らの技術を用いて遺伝子間腫瘍不均一性を研究できることの概念実証として、EGFR、KRAS、およびTP53の変異の特有の組み合わせを保有するFFPE事例のスクリーニングのために、個別化インサイチュー変異アッセイを設定した。
実施例11〜17は、腫瘍組織切片および細胞学的調製物において点変異を特異的に標的化する多重インサイチューアッセイの確立を記述している。インサイチューでmRNAの逆転写によって合成された転写物を、変異体または野生型特異的パドロックプローブで標的化し、RCAによって検出可能なレベルまで増幅する。その後、得られた野生型および変異産物を異なる色のフルオロフォアで標識する。このパドロックプローブに基づくアッセイは、分子的癌診断のための変異解析を腫瘍組織切片上で直接行うことができることを初めて実証する。多重化インサイチューアッセイを開発し、結腸直腸癌において抗EGFR療法に対する耐性と関連しているKRASコドン12および13における活性化点変異に関する概念実証として検証した。プローブの選択性は、最初は個々に試験した。KRAS変異体と野生型の試料の間には明確な区別があり、遺伝子型は、対応する蛍光シグナルの単純な顕微鏡可視化によって容易に決定された。多重検出に関して、単一の対応するパドロックプローブ対と、すべてのコドン12および13 KRASパドロックプローブのカクテルとの対照比較により、2つのアプローチが効率および特異性の点で類似していることが示された。新鮮凍結組織は高品質のDNAおよびRNAを含み、分子研究のための貴重な基準として役立つため、パドロックプローブ戦略は非固定組織調製物において開発した。しかしながら、新鮮凍結組織における診断の実行は、実質的かつ高価なバイオバンク化の労力を必要とする。別法として、新鮮切断腫瘍表面からの捺印上で非固定腫瘍細胞を使用した。したがって、試料が到着した日にKRAS変異状態を決定することができ、これは本発明者らの日常的なパイロシーケンシングアッセイと一致した。
Braf変異の検出
BRAFは、異なる種類の腫瘍、主に悪性黒色腫、マイクロサテライトにおけるミスマッチ修復欠損(MSI)を示す散発性結腸直腸腫瘍、低悪性度卵巣漿液性癌、および甲状腺乳頭癌における体細胞変異を示す。これらの変異の80%は、アミノ酸置換V600Eを引き起こすホットスポットトランスバージョン変異T1799Aに相当する。
Claims (28)
- スライド表面上のホルマリン固定されたパラフィン包埋(FFPE)である細胞の試料中のKRAS遺伝子の1つまたは複数の変異をコードするmRNAを局在インサイチュー検出するための方法であって、
(a)プライマーを用いて試料中のmRNAからcDNAを作製する段階;
(b)該cDNAとハイブリダイズしているmRNAを消化する段階;
(c)該試料を、KRAS遺伝子に対する変異に特異的な1つまたは複数のパドロックプローブと接触させる段階;
(d)環状化パドロックプローブを形成させるために、該パドロックプローブの末端を直接的または間接的に結合させる段階;
(e)ローリングサークル増幅産物を作製するために、該環状化パドロックプローブをローリングサークル増幅(RCA)に供する段階;ならびに
(f)ローリングサークル増幅産物を検出する段階
を含み、パドロックプローブが以下を含む、方法:
(i) Y1-X1-Z1-A
(ii) Y1-X1-Z1-T
(iii) Y1-X1-Z1-C
(iv) Y2-X1-Z2-A
(v) Y2-X1-Z2-T
(vi) Y2-X1-Z2-C
(vii) Y3-X1-Z3-A
(viii) Y1-X2-Z1-G
(ix) Y2-X2-Z2-G、または
(x) Y3-X2-Z3-G
式中:
X1またはX2は16〜50ヌクレオチドであり;
Y1+Z1=20〜29ヌクレオチドであり;
Y2+Z2=20〜29ヌクレオチドであり;
Y3+Z3=20〜29ヌクレオチドであり;
Y1は、GTGGCGTAGGCAAGA (SEQ ID NO:1)、GTGGCGTAGGCAAG (SEQ ID NO:2)、GTGGCGTAGGCAA (SEQ ID NO:3)、GTGGCGTAGGCA (SEQ ID NO:4)、GTGGCGTAGGC (SEQ ID NO:5)、GTGGCGTAGG (SEQ ID NO:6)、GTGGCGTAG、GTGGCGTA、GTGGCGT、またはGTGGCGであり;
Y2は、TGGCGTAGGCAAGAG (SEQ ID NO:7)、TGGCGTAGGCAAGA (SEQ ID NO:8)、TGGCGTAGGCAAG (SEQ ID NO:9)、TGGCGTAGGCAA (SEQ ID NO:10)、TGGCGTAGGCA (SEQ ID NO:11)、TGGCGTAGGC (SEQ ID NO:12)、TGGCGTAGG、TGGCGTAG、TGGCGTA、またはTGGCGTであり;
Y3は、CGTAGGCAAGAGTGC (SEQ ID NO:13)、CGTAGGCAAGAGTG (SEQ ID NO:14)、CGTAGGCAAGAGT (SEQ ID NO:15)、CGTAGGCAAGAG (SEQ ID NO:113)、CGTAGGCAAGA (SEQ ID NO:114)、CGTAGGCAAG (SEQ ID NO:115)、CGTAGGCAA、CGTAGGCA、CGTAGGC、またはCGTAGGであり;
Z1は、TGGTAGTTGGAGCT (SEQ ID NO:27)、GGTAGTTGGAGCT (SEQ ID NO:28)、GTAGTTGGAGCT (SEQ ID NO:29)、TAGTTGGAGCT (SEQ ID NO:30)、AGTTGGAGCT (SEQ ID NO:31)、GTTGGAGCT、TTGGAGCT、TGGAGCT、GGAGCT、またはGAGCTであり;
Z2は、GGTAGTTGGAGCTG (SEQ ID NO:16)、GTAGTTGGAGCTG (SEQ ID NO:17)、TAGTTGGAGCTG (SEQ ID NO:18)、AGTTGGAGCTG (SEQ ID NO:19)、GTTGGAGCTG (SEQ ID NO:20)、TTGGAGCTG、TGGAGCTG、GGAGCTG、GAGCTG、またはAGCTGであり;かつ
Z3は、AGTTGGAGCTGGTG (SEQ ID NO:21)、GTTGGAGCTGGTG(SEQ ID NO:22)、TTGGAGCTGGTG(SEQ ID NO:23)、TGGAGCTGGTG(SEQ ID NO:24)、GGAGCTGGTG(SEQ ID NO:25)、GAGCTGGTG(SEQ ID NO:26)、AGCTGGTG、GCTGGTG、CTGGTG、またはTGGTGである。 - 試料中のRNAと相補的なcDNAを作製する段階が、該試料を逆転写酵素および逆転写プライマーと接触させる段階を含む、請求項1記載の方法。
- 逆転写プライマーがリボヌクレアーゼ耐性である、請求項2記載の方法。
- 逆転写プライマーが、前記細胞内に固定化され得るように修飾される、請求項2記載の方法。
- 逆転写プライマーが、細胞もしくは細胞成分に結合できるか細胞もしくは細胞成分と反応できる機能的部分、または細胞もしくは細胞成分に結合できるアフィニティー結合基を有する、請求項4記載の方法。
- 試料にリボヌクレアーゼを添加する段階を含む、請求項1記載の方法。
- パドロックプローブの集合が、異なる検出プローブ結合領域を含む、請求項1記載の方法。
- 異なる検出プローブ結合領域が、異なって標識された検出プローブによって認識され、該検出プローブが、異なる蛍光標識、発色標識、放射性標識、発光標識、磁性標識、または電子密度標識を含む、請求項7記載の方法。
- X2がX1とは異なる、請求項1記載の方法。
- プライマーが、2'O-Me RNA、メチルホスホナート、もしくは2' Fluor RNA塩基、ペプチジル核酸残基、またはロックド核酸残基を含む、請求項1記載の方法。
- プライマーが1個または複数個のロックド核酸残基を含む、請求項10記載の方法。
- プライマーが、プライマー配列中に、1個または複数個の天然または合成ヌクレオチドによって分離された2個またはそれ以上のロックド核酸を含む、請求項11記載の方法。
- 前記cDNAとハイブリダイズしているmRNAを消化するためにリボヌクレアーゼを添加する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- リボヌクレアーゼがRNase Hである、請求項13記載の方法。
- X1およびX2がそれぞれ、少なくとも1個の標識ヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
- 標識ヌクレオチドがフルオロフォアまたは発色団を含む、請求項15記載の方法。
- (i)〜(vii)より選択される各プローブが同じX1を有する、請求項1記載の方法。
- (viii)〜(x)より選択される各プローブが同じX2を有する、請求項1記載の方法。
- 前記RCAのプライマーとして働く遊離の3'末端を生成するために、ローリングサークル増幅が、cDNAを消化することができる3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを使用する、請求項1記載の方法。
- DNAポリメラーゼがφ29ポリメラーゼである、請求項19記載の方法。
- cDNAを消化して、RCAのプライマーとして働く遊離の3'末端を生成させるために、試料をエキソヌクレアーゼと接触させる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 接触させる段階(c)において、試料を少なくとも第1および第2パドロックプローブと接触させ、第1パドロックプローブがcDNA上の隣接した領域と相補的な末端領域を含み、第2パドロックプローブが、第2パドロックプローブの5'または3'終端において第1パドロックプローブの末端領域と単一ヌクレオチドだけ異なる末端領域を含む、請求項1記載の方法。
- 複数の異なるパドロックプローブを用いて、複数の異なるmRNAが検出される、請求項1記載の方法。
- mRNAが単一細胞において検出される、請求項1記載の方法。
- 試料が、身体の組織もしくは器官、または体液に由来する、請求項1記載の方法。
- 試料が、結腸、肺、膵臓、前立腺、皮膚、甲状腺、肝臓、卵巣、子宮内膜、腎臓、脳、精巣、リンパ液、血液、血漿、膀胱、または乳房試料である、請求項1記載の方法。
- 試料が、癌細胞中に見出されるmRNAを含むと疑われる、請求項1記載の方法。
- 1つまたは複数のパドロックプローブが少なくとも40%のGC含量を有する、請求項1記載の方法。
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