CN112430656A - 癫痫相关基因面板的捕获探针 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种癫痫疾病相关基因Panel的捕获探针组，包括针对癫痫相关的214个目标基因的探针序列，其中每个目标基因设置有至少3个对应的探针序列。本发明提供的上述基因面板(panel)的检测探针，可实现癫痫遗传致病基因的目标区域有效捕获，结合二代高通量测序实现目标基因的高通量、高深度测序检测，覆盖全面，降低成本，提高准确度。

Description

癫痫相关基因面板的捕获探针
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种癫痫疾病相关基因面板(Panel)的捕获探针，通过联合二代测序试剂盒，针对目标基因区域进行捕获，最终实现目标基因的高深度、高通量测序。
背景技术
癫痫是神经系统常见的反复发作的慢性疾病，是大脑神经元异常同步放电所引起的暂时性脑功能障碍综合征。全世界有超过7000万人患有癫痫，中国约有900万的癫痫患者，其中500～600万是活动性癫痫患者，我国每年新增癫痫患者40万-60万人，其中有近30％的患者药物控制不佳或者遗留功能障碍，对个人及家庭造成了沉重的负担同时给社会带来了极大的危害和影响。癫痫可发生于各个年龄人群，以儿童患者和老年患者比较常见。癫痫的发病机制复杂，当前癫痫的检查主要依据临床表现、脑电图和头颅影像检查。癫痫发作时可以导致大脑神经元的离子通道、神经递质及受体功能异常，从而发生放电。EEG能够记录下这种异常电活动，是癫痫患者的管理以及识别亚临床发作和非惊厥持续状态的重要检查方法，但是脑电图不能排除癫痫发作，在多达50％的癫痫患者中可以看到正常的脑电图。脑成像对于首次癫痫发作的患者极为重要，常用于评估严重情况并确定癫痫发作的可能原因，脑成像对于患有慢性癫痫且原因不明的患者意义有限。然而在局灶性癫痫患者中有30％到60％的磁共振成像(MRI)正常。因此，常规检查对于癫痫患者及高风险的个体具有局限性，需要开发新的检查手段或技术用于指导癫痫疾病的筛查、预防及治疗。
对于癫痫易感基因的过往研究，已鉴定许多与之相关的致病基因。目前市场上，SNP(单核苷酸多态性)分型及遗传致病基因突变检测技术主要有三种：荧光定量PCR法、基因芯片法、测序法。(1)荧光定量PCR法：荧光定量PCR采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点设计特异性的探针，具有灵敏度高、准确性高和特异性高等优势。但荧光定量PCR通量低，若要同时检测多个个SNP位点，需要分管检测，操作复杂，样品用量大，难以适应临床需求。此外，荧光定量PCR难以设置内参质控，无法避免假阳性和假阴性。(2)基因芯片法：基因芯片是通过微加工技术，将数以万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。芯片的种类较多，由于缺乏统一的质量控制标准因此也限制了基因芯片技术的普及。(3)测序法：Sanger测序法是SNP分型金标准，不仅能检测已知SNP，也能发现未知SNP。但Sanger测序法检测通量低，对于结构复杂的突变区域检测准确度较低。当测序位点较多时需要逐个位点测序，耗时长，累计价格相对昂贵。
二代测序技术的出现缩短了基因检测的时间，降低了基因检查的费用，使基因检测在临床得到普遍应用。基于二代测序技术，开发一种高通量、低成本、高准确率、高深度的多基因捕获、并遗传检测的手段，成为可能。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种针对癫痫的人遗传致病性基因panel捕获探针，利用特异性生物素标记的探针的基因panel，可以捕获多个目标基因的外显子区域，结合二代测序的建库、测序试剂盒，实现目标基因的捕获测序，并通过生物信息学分析出相应的致病性遗传突变位点。利用该基因panel捕获探针体系、联合二代测序获得基因的遗传突变信息，明确受检者的基因突变的携带情况、发病因素，为患者的治疗、疾病预防以及癫痫疾病的预后控制提供指导，以期实现癫痫致病基因在癫痫风险、疑似人群的筛查、防控或精准治疗的应用，具有重要的现实意义与社会价值。
本发明实施例是这样实现的，一种癫痫疾病相关基因Panel的捕获探针组，包括针对以下全部目标基因的探针序列：
Figure BDA0002821990670000021
其中每个目标基因设置有至少3个对应的探针序列。
具体地，其中MT-CYB、MT-ND4、MT-ND5三个基因为非编码基因。
进一步地，每一个所述探针序列5’端标记生物素，及相应的链霉亲和素捕获磁珠。
进一步地，所述探针对于目标基因的编码区域序列覆盖度不低于97.98％，探针序列的数量为至少6813个。
本发明实施例还提供一种一次性捕获上述全部214个目标基因的方法，利用上述的探针组来进行基因目标区域的捕获，捕获之后进行二代基因高通量、高深度测序操作。
本发明提供的上述基因面板(panel)的捕获探针，可实现癫痫遗传致病基因的目标区域有效捕获，结合二代高通量测序检测，降低成本，覆盖全面、提高准确度。本发明的方法基于目标区域磁珠法捕获系统，以及联合全外显子二代测序技术，获得针对癫痫致病基因全外显子序列信息，通过本发明基因面板对癫痫遗传基因的致病性突变位点进行高效捕获、并准确测序检测。通过发现基因突变及基因缺陷，可协助癫痫患者指导临床治疗、协助高风险患者进行遗传咨询、风险评估，以及提供个性化治疗，有助于癫痫疾病的预防及控制。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过自主调研和分析设计，整合总共214个癫痫疾病密切相关的目标基因，包括部分癫痫密切相关线粒体基因，进行特异性捕获探针设计，总共设计6813个探针，覆盖目标基因97.98％以上的区域。
2、本发明设计多个癫痫遗传致病性基因的捕获探针，可以同时对较大通量的目标基因进行准确捕获，通过对目标基因外显子区域DNA进行高效富集，然后在二代测序平台上进行高通量、高深度测序，有效提高基因的测序深度和覆盖度，提高测序准确率。其中二代测序所涉及的DNA加接头、建库、测序等，其相关试剂盒及操作流程为本领域技术人员所熟知的。
3、本发明通过二代高通量测序及生物信息学分析，利用开发的上述探针对癫痫致病性基因进行捕获、测序并检测致病性突变位点，明确受检者的基因突变的携带情况、发病因素。其生物信息学分析流程及软件为本领域所熟知，如BWA、ANNOVAR、GATK软件等。本发明涉及的数据分析会依据疾病特征、临床表现，设定特定的数据过滤参数及分析条件，如基因组数据库突变过滤频率0.01％等，因此，本发明说明书中不提供明确的、单一的固定参数与分析条件。
4、本发明为患者的遗传检查、治疗以及癫痫疾病的预后控制提供高通量、高准确率的目标基因测序方法，助力明确致病因素，以期实现癫痫致病基因的检测在癫痫风险人群筛查或精准治疗中的应用，降低发病率。
附图说明
图1是本发明实施例中利用本发明的基因Panel捕获、并测序分析出基因突变位点后，通过金标准Sanger测序验证突变位点的结果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
二代测序技术的出现缩短了基因检测的时间，降低了基因检查的费用，使基因检测在临床得到普遍应用。基于二代测序技术，本申请的发明人研究并开发了一种癫痫多基因panel捕获探针，联合二代测序试剂盒，用于癫痫疾病相关致病基因的检测和筛查，实现高通量、高深度的多基因检测。同时，使用个性化的生物信息学数据分析方法，对基因突变位点进行深入分析、过滤及解读，明确疾病的主要遗传致病因素，有望用于疑似癫痫个体的遗传检查，并为疾病的个性化治疗、遗传咨询、风险评估提供依据。
本发明实施例提供一种用于癫痫的基因panel的捕获探针，相关基因信息如上所述(214个基因)，这些基因组成上述基因面板，每个基因设置至少3个探针，且探针对于目标基因的编码区域覆盖度不低于97.98％。上述链霉亲和素磁珠以及生物素标记探针的合成为本领域技术人员所熟知的。上述214个基因均为本发明的基因panel所必不可少的。
基因panel是一个多基因组合的目标区域捕获系统，在基因检测中可检测基因的所有遗传突变，比常规PCR技术检测通量更大，获得的基因信息量更多、更完整。本设计整合了癫痫疾病发生和功能相关的关键基因，用基因panel进行基因检测时，核心点在于如何选择基因组合中与疾病风险评估、疾病分型及治疗相关的基因，并评估基因信息、突变位点与各临床表型、诊疗因素等相关性。
本发明提供的基因panel通过自主调研、研发和分析设计，整合总共214个癫痫疾病密切相关的目标基因，包括部分癫痫密切相关的线粒体相关基因，进行捕获探针设计：总共设计6813个探针，覆盖目标基因97.98％以上的区域。生物素的标记位于探针序列的5端。
本发明的探针设计基于人类数据库H.sapiens(Feb.2009GRCh37/hg19)，探针信息如下表1所示，本表格仅提供11个探针序列作为示例。本发明包含的所有其他探针的具体信息，可见表2所示的探针的染色体坐标信息。通过表2的染色体坐标信息，检索Hg19数据库，即可获得具体探针序列信息(其检索方法为本领域人员熟知)：
表1基因面板(Panel)中生物素标记基因探针序列(部分序列)
Figure BDA0002821990670000041
Figure BDA0002821990670000051
表2全部6813个探针对应在染色体位置的详细信息
Figure BDA0002821990670000052
Figure BDA0002821990670000061
Figure BDA0002821990670000071
Figure BDA0002821990670000081
Figure BDA0002821990670000091
Figure BDA0002821990670000101
Figure BDA0002821990670000111
Figure BDA0002821990670000121
Figure BDA0002821990670000131
Figure BDA0002821990670000141
Figure BDA0002821990670000151
Figure BDA0002821990670000161
Figure BDA0002821990670000171
Figure BDA0002821990670000181
Figure BDA0002821990670000191
Figure BDA0002821990670000201
Figure BDA0002821990670000211
Figure BDA0002821990670000221
Figure BDA0002821990670000231
Figure BDA0002821990670000241
Figure BDA0002821990670000251
Figure BDA0002821990670000261
Figure BDA0002821990670000271
Figure BDA0002821990670000281
Figure BDA0002821990670000291
Figure BDA0002821990670000301
Figure BDA0002821990670000311
Figure BDA0002821990670000321
Figure BDA0002821990670000331
Figure BDA0002821990670000341
Figure BDA0002821990670000351
Figure BDA0002821990670000361
Figure BDA0002821990670000371
Figure BDA0002821990670000381
Figure BDA0002821990670000391
Figure BDA0002821990670000401
Figure BDA0002821990670000411
Figure BDA0002821990670000421
Figure BDA0002821990670000431
Figure BDA0002821990670000441
Figure BDA0002821990670000451
Figure BDA0002821990670000461
Figure BDA0002821990670000471
Figure BDA0002821990670000481
Figure BDA0002821990670000491
Figure BDA0002821990670000501
Figure BDA0002821990670000511
Figure BDA0002821990670000521
具体的，发明人利用以上214个基因panel进行目标基因的区域捕获，并通过二代测序实现基因高深度、高通量测序，具体步骤如下：
一、基因组DNA样品提取、制备
使用QIAamp DNA blood mini kit(QIAGEN,Cat:Y5-51106)对受试者静脉血进行DNA的提取和纯化，具体步骤参考生产商提供的标准DNA提取、纯化流程。DNA提取纯化之后检测浓度，纯度检测通过吸光度来实现，OD260/280＝1.8～2.0。
使用Covaris破碎仪将gDNA打断，并进行定量，制备成长度为150-200bp的片段gDNA文库。
二、二代测序实验DNA末端修复、加接头，文库扩增、产物纯化等基本流程。
利用上述步骤制备的DNA，进行基因片段的末端修复、加接头、文库扩增等。此流程为本领域技术人员所熟知的。(以上步骤一、二采用的是本领域公知的方法)
三、目标基因探针的合成及制备
设计合成探针序列(依据表1及表2序列信息)，并标记生物素；制备链霉亲和素磁珠，制备基因Panel液相捕获探针系统。探针合成及制备交由核酸合成公司进行合成即可，为本领域技术人员所熟知的。
四、杂交和捕获；
杂交和捕获实验：采用本发明的基因panel捕获探针，所选取的配套试剂(缓冲液、酶等)和耗材由对应供应商提供，各常规实验试剂用品(缓冲液、酶等)的选择和操作为本领域技术人员所熟知的。操作均按实验流程及说明书调整适宜方案进行使用。
4.1将DNA样品杂交到探针，制备捕获文库：
将文库扩增、纯化后所得DNA产物用于后续探针杂交反应。杂交反应需要样品约750ng DNA。
4.1.1调整DNA浓度至221ng/μL，取3.4μL的gDNA文库样品(750ng)转移到96孔板，密封后放置在冰上保存。
4.1.2提前将捕获探针的杂交缓冲液复温(升温)。如果出现沉淀，将杂交缓冲液在65℃中复温5分钟至沉淀消失。杂交缓冲液使用前在室温下放置。
4.1.3制备封闭液，制备好的溶液使用前在冰上放置。
4.1.4将步骤4.1.1中准备好的gDNA文库样品96孔板取出，每孔加入封闭混合液，混匀。
4.1.5然后将96孔板密封后转移到热循环器，在热循环器中95℃孵育5分钟，然后在65℃中保温5分钟以上。
4.1.6根据捕获文库的大小准备适当稀释的RNase封闭液。为保证反应充分，在制备过程中，准备过量的RNase封闭液。RNase封闭液使用前放置在冰上保存。
4.1.7根据表3制备捕获文库混合液，室温下保存备用。
表3探针捕获文库混合液制备
Figure BDA0002821990670000531
4.1.8将制得的捕获文库杂交混合液加入步骤4.1.6中的96孔板中，每孔加入25μL。吹打混匀，密封96孔板，65℃孵育16至24小时。
表4 PCR反应程序
Figure BDA0002821990670000532
Figure BDA0002821990670000541
4.2.杂交产物链霉亲和素磁珠的捕获、纯化
准备链霉亲和素包被磁珠：
4.2.1在65℃的循环水浴中预热Wash Buffer 2。
4.2.2涡旋充分混匀链霉亲和素磁珠。之后将重悬浮珠加入到新的PCR板中，每孔加入50μL样品。
4.2.3清洗磁珠：加入200μl Binding Buffer，涡旋5s，瞬时离心，之后放置于磁力架上至澄清，弃上清。总共清洗3遍。
4.2.4用200μL的Binding Buffer重悬磁珠。
4.3用链霉亲和素包被磁珠捕获杂交DNA
4.3.1将步骤4.1.8制得的杂交混合物(约25至29μL)转移到步骤4.2.4中制备的含有200μl链霉亲和素磁珠的PCR板中，保持在65℃，缓慢混匀。密封PCR板后，在96孔板混合器上室温孵育(1400-1800rpm)30分钟，确保样品充分混合。
4.3.2瞬时离心后，将板放入磁力架上至溶液澄清，取出并弃上清液。
4.3.3加入200μLWash Buffer 1重悬磁珠，漩涡10s，室温静置15min，放磁力架上至澄清，弃上清。
4.3.4用65℃预热的200μL的Wash Buffer 2重悬磁珠，漩涡5s，65℃下静置孵育10min，置于磁力架上至澄清，弃上清。总共洗涤3次。
4.3.5每个样品孔中加入30μL无核酸酶水重悬磁珠，保留磁珠，置于冰上备用。
五、将上述步骤获得的捕获DNA文库进行样品Post-PCR及纯化；
六、文库DNA上机，进行二代测序；
七、数据分析与处理；经过数据比对、生物信息学序列分析，个性化数据过滤和解读；最终确定目标基因中是否具有致病性的SNP位点，包括风险位点、与药物治疗剂量相关位点等；其生物信息学分析流程及软件为本领域所熟知，本发明涉及的数据分析会依据疾病特征、临床表现，设定特定的数据过滤参数及分析条件，一个实施例中，基因组数据库突变过滤频率为0.01％。
八、Sanger测序验证Panel检测结果的准确性：选取通过基因panel捕获后测序检出的阳性位点，作为本发明Panel检测癫痫疾病遗传信息的有效结果，并设计对应的Sanger测序引物组合验证位点的可靠性。具体步骤为本领域技术人员所熟知。
注：以上步骤五-八为本领域技术人员熟知的操作方法。
应用实施例
利用本发明上述实施例提供的基因panel捕获探针对目标基因进行捕获，并通过二代测序检测出的致病位点信息，设计引物，验证本发明的检测结果的准确性。
下表5为本发明一个实施例中利用基因panel捕获并检测出的致病位点信息：
表5疾病相关部分遗传致病位点信息
Figure BDA0002821990670000551
为验证本发明实施方案中基因panel捕获并检测出的致病位点的准确性，利用下表6中的Sanger测序引物，选择两个突变位点进行验证：
表6 Sanger测序引物序列
引物名称 F R
GABRD CCAGAACAGTGCTGCATCC CCTCACCTCCGATGCCA
PCDH19 TGGATCGCTGGCGTTGA GAGACGCAGTCGCACTACA
利用表6的引物对受试者的DNA进行扩增，并进行测序验证。基因扩增及基因序列测序操作为本领域技术人员熟知。根据测序结果分析、验证确认Panel对目标区域的捕获测序结果的准确性。
表5和图1显示了利用本发明的基因panel探针组，对某患者基因检测和测序后，检测到的遗传突变位点结果，图1为通过Sanger测序确认PCDH19、GABRD基因突变型位点外显子组测序的验证结果，结果表明本发明的基因Panel检测方法结果准确并且可靠。也就是说，图1的结果验证的表1检测的突变位点是准确的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市人民医院
<120> 癫痫相关基因面板的捕获探针
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccagggtct agcggattgc aaagggcctg gtagaatcaa agagggatat actaatgcaa 60
cttcgaggta ggagcaaggc ttggggaaaa tgctgtggca aattctcagt aatatggaac 120
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagccaaag tggggtggga gcgcgaagat ggcagctgct gaggaggagc cgaagcccaa 60
aaagctgaag gtggaggcgc cgcaagcgct gaggtgagcg ctgccggact tggggaggag 120
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatgagctgc cgcgcgttgt ccagagccca gcccagccct accgcgcgcg gcccggagct 60
ctgttccctg gaactttggg cactgcctct gggacccctg ccggccagca ggcaggatgg 120
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtcatggac caccaggacc cctactccgt gcaggccaca gcggccatag cggcggccat 60
caccttcctc attctcttta ccatcttcgg caacgctctg gtcatcctgg ctgtgttgac 120
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcttccctg gtccagtcca ccctggcggg gtcgcagggt tgggatggcg gctggaggcg 60
atcatggttc gcccgacagc taccgctcac ctcttgcctc ccgctatgcc agcccggaga 120
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagcgcact cggtgccccg cgcagggtcg cgatgctgcc cggtttggca ctgctcctgc 60
tggccgcctg gacggctcgg gcgctggagg tgggtgccgc gcctcggaag gcggggggag 120
<210> 7
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcagacggg gcggtggcgg ggtcgtgccc agtgggaggg gtcgggtctg cccaatgggt 60
tctcccgggc ggggggcggg gctctatttc agcagctctc agggccttgg gctcatcccg 120
<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagctgcggt ttctcttcag gtcggaatgg atcttgaagg ggaccgcaat ggaggagcaa 60
agaagaagaa cttttttaaa ctgaacaata aaaggtaact agcttgtttc attttcatag 120
<210> 9
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcctgtttcc tgtcgccgtc gttgcccggg ccatggcgac ctgcatttgg ctgcggagct 60
gtggggcccg gcgcctcggg tcgacgtttc caggctgccg cctccgcccc cgcgccggc 119
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgtctgcaga aagataaaaa ctctccagat gtcttccagt aatgtcgaag tttttatccc 60
agtgtcacaa ggaaacacca atggcttccc cgcgacagct tccaatgacc tgaaggcatt 120
<210> 11
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgcgccagct acggggcctc agagaagccg gacttcgcaa gcaccatgca gtggataagg 60
ggcggatcgg gaatggtgag tgcatgtaac cttggcttcc cttgcttgag cctctcagtc 120
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccagaacagt gctgcatcc 19
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctcacctcc gatgcca 17
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tggatcgctg gcgttga 17
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagacgcagt cgcactaca 19

Claims (7)

1.一种癫痫疾病相关基因面板的捕获探针组，其特征在于：包括针对以下全部目标基因的探针序列：
Figure FDA0002821990660000011
其中，每个目标基因至少具有3个对应的探针序列。
2.根据权利要求1所述的捕获探针组，其特征在于，所述目标基因中MT-CYB、MT-ND4和MT-ND5三个基因为非编码基因。
3.根据权利要求1所述的捕获探针组，其特征在于：所述探针序列的5’端标记生物素及相应的链霉亲和素捕获磁珠。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的捕获探针组，其特征在于：所述探针对于目标基因的编码区域捕获的覆盖度不低于97.98％。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的捕获探针组，其特征在于：所述探针序列的数量为至少6813个。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的捕获探针组，其特征在于：所述的目标基因对应的探针序列在染色体上的坐标位置如表2所示。
7.一种一次性捕获以下全部目标基因的方法：
Figure FDA0002821990660000021
其特征在于，利用根据权利要求1-6中任一项所述的探针组来进行基因目标区域的捕获，捕获之后进行二代基因测序实现目标基因的高深度、高通量测序。
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