CN112442527B - 孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法及应用 - Google Patents

孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112442527B
CN112442527B CN201910797314.1A CN201910797314A CN112442527B CN 112442527 B CN112442527 B CN 112442527B CN 201910797314 A CN201910797314 A CN 201910797314A CN 112442527 B CN112442527 B CN 112442527B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
asd
hla
mutation
autism
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910797314.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112442527A (zh
Inventor
王明帮
王艳
何福生
周家秀
周文浩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Imunobio Technology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Imunobio Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Imunobio Technology Co ltd filed Critical Shenzhen Imunobio Technology Co ltd
Priority to CN201910797314.1A priority Critical patent/CN112442527B/zh
Publication of CN112442527A publication Critical patent/CN112442527A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112442527B publication Critical patent/CN112442527B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明实施例提供了一种孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法以及HLA‑B基因的错义突变p.A93G、HLA‑DQB1基因的错义突变p.S229N以及LILRB2基因的错义突变p.R322H以及剪接突变c.956‑4C>T在孤独症基因诊断产品中的应用。相对于现有的全外显子/全基因组检测，其所需要的检测成本和数据处理难度都有了大幅度的下降，可以很好的应用于ASD的临床遗传学评估，对于ASD的防控具有一定的临床价值。

Description

孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及ASD诊断技术领域，特别是涉及一种孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法及应用。
背景技术
孤独症谱系障碍(ASD，Autism Spectrum Disorders)是一组影响终生的神经系统发育障碍。其影响着超过1％的学龄期儿童，给普通家庭和整个社会造成了严重的经济和社会负担。
早期的证据表明免疫系统的失调与ASD相关，孕期感染/孕期免疫激活(maternalimmune activation,MIA)是ASD的一个环境风险因子。另有文献显示MIA小鼠后代常表现出ASD样行为，是目前比较成功的ASD小鼠模型，Choi等研究发现MIA诱导的ASD样行为依赖于Th17细胞和母体IL-17a，通过阻断IL-17a可改善MIA小鼠后代的行为异常；越来越多的证据表明ASD患者存在血清细胞因子异常，Tsilioni等发现血清IL-6和TNF可以定义ASD亚组，其从天然类黄酮木犀草素的治疗中获益最多，Al-Ayadhi等对45名6-12岁自闭症儿童进行的横断面研究显示，IL-17A与自闭症严重程度呈正相关，近50％的自闭症儿童血清IL-17A水平升高，其中67.9％为重度儿童，17％为轻度至中度ASD儿童。
目前为止，对于ASD尚缺乏有效的实验室诊断方法。考虑到ASD有很强的遗传背景，可以尝试使用ASD临床遗传学评估的方法。
但是，ASD有很高的遗传异质性，单个变异对ASD的解释度极小，所以在进行ASD临床遗传学评估时候，需要采用染色体芯片结合全外显子组/全基因组测序方法来实现。这样的方式成本较高，数据量极大对于数据解读有相当的难度，对于ASD患者的临床遗传学评估的开展和推广造成了许多限制。
因此，迫切需要提供方便快捷，成本低廉的基因检测技术，用以辅助进行ASD的诊断。
发明内容
本发明实施例提供一种孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法及应用，旨在解决现有ASD诊断方法所存在的一种或者多种问题。
第一方面，本发明实施例提供了HLA-B基因的错义突变p.A93G、HLA-DQB1基因的错义突变p.S229N以及LILRB2基因的错义突变p.R322H以及剪接突变c.956-4C>T在孤独症基因诊断产品中的应用。
第二方面，本发明实施例提供了一种孤独症诊断试剂盒。所述试剂盒包括：用于检测待测样品中的HLA-B基因、HLA-DQB1基因以及LILRB2基因的若干种试剂。
可选地，所述试剂包括：用于对所述HLA-B基因、HLA-DQB1基因以及LILRB2基因的一个或者多个突变位点进行特异性扩增的PCR引物。
可选地，所述HLA-B基因的突变位点为错义突变p.A93G；所述HLA-DQB1基因的突变位点为错义突变p.S229N；所述LILRB2基因的突变位点为错义突变p.R322H以及剪接突变c.956-4C>T。
第三方面，本发明实施例提供了一种用于孤独症诊断的基因芯片。所述基因芯片包括用于检测HLA-B基因、HLA-DQB1基因以及LILRB2基因中的一个或者多个突变位点的基因探针。
可选地，所述基因探针包括用于检测所述HLA-B基因的错义突变p.A93G，用于检测所述HLA-DQB1基因的错义突变p.S229N以及用于检测LILRB2基因的错义突变p.R322H和剪接突变c.956-4C>T的探针。
第四方面，本发明实施例提供了一种基因靶点筛选方法。该基因靶点筛选方法通过靶向捕获芯片进行目标区域测序；所述靶向捕获芯片用于捕获若干个免疫应答分子基因。
可选地，所述目标区域测序的平均覆盖深度大于1000X，10倍覆盖率大于99％。
可选地，所述目标区域的大小为500K。
可选地，所述靶向捕获芯片用于捕获404个免疫应答分子基因。
本发明实施例中提供了HLA-B基因、HLA-DQB1基因以及LILRB2基因上的多个突变位点作为孤独症检测的新靶标，可以应用于孤独症患者及高危人群的ASD检测，为孤独症的防控提供一定的临床价值。
相对于现有的全外显子/全基因组检测，其所需要的检测成本和数据处理难度都有了大幅度的下降，可以很好的应用于ASD的临床遗传学评估。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。
图1为本发明实施例提供的突变位点的统计分析结果的示意图。
序列表编号如下：
SEQ ID 1：GATCGGAAGAGCACACGTCT
SEQ ID 2：AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有说明，否则本说明书中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。
本发明实施例中揭露的数值及其数值范围是近似值，而并非确定值。在误差或者实验条件允许的情况下，可以包括在误差范围内的所有值。本发明实施例中提供的数值范围用于表示在混合物中的组分的相对量以及其他方法实施例中列举的温度或者其他参数的范围。
在本发明实施例中，令人惊喜的发现HLA-B基因的错义突变p.A93G、HLA-DQB1基因的错义突变p.S229N以及LILRB2基因的错义突变p.R322H以及剪接突变c.956-4C>T这四个突变位点可以应用于ASD的遗传学评估。在ASD诊断过程中，可以以上述的四个突变位点作为检测靶点，提供有价值的筛查诊断结论。
以下结合具体实例，详细描述上述ASD检测靶点的筛选和发现过程：
1)征集研究对象进入患者组和对照组：
患者组为来自深圳市儿童医院心理科ASD患儿。患者组的纳入标准为：①根据《美国精神障碍诊断与统计手册第5版》，诊断为ASD“需要非常多支持”的患儿；②年龄<14岁；③性别不限。
患者组的排除标准为：①患有其他精神疾病(如强迫症，多动症等)；②患有其他神经发育障碍疾病；③患有遗传代谢性疾病；④患有严重神经疾病以及颅脑损伤史等重大躯体疾病史；⑤近2周内有急性躯体疾病及使用过抗生素。
作为对照组的典型发育(TD)儿童来自深圳市儿童医院儿保科幼儿园入学体检儿童。其纳入标准为：①无精神疾病，身体健康；②与患者组年龄及性别匹配。排除标准同患者组。
所有进入患者组和对照组的儿童家长对本研究知情并签署知情同意书，本研究经深圳市儿童医院伦理委员会批准。
2)DNA提取和质检：
抽取3-5毫升全血，并储存在-80℃作为样品。使用PureLinkTM基因组DNA 小量提取试剂盒(Thermo Fisher，Foster City，CA)从全血样品中提取DNA，对基因组DNA样品进行质控，利用NanoDrop ND2000(Thermo Fisher,USA)进行定量检测浓度及纯度。
其中，DNA质检合格的标准是：DNA总量在1μg以上，纯度A260/280比值在1.8-2.0范围内，琼脂糖凝胶电泳电泳结果显示DNA主带清晰可见且片段大小在23K左右，用以判断基因组的完整性。
3)小片段库建库：
取1μg的DNA样本，利用Bioruptor打断仪(Diagenode,Belgium)，设置参数为：ON30秒，OFF 30秒，共30cycles，将DNA打断成150bp-250bp大小(取对照样品电泳检测条带来判断)。
然后，对打断后形成的基因组DNA小片段，进行末端补平(Enzymatics Inc,USA)。末端补平的具体操作方式为：使用ABI 2720型PCR仪(Thermo Fisher,USA)，加热模块设置20℃，时间30min,4℃保温，然后利用MagPure A3 XP beads(Magen,China)进行磁珠纯化。
5’端磷酸基团修复，和3’端加A(Enzymatics Inc,USA)，具体为ABI 2720型PCR仪(Thermo Fisher,USA)，加热模块设置37℃，时间30min,4℃hold，然后利用MagPure A3 XPbeads(Magen,China)进行磁珠纯化。
最后，将适合Illumina Hiseq测序仪(Illumina，San Diego，CA，USA)的合成好的Pare End Adapters接头(Thermo Fisher,USA)进行连接，具体为ABI 2720型PCR仪(ThermoFisher,USA)，加热模块设置20℃，时间20min,4℃hold，然后利用MagPure A3 XP beads(Magen,China)进行磁珠纯化。
对纯化后的连接产物，利用ABI 2720PCR仪(Thermo Fisher,USA)进行PCR预扩增(KAPA Biosystems,USA)，并引入能区分单个样本的合成好的Index序列(Thermo Fisher,USA)，以得到小片段测序文库。其中，该PCR预扩增的参数是：95℃4mins，98℃20s，65℃30s，5个循环，72℃30s，72℃5min，12℃保温。
取1微升小片段文库进行Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher,USA)进行定量，并对捕获文库进行浓度检测。当浓度大于3ng/μl时，表明文库合格。
4)目标区域捕获：
本实施例中，针对404个免疫应答基因的目标区域捕获参照TargetSeqTM液相芯片捕获测序试剂盒(iGeneTech,Beijing，China)进行。
首先，在杂交捕获前，需将小片段库与Hyb block混合，对基因组中的重复序列进行封闭，避免基因组中重复序列自我形成杂交体。
然后，将Hyb Buffer(iGeneTech,Beijing，China)置于室温融化，混匀后置于65℃水浴锅内预热，待溶液完全溶解后(无沉淀及浑浊物)，每个样品取20μl Hyb Buffer(iGeneTech,Beijing，China)置于PCR管内，继续置于65℃水浴锅内孵育。
另外，在杂交前，准备5μl RNase block(Thermo Fisher,USA)，与单链RNA探针混合以防止探针降解。
液相杂交捕获的原理是利用单链DNA片段与单链RNA探针在序列上的互补配对的原则，将单链RNA探针对应的目标DNA形成DNA-RNA杂交体，以实现目标区域的杂交捕获。
在本实施例中，杂交捕获在ABI 2720PCR仪(Thermo Fisher,USA)上进行。盖上管盖并盖好PCR仪热盖，65℃孵育过夜(8-16h)。杂交完成后，由于探针上带有的生物素标记，可通过抗生物素标记的磁珠，即Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads(Thermo Fisher，美国)，将DNA-RNA杂交体结合到磁珠上。
在杂交过程中，由于磁珠-DNA-RNA复合物存在众多非特异性结合。因此，可以通过洗涤液(iGeneTech,Beijing，China)对非特异性结合的磁珠-DNA-RNA复合物进行洗涤，去除非特异性结合的DNA。
最后，对杂交捕获得到的目标区域，在ABI 2720PCR仪(Thermo Fisher,USA)上进行PCR富集，对应的PCR参数设置为：95℃4mins，98℃20s，65℃30s，16个循环，72℃30s，72℃min，12℃保温。
PCR扩增试剂来自KAPA Biosystems,USA；Nextflex primer合成于Invitrogen,China。扩增后及为的目标区域捕获文库，利用Qubit dsDNA HS Assay Kit对文库进行质检，合格文库的标准是大于3ng/μl。
5)高通量测序：对构建好的测序文库，进行HiSeq X-ten测序仪(Illumina，SanDiego，CA，USA)PE150上机测序。
6)生物信息分析：
利用Trimmomatic软件(可参见Bolger,A.M.,M.Lohse,and B.Usadel,Trimmomatic:a flexible trimmer for Illumina sequence data.Bioinformatics,2014.30(15):p.2114-20)过滤原始数据接头序列和低质量序列。
其中，接头序列如SEQ ID 1和SEQ ID 2所示。过滤低质量序列是指过滤碱基质量值小于20(即正确率大于99％)的碱基以后，进一步去除碱基长度小于40bp的序列。
用fastqc软件(http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/)对过滤后的数据进行质量评估，使得测序质量值大于30的碱基在95％以上的干净数据(Clean Reads)。
对得到的干净数据，利用BWA-MEM软件(可参见Li,H.,Toward betterunderstanding of artifacts in variant calling from high-coveragesamples.Bioinformatics,2014.30(20):p.2843-51)比对到人类参考基因组(Feb.2009，hg19,GRCh37，download from UCSC)上，生成比对的BAM文件。
在比对完成后利用samtools(可参见Li,H.,et al.,The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.Bioinformatics,2009.25(16):p.2078-9)和picard软件(http://broadinstitute.github.io/picard/)将PCR重复序列去除，提高最终结果的准确性。
然后利用GATK(Genome Analysis Toolkit)(可参见McKenna,A.,et al.,TheGenome Analysis Toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generationDNA sequencing data.Genome Res,2010.20(9):p.1297-303)从比对的结果中进行SNP和InDel等变异检测。
最后对检测到的变异出来的结果用ANNOVAR软件(可参见Wang,K.,M.Li,andH.Hakonarson,ANNOVAR:functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.Nucleic Acids Res,2010.38(16):p.e164)进行注释，并进行测序深度和覆盖度评估。
7)统计分析：
首先计算出各组中，携带稀有突变位点(包括杂合或者纯合突变，参考gnomAD数据库http://gnomad.broadinstitute.org，该数据库整理了各种大规模的外显子和全基因组测序数，其中exome数据集有123136个样本，包括8624个东亚人EAS，EAS次等位基因频率小于0.1，为较稀有的突变)。
然后利用Fischer检测，计算各组的P值。在发现和验证阶段均显著(P值小于0.05，fisher检验)，同时合并两个阶段的数据后，FDR校正后也显著(fdr值小于0.05，fisher检验)。基因水平相关性检测中，采用合并所有样本的数据，通过SKAT-O方法计算，在P值小于0.001被定义为差异显著。
8)Sanger测序验证：
对统计分析后得到的4个稀有突变进行Sanger测序验证。
9)研究结论：
本实施例中，包括发现和验证两个阶段。在发现阶段，征集了孤独症谱系障碍(ASD)患者37例，同时纳入55例正常人为健康对照(control)组，利用在先设计的可捕获404个免疫应答分子的panel进行超高深度的测序(目标区域大小为～500K，平均覆盖深度>1000X，10x coverage rate(％)>99％)，检测出7526个点突变，其中的285个点突变在ASD和对照组差异显著(P值小于0.05，fisher检验)。
在验证阶段，征集了孤独症谱系障碍(ASD)患者35例，同时纳入52例正常人为健康对照(control)组，统计分析发现有231个点突变在ASD和对照组差异显著(P值小于0.05，fisher检验)。
综合发现和验证阶段的结果，存在61个与ASD相关的点突变，其中4个为功能性的稀有突变(即外显子区错义突变，剪接突变等)得到了Sanger验证。另外，基因水平分析的结果表明HLA-B，LILRB2的基因P值达到了小于1x10-5的水平。
这四个功能性的稀有突变具体包括：LILRB2基因的错义突变p.R322H(rs1128646)和剪接突变c.956-4C>T(rs11666104)，HLA-DQB1基因的错义突变p.S229N(rs1130429)和HLA-B基因的错义突变p.A93G(rs41546313)，具体的统计分析结果如图1所示。
在图1中，“or”为odd rate。亦即危险因子，数值越高表明患病危险程度越高。“fdr”和“SKAT-O Gene-Level P value”分别为q值和p值，用于判断数据是否具有统计学意义。“risk allele carriers”为风险等位基因携带者，ASD是患者组，HC是正常发育的对照组。
在本发明实施例中，系统地对免疫应答分子基因，包括HLA区域基因和细胞因子及受体基因在孤独症儿童里面的突变情况进行评估，最终的研究结果表明：
1.1、来自HLA Class I的HLA-B基因的错义突变p.A93G是ASD风险因素。
1.2、HLA Class II的HLA-DQB1基因的错义突变p.S229N在ASD比例为(14/72＝19.44％)，显著高于对照组(4/107＝3.73％)。
HLA-DQB1是儿童乳糜泻(celiac disease)的易感基因[19]，celiac disease是一种免疫性肠病，主要表现是对麸质不耐受，症状与ASD普遍存在的肠道功能紊乱有相似之处。干预乳糜泻的方法，即无麸质/无酪蛋白(GFCF，Gluten-Free/Casein-Free)饮食在ASD中使用较广泛，20-29％的父母报告ASD表型有显著改善，上述发现可能为ASD患者无麸质/无酪蛋白(GFCF)饮食干预提供了理论支持。
1.3、LILRB2基因，HLA Class I分子的抑制性受体基因的两个紧密连锁的错义突变p.R322H和c.956-4C>T在ASD比例均为20.83％(15/72)，而这两个突变在对照组较稀少(2/107＝1.87％)。
已有的研究结果表明：LILRB2基因编码神经元细胞表面受体，可作为β-淀粉样蛋白(β-Amyloid)的受体参与Alzheimer’s disease的发生，抑制β-淀粉样蛋白(β-Amyloid)与LilrB2的结合已经成为一种治疗阿兹海默病的潜在途径。
1.4、上述的4个免疫应答因子的基因突变存在于44.44％(32/72)的ASD患者中，可作为ASD临床遗传学评估的新靶标，提示孤独症儿童免疫功能异常可能有一定的遗传基础，后续可以开发新ASD临床遗传学评估工具
通过本发明实施例的发现和验证，从而筛选确定了4个与ASD密切相关的基因突变位点(在44.44％的孤独症患者中存在这些基因突变)。在实际应用过程中，可以采用任何合适的方式对上述的4个易感基因的突变位点进行检测，从而起到辅助诊断ASD的作用，为孤独症的防控提供一定的价值。
在一些实施例中，可以采用检测试剂盒的形式对HLA-B基因、HLA-DQB1基因以及LILRB2基因中的一个或者多个突变位点进行检测。该孤独症检测试剂盒内包括了基因检测过程中需要使用到的所有试剂。具体使用的试剂根据所使用的基因检测原理所确定。
具体的，该孤独症检测试剂盒可以是基于PCR特异性扩增原理所实现的检测试剂盒。在试剂盒中包含了进行PCR反应所需要的一系列试剂，例如用于特异性扩增上述作为检测靶点的HLA-B基因、HLA-DQB1基因以及LILRB2基因的3对特异性引物。
在另一些实施例中，还可以采用基因检测芯片的形式对HLA-B基因、HLA-DQB1基因以及LILRB2基因中的一个或者多个突变位点进行检测。基因芯片是集成有多种探针，通过探针的与目标检测序列之间的互匹配和荧光发光强度等方式实现突变位点检测的产品。
具体的，该基因检测芯片或基因芯片上可以至少集成有用于检测所述HLA-B基因的错义突变p.A93G，所述HLA-DQB1基因的错义突变p.S229N，所述LILRB2基因的错义突变p.R322H和剪接突变c.956-4C>T这四个突变位点的探针。
当然，该基因检测芯片还可以根据实际情况的需要，集成有用于检测其他突变位点的探针，而不限于以上的4个突变位点。
本发明实施例通过对HLA-B基因、HLA-DQB1基因以及LILRB2基因中的一个或者多个突变位点的检测，来辅助完成ASD的诊断或者初期筛查，为临床治疗提供相应的帮助。
应当说明的是，基于本发明实施例公开的突变位点的编号以及基因名称，可以在NCBI或者UCSC等现有的基因数据库中查询搜索获得对应的基因序列信息。该检索方法为本领域技术人员所熟知，已经满足充分公开的要求。
序列表
<120> 孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法及应用
<141> 2019-08-23
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gatcggaaga gcacacgtct 20
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgt 33

Claims (1)

1.分型检测基因突变组合的试剂在制备孤独症诊断产品中的应用；所述基因突变组合为：
HLA-B基因的错义突变p.A93G，其rs号为：rs41546313；
HLA-DQB1基因的错义突变p.S229N，其rs号为：rs1130429；
LILRB2基因的错义突变p.R322H，其rs号为：rs1128646；
以及LILRB2基因的剪接突变c.956-4C>T，其rs号为：rs11666104。
CN201910797314.1A 2019-08-27 2019-08-27 孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法及应用 Active CN112442527B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910797314.1A CN112442527B (zh) 2019-08-27 2019-08-27 孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910797314.1A CN112442527B (zh) 2019-08-27 2019-08-27 孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112442527A CN112442527A (zh) 2021-03-05
CN112442527B true CN112442527B (zh) 2022-11-11

Family

ID=74740948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910797314.1A Active CN112442527B (zh) 2019-08-27 2019-08-27 孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112442527B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106011224A (zh) * 2015-12-24 2016-10-12 晶能生物技术（上海）有限公司 神经系统遗传性疾病基因联合筛查方法、试剂盒及其制备方法
WO2018187518A1 (en) * 2017-04-07 2018-10-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-ilt4 antibodies and antigen-binding fragments

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1224322A2 (en) * 1999-02-22 2002-07-24 Variagenics, Inc. Gene sequence variations with utility in determining the treatment of disease
US8173369B2 (en) * 2008-05-15 2012-05-08 The Regents Of The University Of California Peripheral gene expression biomarkers for autism
WO2010056982A2 (en) * 2008-11-17 2010-05-20 The George Washington University Compositions and methods for identifying autism spectrum disorders
US20130123124A1 (en) * 2010-03-12 2013-05-16 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for characterizing autism spectrum disorder based on gene expression patterns
CA2744424A1 (en) * 2010-09-14 2012-03-14 The Hospital For Sick Children Biomarkers for autism spectrum disorders
WO2013134315A1 (en) * 2012-03-05 2013-09-12 Berg Pharma Llc Compositions and methods for diagnosis and treatment of pervasive developmental disorder
GB201212334D0 (en) * 2012-07-11 2012-08-22 Warwick The Therapeutic targets for alzheimers disease
CN107167610B (zh) * 2017-05-04 2019-12-06 深圳市英马诺生物科技有限公司 自闭症生物标志物及其检测试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106011224A (zh) * 2015-12-24 2016-10-12 晶能生物技术（上海）有限公司 神经系统遗传性疾病基因联合筛查方法、试剂盒及其制备方法
WO2018187518A1 (en) * 2017-04-07 2018-10-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-ilt4 antibodies and antigen-binding fragments

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G蛋白偶联受体37的基因突变与自闭症发病机制相关性的研究;俞志凌等;《山西医药杂志》;20140125;第43卷(第2期);第139-142页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112442527A (zh) 2021-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109797212B (zh) 一种检测肺动脉高压的致病/易感基因的方法
Kantarci et al. Characterization of the chromosome 1q41q42. 12 region, and the candidate gene DISP1, in patients with CDH
Mitsunaga et al. Exome sequencing identifies novel rheumatoid arthritis-susceptible variants in the BTNL2
US20210024999A1 (en) Method of identifying risk for autism
CN112226440B (zh) 一种遗传性原发不孕的致病突变及其检测试剂
CN112442527B (zh) 孤独症诊断试剂盒、基因芯片、基因靶点筛选方法及应用
CN105838720B (zh) Ptprq基因突变体及其应用
WO2017221040A2 (en) Genetic diagnostics of intellectual disability disorder, autism spectrum disorder and epilepsy
CN112002417B (zh) 一种多基因分子诊断模型、其构建方法及应用
CN109097465B (zh) Clip3基因的snp位点的应用
CN106868128B (zh) 一组辅助诊断乳腺癌的生物标记物及其应用
CN107385076B (zh) 一种甲状腺功能减退致病基因突变及基于此基因突变的诊断试剂
KR101167945B1 (ko) Ａｔｇ16ｌ1 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법
CN110205322B (zh) 一种乳腺癌致病基因sec63的突变snp位点及其应用
Kim et al. Usefulness of direct sequencing of pooled DNA for SNP identification and allele-frequency determination compatible with a common disease/common variant hypothesis
CN109097464B (zh) Cfap43基因的snp位点的应用
CN107312864B (zh) 一种用于ppd辅助诊断的wisp3基因突变及其应用
KR101167940B1 (ko) Ｆｍｎ2 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법
Oishi et al. Targeted exome sequencing in Japanese patients with retinitis pigmentosa
CN115806998A (zh) 肺动脉高压变异基因notch3及其应用
KR101075392B1 (ko) Ｆｇａ 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 이를 이용한 검출 방법
KR101167942B1 (ko) Ａｌｇ12 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법
CN114317713A (zh) 一种阿尔兹海默症的基因诊断试剂盒及其应用
CN112430656A (zh) 癫痫相关基因面板的捕获探针
KR101167934B1 (ko) Ｔｉｃａｍ1 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant