CN109439741A - 检测特发性癫痫病基因探针组合物、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供检测特发性癫痫病基因探针组合物、试剂盒及应用。检测特发性癫痫病基因探针组合物,其不同之处在于,所述基因探针组合物包括SCN2A基因探针、SCN1A基因探针、KCNQ2基因探针、CHRNA4基因探针、GABRA1基因探针、GABRD基因探针、LGI1基因探针、CLCN2基因探针及CACNA1H基因探针。本发明提供的检测试剂盒以探针杂交捕获为基础,具有高通量和同时检测多个基因外显子上的高频突变位点的优点,改变传统单基因格昂贵,耗时长,操作繁琐等劣势。实现“单个小样本多基因的检测”,满足小样本最检测价大化使用、获得最大信息量的临床实践需求。
Description
技术领域
本发明涉及基因测试领域,具体涉及检测特发性癫痫病基因探针组合物、试剂盒及应用。
背景技术
癫痫是最常见的神经系统疾病之一,分为特发性癫痫和继发性癫痫。研究表明,癫痫虽未归到遗传性疾病范畴,但遗传倾向明显。母亲患癫痫,其子代患癫痫的危险性为正常人群的2~4倍。遗传因素是导致癫痫、特别是经典的特发性癫痫的重要原因。分子遗传学研究发现,大部分遗传性特发性癫痫的分子机制为离子通道及相关分子的结构或功能改变。育龄癫痫患者受孕孕前常规检测比较简单,无法检测出后代是否具有遗传性的癫痫及其风险。目前临床上主要通过患者的临床表现、实验室检测对疾病进行诊断,这些方法无法明确疾病的发病机制、疾病的分型,尤其是癫痫中的特发性癫痫。
近年来,对于癫痫的发病基础研究取得了显著的成果,尤其是针对其分子生物学的研究,涉及其癫痫病的病变基因多种多样,较常规的PCR方法不能直观的得到具体的突变序列,而一代测序的方法受到测序通量的影响,无法一次性检测多个基因的全部外显子区域,而二代测序作为一种高通量的检测方法,可以一次性准确测量多个基因的外显子以及相关序列,使精准诊断遗传性特发性癫痫病成为可能,但到目前为止,还未出现针对特发性癫痫病高通量检测的试剂盒。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供检测特发性癫痫病基因探针组合物、试剂盒及应用。
具体技术方案如下:
检测特发性癫痫病基因探针组合物,其不同之处在于,所述基因探针组合物包括SCN2A基因探针、SCN1A基因探针、KCNQ2基因探针、CHRNA4基因探针、GABRA1基因探针、GABRD基因探针、LGI1基因探针、CLCN2基因探针及CACNA1H基因探针。
上述技术方案中,所述SCN2A基因探针包括SCN2A G56A位点测试探针;所述SCN1A基因探针包括SCN1A G3199A位点测试探针、SCN1A C5006A位点探针及SCN1A A1212G位点测试探针;所述KCNQ2基因测试探针包括KCNQ2 C912T位点探针;所述CHRNA4基因探针包括CHRNA4 T699C位点测试探针、CHRNA4 G1209T位点测试探针、CHRNA4 T678C位点测试探针、CHRNA4 C851T位点测试探针及CHRNA4 C189T位点测试探针;所述GABRA1基因探针包括GABRA1 T156C位点测试探针;所述GABRD基因探针包括GABRD C816T位点测试探针;所述LGI1基因探针包括LGI1 T513C位点测试探针;所述CLCN2基因探针包括CLCN2 T774C位点测试探针;所述CACNA1H基因探针包括CACNA1H C1919T位点测试探针、CACNA1H T3957C位点测试探针、CACNA1H G6212A位点测试探针、CACNA1H T4338C位点测试探针、CACNA1H C5712T位点测试探针及CACNA1H T5929C位点测试探针。
上述技术方案中,所述SCN2A G56A位点测试探针序列如SEQ ID NO.1所示;所述SCN1A G3199A位点测试探针序列如SEQ ID NO.2所示;所述SCN1A C5006A位点测试探针序列如SEQ ID NO.3所示;所述SCN1A A1212G位点测试探针序列如SEQ ID NO.4所示;所述KCNQ2 C912T位点测试探针序列如SEQ ID NO.5所示;所述CHRNA4 T699C位点测试探针序列如SEQ ID NO.6所示;所述CHRNA4 G1209T位点测试探针序列如SEQ ID NO.7所示;所述CHRNA4 T678C位点测试探针序列如SEQ ID NO.8所示;所述CHRNA4 C851T位点测试探针序列如SEQ ID NO.9所示;所述CHRNA4 C189T位点测试探针序列如SEQ ID NO.10所示;所述GABRA1 T156C位点测试探针序列如SEQ ID NO.11所示;所述GABRD C816T位点测试探针序列如SEQ ID NO.12所示;所述LGI1 T513C位点测试探针序列如SEQ ID NO.13所示;所述CLCN2 T774C位点测试探针序列如SEQ ID NO.14所示;所述CACNA1H C1919T位点测试探针序列如SEQ ID NO.15所示;所述CACNA1H T3957C位点测试探针序列如SEQ ID NO.16所示;所述CACNA1H G6212A位点测试探针序列如SEQ ID NO.17所示;所述CACNA1H T4338C位点测试探针序列如SEQ ID NO.18所示;所述CACNA1H C5712T位点测试探针序列如SEQ ID NO.19所示;所述CACNA1H T5929C位点测试探针如SEQ ID NO.20所示。
含权利要求上述探针组合物的试剂盒。
上述试剂盒在制备特发性癫痫病相关基因的高通量文库中的应用。
一种制备特发性癫痫病相关基因的高通量文库的方法,其不同之处在于,利用上述试剂盒抽提测试样品,将测试样品中基因组DNA进行提取后进行片段化得到具有粘性末端的DNA片段,将具有粘性末端的DNA片段进行扩增,扩增后进行接头;将接头后的DNA片段利用权力要求4所述试剂盒进行杂交捕获,获得目的片段;将目的片段纯化后再PCR扩增,分离纯化,得到与特发性癫痫病相关基因的高通量文库。
上述技术方案中,其不同之处在于,具体包括以下步骤:
步骤(1)利用上述试剂盒抽提血液,提取基因组DNA;
步骤(2)用Ion Xpress plus Fragment Library kit将DNA片段化;
步骤(3)用Agencourt AMPure XP beads纯化并选择出片段化DNA;
步骤(4)制备好的片段化的DNA文库采用琼脂糖或Agilent 2100 Bioanalyzer检测DNA文库的片段化质量;
步骤(5)用Sureselect Target Enrichment Kit Ion Box#2和Herculase IIFusion DNAPolymerase将加接头片段化DNA进行短循环扩增;
步骤(6)用Agencourt AMPure XP beads纯化扩增后的加接头片段化DNA;
步骤(7)用QIAxcel对纯化后的加接头片段化DNA进行质控,得到DNA文库;
步骤(8)将步骤(7)所述DNA文库利用权利要求4所述测试盒进行杂交捕获,用Sureselect Target Enrichment Kit Ion Box#1纯化捕获的特发性癫痫基因文库;
步骤(9)用Sureselect Target Enrichment Kit Ion Box#2和Herculase IIFusion DNA Polymerase将步骤(8)所述特发性癫痫基因文库进行短循环扩增;
步骤(10)用Agencourt AMPure XP beads将步骤(9)所述扩增后的特发性癫痫基因文库进行纯化;
步骤(11)用QIAxcel对所述步骤(10)纯化后的特发性癫痫基因文库进行质控;
步骤(12)用无核酸酶的水将质控后的特发性癫痫基因文库进行稀释、富集,然后用One Touch 2系统进行扩增,最后用One Touch ES系统纯化富集,得到特发性癫痫病相关基因的高通量文库。
上述技术方案中,所述步骤(1)中,提取基因组DNA其浓度在10ng/μl以上;所述步骤(3)中,选择出的DNA片段在100bp~150bp之间;所述步骤(8)中,所述DNA文库利用上述所述测试盒进行杂交捕获的时间为16小时~24小时;所述步骤(12)中,将质控后的特发性癫痫基因文库稀释到12pmol/μl,取100μl进行富集。
一种特发性癫痫病相关基因的高通量文库,其不同之处在于,所述高通量文库是利用上述测试盒进行制备的。
上述高通量文库在Ion Proton二代测序平台中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于,(1)本发明提供的检测试剂盒收集了当下特发性癫痫基因高频突变位点,检测基因更精准,能准确发现患者的遗传信息,检测结果还将为优化个体化诊疗分子分型,筛查技术方案以及靶向治疗耐药的后续治疗和研究提供依据;(2)本发明提供自主研发的检测试剂盒,在价格上存在优势,降低了患者的临床检测费用,可转化研究应用于临床,产生经济效益和优化临床资源配置;(3)本发明提供的检测试剂盒以探针杂交捕获为基础,具有高通量和同时检测多个基因外显子上的高频突变位点的优点,改变传统单基因检测价格昂贵,耗时长,操作繁琐等劣势。实现“单个小样本多基因的检测”,满足小样本最大化使用、获得最大信息量的临床实践需求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案进行详细说明。
实施例一
试剂盒的制备
1、确定特发性癫痫基因的热点突变位点,筛选出于特发性癫痫的候选基因位点,确定纳入试剂盒。
检测特发性癫痫病基因探针组合物,其不同之处在于,所述基因探针组合物包括SCN2A基因探针、SCN1A基因探针、KCNQ2基因探针、CHRNA4基因探针、GABRA1基因探针、GABRD基因探针、LGI1基因探针、CLCN2基因探针及CACNA1H基因探针。
上述技术方案中,所述SCN2A基因探针包括SCN2A G56A位点测试探针;所述SCN1A基因探针包括SCN1A G3199A位点测试探针、SCN1A C5006A位点探针及SCN1A A1212G位点测试探针;所述KCNQ2基因测试探针包括KCNQ2 C912T位点探针;所述CHRNA4基因探针包括CHRNA4 T699C位点测试探针、CHRNA4 G1209T位点测试探针、CHRNA4 T678C位点测试探针、CHRNA4 C851T位点测试探针及CHRNA4 C189T位点测试探针;所述GABRA1基因探针包括GABRA1 T156C位点测试探针;所述GABRD基因探针包括GABRD C816T位点测试探针;所述LGI1基因探针包括LGI1 T513C位点测试探针;所述CLCN2基因探针包括CLCN2 T774C位点测试探针;所述CACNA1H基因探针包括CACNA1H C1919T位点测试探针、CACNA1H T3957C位点测试探针、CACNA1H G6212A位点测试探针、CACNA1H T4338C位点测试探针、CACNA1H C5712T位点测试探针及CACNA1H T5929C位点测试探针。
2、设计合成出探针
所述SCN2A G56A位点测试探针序列如SEQ ID NO.1所示;所述SCN1A G3199A位点测试探针序列如SEQ ID NO.2所示;所述SCN1A C5006A位点测试探针序列如SEQ ID NO.3所示;所述SCN1A A1212G位点测试探针序列如SEQ ID NO.4所示;所述KCNQ2 C912T位点测试探针序列如SEQ ID NO.5所示;所述CHRNA4 T699C位点测试探针序列如SEQ ID NO.6所示;所述CHRNA4 G1209T位点测试探针序列如SEQ ID NO.7所示;所述CHRNA4 T678C位点测试探针序列如SEQ ID NO.8所示;所述CHRNA4 C851T位点测试探针序列如SEQ ID NO.9所示;所述CHRNA4 C189T位点测试探针序列如SEQ ID NO.10所示;所述GABRA1 T156C位点测试探针序列如SEQ ID NO.11所示;所述GABRD C816T位点测试探针序列如SEQ ID NO.12所示;所述LGI1 T513C位点测试探针序列如SEQ ID NO.13所示;所述CLCN2 T774C位点测试探针序列如SEQ ID NO.14所示;所述CACNA1H C1919T位点测试探针序列如SEQ ID NO.15所示;所述CACNA1H T3957C位点测试探针序列如SEQ ID NO.16所示;所述CACNA1H G6212A位点测试探针序列如SEQ ID NO.17所示;所述CACNA1H T4338C位点测试探针序列如SEQ ID NO.18所示;所述CACNA1H C5712T位点测试探针序列如SEQ ID NO.19所示;所述CACNA1H T5929C位点测试探针如SEQ ID NO.20所示。
实施例二
特发性癫痫病相关基因的高通量文库的建立
步骤(1)利用上述试剂盒抽提血液,提取基因组DNA;
步骤(2)用Ion Xpress plus Fragment Library kit将DNA片段化;
步骤(3)用Agencourt AMPure XP beads纯化并选择出片段化DNA;
步骤(4)制备好的片段化的DNA文库采用琼脂糖或Agilent 2100 Bioanalyzer检测DNA文库的片段化质量;
步骤(5)用Sureselect Target Enrichment Kit Ion Box#2和Herculase IIFusion DNAPolymerase将加接头片段化DNA进行短循环扩增;
步骤(6)用Agencourt AMPure XP beads纯化扩增后的加接头片段化DNA;具体反应体系如表1所示,将配好的反应体系置于PCR仪上,16℃解育16小时;
步骤(7)用QIAxcel对纯化后的加接头片段化DNA进行质控,得到DNA文库;
步骤(8)将步骤(7)所述DNA文库利用权利要求4所述测试盒进行杂交捕获,用Sureselect Target Enrichment Kit Ion Box#1纯化捕获的特发性癫痫基因文库;
步骤(9)用Sureselect Target Enrichment Kit Ion Box#2和Herculase IIFusion DNA Polymerase将步骤(8)所述特发性癫痫基因文库进行短循环扩增;
步骤(10)用Agencourt AMPure XP beads将步骤(9)所述扩增后的特发性癫痫基因文库进行纯化;
步骤(11)用QIAxcel对所述步骤(10)纯化后的特发性癫痫基因文库进行质控;
步骤(12)用无核酸酶的水将质控后的特发性癫痫基因文库进行稀释、富集,然后用One Touch 2系统进行扩增,反应体系如表2所示,反应程序如表3所示,最后用One TouchES系统纯化富集,得到特发性癫痫病相关基因的高通量文库。
上述技术方案中,所述步骤(1)中,提取基因组DNA其浓度在10ng/μl以上;所述步骤(3)中,选择出的DNA片段在100bp~150bp之间;所述步骤(8)中,所述DNA文库利用上述所述测试盒进行杂交捕获的时间为16小时~24小时;所述步骤(12)中,将质控后的特发性癫痫基因文库稀释到12pmol/μl,取100μl进行富集。
表1连接接头反应体系
表2基因文库反应体系
表3基因文库反应程序
实施例三
按要求对Ion Proton二代测序平台分别进行氯洗和水洗各一次,然后初始化并准备试剂。
(1)检查氩气阀门至30psi,总压力不低于500psi。
(2)Wash 2的瓶子分别用200ml水清洗3次,标记1920ml刻度线,打开终端阀门调整至0.5LPM,充气5分钟。然后加入水至1920ml刻度线,接着加入80ml Ion PTMW2 Solution,然后上下颠倒5次,接着保持充气状态直至使用。通常pH为5~6之间,接着做初始化。
(3)配制Wash 3,加入1×W3 Solution至50ml刻度线。
(4)配制Wash 1,加入32μl 1mol/L NaOH到瓶底。
(5)启动初始化。
确保一个用过的chip在位置上。按下“Initialize”,根据提示,选择“Ion PITMSequencing 200 Kit”,按下“next”,机器会自动检查压力,如果压力正常按下“next”,如果压力低按下“yes”校正。按下“next”,根据提示换新的手套安装Wash 1洗液、2、3的Sipper吸头,注意不要让Sipper吸头碰到任何东西。快速的放置Wash1洗液、2、3在正确的位置上,开始初始化,大概需要40分钟。如果pH一直没有在7.70~7.85之间,则需补充Wash 1洗液或者加入100mmol/L HCl到Wash 2洗液中(约10μl 100mmol/L HCl降低0.1个单位pH,浓HCl浓度为11mol/L,稀释一百倍即可用),或者更换一个chip。期间机器温度在28-30度最合适,压力不低于10psi。
(6)准备dNTP,待dNTP母液溶解后,充分震荡后离心,对应的管子中分别加20μldNTP,根据提示,更换对应的蓝色的sipper,不要使其接触到任何东西,然后装好管子旋紧,4种dNTP依次进行。按下“next”,根据提示完成初始化,按下next回到主界面。
(7)准备试剂:50%退火缓冲液(Annealing Buffer)和Flushing solution。
(8)准备Template-positive ISPs。
在样品ISPs中,加入事先震荡混匀的5μl Ion PITM Control Ion Sphere TMparticles,吹打混匀后,15500g离心5分钟,注意沉淀的方向。去掉上清,留下10μl(需要对照),加入15μl Ion PITM Annealing Buffer和20μl Ion PITM Sequencing Primer,震荡混匀10秒,轻甩2秒。放置到PCR以上退火反应,程序为95℃,2min;37℃,2min;25℃,热盖。反应结束后,加入10μl Ion PITM Loading Buffer,震荡混匀5秒,离心机轻甩2秒,置于室温。
(9)将准备好的ISP样品Loading到芯片中并冲洗芯片。
(10)将加好样品的芯片放置到仪器上,选择一个planed run(Plan run时需设置好运行分析插件:FastQC,fastqcreater,Variant caller,Coverage analysis),开始测序。
3、Ion reporter系统分析测序数据。
(1)将仪器分析出的Bam文件和VCF文件均上传至Ion reporter系统中。
(2)测序数据与Hg 19人基因组参照序列进行比对。
(3)设置数据filter条件对比对结果进行分析,得出基因的真实突变位点(数据filter条件包括:zygosity,variant type,variant effect,location,filteredcoverage,minor allele frequency,drug bank)。
4、选取两例特发性癫痫病患者血液样本通过Sanger测序法获得部分位点的基因序列;
将上述血液样本用实施例一的试剂盒,实施例二的步骤制备高通量文库;
将两种测序方法进行对比,结果如表4所示。
表4 Sanger法测序结果与本试剂盒检测结果
5、本发明试剂盒检测10例癫痫样本,与直接测序法检测结果比较,使用本发明试剂盒在这些样本中与直接测序法检测结果完全一致。
表5试剂盒突变列表
____________________________________________
详细信息
必须说明的是,以上所述实施例只是本发明的一些实施方式。对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 合肥诺为尔基因科技服务有限公司
<120> 检测特发性癫痫病基因探针组合物、试剂盒及应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 11
tatgtttttt ttcagctatg gacagccgtc attacaagat gaacttaaag acaataccac 60
tgtcttcacc aggattttgg acagactcct agatggttat gacaatcgcc tgagaccagg 120
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcatccaat cctacatgcc ctccgtcctg ctggtcgcca tgtcctgggt ctccttctgg 60
atcagccagg cggcggtgcc cgccagggtg tctctaggta cggggcctcg ccgctgctcc 120
<210> 13
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcggtaattc ctaatctaac cctgtaggta gctttggaac ttgacaaatg cagccaaacg 60
attgatttcg aatgactgaa ccctcattgg acagaaccat agatatatac aaatactaag 120
<210> 14
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagatggtgc caggtagggg gcccacgagg ctaggcctgc ctccctctgc tgttcttccc 60
tttagagact attacagccc tcttcaaaac ccgattccgg ctcgacttcc cctttgacct 120
<210> 15
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcaaaggcag caccagcccc ggacccaagg ggaagtgggc cggtggaccg ccaggcaccg 60
gggggcacgg cccgttgagc ttgaacagcc ctgatcccta cgagaagatc ccgcatgtgg 120
<210> 16
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cccacccagg ttccgcgtct cctgccagaa ggtcatcaca cacaagatgt ttgatcacgt 60
ggtcctcgtc ttcatcttcc tcaactgcgt caccatcgcc ctggagaggc ctgacattga 120
<210> 17
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cccagggggg ctccctgcag tccccaccac gctccccacg gcccgccagc gtccgcactc 60
gtaagcatac cttcggacag cgctgcgtct ccagccggcc ggcggcccca ggcggagagg 120
<210> 18
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggtggagacg ctgatatcat cactcaggcc cattgggaac atcgtcctca tctgctgcgc 60
cttcttcatc atttttggca ttttgggtgt gcaggtgtgt ggcccccacg tgcccggggg 120
<210> 19
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gatcgagctg gagatggcgc agggccccgg gagtgcacgc cgggtggacg cggacaggcc 60
tcccttgccc caggagagtc cgggcgccag ggacgcccca aacctggttg cacgcaaggt 120
<210> 20
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agagtcctgt gcctccctcc agatcccatt ggctgtgtcg tccccagcca ggagcggcga 60
gcccctccac gccctgtccc ctcggggcac agcccgctcc cccagtctca gccggctgct 120
Claims (10)
1.检测特发性癫痫病基因探针组合物,其特征在于,所述基因探针组合物包括SCN2A基因探针、SCN1A基因探针、KCNQ2基因探针、CHRNA4基因探针、GABRA1基因探针、GABRD基因探针、LGI1基因探针、CLCN2基因探针及CACNA1H基因探针。
2.根据权利要求1所述检测特发性癫痫病基因探针组合物,其特征在于,所述SCN2A基因探针包括SCN2A G56A位点测试探针;所述SCN1A基因探针包括SCN1A G3199A位点测试探针、SCN1A C5006A位点探针及SCN1A A1212G位点测试探针;所述KCNQ2基因测试探针包括KCNQ2 C912T位点探针;所述CHRNA4基因探针包括CHRNA4 T699C位点测试探针、CHRNA4G1209T位点测试探针、CHRNA4 T678C位点测试探针、CHRNA4 C851T位点测试探针及CHRNA4C189T位点测试探针;所述GABRA1基因探针包括GABRA1 T156C位点测试探针;所述GABRD基因探针包括GABRD C816T位点测试探针;所述LGI1基因探针包括LGI1 T513C位点测试探针;所述CLCN2基因探针包括CLCN2 T774C位点测试探针;所述CACNA1H基因探针包括CACNA1HC1919T位点测试探针、CACNA1H T3957C位点测试探针、CACNA1H G6212A位点测试探针、CACNA1H T4338C位点测试探针、CACNA1H C5712T位点测试探针及CACNA1H T5929C位点测试探针。
3.根据权利要求2所述检测特发性癫痫病基因探针组合物,其特征在于,所述SCN2AG56A位点测试探针序列如SEQ ID NO.1所示;所述SCN1A G3199A位点测试探针序列如SEQID NO.2所示;所述SCN1A C5006A位点测试探针序列如SEQ ID NO.3所示;所述SCN1AA1212G位点测试探针序列如SEQ ID NO.4所示;所述KCNQ2 C912T位点测试探针序列如SEQID NO.5所示;所述CHRNA4 T699C位点测试探针序列如SEQ ID NO.6所示;所述CHRNA4G1209T位点测试探针序列如SEQ ID NO.7所示;所述CHRNA4 T678C位点测试探针序列如SEQID NO.8所示;所述CHRNA4 C851T位点测试探针序列如SEQ ID NO.9所示;所述CHRNA4C189T位点测试探针序列如SEQ ID NO.10所示;所述GABRA1 T156C位点测试探针序列如SEQID NO.11所示;所述GABRD C816T位点测试探针序列如SEQ ID NO.12所示;所述LGI1 T513C位点测试探针序列如SEQ ID NO.13所示;所述CLCN2 T774C位点测试探针序列如SEQ IDNO.14所示;所述CACNA1H C1919T位点测试探针序列如SEQ ID NO.15所示;所述CACNA1HT3957C位点测试探针序列如SEQ ID NO.16所示;所述CACNA1H G6212A位点测试探针序列如SEQ ID NO.17所示;所述CACNA1H T4338C位点测试探针序列如SEQ ID NO.18所示;所述CACNA1H C5712T位点测试探针序列如SEQ ID NO.19所示;所述CACNA1H T5929C位点测试探针如SEQ ID NO.20所示。
4.含权利要求1~3任一项所检测特发性癫痫病基因探针组合物的试剂盒。
5.权利要求4所述试剂盒在制备特发性癫痫病相关基因的高通量文库中的应用。
6.一种制备特发性癫痫病相关基因的高通量文库的方法,其特征在于,用权利要求4所述试剂盒抽提测试样品,将测试样品中基因组DNA进行提取后进行片段化得到具有粘性末端的DNA片段,将具有粘性末端的DNA片段进行扩增,扩增后进行接头;将接头后的DNA片段利用权力要求4所述试剂盒进行杂交捕获,获得目的片段;将目的片段纯化后再PCR扩增,分离纯化,得到与特发性癫痫病相关基因的高通量文库。
7.根据权利要求6所述一种制备特发性癫痫病相关基因的高通量文库的方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
步骤(1)利用权利要求4所述试剂盒抽提血液,提取基因组DNA;
步骤(2)用Ion Xpress plus Fragment Library kit将DNA片段化;
步骤(3)用Agencourt AMPure XP beads纯化并选择出片段化DNA;
步骤(4)制备好的片段化的DNA文库采用琼脂糖或Agilent 2100 Bioanalyzer检测DNA文库的片段化质量;
步骤(5)用Sureselect Target Enrichment Kit Ion Box#2和Herculase II FusionDNAPolymerase将加接头片段化DNA进行短循环扩增;
步骤(6)用Agencourt AMPure XP beads纯化扩增后的加接头片段化DNA;
步骤(7)用QIAxcel对纯化后的加接头片段化DNA进行质控,得到DNA文库;
步骤(8)将步骤(7)所述DNA文库利用权利要求4所述测试盒进行杂交捕获,用Sureselect Target Enrichment Kit Ion Box#1纯化捕获的特发性癫痫基因文库;
步骤(9)用Sureselect Target Enrichment Kit Ion Box#2和Herculase II FusionDNA Polymerase将步骤(8)所述特发性癫痫基因文库进行短循环扩增;
步骤(10)用Agencourt AMPure XP beads将步骤(9)所述扩增后的特发性癫痫基因文库进行纯化;
步骤(11)用QIAxcel对所述步骤(10)纯化后的特发性癫痫基因文库进行质控;
步骤(12)用无核酸酶的水将质控后的特发性癫痫基因文库进行稀释、富集,然后用OneTouch 2系统进行扩增,最后用One Touch ES系统纯化富集,得到特发性癫痫病相关基因的高通量文库。
8.根据权利要求7所述一种制备特发性癫痫病相关基因的高通量文库的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,提取基因组DNA其浓度在10 ng/μl以上;所述步骤(3)中,选择出的DNA片段在100 bp~150 bp之间;所述步骤(8)中,述DNA文库利用权利要求4所述测试盒进行杂交捕获的时间为16小时~24小时;所述步骤(12)中,将质控后的特发性癫痫基因文库稀释到12 pmol/μl,取100 μl进行富集。
9.一种特发性癫痫病相关基因的高通量文库,其特征在于,所述高通量文库是利用权利要求4所述测试盒进行制备的。
10.权利要求9所述特发性癫痫病相关基因的高通量文库在Ion Proton二代测序平台中的应用。
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