CN115198003B - 适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用 - Google Patents
适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115198003B CN115198003B CN202210586945.0A CN202210586945A CN115198003B CN 115198003 B CN115198003 B CN 115198003B CN 202210586945 A CN202210586945 A CN 202210586945A CN 115198003 B CN115198003 B CN 115198003B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- barcode
- sequencing
- probe
- hybridization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 121
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 75
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 23
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 14
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims description 12
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims description 12
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims description 11
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 7
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 6
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract description 22
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 3
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 3
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 3
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000006049 ring expansion reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- 101150019828 42 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006093 RNA methylation Effects 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 2
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012174 single-cell RNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 208000007578 phototoxic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000018 phototoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
- G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
- Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用，该方法通过杂交探针的设计、探针预处理、样品杂交、连接反应、滚环扩增，仅需4轮连接测序即可解读上万种基因的原位空间转录表达谱。依据其探针设计特点又可应用于点突变以及甲基化位点原位检测。可实现单细胞、单分子、单碱基分辨的高通量基因原位解读。该方法的信号解读不依赖超分辨成像平台，推动了高通量原位空间转录组的普及和发展。
Description
本发明是申请号为2020112910056的中国发明专利“适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法及其应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及高通量原位杂交领域，具体涉及一种适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用。
背景技术
细胞学说的提出为科学家们对生命体的结构和功能以及其运转机制的研究奠定了基础。随着研究的深入，人们发现机体中同一组织来源的细胞也会存在基因组、表观基因组以及转录组上的差异；因此基于单细胞水平的研究尤为重要，应运而生的单细胞测序技术实现了在单个细胞水平上面对转录组或基因组进行扩增并测序。继人类基因组计划的浪潮之后人类细胞生物分子图谱计划(Human BioMolecular Atlas Program HuBMAP)和细胞图谱项目蓄势待发。
单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术让我们对细胞群的异质性、发育过程的动力学、疾病的发生发展以及细胞功能的调控机制都有了更深程度的理解。单个细胞是如何协调周围的多个细胞发挥功能仅仅依靠单个细胞的身份信息是远远不够的，需要借助新的方法来展示每个细胞的空间位置关系。运用生物信息学的方法对RNAseq数据中单个细胞的转录组进行聚类分析。由于细胞标记基因的相关位置信息有很大空白，因而此方法存在很大局限。另一方面，模式生物表达图谱以及艾伦脑科学研究所的小鼠和人类大脑图谱的广泛应用印证了空间转录组的前景价值。然而通过传统原位杂交或细胞特异性标签基因绘制的传统的图谱通量较低，无法解析复杂的环路及功能；近年有众多科学家通过原位杂交的方法对细胞的空间转录组进行成像，真实还原了细胞中转录组的表达状态。
目前主流的原位转录组学方法有基于单分子原位杂交的多重抗误差矫正荧光原位杂交技术(multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization,MERFISH)、序贯荧光原位杂交(sequential fluorescence in situ hybridization，seqFISH)、STARmap(Spatially-resolved Transcript Amplicon Readout Mapping。通过对多种不同的转录组进行迭代成像，从而将转录组的空间位置一一还原。由于每个转录本上只标记了32个荧光分子，该类方法的成像需要借助于超分辨荧光显微镜镜，成本高、技术要求高，因此很大程度上的限制了其广泛使用；此外这类方法目前都无法对基因的突变进行检测。
STARmap是一种基于原位测序的方法来展示空间转录组，运用锁式探针对转录本进行原位杂交，在锁式探针上针对不同转录本设计了相应的barcode，然后通过滚环扩增的方式对杂交的信号进行放大，最后通过连接测序的方式对barcode的序列逐轮进行解读，从而高通量的还原具有单细胞分辨率的转录组的空间位置信息。该方法的优势是信号强，可运用普通共聚焦进行成像，缺点是效率较低，易出现非特异性，也无法对基因的突变进行检测，只能检测转录本的有无。
原位转录组学在高精细神经环路解析、个体发育以及疾病发展等各项研究中有所应用，但目前的方法仍然存在下列问题：
1.基于单分子杂交的方法：
1)探针制备繁琐，成本高：针对每个基因需要设计24个以上的探针，虽以引物池的形式合成，但后续每个探针要经过PCR低循环扩增、纯化、转录、反转录、去RNA、再纯化等诸多过程。对于高通量多基因杂交工作量大。解读探针均需要氨基修饰，成本高。
2)组织样本处理要求高：组织透明处理需将盖玻片以及载玻片做硅烷化修饰和多聚赖氨酸等多种功能化处理，再进行组织水凝胶包埋，氨基修饰固定mRNA等多个步骤。技术要求高。
3)操作步骤繁琐，多次杂交，迭代成像：整个信号解读过程需经历多次杂交-成像-信号剥离的循环操作，这不仅对杂交换液系统的稳定性要求高，对保持mRNA在多次杂交和信号剥离的循环中的稳定性仍然是一个巨大的挑战。
4)成像设备要求高：由于单点信号荧光分子的数量有限，给稳定成像带来压力，需要借助高端共聚焦系统或超分辨系统进行成像；对同一组织进行反复多次成像会带来光毒性和光淬灭的风险，使真实信号无法解读。
5)信号解读繁琐：为实现高通量杂交的目的需要经过逐轮杂交，再将各轮信号进行配准叠加，不考虑成像过程相差色差等光学畸变影响，对每轮信号进行校准仍然困难较大，随着杂交轮数的增加，难度增加。
6)无法实现多基因点突变检测：目前基于杂交的方式其信号的特异性依赖于序列互补配对，无法实现对单个碱基的分辨。
2.基于原位测序的方法：
1)探针特异性差：锁式探针的缺口环化不依赖于靶序列mRNA分子，而是另一条与之配套使用的RCA引物探针，造成探针在非靶序列杂交后非特异性信号的放大，产生非特异性。
2)组织样本处理要求高：同上述基于杂交的方法类似，对于较厚组织需进行水凝胶透明处理，载玻片以及盖玻片的功能化处理、组织去除蛋白或脂质后轻微组织形变、以及转录本的保存完整度等均对空间转录组的精准展示形成挑战。
3)单向测序效率低：对于barcode的解读一般采用基于连接的测序方式，每轮测序只能解读一位barcode，每轮需经过杂交-连接-成像-信号剥离4个步骤，对系统稳定性要求高，在对1000个基因进行原位空间转录组展示至少要通过5轮的连接测序，数据配准读取难度大，周期长，效率低。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，本发明将杂交探针特异性杂交多个转录本，通过滚环扩增的方式原位放大每个转录本携带的barcode信息，通过双端连接测序的方式高通量的对barcode信息进行解读，最后通过图像配准与注释来展示转录组的空间信息。该方法仅需4轮连接测序即可解读上万种基因的原位空间转录表达谱，其克服了传统原位空间转录组展示技术探针制备繁琐，成本高；组织样本处理要求高；无法检测点突变；操作复杂；多次杂交，迭代成像，成像设备要求高；信号解读繁琐；探针特异性差；单向测序效率低以及多轮数据配准读取难度大等障碍。
为实现上述目的，本发明所设计一种适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，包括以下步骤：
1)杂交探针的设计
从待检测细胞或组织的RNA序列中筛选出杂交效率高、特异性强、无RNA高级结构的靶序列区域设计杂交探针，其中，所述杂交探针由锁式探针和RCA引发探针组成；
2)探针预处理
对杂交探针中锁式探针的5’端进行磷酸化处理；
3)样品杂交
在待检测样本上制备一个反应腔室，用多聚甲醛对进行固定，然后用甲醇进行脱水和变性处理，再将含有杂交探针的缓冲液加入到反应腔室中过夜孵育；
4)连接反应
将连接酶反应体系加入到反应腔室中进行连接反应，使锁式探针与对应RNA上的靶序列互补配对形成半闭合的环状结构；
5)滚环扩增
RCA引发探针同时与RNA上的靶序列和锁式探针互补，Phi29 DNA聚合酶以RCA引发探针为引物，以锁式探针的环状结构为模板进行滚环扩增，进一步放大信号；
6)
barcode测序(应用连接测序的原理)及数据分析，解读高通量转录组的空间信息：
a.将连接酶反应体系加入反应腔室中进行连接测序反应，然后对锁式探针中barcode的第一位碱基序列进行测序，按待检测样本特征对研究区域进行逐层成像扫描，叠加各层信号进行最大投影，注册解读每个荧光信号信息对应barcode信息；
b.同法依次解读锁式探针中barcode上的碱基序列信息；
c.对上述获得的3轮测序信息进行配准、barcode过滤、细胞分割；然后依次进行单细胞数据分析、基因的表达值进行表达矩阵的标准化和聚类分析，通过归一化和标准化处理对基因集进行降维聚类，根据不同细胞标记物对细胞群进行分类以及更细的亚分群，以确定特殊的细胞群，最终进行表达型的分析。
进一步地，所述步骤1)中，RNA序列的靶序列由3段连续的靶序列A、B和C组成，且所述锁式探针由5’端至3端’为A’序列，loop序列和B’序列，所述A’序列和B’序列分别与靶序列A、靶序列B互补，故所述锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构(依赖于连接酶对杂交探针5’端及3’端与靶序列精准互补配对的碱基进行识别，任意一端存在点突变或RNA甲基化则无法连接闭合成环。根据此特性可应用于点突变原位检测或甲基化位点检测)；所述loop序列分别由anchor序列和barcode序列组成(barcode序列为两个barcode序列的总称，分别为barcode1序列和barcode2序列)。
再进一步地，所述loop序列的组成根据双barcode序列的测序方式不同，分为：
当barcode序列为双端测序时，与之对应的loop序列从5’端向3’端依次包括barcode1序列、mid-anchor序列和barcode2序列
其中，barcode1序列和barcode2序列的长度均为3-9bp，mid-anchor序列长度为15-30bp(其为常用连接测序引物序列)；
当barcode序列为单向双barcode测序，与之对应的loop序列从5’端向3’端依次包括barcode1序列、anchor-1序列、barcode2序列和anchor-2序列。
其中，barcode1序列和barcode2序列的长度均为3-9bp，anchor-1序列和anchor-2序列的长度为10-20bp(它们为常用连接测序引物序列)。
再进一步地，所述barcode序列分别由A、G、C、T排列组合而成。
再进一步地，进行双barcode测序时，对应的loop序列中，barcode1序列和barcode2序列每一位对应的碱基进行组合，其组合数为其中为从4种碱基中选出2个碱基进行组合，“4”为选出的2个碱基为同一种碱基的4种可能，则经过n轮测序后双barcode序列(barcode1序列和barcode2序列)的组合数为10n；
再进一步地，所述RNA序列中，靶序列A、靶序列B和靶序列C长度均为11～16bp。
再进一步地，所述步骤2)中，磷酸化处理过程中，使用的酶为T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)。
再进一步地，所述步骤4)中，连接酶反应体系的连接酶为Splint R连接酶。
本发明的有益效果：
1.特异性强：本发明以锁式探针的形式靶杂交不同的RNA，其信号的扩增取决于两端靶序列的精准互补配对，减少了非特异性扩增的可能，提高系统准确性；
2.通量高：本发明主要通过双端测序，双向解读barcode，每轮产生10种组合信号，即第N轮即可解读10N种不同的RNA，将以往信号解读的4进制升级为10进制；
3.成像条件普适性高：共聚焦成像系统即可实现。本发明主要是通过滚环扩增的方法放大信号，每个信号点约由1000个荧光分子组成，运用共聚焦成像系统即可对拥挤的信号簇进行解析。这将使空间转录组得到更广泛的应用；
4.可以检测基因的单碱基突变：锁式探针两端与靶序列互补配对后形成未闭合的环状结构，依赖于连接酶对开口处5’和3’端精准互补配对的碱基进行识别，两端任意一段存在点突变是无法连接闭合成环。这将使空间转录组得到更广泛的应用，比如用于肿瘤突变检测等等；
5.适用于m6A甲基化原位检测：针对甲基化位点设计锁式探针，连接酶对甲基化RNA敏感，难以识别封闭成环；
6.本发明可实现单细胞、单分子分辨的高通量基因原位解读。
7.本发明通过两套探针直接靶向RNA，无需反转录，减少成本和操作复杂性；以锁式探针的形式靶向杂交不同的基因转录本，其信号的扩增取决于两端靶向序列的精准互补配对，减少非特异性扩增，提高系统的准确率，利用splintR酶，相比目前原位测序技术运用的酶而言，更加高效。
综上所述，本发明通过滚环扩增的方法放大信号，每个信号点约由1000个荧光分子组成，相对基于杂交的方法(每个信号点约有24个以上的荧光分子组成)信号更强，易于信号捕获，无需超分辨成像系统，运用共聚焦成像系统即可对信号簇进行解析，降低了实验成本和操作难度，推动了高通量原位空间转录组的普及和发展。
附图说明
图1为SSIP-Seq操作流程图；
图2为SSIP-Seq探针设计图；
图3为SSIP-Seq双端测序设计图；
图4为SSIP-Seq双端测序成像效果图；
图5为SSIP-Seq单向双barcode测序设计图；
图6为SSIP-Seq单向双barcode测序成像效果图；
图7为SSIP-Seq图形处理流程图；
图8为RNA的m6A甲基化原位检测；
图9为RNA的m6A甲基化原位检测10个视野计数统计图；
图10为c6胶质瘤5种基因的突变型及野生型的空间分布；
图11SSIP-Seq解读下丘脑42个基因3轮杂交示意图。
图12SSIP-Seq解读下丘脑42个基因空间分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
本发明的适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，包括以下步骤：
1)杂交探针的设计
从待检测细胞或组织的RNA序列中筛选出杂交效率高、特异性强、无RNA高级结构的靶序列区域设计杂交探针，其中，所述杂交探针由锁式探针和RCA引发探针组成；
2)探针预处理
对杂交探针中锁式探针的5’端进行磷酸化处理；
3)样品杂交
在待检测样本上制备一个反应腔室，用多聚甲醛对进行固定，然后用甲醇进行脱水和变性处理，再将含有杂交探针的缓冲液加入到反应腔室中过夜孵育；
4)连接反应
将连接酶反应体系加入到反应腔室中进行连接反应，使锁式探针与对应RNA上的靶序列互补配对形成半闭合的环状结构；
5)滚环扩增
RCA引发探针同时与RNA上的靶序列和锁式探针互补，Phi29 DNA聚合酶以RCA引发探针为引物，以锁式探针的环状结构为模板进行滚环扩增，进一步放大信号；
6)barcode测序(应用连接测序的原理)及数据分析，解读高通量转录组的空间信息：
a.将连接酶反应体系加入反应腔室中进行连接测序反应，然后对锁式探针中barcode的第一位碱基序列进行测序，按待检测样本特征对研究区域进行逐层成像扫描，叠加各层信号进行最大投影，注册解读每个荧光信号信息对应barcode信息；
b.同法依次解读锁式探针中barcode上的碱基序列信息；
c.对上述获得的3轮测序信息进行配准、barcode过滤、细胞分割；然后依次进行单细胞数据分析、基因的表达值进行表达矩阵的标准化和聚类分析，通过归一化和标准化处理对基因集进行降维聚类，根据不同细胞标记物对细胞群进行分类以及更细的亚分群，以确定特殊的细胞群，最终进行表达型的分析。
基于上述方法，根据实际情况进行如下检测：
实施例1
利用上述高通量转录组空间位置信息的检测方法原位检测RNA甲基化，
1.杂交探针的设计
根据RNA中含有甲基化位点的靶序列设计杂交探针，该杂交探针中锁式探针的5’端第一个碱基与靶序列的甲基化的碱基互补，
表
2.探针预处理
应用T4多聚核苷酸激酶对锁式探针5’端进行磷酸化处理；
3.样品杂交
①将待检含有甲基化位点和无甲基化位点的RNA靶序列核酸分子分别转染到贴壁培养的293T细胞中，培养3小时；在培养小皿上制备一个反应腔室，PBST(含0.1％吐温20的PBS)快洗2次，去除残留培养基以及其它杂质；
②4％多聚甲醛(PFA)对细胞固定10min，将反应腔室内溶液吸弃，用PBST洗涤3次，每次5min，充分去除多余的PFA；
③加入-20℃预冷的甲醇，立即放入-80℃反应15min，进行组织脱水和变性；将反应腔室从-80℃取出，然后置于室温平衡5分钟，将反应体系吸弃，用PBST洗涤3次，每次5min；
④杂交探针以100nM的终浓度加入到杂交缓冲液中；将杂交反应体系混匀后加入反应腔室中，置于湿盒内，40℃过夜杂交。
5、连接反应
将Splint R连接酶反应体系混匀，加入到反应腔室内，置于25℃，反应2小时；锁式探针与对应RNA上的靶序列互补配对形成半闭合的环状结构；
6.滚环扩增
将phi29DNA聚合酶滚环扩展反应体系混匀，加入到反应腔室内，置于30℃，反应2小时。
7.原位解读空间信息(荧光探针显色)及数据分析
①配制荧光探针杂交体系加入反应腔室中置于25℃，反应3h；
②将腔室内的杂交反应体系吸弃，用PBST洗涤两次，每次5min；然后进行DAPI染色，用PBS配制浓度为0.1ug/ml的DAPI染液，加入到反应腔室中，室温反应2min。
③应用Leica TCS SP8激光共聚焦进行成像，分别设置对应荧光通道，确定组织切片的信号最顶端和最底端，以0.5μm的步径对组织进行逐层扫描，叠加各层图像获得最大投影的整体信号图；如图9所示，采集多个视野进行信号统计，甲基化位点与未甲基化的位点的存在统计学差异。
因此，此方法可运用于甲基化敏感性检查。
实施例2
利用上述高通量转录组空间位置信息的检测方法检测大鼠胶质瘤组织切片中5种基因的突变型及其野生型，包括以下步骤：
1.杂交探针的设计
选择C6胶质瘤细胞相关基因的突变位点设计杂交探针，锁式探针的5’端第一个碱基与靶序列突变的碱基互补，另外设计与之对应的野生型的探针，分别配给不同的barcode，探针序列如下：
| M-Nptxr-PLP-1 | GGTGAGTCCCAGGCCTTATGCGTCTATTTGTTTATAGTGGAGCCTCACGAGCAGCGCC |
| Nptxr-RCA-2 | GCGTTCTCCAGCTGAGGCTCCACTA |
| Nptxr-PLP-1 | GGTGAGTCCCAGGCCTTTTGCGTCTATTTGTTTCTAGTGGAGCCTCACGAGCAGCGCG |
| M-Tuba1a-PLP-1 | GTGCACTGGTCAGCCTTATGCGTCTATTTGTTTTTAGTGGAGCCTGCCCTGGAGACCG |
| Tuba1a-RCA-2 | TGGAAAACCAAGATAGGCTCCACTA |
| Tuba1a-PLP-1 | GTGCACTGGTCAGCCTTTTGCGTCTATTTGTTTGTAGTGGAGCCTGCCCTGGAGACCC |
| M-Eno1-PLP-1 | TCGGAGGCAGCCACCTTATGCGTCTATTTGTTTCTAGTGGAGCCTAGCCCTGTAGAAT |
| Eno1-RCA-2 | AGGTCATACTTGCGAGGCTCCACTA |
| Eno1-PLP-1 | TCGGAGGCAGCCACCTTCTGCGTCTATTTGTTTCTAGTGGAGCCTAGCCCTGTAGAAC |
| M-Tnc-PLP-1 | ACCATGGATGGGGCCTTATGCGTCTATTTGTTTGTAGTGGAGCCTCCCATCCACGGTA |
| Tnc-RCA-2 | GTCTCAGTATCCGAAGGCTCCACTA |
| Tnc-PLP-1 | ACCATGGATGGGGCCTTCTGCGTCTATTTGTTTGTAGTGGAGCCTCCCATCCACGGTC |
| M-Spp1-PLP-1 | AGCCTCATCGGACCCTTTTGCGTCTATTTGTTTTTAGTGGAGCCTGGATGACCTTGAG |
| Spp1-RCA-2 | ACGCTGGGCAACTCAGGCTCCACTA |
| Spp1-PLP-1 | AGCCTCATCGGACCCTTGTGCGTCTATTTGTTTGTAGTGGAGCCTGGATGACCTTGAT |
2.探针预处理
应用T4多聚核苷酸激酶对锁式探针5’端进行磷酸化处理；
3.样品杂交
①将组织进行冰冻切片每张脑片厚度10μm，做好识别标记；PBST快洗2次，去除残留组织周围的OCT以及其它杂质。
②4％多聚甲醛(PFA)对脑组织固定10min，将反应腔室内溶液吸弃，用PBST洗涤3次，每次5min，充分去除多余的PFA。
③加入-20℃预冷的甲醇，立即放入-80℃反应15min，进行组织脱水和变性处理；将反应腔室从-80℃取出，然后置于室温平衡5min，将反应体系吸弃，用PBST洗涤3次，每次5min。
④杂交探针以100nM的终浓度加入到杂交缓冲液中；将杂交反应体系混匀后加入反应腔室中，置于湿盒内，40℃过夜杂交。
4.连接反应
将连接酶反应体系混匀，加入到反应腔室内，置于25℃，反应2小时；
5.滚环扩增
将phi29DNA聚合酶滚环扩展反应体系混匀，加入到反应腔室内，置于30℃，反应2小时。
6.barcode测序(应用连接测序的原理)及数据分析解读高通量空间信息：
①配制测序反应体系入反应腔室中置于25℃，反应3h。
②将腔室内的杂交反应体系吸弃，用PBST洗涤两次，每次5min。然后进行DAPI染色，用PBS配制浓度为0.1ug/ml的DAPI染液，加入到反应腔室中，室温反应2min。
③应用Leica TCS SP8激光共聚焦进行成像，分别设置对应荧光通道，确定组织切片的信号最顶端和最底端，以0.5μm的步径对组织进行逐层扫描，叠加各层图像获得最大投影的整体信号图。
如图10所示，解读对应基因barcode，实现野生型及突变型转录本可视化，观察到大量突变型基因在肿瘤细胞中大量富集。
实施例3
利用上述高通量转录组空间位置信息的检测方法检测下丘脑区42个基因原位空间转录组，包括以下步骤：
1.杂交探针的设计
所选基因包含特异性细胞的标志物以及其功能相关基因，针对这些RNA的靶序列设计对应的锁式探针及RCA探针，探针序列如下：
2.探针预处理
应用T4 PNK对锁式探针进行磷酸化处理。
3.样品杂交
①将组织进行冰冻切片每张脑片厚度10μm，做好相关标记；PBST快洗2次，去除残留组织周围的OCT以及其它杂质。
②4％多聚甲醛(PFA)对脑组织固定10min，将反应腔室内溶液吸弃，用PBST洗涤3次，每次5min，充分去除多余的PFA。
③加入-20℃预冷的甲醇，立即放入-80℃反应15min，进行组织脱水和变性处理；将反应腔室从-80℃取出，然后置于室温平衡5分钟，将反应体系吸弃，用PBST洗涤3次，每次5min。
④将杂交探针以100nM的终浓度加入到杂交缓冲液中；将杂交反应体系混匀后加入反应腔室中，置于湿盒内，40℃过夜杂交。
4.连接反应
将连接酶反应体系混匀，加入到反应腔室内，置于25℃，反应2小时。
5.滚环扩增
将phi29DNA聚合酶滚环扩展反应体系混匀，加入到反应腔室内，置于30℃，反应2小时。
6.barcode测序(应用连接测序的原理)及数据分析，解读高通量空间信息：
①第一位barcode测序
a、配制测序反应体系加入反应腔室中置于25℃，反应3h。
b、将腔室内的杂交反应体系吸弃，用PBST洗涤两次，每次5min；然后进行DAPI染色，用PBS配制浓度为0.1ug/ml的DAPI染液，加入到反应腔室中，室温反应2min；加入成像缓冲液，进行第一轮成像。
c、应用Leica TCS SP8激光共聚焦进行成像，分别设置对应荧光通道，确定组织切片的信号最顶端和最底端，以0.5μm的步径对组织进行逐层扫描，叠加各层图像获得最大投影的整体信号图。
②第二位barcode测序
60％甲酰胺洗涤缓冲液置于室温洗涤两次，20分钟每次，将第一轮信号剥离，用第二轮测序引物anchor-2按照第一轮barcode测序中的反应体系及步骤进行第二位barcode的解读；第二轮成像必须保持与第一次成像时相同的位置以及参数，进行第二轮图像采集。
③第三位barcode测序
60％甲酰胺洗涤缓冲液置于室温洗涤两次，20分钟每次，将第二轮信号剥离，用第三轮测序引物anchor-3按照上一轮barcode测序中的反应体系及步骤进行第三位barcode的解读，同样成像位置与相关参数保持不变；进行第三轮图像采集。
④数据分析
如图11所示，对3轮图片进行配准，barcode校准，确定每个基团的空间位置分布，然后进行细胞分割；最后进行单细胞数据分析；还原组织精细的分子构筑。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (7)
1.一种适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，该方法用于非诊断目的检测，其特征在于：包括以下步骤：
1)杂交探针的设计
从待检测细胞或组织的RNA序列中筛选出杂交效率高、特异性强、无RNA高级结构的靶序列区域设计杂交探针，其中，所述杂交探针由锁式探针和RCA引发探针组成；其中，RNA序列的靶序列由3段连续的靶序列A、B和C组成，且所述锁式探针由5’端至3端’为A’序列，loop序列和B’序列，所述A’序列和B’序列分别与靶序列A、靶序列B互补，故所述锁式探针与靶序列互补配对后形成半闭合的环状结构；所述loop序列分别由anchor序列和barcode序列组成；所述loop序列的组成根据双barcode序列的测序方式不同，分为：
当barcode序列为双端测序时，与之对应的loop序列从5’端向3’端依次包括barcode1序列、mid-anchor序列和barcode2序列
其中，barcode1序列和barcode2序列的长度均为3-9bp，mid-anchor序列长度为15-30bp；
当barcode序列为单向双barcode测序，与之对应的loop序列从5’端向3’端依次包括barcode1序列、anchor-1序列、barcode2序列和anchor-2序列；
其中，barcode1序列和barcode2序列的长度均为3-9bp，anchor-1序列和anchor-2序列的长度为10-20bp；
2)探针预处理
对杂交探针中锁式探针的5’端进行磷酸化处理；
3)样品杂交
在待检测样本上制备一个反应腔室，用多聚甲醛对进行固定，然后用甲醇进行脱水和变性处理，再将含有杂交探针的缓冲液加入到反应腔室中过夜孵育；
4)连接反应
将连接酶反应体系加入到反应腔室中进行连接反应，使锁式探针与对应RNA上的靶序列互补配对形成半闭合的环状结构；
5)滚环扩增
RCA引发探针同时与RNA上的靶序列和锁式探针互补，Phi29DNA聚合酶以RCA引发探针为引物，以锁式探针的环状结构为模板进行滚环扩增，进一步放大信号；
6)barcode测序及数据分析，解读高通量转录组的空间信息：
a.将连接酶反应体系加入反应腔室中进行连接测序反应，然后对锁式探针中barcode的第一位碱基序列进行测序，按待检测样本特征对研究区域进行逐层成像扫描，叠加各层信号进行最大投影，注册解读每个荧光信号信息对应barcode信息；
b.同法依次解读锁式探针中barcode上的碱基序列信息；
c.对上述获得的3轮测序信息进行配准、barcode过滤、细胞分割；然后依次进行单细胞数据分析、基因的表达值进行表达矩阵的标准化和聚类分析，通过归一化和标准化处理对基因集进行降维聚类，根据不同细胞标记物对细胞群进行分类以及更细的亚分群，以确定特殊的细胞群，最终进行表达型的分析。
2.根据权利要求1所述适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述barcode序列分别由A、G、C、T随机排列组合而成。
3.根据权利要求2所述适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，其特征在于：进行双barcode测序时，对应的loop序列中，barcode1序列和barcode2序列每一位对应的碱基进行组合，其组合数为其中为从4种碱基中选出2个碱基进行组合，“4”为选出的2个碱基为同一种碱基的4种可能，则经过n轮测序后双barcode的组合数为10n。
4.根据权利要求1所述适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述RNA序列中，靶序列A、靶序列B和靶序列C长度均为11～16bp。
5.根据权利要求1所述适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述步骤2)中，磷酸化处理过程中，使用的酶为T4多聚核苷酸激酶T4 PNK。
6.权利要求1所述适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法，其特征在于：所述步骤4)中，连接酶反应体系的连接酶为Splint R连接酶。
7.一种权利要求1所述的方法在点突变检测和甲基化位点检测中的应用，其中，所述应用适用于非诊断目的。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210586945.0A CN115198003B (zh) | 2020-11-18 | 2020-11-18 | 适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011291005.6A CN112592962B (zh) | 2020-11-18 | 2020-11-18 | 适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法及其应用 |
| CN202210586945.0A CN115198003B (zh) | 2020-11-18 | 2020-11-18 | 适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011291005.6A Division CN112592962B (zh) | 2020-11-18 | 2020-11-18 | 适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115198003A CN115198003A (zh) | 2022-10-18 |
| CN115198003B true CN115198003B (zh) | 2023-07-25 |
Family
ID=75183200
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011291005.6A Active CN112592962B (zh) | 2020-11-18 | 2020-11-18 | 适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法及其应用 |
| CN202210586945.0A Active CN115198003B (zh) | 2020-11-18 | 2020-11-18 | 适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011291005.6A Active CN112592962B (zh) | 2020-11-18 | 2020-11-18 | 适用于高通量转录组空间位置信息的检测方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN112592962B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114171112A (zh) * | 2021-11-02 | 2022-03-11 | 华东师范大学 | 一种利用分子杂交技术进行基于蛋白结构的药物设计方法 |
| CN114480582B (zh) * | 2022-02-07 | 2024-04-12 | 华中农业大学 | 运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用 |
| CN114574579B (zh) * | 2022-02-12 | 2024-04-19 | 北京工业大学 | 一种基于原位滚环扩增的脑胶质瘤基因突变的可视化分型方法 |
| CN115083521B (zh) * | 2022-07-22 | 2022-11-11 | 角井(北京)生物技术有限公司 | 一种单细胞转录组测序数据中肿瘤细胞类群的鉴定方法及系统 |
| WO2024138636A1 (zh) * | 2022-12-30 | 2024-07-04 | 深圳华大生命科学研究院 | 细胞图像配准方法、系统、电子设备及存储介质 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018112806A1 (zh) * | 2016-12-21 | 2018-06-28 | 深圳华大智造科技有限公司 | 将线性测序文库转换为环状测序文库的方法 |
| CN109797201A (zh) * | 2019-03-12 | 2019-05-24 | 华侨大学 | 一种原位多重核酸检测方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8551708B2 (en) * | 2011-02-15 | 2013-10-08 | Leica Biosystems Newcastle Ltd. | Methods for localized in situ detection of mRNA |
| CN103266168A (zh) * | 2013-05-08 | 2013-08-28 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 检测乙型肝炎病毒耐药基因的rca方法 |
-
2020
- 2020-11-18 CN CN202011291005.6A patent/CN112592962B/zh active Active
- 2020-11-18 CN CN202210586945.0A patent/CN115198003B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018112806A1 (zh) * | 2016-12-21 | 2018-06-28 | 深圳华大智造科技有限公司 | 将线性测序文库转换为环状测序文库的方法 |
| CN109797201A (zh) * | 2019-03-12 | 2019-05-24 | 华侨大学 | 一种原位多重核酸检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states;Xiao Wang等;Science;第361卷;1-22 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112592962A (zh) | 2021-04-02 |
| CN115198003A (zh) | 2022-10-18 |
| CN112592962B (zh) | 2022-11-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN115198003B (zh) | 适用于barcode测序的转录组空间位置信息的检测方法及其应用 | |
| AU2017200433B2 (en) | Multivariate diagnostic assays and methods for using same | |
| RU2733545C2 (ru) | Пространственное картирование молекулярных профилей образцов биологических тканей | |
| JP7327826B2 (ja) | 核酸の検知 | |
| US9330295B2 (en) | Spatial sequencing/gene expression camera | |
| CN102369294B (zh) | 非小细胞肺癌标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片 | |
| EP3968023A1 (en) | Assays for single molecule detection and use thereof | |
| US20070148690A1 (en) | Analysis of gene expression profiles using sequential hybridization | |
| CN108779487A (zh) | 用于检测甲基化状态的核酸和方法 | |
| WO2017028760A1 (zh) | 一种单分子测序方法、装置、系统及应用 | |
| US8535914B2 (en) | Probe, probe set and information acquisition method using the same | |
| CN105899680A (zh) | 核酸探针和检测基因组片段的方法 | |
| CN106536735A (zh) | 分析dna样品的探针集合和使用所述探针集合的方法 | |
| CN105505755A (zh) | 空间转录组建库测序方法及所用装置 | |
| US20240052396A1 (en) | Selective protection of nucleic acids | |
| CA2826384C (en) | A method for detecting chromosome structure and gene expression simultaneously in single cells | |
| CN102918164B (zh) | 区分乳腺癌与良性乳腺疾病的方法和试剂盒 | |
| CN114480582B (zh) | 运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用 | |
| CN111020710A (zh) | 造血及淋巴组织肿瘤的ctDNA高通量检测 | |
| Cai | Spatial mapping of single cells in human cerebral cortex using DARTFISH: A highly multiplexed method for in situ quantification of targeted RNA transcripts | |
| CN112430656A (zh) | 癫痫相关基因面板的捕获探针 | |
| WO2024031068A1 (en) | Systems and methods for immunofluorescence quantification | |
| CN109825592A (zh) | 一种与乳腺癌发生发展相关的生物标志物的用途 | |
| Bouquin | Comparison of snv genotyping sensitivity of next-generation sequencing with illumina's miseq and quantitative real-time pcr with fluidigm's biomark hd | |
| CN109609652A (zh) | 一种用于肝癌诊断的生物标志物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20230706 Address after: 529100 minke Park entrepreneurial Service Center building, Xinhui Economic Development Zone, Jiangmen City, Guangdong Province Applicant after: Kunyu Biotechnology (Jiangmen) Co.,Ltd. Address before: 430070 No. 1 Lion Rock street, Hongshan District, Hubei, Wuhan Applicant before: HUAZHONG AGRICULTURAL University Applicant before: Kunyu Biotechnology (Jiangmen) Co.,Ltd. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |