CN106544407A - 确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA比例的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种确定受体cfDNA样本中供体来源的cfDNA比例的方法，包括：获取第一和第二测序数据，第一和第二测序数据分别为受体gDNA和受体cfDNA的至少一部份的测序结果；将第一和第二测序数据分别与参考序列比对，获得第一和第二比对结果；基于第一比对结果进行SNP检测，获得第一分型结果，第一分型结果包括多个一级纯合子SNP，表示为AA；基于第二比对结果中比对上二级纯合子SNP的第二读段的量，确定供体来源的cfDNA的比例，二级纯合子SNP为比对上该位点的第二读段中包含不支持等位基因A的第二读段的一级纯合子SNP的至少一部分。该方法不依赖于供体遗传样本，就能准确确定受体cfDNA中供体来源cfDNA的含量。

Description

确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA比例的方法
技术领域
本发明涉及生物信息和生物检测领域，具体的，本发明涉及一种确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的方法、一种确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的装置、一种监测免疫排斥的方法以及一种监测免疫排斥的装置。
背景技术
器官和组织移植是20世纪最重要的医学成就之一，目前移植术已成为组织、器官功能衰竭终末阶段最有效的治疗措施。对器官移植患者进行免疫排斥反应监测，是提高器官移植患者术后长期存活率的重要手段。目前诊断急性排斥反应主要依靠穿刺移植器官进行组织活检，例如心脏移植后进行心肌、心内膜穿刺活检。该方法创伤性大、费用高且易引发并发症。
而当前与排斥反应有关的非创伤性检测指标如细胞因子的检测、淋巴细胞检测、补体和粘附分子检测、蛋白质和酶类检测及MHC分子等，由于免疫反应的复杂性，上述免疫学检测方法均有其局限性，结果容易受细菌、病毒感染等因素影响，不宜单独作为判断排斥的依据。而且由于器官移植排斥反应涉及范围广泛，情况复杂，现仍未找到公认的、无创伤性的、敏感性和特异性均足以应用于临床监测的指标。
在器官移植患者体内，当移植物受到受体排斥时，细胞从器官脱落，进一步凋亡、裂解，释放供体来源的cfDNA(cell-free donor-derived DNA，cfdDNA)进入受体血液。正常状态下受体血液中供体来源的cfDNA几乎没有或者含量是极低的，只有在发生免疫排斥反应时cfDNA的含量上调，因此，可以通过计算受体外周血中供体来源cfDNA的比例，从而辅助判断机体是否发生排斥反应。
最开始这方面的研究集中在性别不匹配器官移植方面，即女性受体接受男性供体的器官，通过检测Y染色体特异基因从而判断血浆中供体来源cfDNA的含量，这就受到了很多限制，不能广泛应用于临床。
再者，临床上往往缺乏移植前样本，特别是供体样本，缺乏供体的遗传信息也使得cfdDNA含量的确定困难。
现有的确定受体中供体细胞游离DNA(cfdDNA)含量的方法，以及器官移植排斥检测手段，有待改进或补充。
发明内容
本发明旨在至少解决上述问题至少之一或者提供至少一种可选择的商业手段。
依据本发明的第一方面，本发明提供一种确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的方法，该方法包括步骤：获取第一测序数据和第二测序数据，所述第一测序数据为受体基因组DNA的至少一部分的测序结果，包括多个第一读段，所述第二测序数据为受体cfDNA的至少一部份的测序结果，包括多个第二读段；将所述第一测序数据和所述第二测序数据分别与参考序列进行比对，对应获得第一比对结果和第二比对结果；基于所述第一比对结果进行SNP检测，获得第一分型结果，所述第一分型结果包括多个一级纯合基因型SNP，表示所述一级纯合基因型SNP在所述敌意测序数据中的基因型为AA；基于所述第二比对结果中比对上二级纯合基因型SNP的第二读段的量，确定所述供体来源cfDNA的比例，所述二级纯合基因型SNP为满足以下条件的一级纯合基因型SNP的至少一部分：第二比对结果中比对上该二级纯合基因型SNP的第二读段中包含不支持等位基因A的第二读段。
依据本发明的第二方面，本发明提供一种确定受体cfDNA样本中供体来源的cfDNA的比例的方法，包括以下步骤：获取第一测序数据，所述第一测序数据为受体基因组DNA的至少一部分的测序结果，包括多个第一读段；将所述第一测序数据与参考序列进行比对，获得第一比对结果；基于所述第一比对结果进行SNP检测，获得第一分型结果，所述第一分型结果包括多个一级纯合基因型SNP；获取第二测序数据，所述第二测序数据为受体cfDNA的至少一部份的测序结果，包括多个第二读段；将所述第二测序数据与所述参考序列进行比对，获得第二比对结果；基于所述第二比对结果中比对上二级纯合基因型SNP的第二读段的量，确定所述供体来源的cfDNA的比例，所述二级纯合基因型SNP为所述第二比对结果中比对上该位点的第二读段中包含不支持等位基因A的第二读段的一级纯合基因型SNP的至少一部分。
上述本发明的任一方法，首次摆脱了对供体遗传样本的依赖，而且可以利用灵活的、一体化的软件包的形式实现，能够独立部署、高效运行。将该方法应用于移植排斥监测，由于该方法为低创或无创检测、具有可接受的成本和直观的数字化结果，可作为一种便捷、早期、无创、准确的移植排斥监测辅助技术，可作为临床免疫排斥检测的辅助或补充手段。
上述本发明任一方面的确定受体cfDNA样本中供体来源的cfDNA的比例的方法的全部或部分步骤，可以利用包含可拆分的相应单元功能模块的装置/系统来施行，或者将方法程序化、存储于机器可读介质，利用机器运行该可读介质来实现。
依据本发明的第三方面，本发明提供一种确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的装置，该装置用以实施上述本发明任一方面的确定受体cfDNA样本中供体来源的cfDNA的比例的方法的全部或部分步骤，该装置包括：数据输入单元，用于输入数据；数据输出单元，用于输出数据；处理器，用于执行可执行程序，所述可执行程序包括完成上述本发明任一方面的方法；存储单元，与所述数据输入装置、所述数据输出装置和所述存储器相连，用于存储数据，其中包括所述可执行程序。本领域技术人员能够理解，所称的可执行程序可以保存在存储介质中，所称存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘或光盘等。
依据本发明的第四方面，本发明提供一种监测器官移植排斥的装置，包括：分别于不同时间点对受体进行采血，获得多个血液样本；利用上述本发明任一方面的方法确定每个所述血液样本中供体来源cfDNA的比例；基于确定的多个所述供体来源cfDNA的比例，进行所述监测。
依据本发明的第五方面，提供一种监测器官移植排斥的装置，该装置用以实施上述本发明一方面的监测器官移植排斥的方法的全部或部分步骤，该装置包括：样本获取单元，用以分别于不同时间点对受体进行采血，获得多个血液样本；供体cfDNA比例确定单元，与所述样本获取单元相连，用以利用上述本发明任一方面的确定受体cfDNA样本中供体来源的cfDNA的比例的方法确定每个所述血液样本中供体来源cfDNA的比例；监测单元，与所述供体cfDNA比例确定单元相连，用以基于确定的多个所述供体来源cfDNA的比例，进行所述监测。
利用上述本发明的方法和/或装置系统，能够只依据受体的遗传样本确定出能够区分供体和受体的SNP，将这些SNP作为区分混合cfDNA中供体和受体来源cfDNA的标记；而通过这些标记位点得到的测序读段的支持情况，利用本发明的方法和/或装置，可准确确定移植后的受体cfDNA样本中的cfdDNA的含量；而将其应用于器官移植排斥检测，由于其为低创或无创的检测，且具有可接受的成本、直观的数字化结果展示，能够作为一种便捷、早期、无创和准确的移植排斥监测辅助技术，而且为非依赖供体遗传样本的技术，为临床判断移植排斥程度提供建议，或者作为临床检测移植排斥的辅助或补充手段。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明的一个实施例中的获得测序数据的实验总流程图。
图2是本发明的一个实施例中的确定受体cfDNA样本中的供体cfDNA比例的基因分型的实验流程图。
图3是本发明的一个实施例中的基于高通量测序平台的血浆cfDNA检测的实验流程图。
图4是本发明的一个实施例中的无供体依赖性的器官移植免疫排斥监测软件包实现的流程的示意图。
图5是本发明的一个实施例中的校正供体cfDNA比例与真实供体cfDNA比例的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
所述实施方式在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本文中，所使用的术语“第一”、“第二”、“一级”、“二级”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性、隐含指明所指示的技术特征的数量或者具有顺序关系。由此，限定有“第一”、“第二”、“一级”或“二级”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，除非另有明确的规定和限定，术语“顺序连接”、“相连”、“连接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本文中，所称的供体和受体，是相对的两个个体，是基于移植，例如基于器官或组织移植时的供给一方和接受一方来说的。供体和受体可以是相同物种，也可以是亲缘关系近的能够或者可能能够进行器官或组织移植的不同物种。
下文的公开了不同的具体实施方式或实施例用来实现本发明的不同方法步骤或装置结构。为了简化本发明的公开，下文中对特定例子的步骤和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和/或设置之间的关系。
根据本发明的一个实施方式提供的一种确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的方法，包括以下步骤：
S10获取第一测序数据和第二测序数据。
所述第一测序数据为受体基因组DNA的至少一部分的测序结果，包括多个第一读段，所述第二测序数据为受体cfDNA的至少一部份的测序结果，包括多个第二读段。
所称的测序数据通过对核酸序列进行测序得来，测序依据所选的测序平台的不同，可选择但不限于半导体测序技术平台比如PGM、Ion Proton、BGISEQ-100平台，合成边测序的技术平台比如Illumina公司的Hiseq、Miseq序列平台以及单分子实时测序平台比如PacBio序列平台。测序方式可以选择单端测序，也可以选择双末端测序，获得的下机数据是测读出来的片段，称为读段(reads)。根据本发明的一个实施例，所称第一或者第二测序数据中的读段的长度不相同，测序数据利用华大基因的BGISEQ-100测序平台或者Life Technologies公司的Ion Torrent系列中的Proton测序平台对基因组核酸序列进行测序获得。所测核酸序列通常是将来个体的基因组DNA样本经过打断获得的，接着根据所选用的测序方法或测序平台进行相应的测序文库(library)制备，进而将测序文库上机测序，获得下机数据即测序数据。需要说明的是，对于cfDNA样本，由于其本身就是片段，一般不需再对其进行打断。
第一和第二测序数据的获取，可以先后进行，例如先获取第一测序数据再获取第二测序数据，也可以同时进行。根据本发明的实施例，S10获取第一测序数据和第二测序数据，包括：S12获取受体基因组DNA样本和受体cfDNA样本，所述基因组DNA样本包含基因组DNA(gDNA)，所述cfDNA样本包含cfDNA；S14对所述基因组DNA和/或cfDNA进行捕获，获得第一目的片段和/或第二目的片段；S16对所述第一目的片段和/或第二目的片段进行测序，获得所述第一测序数据和/或所述第二测序数据。
该实施例对S12中的受体基因组DNA样本和受体cfDNA样本的获取顺序不作限制，可先后获取或者同时获取，根据本发明的一个实施例，获取受体的外周血样本，分离出其中的血细胞作为受体基因组DNA样本，剩下的血浆样本包含cfDNA，为受体cfDNA样本，同时获得gDNA样本和cfDNA样本。
根据本发明的一个实施例，S14包括对基因组DNA进行捕获，包括进行以下：S141对所述基因组DNA进行片段化，获得第一DNA片段，较佳的，使所述第一DNA片段的大小为150-250bp；S142对所述第一DNA片段进行末端修复，获得第一修复片段；S143对所述第一修复片段进行测序接头连接，获得第一连接产物；S144对所述第一连接产物进行大小选择，获得预定大小的第一连接产物，较佳的，使选择的预定大小的第一连接产物的大小为210-270bp；S145对所述预定大小的第一连接产物进行扩增，获得第一扩增产物；以及S146对所述第一扩增产物进行所述捕获，以获得所述第一目的片段。
根据本发明的另一个实施例，S14包括对cfDNA进行捕获，包括进行以下：S114对所述cfDNA进行末端修复，获得第二修复片段；S134对所述第二修复片段进行测序接头连接，获得第二连接产物；S154对所述第二连接产物进行扩增，获得第二扩增产物；以及S174对所述第二扩增产物进行所述捕获，以获得所述第二目的片段。
捕获可以利用固相芯片进行，也可以利用液相芯片进行，本实施例对捕获方式不作限制。根据本发明的实施例，利用液相芯片进行所述捕获，捕获的区域包括基因组上次等位基因频率最接近0.5的至少1000个SNP位点。根据本发明的一个较佳实施例，捕获的区域包括以下合并(i)-(iii)至少之二后的非冗余位点：(i)人类群体等位基因频率数据库中的杂合度为0.48-0.5的SNP位点，(ii)在千人基因组数据库的东亚人群中的次等位基因频率为0.5，或者在该数据库中的所有群体中的平均次等位基因频率为0.4-0.5的SNP位点，(iii)在HapMap数据库的CHB子库中的次等位基因频率大于0.4，或者次等位基因频率为0.5，或者杂合度为0.48-0.5的SNP位点。由此，可以使用更小的捕获芯片、更低的数据量，也即更低的成本来检测供体的fdDNA含量。通常所说的SNP都是二态性的，基因型是指同源染色体上一对等位位点的类型的组合。所称的SNP的次等位基因频率，也叫最小等位基因频率(minor allelefrequency，MAF)是指该SNP的频率较低的等位基因在给定人群中的频率。SNP的MAF可以依据数据库公开的信息，在该实施例中，挑选的MAF符合要求的SNP是通过查找相应数据库中提供的信息来确定的。所称的杂合度(heterozygosity)是SNP的另一个频率参数，杂合度＝2MAF(1-MAF)。杂合度或者MAF越高即越接近0.5，说明该SNP在群体中杂合频率越高，最后被确定为可区分受体和供体的SNP的可能性越大。对捕获的目标区域进行有优化设计、有目的的筛选，能够减少数据总量，降低测序成本、分析成本和时间。根据本发明的另一个实施例，通过上述筛选，最终获得的捕获的区域包括表1中的SNP位点。
S20比对。
将第一测序数据和第二测序数据分别与参考序列进行比对，对应获得第一比对结果和第二比对结果。
将测序数据中的读段比对到参考序列上(reads mapping或者reads alignment)，是指将测序得到的DNA片段(也就是reads)定位在基因组上。通过读段定位，在克服测序产生的reads过短导致的技术困难的同时，也方便利用基因组位置作为桥梁，来将测序得到的数据与前期研究产生的注释结果进行整合。读段比对定位往往被作为测序数据分析的第一步，其质量的好坏以及速度的快慢，都会直接对后续的分析工作产生影响。在比对过程中，根据比对参数的设置，reads最多允许有n个碱基错配(mismatch)，n优选为1或2，若reads中有超过n个碱基发生错配，则视为该对reads无法比对到参考序列。具体比对时，可使用各种比对软件，例如SOAP(Short Oligonucleotide Analysis Package)，bwa，Tmap等，本实施方式对此不作限定。
所说的参考序列是已知序列，可以是预先获得的目标个体所属生物类别中的任意的参考模板，例如，同一生物类别的已公开的基因组组装序列，若混合核酸样本为来自人类，其基因组参考序列(也称为参考基因组)可选择NCBI数据库提供的HG19。比对结果包含各条读段与参考序列的比对情况，包括读段是否能够比对上参考序列、读段比对到参考序列的位置、比对到参考序列的唯一位置还是多个位置、某一位点多少读段比对上、比对上某位点的读段的相应位置的碱基类型等。
根据本发明的实施例，要求捕获的目标区域的平均测序深度为不小于200×，相当于平均每个目标位点都有200条读段比对上。如此，使最终获得的结果更加可信。
根据本发明的实施例，在获得第一比对结果和/或第二比对结果之后，对第一比对结果和/或第二比对结果进行去重，分别以去重后的第一比对结果和/或去重后的第二比对结果替代第一比对结果和/或第二比对结果，再进行后续步骤，有利于含量或比例的准确确定。
S30基于第一比对结果进行SNP检测。
基于第一比对结果进行SNP检测，获得第一分型结果，第一分型结果包括多个一级纯合基因型SNP，表示所述一级纯合基因型SNP在所述第一测序数据中的基因型为AA。所称的纯合基因型也称为纯合子。需要说明的是，这里以字母“AA”表示第一分型结果中的纯合子SNP，只是为方便指代该类型SNP，非指碱基为A，也非指具体的一个或多个该类型SNP。
SNP检测或者SNP识别可以利用各种SNP识别软件，包括但不限于SOAPsnp、SomaticSniper、CaVEMan、SAMtools、MuTect和TVC。将比对上同一位点的读段分成不同类别，是基于比对上的读段中的对应位置的碱基不同来进行的，例如比对到参考序列碱基为A的位点的读段中，一部分读段的该位置上的碱基为A，另一部分读段的该位置上的碱基为G，则比对到该位点的读段分为两类。
对于与参考序列碱基一致的或者不一致的纯合子位点，常规的SNP识别分型软件不能对其进行分型。根据本发明的一个实施例，先利用TVC软件进行SNP识别及分型，对于纯合子位点，TVC软件没办法对其分型。为最大化位点分型，在本发明的实施例中，利用SNP的各类读段的支持情况来分型。根据本发明的实施例，所称的基于第一比对结果进行SNP检测，获得第一分型结果，包括进行以下a或者进行以下a和b：a.依据所占的比例大于95％的那一类第一读段，确定该位点的基因型，b.依据所占的比例大于等于25％且小于等于95％的多类第一段读段中的所占比例最大的前两类第一读段，确定该位点的基因型，多类第一读段之间的区别在于其共同比对上的位点的相应位置上的碱基不同。规则a，即比对上一位点的第一读段中的某一类第一读段的比例大于95％，则认为该位点为纯合子，组成碱基为比例大于95％的这类比对上的读段的相应位置的碱基；b中，即对比上一位点的读段中有两类或者多于两类的读段的比例介于25％到95％，则认为该位点是杂合子，碱基组成为其中的比例最大，即相对最接近95％的两类读段相应位置上的碱基。需要说明的是，a和/或b分型规则，适用于所有类型的位点的分型，本领域技术人员可以按照所称的a和/或b，不利用现有的基因分型软件，对位点直接分型。
为使上述依据读段的支持比例进行分型的分型结果准确，对后续分析有意义，根据本发明的一个较佳实施例，在进行a和/或b之前，分别对第一读段和第二读段进行去重，去掉由于文库构建过程的扩增带来的重复。
根据本发明的较佳实施例，仅保留等位基因频率为100％、和/或测序深度大于等于平均测序深度的一级纯合基因型SNP。这里，所称的等位基因频率为100％的位点，比对上该位点的所有第一读段的相应位置上的碱基都相同。这样，对一级纯合基因型SNP进行严格过滤，利于确定的结果更加准确可信。
S40确定所述供体来源cfDNA的比例。
基于第二比对结果中比对上二级纯合基因型SNP的第二读段的量，确定供体来源的cfDNA的比例。二级纯合基因型SNP为第二比对结果中比对上该位点的第二读段包含不支持等位基因A的第二读段的一级纯合基因型SNP的至少一部分。需要说明的是，所称的“量”，可以是绝对数目、相对数目例如比例或者函数关系式。还需要说明的是，以字母A表示等位基因，只是为方便说明，非指示该位点的等位基因为碱基A。所称的二级纯合基因型SNP，亦即为在受体中为纯合子、在供体中为杂合子或者为不同纯合子的位点，依据比对到该类位点的第二读段的量，就能确定供体来源的cfDNA的比例。
根据本发明的实施例，在进行该步骤之前，去除第二比对结果中的非唯一比对的第二读段，以准确确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例。
根据本发明的实施例，所称的二级纯合基因型SNP为第二比对结果中比对上该位点的第二读段包含不支持等位基因A的第二读段的所有一级纯合基因型SNP，依据以下公式计算比例， 其中，N表示第二读段的数量，NAB(B)表示比对上一级纯合子AA且不支持等位基因A的第二读段有两类的这两类第二读段的总数量，NBB(B)表示比对上一级纯合子AA且不支持等位基因A的第二读段只有一类的这类第二读段的数量，NAA(A)表示比对上一级纯合子AA且支持等位基因A的第二读段的数量。
根据本发明的实施例，所称的二级纯合基因型SNP为第二比对结果中比对上该位点的第二读段包含不支持等位基因A的第二读段的一级纯合基因型SNP中的一部分，该二级纯合基因型SNP具有以下特点：在第二比对结果中有且只有一类不支持等位基因A的第二读段，将该类第二读段支持的等位基因表示为C，则在该示例中每个二级纯合基因型SNP在第二测序数据中的基因型均可表示为AC。每个二级纯合基因型SNP位点获得的支持等位基因C的第二读段的数目占比对上该位点的所有读段数目的比例称为频率，每个二级纯合基因型SNP的该频率＝NC/(NA+NC)，其中，NC表示比对上该二级纯合基因型SNP且不支持等位基因A的第二读段的数目，NA表示比对上该二级纯合基因型SNP且支持等位基因A的第二读段的数目。第二测序数据中可得到大量这样的频率，这些频率反映供体cfDNA含量和极小部分的测序测序或比对错误的比例。需要说明的是，这里以字母C表示不同于A的等位基因，只是为方便说明以区分A，非指该等位基因的碱基类型为C。
为排除掉测序错误或比对错误对确定cfdDNA含量的影响，发明人首次提出可区分受体和供体位点中的反映供体频率的数据可反映供体含量的假设，基于该假设运用等位基因频率检测的方法，来计算受体cfDNA中的供体来源cfDNA的比例。根据本发明的实施例，该步骤包括：对所述量进行聚类，获得聚类结果；依据所述聚类结果中呈两倍关系的两类量中的至少一类确定所述供体来源cfDNA的比例。聚类可采用各种聚类算法，本实施例对此不作限定。理论上，所称的量可明显被聚类成两类(簇)，且这两类存在两倍关系。根据本发明的一个实施例，所称的量为各个二级纯合基因型SNP(二级纯合子AA)中的不支持等位基因A的一类或各类第二读段所占的比例，使用K-means聚类算法进行聚类，K＝2，将上述一类或各类第二读段所占比例值按均值迭代聚成两个簇，使用均值进行卡方检验，判断两倍关系的显著性，输出两类均值，其中的为另一个均值的两倍的均值即为供体来源cfDNA的比例。
根据本发明的另一个实施方式提供的一种确定受体cfDNA样本中供体来源的cfDNA的比例的方法，包括以下步骤：S100获取第一测序数据，所述第一测序数据为受体基因组DNA样本的至少一部分的测序结果，包括多个第一读段；S200将所述第一测序数据与参考序列进行比对，获得第一比对结果；S300基于所述第一比对结果进行SNP检测，获得第一分型结果，所述第一分型结果包括多个一级纯合基因型SNP；S400获取第二测序数据，所述第二测序数据为受体cfDNA的至少一部份的测序结果，包括多个第二读段；将所述第二测序数据与所述参考序列进行比对，获得第二比对结果；S500基于所述第二比对结果中比对上二级纯合基因型SNP的第二读段的量，确定所述供体来源的cfDNA的比例，所述二级纯合基因型SNP为所述第二比对结果中比对上该位点的第二读段中包含不支持等位基因A的第二读段的一级纯合基因型SNP。前述对本发明实施方式或者任一实施例中的确定受体cfDNA样本中供体来源的cfDNA的比例的方法中的步骤以及特征的解释、以及优点的描述，同样适用本发明这一实施方式的方法，在此不再赘述。
上述任一实施方式或实施例的方法，不依赖于供体遗传样本，可以利用灵活的、一体化的软件包的形式实现，能够独立部署、高效运行。根据本发明的一个实施例，将该方法应用于移植排斥监测，由于任一该方法为低创或无创检测、具有可接受的成本和直观的数字化结果，可作为一种便捷、早期、无创、准确的移植排斥监测辅助技术，可作为临床免疫排斥检测的辅助或补充手段。
上述本发明任一方面的确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的方法的全部或部分步骤，可以利用包含可拆分的相应单元功能模块的装置/系统来施行，或者将方法程序化、存储于机器可读介质，利用机器运行该可读介质来实现。
根据本发明的再一个实施方式提供的一种确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的装置，该装置用以实施上述本发明任一实施方式或任一实施例的受体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的方法的全部或部分步骤，该装置包括：数据输入单元，用于输入数据；数据输出单元，用于输出数据；处理器，用于执行可执行程序，所述可执行程序包括完成上述本发明任一方面的方法；存储单元，与所述数据输入装置、所述数据输出装置和所述存储器相连，用于存储数据，其中包括所述可执行程序。本领域技术人员能够理解，所称的可执行程序可以保存在存储介质中，所称存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘或光盘等。
根据本发明的又一个实施方式提供的一种监测器官移植排斥的方法，包括：分别于不同时间点对受体进行采血，获得多个血液样本；利用上述本发明任一实施方式或实施例的方法确定每个所述血液样本中供体来源cfDNA的比例；基于确定的多个所述供体来源cfDNA的比例，进行所述监测。
根据本发明的一个实施方式提供的一种监测器官移植排斥的装置，该装置用以实施上述的监测器官移植排斥的方法的全部或部分步骤，该装置包括：样本获取单元，用以分别于不同时间点对受体进行采血，获得多个血液样本；供体cfDNA比例确定单元，与所述样本获取单元相连，用以利用上述本发明任一实施方式或实施例的确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA的比例的方法确定每个所述血液样本中供体来源cfDNA的比例；监测单元，与所述供体cfDNA比例确定单元相连，用以基于确定的多个所述供体来源cfDNA的比例，进行所述监测。
利用上述本发明的方法和/或装置系统，能够只依据受体的遗传样本确定出能够区分供体和受体的SNP，将这些SNP作为区分混合cfDNA中供体和受体来源cfDNA的标记；而通过这些标记位点得到的测序读段的支持情况，利用本发明的方法和/或装置，可准确确定移植后的受体cfDNA样本中的cfdDNA的含量；而将其应用于器官移植排斥检测，由于其为低创或无创的检测，且具有可接受的成本、直观的数字化结果展示，能够作为一种便捷、早期、无创和准确的移植排斥监测辅助技术，而且为非依赖供体遗传样本的技术，为临床判断移植排斥程度提供建议，或者作为临床检测移植排斥的辅助或补充手段。
以下结合附图和具体实施例对本发明的方法和/或装置进行详细的描述。下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和引物)、软件及仪器，都是常规市售产品或者开源的，比如购自Life Technologies公司、华大基因等。
实施例一
一、获得第一测序数据的实验方法，一般包括：
(一)目标SNP位点设计
由于该示例方法要求SNP位点的测序深度高，平均需达200×或以上，普通的芯片用于本方法会造成大量数据浪费，使检测成本极大提高，因此，发明人按照次等位基因频率(MAF)值越接近于0.5的思路，自主设计、自主合成了一款小型SNP芯片用于目标区域捕获。
目标SNP位点获取途径主要有以下几种：
1.ALFRED等位基因频率数据库，按照杂合度从0.48至0.5的区间进行过滤，获取946个SNP位点；
2.1000Genomes数据库，在EAS超群子库中按频率为0.5的条件进行过滤，然后按照该库所有群体的平均频率从0.4至0.5的区间再进行过滤，共获取2263个SNP位点；
3.HapMap数据库，选取MAF值大于0.4的中华(CHB)群体子库，按MAF值等于0.5及杂合度在0.48至0.5区间的条件进行过滤，共获取1979个位点。
对以上SNP位点进行合并去冗余，排除位于X、Y性染色体上的位点，同时要求在dbsnp数据库中有唯一的“rs”编号。最终，获得3846个目标SNP位点，如表1所示。对目标SNP位点进行两边延伸至100bp，进行探针设计，最终设计成一款小型、适用该方法中的捕获的SNP芯片。
表1
rs2494624 rs6683165 rs11120890 rs4908616 rs2640908 rs707472 rs9435151 rs4846000
rs730123 rs4661453 rs6678469 rs485897 rs807455 rs4920650 rs2816025 rs477155
rs2235547 rs6691722 rs10903111 rs7513064 rs2236852 rs4659370 rs10794507 rs7535816
rs6698316 rs4949589 rs10799103 rs7519644 rs404405 rs6704396 rs12750693 rs1149038
rs6680621 rs11590681 rs114480320 rs6669395 rs7546366 rs4308943 rs6687753 rs11208299
rs7547176 rs6664708 rs6600384 rs10789403 rs10890155 rs3791051 rs272565 rs2297812
rs1484413 rs1628297 rs2297656 rs12041966 rs4926985 rs6697692 rs6688040 rs3118036
rs494214 rs684867 rs1779866 rs2207789 rs2886919 rs3009577 rs9436678 rs6588044
rs4430373 rs12140250 rs4650112 rs11209397 rs10489547 rs1935244 rs11162136 rs10747346
rs11163300 rs10493766 rs17127806 rs4847196 rs10874866 rs12131293 rs1571049 rs11166508
rs1491646 rs796544 rs625926 rs11185151 rs10785836 rs657420 rs527288 rs2748680
rs4240542 rs4453038 rs4272626 rs12039340 rs380155 rs6683142 rs4950494 rs11588437
rs6587705 rs6427658 rs3795741 rs4661031 rs10465957 rs11265289 rs4656855 rs2369406
rs2502812 rs2250993 rs4657130 rs4657154 rs4657155 rs7513132 rs6700395 rs10799871
rs10799872 rs2841981 rs7543224 rs2205845 rs2103639 rs7544590 rs10919483 rs6683847
rs6425482 rs10737340 rs7525372 rs10912080 rs2861980 rs12022368 rs17574056 rs10797943
rs9425336 rs6663267 rs12137257 rs4651423 rs1602012 rs4534385 rs431889 rs400172
rs516084 rs815742 rs845628 rs1711758 rs2094025 rs10733070 rs9651063 rs623111
rs12118718 rs10801416 rs4657806 rs10919830 rs585041 rs9427715 rs12137900 rs12125583
rs11240672 rs4951309 rs6658163 rs10900447 rs823114 rs2357587 rs61828076 rs11119948
rs12568188 rs340853 rs6668907 rs12738331 rs2813684 rs10779288 rs11117790 rs6604568
rs6604589 rs4846468 rs645142 rs2807845 rs3010852 rs35293291 rs12033057 rs9943197
rs1727029 rs883583 rs6541316 rs7514972 rs4658890 rs10752796 rs6665230 rs7526011
rs9435492 rs9435539 rs6586363 rs10803234 rs6429466 rs746997 rs4659619 rs12038672
rs4406617 rs10926222 rs10495474 rs12144559 rs2291409 rs12744297 rs12119594 rs2085555
rs12143602 rs12141946 rs3127469 rs10802220 rs6661897 rs10754558 rs6688948 rs9677943
rs11674560 rs4927621 rs59771193 rs12476309 rs11690345 rs10171401 rs10929518 rs16864620
rs6756093 rs6718476 rs2693818 rs6741456 rs12617706 rs1430289 rs1367270 rs1034380
rs238629 rs2356357 rs12473958 rs12474828 rs4669490 rs16867226 rs6707887 rs1054561
rs4669492 rs4669625 rs11904084 rs1734341 rs1734342 rs1615421 rs1734358 rs1734361
rs1734365 rs1387570 rs2357821 rs6432266 rs13033675 rs72493344 rs72779862 rs7574217
rs807582 rs11901571 rs7577790 rs12613420 rs2449623 rs589842 rs12999091 rs11125884
rs12466350 rs1447188 rs1447190 rs2593433 rs212752 rs6751657 rs6742602 rs7565016
rs4439939 rs12475896 rs2373782 rs11124965 rs17032635 rs12712931 rs11125128 rs7602044
rs6716567 rs6545107 rs10195274 rs10184260 rs6733430 rs4450649 rs2193690 rs843646
rs7557639 rs4671358 rs4672331 rs7563535 rs1978404 rs1472031 rs11903638 rs2861632
rs12994875 rs13031428 rs11687437 rs10182682 rs11684466 rs13420244 rs6546742 rs6757131
rs13387588 rs4853065 rs11675344 rs2007848 rs4465789 rs4853146 rs2160370 rs2192922
rs2216102 rs10181895 rs10205659 rs925991 rs11691388 rs13029122 rs34767571 rs62170373
rs62170374 rs10192926 rs6729714 rs10165209 rs12472674 rs6547306 rs6758746 rs6547308
rs3100108 rs35391999 rs7581471 rs10203293 rs17026540 rs13395344 rs231556 rs231558
rs4096200 rs13432811 rs10202379 rs12478256 rs17031229 rs10185531 rs12616319 rs10207608
rs12104935 rs12463442 rs315952 rs7594791 rs17046609 rs17046615 rs17046639 rs6758777
rs4849766 rs11122822 rs6758991 rs7587477 rs12466272 rs55977322 rs4848685 rs10187048
rs12619998 rs3768866 rs1866460 rs936131 rs13424930 rs13401007 rs11891214 rs11891266
rs12613726 rs11695854 rs6430460 rs1649570 rs10204209 rs7607239 rs9646663 rs12472074
rs12472110 rs7561770 rs6720897 rs4662303 rs6722966 rs11681900 rs16827230 rs13419995
rs816889 rs10204829 rs1482313 rs4664918 rs4664919 rs6716681 rs12471260 rs1457235
rs7599823 rs6432740 rs12052528 rs3098650 rs17607603 rs3791860 rs16860543 rs4972516
rs11674587 rs12693237 rs10185223 rs17191654 rs6724378 rs6737765 rs10172410 rs11679657
rs13011100 rs13384417 rs6747256 rs7599179 rs13391723 rs34997637 rs7608834 rs12478266
rs16840070 rs12162325 rs11692301 rs7578914 rs11694792 rs6738605 rs12468504 rs13022344
rs6732993 rs10804115 rs10497867 rs7603584 rs4129010 rs6717641 rs7573536 rs12991600
rs6741142 rs16838023 rs7574280 rs4610054 rs13030205 rs10192231 rs1561298 rs11687587
rs828911 rs705649 rs12470053 rs4674066 rs6728330 rs667750 rs1346798 rs16825437
rs2432679 rs7422445 rs4099415 rs4099416 rs4284822 rs6757951 rs10193272 rs6739418
rs10187515 rs13417255 rs4355095 rs10498185 rs2709423 rs4455149 rs10182873 rs10933235
rs10209496 rs10180608 rs12615058 rs12615089 rs4312487 rs6436754 rs6436755 rs6436758
rs4246656 rs12998075 rs6437062 rs2592114 rs2924814 rs7569824 rs6754875 rs3791424
rs10184738 rs4851996 rs12469558 rs749924 rs11714648 rs2600029 rs1178488 rs11129096
rs2320963 rs9310883 rs13063069 rs1396415 rs1688413 rs2637546 rs17709863 rs9837289
rs1872996 rs2543491 rs6443222 rs709641 rs6795673 rs1710893 rs9813290 rs6765768
rs2133132 rs6774271 rs4684999 rs2733534 rs2257984 rs2279017 rs2607755 rs9844200
rs55985119 rs2278962 rs4685320 rs7432238 rs9859926 rs9822136 rs9860391 rs6797574
rs17014597 rs747313 rs6794654 rs7634790 rs4680763 rs9849208 rs13059806 rs1836181
rs13100297 rs3773652 rs6550023 rs12496184 rs4955278 rs17279970 rs6807330 rs2286939
rs2286940 rs9876116 rs4678571 rs6762997 rs11714912 rs9968170 rs2276868 rs6786191
rs499475 rs12639142 rs2878628 rs7426478 rs7372541 rs510013 rs934083 rs4481124
rs12629222 rs753819 rs12632824 rs7613368 rs1901890 rs6777784 rs475747 rs7636925
rs7640062 rs9837200 rs7623286 rs4688495 rs12495731 rs9863628 rs1158924 rs6549221
rs11128143 rs1367369 rs1316780 rs7641488 rs6785021 rs12107824 rs7432324 rs12487433
rs9831375 rs9873622 rs4856379 rs1358606 rs7625954 rs12495441 rs1370209 rs9850360
rs10511133 rs6806126 rs9820215 rs9942007 rs7627313 rs9812699 rs9837006 rs34310679
rs9819239 rs9852345 rs6804539 rs7620246 rs7620442 rs1349790 rs9839497 rs7618295
rs13078920 rs4928088 rs1375511 rs1626282 rs1164084 rs13062004 rs4682251 rs17202592
rs12106967 rs9840563 rs9884006 rs9850446 rs11714459 rs1575037 rs9817322 rs9869738
rs9820381 rs6810172 rs1317671 rs2332690 rs4527323 rs7627031 rs4555544 rs7650872
rs9870482 rs7653440 rs11709339 rs12639254 rs12488259 rs10935019 rs4974500 rs9858763
rs1392920 rs4894320 rs3937966 rs2677421 rs6780250 rs7651071 rs1097939 rs961929
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rs7286517 rs5767076 rs34189568 rs9616585
(二)实验思路及一般操作步骤
本实验方法思路如图1所示，可分为两块：
1、对器官移植患者的受体样本进行目标区域捕获测序，用于基因分型，基因分型实验步骤如图2所示；移植后受体血液样本分离的血细胞充当移植前受体样本，即受体基因组样本。
2、对移植后受体各个采血点的血浆cfDNA样本进行目标区域捕获和高深度测序，用于分析评估各采血点血浆中供体cfDNA占总cfDNA的百分比，如图3所示。
以上各块的具体实验操作步骤如下：
1、基因组目标区域捕获进行SNP分型
基因组SNP分型实验流程如图2所示。先取1μg基因组DNA打断成主带为小片段DNA，打断后DNA片段进行末端补平，加接头，构建完成的文库，通过上述自主设计合成的液态芯片将目标区域进行富集，然后通过PCR扩增后纯化产物即可用于测序分析，其具体步骤如下：
1.1外周血样本基因组DNA的提取；
1.2取1μg基因组DNA，超声波打断为小片段DNA(随测序仪建库的不同而变化)；
1.3把打断成小片段的DNA修复成平末端；
1.4加上接头后，用琼脂糖电泳切胶法选择DNA片段大小；
1.5PCR扩增目地片段，用芯片进行SNP位点捕获；
1.6PCR扩增，Agilent 2100检测文库质量合格后，进行高通量测序。
2、各采血点的血浆cfDNA检测
血浆cfDNA检测实验流程如图3所示。各采血点血浆分离后，提取cfDNA、末端修复、加接头、PCR扩增，自主合成芯片杂交，杂交产物通过PCR扩增，纯化后的产物即可用于测序分析，具体步骤如下：
2.1两步离心法分离各采血点血浆，避免基因组污染，提取血浆cfDNA；
2.2浆cfDNA修复成平末端；
2.3加上接头并PCR扩增目地片段，用芯片进行SNP位点捕获；
2.4PCR扩增捕获的片段，Agilent 2100检测文库质量合格后，进行高通量测序。
二、获得测序数据后，将数据分析方法编写成一软件包，软件包实现的内容一般包括以下：
1.与参考基因组比对。以BGISEQ-100测序平台为例，对BGISEQ-100有效测序数据使用tmap工具比对到参考基因组上，得到精确的比对结果。其中tmap工具源自：https://github.com/iontorrent/TS/tree/master/Analysis/TMAP。其他测序平台候选比对工具有Burrows-Wheeler Aligner(BWA，参考文献：Li H.and Durbin R.(2009)Fast and accurate short readalignment with Burrows-Wheeler Transform.Bioinformatics,25:1754-60.)、Bowtie(参考文献：Langmead B,et al.Ultrafast and memory efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.Genome Biol10:R25.)等。
2.比对结果去除PCR重复片段。以BGISEQ-100测序平台为例，对tmap工具比对后的结果(bam格式)使用BamDuplicates工具去除PCR重复片段。其中，BamDuplicates工具源自Ion Torrent Systems,Inc.，其他测序平台候选去重工具有samtools rmdup及Picard MarkDuplicates(工具官网地址：http://broadinstitute.github.io/picard/index.html)等。
3.统计及质量控制。统计目标区域数据量占总数据量的比例、目标区域的平均测序深度、目标区域的覆盖率等，生成一系列质控指标用于判断测序数据的质量情况。
4.受体血细胞及血浆DNA按目标SNP位点进行展开
去重后的受体血浆DNA数据仅保留唯一比对的测序数据，分别对受体血细胞及血浆去重后的数据进行samtools pileup(参考文献：Li H.,Handsaker B.,Wysoker A.,Fennell T.,Ruan J.,Homer N.,Marth G.,Abecasis G.,Durbin R.and 1000Genome Project Data Processing Subgroup(2009)The Sequencealignment/map(SAM)format and SAMtools.Bioinformatics,25,2078-9.[PMID:19505943].软件官网地址：http://samtools.sourceforge.net/index.shtml)，对pileup结果进行每个位点支持不同碱基的reads数进行统计。
前4步对进行目标区域捕获测序的受体血细胞及血浆样本均适用。对于血浆样本，在第3步去重后，还需去掉多比对的reads，只获取唯一比对的reads。
5.受体血细胞DNA样本基因分型
以BGISEQ-100测序平台为例，使用TVC工具(默认参数targetseq_germline_lowstringency_p1_parameters.json文件)(参考：http://ioncommunity.lifetechnologies.com/community/products/torrent-variant-caller)分别检测受体血细胞(或组织)的遗传性SNP(Germline SNP)，得到部分基因分型位点。对TVC工具无法分型的位点，通过频率即支持reads的比例来分型，最大化基因分型位点，同时进行降噪处理，仅保留高质量的基因分型结果。其他测序平台候选基因分型工具有GATK(软件获取地址：https://www.broadinstitute.org/gatk/index.php)等，基因分型的具体操作步骤为：
(1)使用TVC工具对受体血细胞DNA数据进行分型，测序深度阈值为6。
(2)统计每个位点的基因型。对于TVC工具无法分型的位点，根据统计等位基因频率来分型。将频率>95％的位点定义为纯合子，将频率在25％(包含25％)至95％(包含95％)间的位点定义为杂合子。对于有多种基因型的杂合子，取最大频率的两种碱基作为其基因型。
(3)仅保留等位基因频率为100％、测序深度大于等于平均测序深度的纯合子位点。
6.统计受体血浆特定位点频率统计
在保留的受体血细胞纯合子位点中，统计受体血浆DNA中不同等位基因的频率，获取血浆频率列表。要求血浆中最多允许2种等位基因，并且不同等位基因的reads支持数至少为2条。
7.受体血浆中供体比例统计
与受体血细胞不同的等位基因碱基大部分可认为来自供体，极小一部分是由于测序或比对错误导致，而供体在该位点可能为杂合子或者纯合子，具体表型未知，可通过频率来判断。以10％供体比例、1000X平均测序深度的血浆样本为例，若在某位点中参考碱基为A，受体血细胞全部为A碱基的reads，受体血浆存在T碱基reads，T碱基reads可能来自供体。若供体为杂合子，则T支持reads条数理应为5，检测T的频率比例为5％，A支持reads条数理应为995，检测A的频率比例为95％；若供体为纯合子，则T支持reads条数理应为10，检测T的频率比例为10％，A支持reads条数理应为990，检测A的频率比例为90％。基于每个可区分供受体位点中供体的频率可代表供体含量的假设，在获取的不同等位基因频率列表中，理论上可明显聚类两类，这两类值存在两倍关系。使用K-means(k＝2)聚类，将频率按均值迭代聚成两类，使用均值进行卡方检验，判断两倍关系的显著性，输出两类均值。
8.生成报告。对质控(QC)，供体比例结果进行汇总生成一张Excel表，数据解读人员在此Excel表格基础上对数据进行解读。
图4显示以上数据分析流程。
目前已有的高通量测序检测混合cfDNA样本中的比例相对少的供体的cfDNA含量的方法或成本过高，或依赖于供体遗传样本。本发明提出一种技术路线为：1)对移植后受体血液样本进行血浆分离，受体血细胞(或组织)DNA通过目标区域捕获测序进行基因分型，保留纯合子位点；2)对移植后受体血浆DNA进行目标区域捕获测序，统计受体血细胞为纯合子的位点中不同等位基因的频率，通过K-means聚类及卡方检验等模型，计算其中的供体cfDNA的比例。本发明将该技术路线编码成一体化操作、可独立部署、高效运行的软件包，目的之一在于提供一种基于高通量测序法的无供体依赖性的器官移植免疫排斥监测的分析方法及软件包。
综合以上，该示例设计了一个新的芯片和相应的实验方法以及数据分析检测方法，至少有以下四个方面的有益效果：
(1)无需供体样本即可进行检测，应用广泛；运用高通量测序技术的检测方法中，首次通过统计受体血细胞为纯合子的位点中不同等位基因的频率进行免疫排斥检测，摆脱了对供体样本的依赖，特别适用于追溯供体样本有一定难度的器官移植患者。因而本实验方法应用更加广泛，能够辅助检测多种器官移植免疫排斥反应如肺移植、心脏移植、肝移植、肾移植等。
(2)检测结果更加准确。本实验方法要求高深度的捕获测序，检测值能准确的反映血浆cfDNA中真实供体含量，使结果更加准确；而且，首次提出可区分供受体位点中供体的频率可反映供体含量的假设，创新性地运用等位基因频率检测的方法，可以取代传统加权公式，来计算供体cfDNA比例，检测值准确反映真实供体cfDNA含量。对移植后血浆进行高深度的捕获测序，而非传统超低深度的全基因组测序，以及严格的降噪处理，检测供体比例更准确。
(3)数据分析方法可利用灵活、一体化的软件包实现，可独立部署、高效运行。
(4)低创或无创的检测、可接受的成本，可作为一种便捷、早期、无创、准确的移植排斥监测技术，可作为临床免疫排斥检测的辅助或补充手段。
实施例二
实施例设计思路如下：取2个正常人血样(取自志愿者)，一个为供体，另一个为受体，混合出待测样本，进行模拟实验。采取的血样分离血细胞与血浆，受体血细胞(无需供体血细胞)提取基因组DNA后，打断DNA并进行目标区域捕获测序，用于基因分型；供体和受体血浆提取cfDNA后，Agelint 2100测定其浓度，供受体的cfDNA按3.5％、5.5％、8％、10％比例人为混合，然后将混合的cfDNA建库捕获测序(本实施例所用测序仪为BGISEQ-100测序平台)，用以检测本实验方法的可靠性。按照实施例一中的实验步骤，本实施例步骤也分为两步，1、受体基因组目标区域捕获测序；2、各混合cfDNA目标区域捕获测序。具体如下：
实施例中接头、PCR扩增引物由Invitrogen公司合成，所使用的C0T1DNA购买于Invitrogen公司。所用试剂信息如下表所示：
1、基因组目标区域捕获测序
1)分离血浆和血细胞
①抗凝管取血(5ml)后，颠倒混匀5-6次充分混匀；
②水平离心机，1600g，4℃离心10min；
③将上清(约1.5ml)分装到2ml管中，下层即为血细胞；
④16000g，4℃离心10min去除残余细胞，将上清转放新的1.5ml管中，标记后-80℃保存。
2)基因组DNA的提取
取200μl分离的血细胞进行基因组DNA提取，具体步骤参见试剂盒说明书。
3)样品打断(Fragmentation)
①在Bioruptor仪制冷水槽中加Milli-Q的水，水面介于MAX线与MIX线之间；
②开启制冷开关并浆制冷仪的温度设置为4℃；
③当制冷水槽的水温达到4℃时开启Bioruptor仪器，制冷水槽中的水会被运送到打断运行槽中，并开始循环流动；
④用Nuclease-free water或(1×TE)将1μg的g DNA稀释到100μL，混匀后用移液器小心的转入打断小管中；点击“set”，按下表设置参数：ON 30s，OFF 30s，5个Cycle；将打断管放入打断转盘装置，并放进打断槽中。点击“run”按钮，盖上仪器盖子，样本开始打断；仪器停止后将样品取出，涡旋振荡10s混匀瞬离后冰浴3min，重复步骤④共6次；
⑤取2μL的样品用于电泳检测打断效果，主带位于150-250bp左右视为合格。
4)打断后DNA的纯化(Agencourt AMPure beads)
①使用前将磁珠置于室温下平衡30min；
②将100μL打断后的DNA转入1.5mL的EP管中，加入1.8倍体积的磁珠(180μL)，用移液器吹打10次混匀；
③室温下静置10min使磁珠与DNA充分结合，然后瞬时离心3秒；
④将EP管放到磁力架上至液体澄清，用移液器小心的去除上清；
⑤保持EP管在磁力架上，加入500μL 70％的乙醇洗涤磁珠表面，以除去盐离子以及未吸附的DNA等，除去乙醇，重复一次；
⑥瞬时离心，尽量完全去除乙醇，并将磁珠置于开盖置于磁力架上，至磁珠表面没有光泽(约10分钟)；
⑦加入25μL Elution Buffer，轻轻将磁珠从管壁冲洗下来并吹打10次混匀；
室温静置10min以使DNA完全从磁珠上洗脱下来；
⑧将EP管放到磁力架上至液体澄清。将25μL洗脱下来的DNA转入一个新的EP管中。
5)末端修复
在1.5ml的离心管中配制末端修复反应体系：
上述100μL反应混合物轻微振荡混合均匀，瞬时离心，在Thermomixe或水浴锅中20℃温浴30min。
6)末端修复产物的纯化(Agencourt AMPure beads)
加入1.8倍体积的磁珠(180μL)纯化，用22μL Elution Buffer洗脱
7)Adapter的连接(Adapter Ligation)
在1.5ml的离心管中配制Adapter连接反应体系，体系如下表。
上述100μL反应混合物轻微振荡混合均匀,瞬时离心后置于Thermomixer中20℃温浴15min。
8)Agencourt AMPure beads纯化连接产物
加入1.5倍体积的磁珠(150μL)纯化，用32μL Elution Buffer洗脱
9)片段选择
①每个样品称取1.3g的琼脂糖于65ml的1×TAE中；
②点样之前加入1μl上样缓冲液再次检查胶孔是否漏液；
③使用NEB 50bp DNA Ladder，须取出1μl与2μl上样缓冲液充分混匀后点样；
④将来自步骤5.8的样品分别至少与10μl上样缓冲液充分混合；
⑤先130使样品跑入胶中，再100V电压下电泳120min；
⑥100ml的电泳缓冲液1×TAE，加入10μl核酸染料EB充分混匀待用；
⑦电泳结束后取出凝胶，放到染胶盘中染色10min；
⑧在凝胶系统中拍照存档；
⑨以Marker为参照，切230bp-250bp回收，再分别切210bp-230bp和250bp-270bp作为备份；
⑩完成切胶后将剩下的胶块放在保鲜膜或PE手套上，用凝胶成像系统中拍照并存档。确认一切没有问题后可将所剩凝胶丢弃至垃圾桶中；
10)片段凝胶回收(QIAquick Gel Extraction Kit)
①往需回收的凝胶中加入6倍体积(600μl)缓冲液QG。
②50℃孵育10min，期间颠倒混匀3～5次，以帮助凝胶溶解。
③往步骤5.10.2的溶液中加入1倍体积(100μl)预冷的异丙醇，充分混匀。
④将步骤5.10.3的溶液加入到核酸吸附柱(MinElute Spin Column)中，室温静置2min，17900g离心1min。
⑤将步骤5.10.4的滤液重新加入到吸附柱中，室温静置2min，17900g离心1min，弃滤液。
⑥往吸附柱中加入500μl缓冲液QG，17900g离心1min，弃滤液。
⑦往吸附柱中加入750μl缓冲液PE，室温静置2～5min，17900g离心1min，弃滤液，重新17900g离心1min。
⑧将吸附柱转移到新的1.5ml离心管中，环吸后室温静置数分钟以晾干吸附柱中残留的液体。
⑨往核酸吸附柱的膜中间悬空加入35μl缓冲液EB，室温静置4min，17900g离心1.5min。
11)片段浓度测定(Qubit)
12)Non-Captured样品LM-PCR
在0.2mL管中配制PCR反应体系：
置于PCR仪中按照下列程序反应：
72℃ 20min，95℃ 5min，8个循环的95℃ 30s/58℃ 30s/70℃ 1min、72℃ 5min、4℃ Hold
13)PCR产物的纯化
加入1.5倍体积的Agencourt AMPure beads(150μL)纯化，用32μL Elution Buffer洗脱。
14)混合(Pooling)
将各文库等比例Pooling成750ng。
15)杂交
杂交前准备
①将heat block调到95℃
②将分装好的4.5μLExome Library从-20℃冰箱中拿出，放在冰上化冻。
样品的杂交
①在一个1.5mL的PE管中加入：
②盖好管盖，用干净的50ml注射器针在分装的EP管盖上戳一个孔，将上述样品文库和block的混合物置于浓缩仪中蒸干，温度设置为60℃；
③使用新的离心管管盖替换戳孔的管盖，标记，并分别加入以下两种试剂：
④将样品震荡混匀后置于离心机上全速离心10秒。将离心后样品转移至95℃heat block中10分钟使DNA变性；
⑤将样品取出，震荡混匀后室温条件下全速离心10秒；
⑥将上述杂交混合物转入分装好的4.5μL Exome Library中；
⑦震荡混匀后置于离心机上全速离心10秒；
⑧放在PCR仪上57℃杂交24h，PCR仪热盖应设置保持在105℃；
16)捕获序列的洗涤和洗脱
准备链霉素磁珠
①提前从冰箱中拿出链霉素磁珠，vortex磁珠1min，使其充分混匀；
②在1.5mL的EP管中加入100μL磁珠(1个样品)；
③将EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心的去除上清；
④保持EP管在磁力架上，加入200μL(2倍体积)的Streptavidin Dynabead Binding and Wash Buffer；
⑤从磁力架上取下EP管，vortex 10s混匀，将EP管重新放回磁力架至液体澄清，用移液器小心的去除上清，用移液器小心的去除上清，重复洗两次；
⑥用100μL的Streptavidin Dynabead Binding and Wash Buffer悬浮磁珠，并将其转入0.2mL的小管中；
⑦用磁力架结合磁珠，直到液体澄清，用移液器小心的去除上清，现在磁珠可以用来结合捕获的DNA了。
将捕获到的DNA结合到链霉素磁珠上
①将杂交混合物吸出来(记录杂交后剩余体积)加到5.2准备好的磁珠中
②用移液器吹打10次混匀。
③将小管放在PCR仪上57℃孵育45min(PCR仪热盖应设置保持在105℃,每隔10min拿出来vortex 3s以防止磁珠沉淀。
结合了捕获DNA的链霉素磁珠的洗涤
①孵育45min后，将混合物从0.2mL的小管中转入1.5mL的EP管中，将EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心的去除上清。
②加100μL预热到57℃的1X Wash Buffer I，vortex 10s混匀，将EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心的去除上清
③从磁力架上取下EP管，加入200μL预热到47℃的1X Stringent Wash Buffer，用移液器吹打10次混匀。57℃孵育5min，将EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心的去除上清。重复本次操作两次，即总共用1X Stringent Wash Buffer洗三次；
④加200μL室温下放置的1X Wash Buffer I(不用47℃预热的)，vortex 2min混匀，如果液体溅到管盖上，用手指轻弹EP管使其集中到管低。将EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心的去除上清；
⑤加200μL室温下放置的1X Wash Buffer II，vortex 1min混匀。将EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心的去除上清。
⑥加200μL室温下放置的1X Wash Buffer III，vortex 30s混匀。将EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心的去除上清。
⑦从磁力架上取下EP管，加入30μLΜltraPureWater。
17)Captured样品LM-PCR
LM-PCR
在1.5mL管中为每个样品按下表配制PCR反应体系：
置于PCR仪中按照下列程序反应。
95℃ 5min、12个循环的95℃ 15s/58℃ 15s/70℃ 1min、72℃ 2min、4℃ Hold
PCR产物的纯化(Agencourt AMPure beads)
①将PCR混合物(100μL)转入1个1.5mL的EP管中，将EP管放到磁力架上至液体澄清，将上清转移到一个新的EP管中，弃链霉素磁珠。
②上清中加入1.5倍体积的磁珠(150μL)进行纯化，用52μL Elution Buffer洗脱；
PCR产物的再次纯化(Agencourt AMPure beads)
加入1.5倍体积的磁珠(75μL)进行纯化，用32μL Elution Buffer洗脱；
18)文库检测
使用Agilent 2100Bioanalyzer检测文库产量
2、各混合cfDNA目标区域捕获测序
1)cfDNA提取
①取200μl血浆到2ml的离心管中，加缓冲液GA到100μl终体积。
②加入20μl Proteinase K溶液，涡旋混匀。
③加入200μl的缓冲液GB，轻轻颠倒混匀，56℃孵育10min，并不时摇动样品。简短离心以去除管盖内壁的液滴。
④加入200μl的无水乙醇。如果室温超过25℃，请将乙醇置冰上预冷。轻轻颠倒混匀样品，室温放置5min，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
⑤将上一步所得溶液添加到一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
⑥向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
⑦向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW,12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
⑧重复操作步骤⑦。
⑨12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置2-5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
⑩将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
2)Qubit HS测定核酸浓度(2100检测)
3)末端修复与纯化
①按照下列的配比准备反应混合物：
在Thermomixer中20℃，反应30min。
②磁珠纯化
加入1.8倍体积的磁珠(90μL)进行纯化，用24μL Elution Buffer洗脱；
4)DNA Adaptor连接与连接产物纯化
①按照下列的配比准备反应混合物
在Thermomixer中，20℃反应20min。
②磁珠纯化
加入1.2倍体积的磁珠(84μL)进行纯化，用32μL Elution Buffer洗脱；
③Qubit测定核酸浓度
5)PCR反应与纯化
①PCR体系和反应条件，扩增体系：
反应程序：72℃ 20min、95℃ 5min、15个循环的95℃ 30s/60℃ 30s/70℃ 30s/ 70℃ 5min、12℃ ∞。
②PCR产物的磁珠纯化
加入1倍体积的磁珠(100μL)进行纯化，用32μL Elution Buffer洗脱；
③Qubit测定核酸浓度
6)后续杂交洗脱等实验步骤同基因组捕获测序
3、结果评价和分析
我们抽取两个自愿者的血液样本，一个做为供体(15ml血液)，另一个做为受体(25ml血液)，分离血浆和血细胞后，供体得到6.6ml血浆，7.5ml血细胞，受体得到11.4ml血浆，12ml血细胞。得到的样本用于下述实验。
3.1基因组DNA的SNP位点分型实验结果及分析
1)基因组DNA提取
取200μl分离的血细胞用于提取DNA，用Qubit进行核酸浓度检测，提取的结果如表2所示，结果显示提取正常中，可用于下步实验。
表2 两志愿者的基因组DNA提取结果
2)打断、加接头及胶回收
取1μg供体基因组DNA超声波打断后，加接头并用琼脂糖电泳进行DNA片段大小选择，我们切取230-250bp和250-270bp大小的片段，其中一份作为备份，胶回收核酸浓度(Qubit检测)如表3所示，胶回收的核酸总量达到杂交捕获的要求，可进行下步实验。
表3 打断后片段选择结果
3)PCR后进行液态芯片杂交捕获
进行一个PCR扩增后，取750ng进行杂交捕获：
4)出库浓度
目的序列杂交捕获下来，洗脱，进行PCR扩增后即可进行下一步的上机测序，出库浓度如下表4所示，出库浓度符合0.3K大小芯片杂交正常水平，2100结果正常，可用于测序分析。
表4 基因组DNA杂交出库结果
3.2血浆cfDNA捕获测序检测结果
我们人工模拟了3.5％、5.5％、8％、10％供体比例的实验，即把两个正常人的血浆cfDNA样本按上述比例混合在一起，然后用高通量测序进行检测。
1)血浆提取cfDNA的提取
供体用6.6ml血浆进行提取，受体用11.4ml血浆进行提取，得到的结果为表5所示，正常人的血浆cfDNA浓度较低，结果显示提取正常。
表5 血浆cfDNA提取结果
2)按模拟浓度比例混合cfDNA
按我们设计的模拟浓度3.5％、5.5％、8％、10％进行混合，具体操作如下：
3)末修，加接头及PCR
混合好的血浆cfDNA，末端修复后，加上不同的接头，进行一个PCR扩增后，纯化浓度如表6所示，结果正常，可用于下步测序分析。
表6 血浆建库PCR纯化结果
4)PCR后进行液态芯片杂交捕获
目地序列杂交捕获下来，洗脱，进行PCR扩增后即可进行下一步的上机测序，出库浓度如下表7所示，出库浓度符合0.3K大小芯片杂交正常水平，2100结果正常，可用于测序分析。
表7 血浆cfDNA杂交出库结果
3.3结果分析与画图
上述的文库用BGISEQ-100测序平台进行测序，得到的数据通过生物信息学分析，得了各个点的供受体cfDNA比值，画成线性图后，结果如图5所示，我们可以看出，其符合线性规律(R2＝0.9999)，证明我们发明的不依赖供体样本的实验方法应用于监测器官移植免疫排斥的灵敏度优于普通方法。
实施例三
为验证运用等位基因频率检测方法的技术可行性，进行已知供体比例的模拟验证试验。以BGISEQ-100测序平台为例，在该实施例中选择正常受体(样品名R)血细胞样品进行目标区域捕获测序，对混合了供体血浆DNA的受体血浆同样进行目标区域捕获测序，混合比例分别为3.5％、5.5％、8％、10％，样品名分别于混合比例命名，对测序有效数据通过tmap比对、BamDuplicates去重、质量控制(QC)、受体血细胞基因分型、受体血浆频率统计、供体比例计算，最终获得4个采血点的供体含量检测报告，以评估器官移植排斥程度。
本检测系统各部流程方法都已整合到软件Donor_cfDNA中，本软件的运行环境为Unix/Linux操作系统，通过Unix/Linux命令行运行。
具体操作步骤如下：
在LINUX操作系统计算机终端中输入以下命令：
perl Donor_cfDNA_main.pl-l list-o result
Donor_cfDNA_main.pl命令行参数见表8的参数说明。
表8 参数说明
一个完整的list表举例如下:
>RD
receptor 1.bam
3.56.bam
5.57.bam
88.bam
10 10.bam
该list表示名为RD的模拟实验，需检测混合了供体DNA比例分别为3.5％、5.5％、8％、10％采样点文库的供体比例。
部分分析结果如表9和表10所示。
表9 统计及质量控制分析
注：上表为结果节选
表10 供体cfDNA比例结果
表10 中每列标签解释及意义如下：
从上述结果来看，检测供体比例与实际供体含量虽然不是完全相等的关系(呈线性关系)，但数值较接近，理论上加大血浆的目标区域平均测序深度至500X，甚至1000X，检测比例值更精确。说明使用该方法技术上可行，可用于或辅助用于检测移植物供体cfDNA含量，进而移植后受体急性排斥的动态监测。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种确定受体cfDNA样本中供体来源的cfDNA的比例的方法，其特征在于，包括：
获取第一测序数据和第二测序数据，
所述第一测序数据为受体基因组DNA的至少一部分的测序结果，包括多个第一读段，
所述第二测序数据为受体cfDNA的至少一部份的测序结果，包括多个第二读段；
将所述第一测序数据和所述第二测序数据分别与参考序列进行比对，对应获得第一比对结果和第二比对结果；
基于所述第一比对结果进行SNP检测，获得第一分型结果，所述第一分型结果包括多个一级纯合基因型SNP，表示所述一级纯合基因型SNP在所述第一测序数据中的基因型为AA；
基于所述第二比对结果中比对上二级纯合基因型SNP的第二读段的量，确定所述供体来源的cfDNA的比例，
所述二级纯合基因型SNP为满足以下条件的一级纯合基因型SNP的至少一部分：第二比对结果中比对上该位点的第二读段中包含不支持等位基因A的第二读段。
2.一种确定受体cfDNA样本中供体来源的cfDNA的比例的方法，其特征在于，包括：
获取第一测序数据，所述第一测序数据为受体基因组DNA的至少一部分序列的测序结果，包括多个第一读段；
将所述第一测序数据与参考序列进行比对，获得第一比对结果；
基于所述第一比对结果进行SNP检测，获得第一分型结果，所述第一分型结果包括多个一级纯合基因型SNP，表示所述一级纯合基因型SNP为AA；
获取第二测序数据，所述第二测序数据为受体cfDNA的至少一部份的测序结果，包括多个第二读段；
将所述第二测序数据与所述参考序列进行比对，获得第二比对结果；
基于所述第二比对结果中比对上二级纯合基因型SNP的第二读段的量，确定所述供体来源cfDNA的比例，
所述二级纯合基因型SNP为满足以下条件的一级纯合基因型SNP的至少一部分：第二比对结果中比对上该位点的第二读段中包含不支持等位基因A的第二读段。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述获取第一测序数据和/或第二测序数据，包括：
获取所述受体基因组DNA样本和/或所述受体cfDNA样本，所述基因组DNA样本包含基因组DNA，所述cfDNA样本包含cfDNA；
对所述基因组DNA和/或cfDNA进行捕获，获得第一目的片段和/或第二目的片段；
对所述第一目的片段和/或第二目的片段进行测序，获得所述第一测序数据和/或所述第二测序数据。
4.权利要求3的方法，其特征在于，对所述基因组DNA进行捕获，包括：
对所述基因组DNA进行片段化，获得第一DNA片段，任选的，所述第一DNA片段的大小为150-250bp；
对所述第一DNA片段进行末端修复，获得第一修复片段；
对所述第一修复片段进行测序接头连接，获得第一连接产物；
对所述第一连接产物进行大小选择，获得预定大小的第一连接产物，任选的，所述预定大小的第一连接产物的大小为210-270bp；
对所述预定大小的第一连接产物进行扩增，获得第一扩增产物；以及
对所述第一扩增产物进行所述捕获，以获得所述第一目的片段。
5.权利要求3的方法，其特征在于，对所述cfDNA进行捕获，包括：
对所述cfDNA进行末端修复，获得第二修复片段；
对所述第二修复片段进行测序接头连接，获得第二连接产物；
对所述第二连接产物进行扩增，获得第二扩增产物；以及
对所述第二扩增产物进行所述捕获，以获得所述第二目的片段。
6.权利要求3-5任一方法，其特征在于，利用液相芯片进行所述捕获，
所述捕获的区域包括以下合并(i)-(iii)中的至少之二后的非冗余位点：
(i)人类群体等位基因频率数据库中的杂合度为0.48-0.5的SNP位点，
(ii)在千人基因组数据库的东亚人群中的次等位基因频率为0.5，或者在该数据库中的所有群体中的平均次等位基因频率为0.4-0.5的SNP位点，
(iii)在HapMap数据库的CHB子库中的次等位基因频率大于0.4，或者次等位基因频率为0.5，或者杂合度为0.48-0.5的SNP位点；
任选的，所述捕获的区域包括表1所示的位点；
任选的，所述测序的平均深度为不小于200×。
7.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述获得第一比对结果和/或第二比对结果之后，
对所述第一比对结果和/或所述第二比对结果进行去重，分别以去重后的第一比对结果和/或去重后的第二比对结果替代所述第一比对结果和/或所述第二比对结果；
任选的，所述基于第一比对结果进行SNP检测，获得第一分型结果，包括进行以下a或者进行以下a和b：
a.依据所占的比例大于95％的那一类第一读段，确定该位点的基因型，
b.依据所占的比例大于等于25％且小于等于95％的多类第一段读段中的所占比例最大的前两类第一读段，确定该位点的基因型，
所述多类第一读段之间的区别在于其共同比对上的位点的相应位置上的碱基不同；
任选的，所述一级纯合基因型SNP为等位基因频率为100％、和/或测序深度大于等于平均测序深度的位点；
任选的，在进行所述基于第二比对结果中比对上二级纯合基因型SNP的第二读段的量，确定所述供体来源cfDNA的比例之前，
去除所述第二比对结果中的非唯一比对的第二读段；
任选的，所述基于第二比对结果中比对上二级纯合基因型SNP的第二读段的量，确定所述供体来源cfDNA的比例，包括：
对所述量进行聚类，获得聚类结果，
依据所述聚类结果中呈两倍关系的两类量中的至少一类确定所述供体来源cfDNA的比例。
8.一种确定受体cfDNA样本中共体来源的cfDNA的比例的装置，其特征在于，包括：
数据输入单元，用于输入数据；
数据输出单元，用于输出数据；
处理器，用于执行可执行程序，所述可执行程序包括完成权利要求1-7任一方法；
存储单元，与所述数据输入装置、所述数据输出装置和所述存储器相连，用于存储数据，其中包括所述可执行程序。
9.一种监测器官移植排斥的方法，其特征在于，包括：
分别于不同时间点对受体进行采血，获得多个血液样本；
利用权利要求1-7任一方法确定每个所述血液样本中供体来源cfDNA的比例；
基于确定的多个所述供体来源cfDNA的比例，进行所述监测。
10.一种监测器官移植排斥的装置，其特征在于，包括：
样本获取单元，用以分别于不同时间点对受体进行采血，获得多个血液样本；
供体cfDNA比例确定单元，与所述样本获取单元相连，用以利用权利要求1-7任一方法确定每个所述血液样本中供体来源cfDNA的比例；
监测单元，与所述供体cfDNA比例确定单元相连，用以基于确定的多个所述供体来源cfDNA的比例，进行所述监测。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913682A (zh) * 2018-07-05 2018-11-30 上海奥测医疗科技有限公司 一种制备cfDNA参考品的方法
CN109280696A (zh) * 2017-07-21 2019-01-29 安塞斯（北京）生物技术有限公司 Snp检测技术拆分混合样本的方法
CN110310699A (zh) * 2019-07-01 2019-10-08 江苏里下河地区农业科学研究所 基于全基因组序列挖掘目标基因序列的分析工具及应用
CN110800063A (zh) * 2017-04-21 2020-02-14 Illumina公司 使用无细胞dna片段大小检测肿瘤相关变体
CN111370057A (zh) * 2019-07-31 2020-07-03 深圳思勤医疗科技有限公司 确定样本染色体结构变异信号强度以及插入片段长度分布特征的方法及应用
CN113061666A (zh) * 2020-12-30 2021-07-02 中南大学湘雅二医院 肝移植后巨细胞病毒的检测方法、应用及系统
WO2022126750A1 (zh) * 2020-12-17 2022-06-23 厦门大学 一种检测受体样品中供体的存在或比例的方法和试剂盒
CN116445596A (zh) * 2023-06-09 2023-07-18 军科正源（北京）药物研究有限责任公司 一种用于人类基因分型的产品、方法及其用途

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
WO2014011928A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
EP3736344A1 (en) 2014-03-13 2020-11-11 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2016183106A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
WO2020076957A1 (en) * 2018-10-09 2020-04-16 Tai Diagnostics, Inc. Cell lysis assay for cell-free dna analysis
US11931674B2 (en) 2019-04-04 2024-03-19 Natera, Inc. Materials and methods for processing blood samples
CN110396560A (zh) * 2019-06-20 2019-11-01 上海奥根诊断技术有限公司 用于检测ddcfDNA的产品在制备检测BKVAN产品中的用途及方法
CN110452975A (zh) * 2019-06-28 2019-11-15 上海奥根诊断技术有限公司 用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后中的用途
CN112951319B (zh) * 2021-02-25 2024-01-09 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种筛选siRNA序列以降低脱靶效应的方法及系统
WO2023116717A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 The First Affiliated Hospital Of Guangzhou Medical University Method for monitoring donar dna fraction

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104232777A (zh) * 2014-09-19 2014-12-24 天津华大基因科技有限公司 同时确定胎儿核酸含量和染色体非整倍性的方法及装置
WO2015138997A1 (en) * 2014-03-14 2015-09-17 Caredx, Inc. Methods of monitoring immunosuppressive therapies in a transplant recipient

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT3004388T (lt) * 2013-05-29 2019-01-25 Chronix Biomedical Donoro ne ląstelinės dnr aptikimas ir jos kiekio nustatymas organo transplantanto recipientų apytakoje
WO2015069933A1 (en) * 2013-11-06 2015-05-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Circulating cell-free dna for diagnosis of transplant rejection
CN104830986B (zh) * 2015-05-07 2018-08-03 深圳承启生物科技有限公司 一种检测胎儿基因信息的方法、装置和系统

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015138997A1 (en) * 2014-03-14 2015-09-17 Caredx, Inc. Methods of monitoring immunosuppressive therapies in a transplant recipient
CN104232777A (zh) * 2014-09-19 2014-12-24 天津华大基因科技有限公司 同时确定胎儿核酸含量和染色体非整倍性的方法及装置

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110800063A (zh) * 2017-04-21 2020-02-14 Illumina公司 使用无细胞dna片段大小检测肿瘤相关变体
CN110800063B (zh) * 2017-04-21 2023-12-08 Illumina公司 使用无细胞dna片段大小检测肿瘤相关变体
CN109280696A (zh) * 2017-07-21 2019-01-29 安塞斯（北京）生物技术有限公司 Snp检测技术拆分混合样本的方法
CN109280696B (zh) * 2017-07-21 2021-03-09 安塞斯（北京）生物技术有限公司 Snp检测技术拆分混合样本的方法
CN108913682A (zh) * 2018-07-05 2018-11-30 上海奥测医疗科技有限公司 一种制备cfDNA参考品的方法
CN110310699A (zh) * 2019-07-01 2019-10-08 江苏里下河地区农业科学研究所 基于全基因组序列挖掘目标基因序列的分析工具及应用
CN111370057A (zh) * 2019-07-31 2020-07-03 深圳思勤医疗科技有限公司 确定样本染色体结构变异信号强度以及插入片段长度分布特征的方法及应用
WO2022126750A1 (zh) * 2020-12-17 2022-06-23 厦门大学 一种检测受体样品中供体的存在或比例的方法和试剂盒
CN113061666A (zh) * 2020-12-30 2021-07-02 中南大学湘雅二医院 肝移植后巨细胞病毒的检测方法、应用及系统
CN116445596A (zh) * 2023-06-09 2023-07-18 军科正源（北京）药物研究有限责任公司 一种用于人类基因分型的产品、方法及其用途
CN116445596B (zh) * 2023-06-09 2023-09-15 军科正源（北京）药物研究有限责任公司 一种用于人类基因分型的产品、方法及其用途

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WO2017045654A1 (zh) 2017-03-23
CN106544407B (zh) 2019-11-08

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