CN110452975A - 用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后中的用途 - Google Patents

用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110452975A
CN110452975A CN201910587416.0A CN201910587416A CN110452975A CN 110452975 A CN110452975 A CN 110452975A CN 201910587416 A CN201910587416 A CN 201910587416A CN 110452975 A CN110452975 A CN 110452975A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ddcfdna
kidney
pulmonary infection
cfdna
blood plasma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910587416.0A
Other languages
English (en)
Inventor
蒋廷亚
刘海涛
葛军
刘枫
王啸晨
黎小锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Augen Diagnostic Technology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Augen Diagnostic Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Augen Diagnostic Technology Co Ltd filed Critical Shanghai Augen Diagnostic Technology Co Ltd
Priority to CN201910587416.0A priority Critical patent/CN110452975A/zh
Publication of CN110452975A publication Critical patent/CN110452975A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后的产品中的用途，用于检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后效果评估的产品，以及检测肺部感染对移植肾损伤和预后效果评估的方法，所述的用于检测ddcfDNA的产品可以检测肾移植受者血浆中供体游离cfDNA(ddcfDNA)的水平，根据供体游离cfDNA(ddcfDNA)的水平诊断肺部感染对移植肾功能损伤和预后效果评估，能够实现对器官移植受者术后的肺部感染对移植肾损伤和预后早期诊断，具有快速、准确、灵敏度高的优势，且检测方法无创，极大减少患者痛苦。

Description

用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾 损伤和预后中的用途
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后的产品中的用途，用于检测肺部感染对移植肾损伤和预后的产品，以及检测肺部感染对移植肾损伤和预后的方法。
背景技术
感染是器官移植后最常见的并发症之一。虽然随着新的免疫抑制药物的开发使用，能够降低排斥反应的发生率和预防治疗感染性并发症，使得器官移植受体存活率在过去的几十年内有显著提高。但感染仍然是造成器官移植失败的重要原因。
肾移植术后患者应用免疫抑制剂，机体免疫功能低下，容易导致感染，而且感染呈多样性。肺脏是常见的靶器官，多重耐药菌群、真菌、病毒和机会致病菌感染，混合感染多。肾移植术后肺部感染的发生率近40％，是术后主要的感染性并发症，且肺部感染所致术后患者死亡率高达70％。这也使得目前的研究热点集中在肾移植术后肺部感染的诊断、治疗等方面，忽略了肺部感染对移植肾功能的影响。
肺部感染会释放大量促炎性细胞因子，失控的炎症反应作用于器官微血管内皮细胞，导致内皮细胞功能障碍、微血管通透性增加，液体漏出，组织水肿，这些引发疾病的内、外源性因子均可通过肾脏的血液循环造成肾单位损伤，产生微量白蛋白尿，其通过直接毒性作用、肾小管超负荷及诱导促炎症反应等多种机制和途径导致移植肾功能下降甚至失功。
目前，对肺部感染引起的移植肾功能损伤还没有有效的检测方法。临床上肾损伤的检测通常通过血肌酐、尿蛋白等指标来判断，但这些指标特异性差，灵敏度低，不能有效区分是排斥还是感染引起的肾损伤，而这两种情况对应着截然不同的治疗方案，给临床治疗造成了很大的困扰。明确的检测出肾移植受者肺部感染引起移植肾的损伤，对于肾移植受者选择合适的治疗方案具有重要意义。因此，需要开发一种可靠的诊断测试制剂及检测方法来检测肺部感染引起的移植肾的损伤。
发明内容
因此，本发明要解决的问题在于克服现有临床无法有效检测肺部感染引起的移植肾的损伤和预后，难以评估肺部感染对移植肾的损伤和肺部感染治疗后的效果，进而提供一种用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染对移植肾损伤和预后的产品中的用途，用于检测肺部感染对移植肾损伤和预后的产品，以及检测肺部感染对移植肾损伤和预后的方法。
为此，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤的产品中的用途。
进一步的，所述的用途还包括制备评估肺部感染引起的移植肾损伤预后的产品中的用途。
进一步的，所述的用于检测ddcfDNA的产品包括检测ddcfDNA的SNP分子标记、检测SNP分子标记的探针、ddcfDNA的检测芯片、ddcfDNA的检测试剂盒或ddcfDNA的检测装置。
进一步的，所述检测ddcfDNA的SNP分子标记选自如表1中所示的SNP位点。
优选的，所述SNP位点包括药物代谢基因的SNP位点。
优选的，所述药物代谢基因为CYP3A4、CYP3A5和CYP2D6。
优选的，所述检测SNP分子标记的探针是基于所述SNP位点设计而成的。
优选的，所述探针包括上游探针和下游探针，所述上游探针的序列是以所述SNP位点为坐标起点，向5’方向延伸80bp的碱基序列为序列信息设计的；所述下游探针的序列是以所述SNP位点为坐标起点，向3’方向延伸80bp碱基序列为序列信息设计的。
进一步的，所述ddcfDNA的检测芯片包括所述检测SNP分子标记的探针。
优选的，还包括单分子标记接头，所述单分子标记接头是由正向序列和反向序列部分配对后的Y型接头。
优选的，所述正向序列由5’端至3’端依次包括5’-接头和特异性分子标签A；所述反向序列由3’端至5’端依次包括3’-接头和特异性分子标签B。
优选的，所述5’-接头序列的碱基序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述3’-接头的碱基序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，所述特异性分子标签A的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性分子标签B的碱基序列如SEQ ID NO.10所示，其中N代表随机碱基。
优选的，所述正向序列的3’末端连接有碱基T，所述反向序列的5’末端连接有磷酸基团。
优选的，所述正向序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示，所述反向序列如SEQID NO.8或SEQ ID NO.9所示。
优选的，还包括试剂盒，所述试剂盒包括检测ddcfDNA的SNP分子标记、检测SNP分子标记的探针、ddcfDNA的检测芯片或单分子标记接头。
进一步的，所述的用途还包括所述ddcfDNA的检测装置，所述检测装置包括：(1)样本获取单元，用以获取基因组DNA和血浆cfDNA；(2)ddcfDNA定量单元，检测ddcfDNA，以获取ddcfDNA定量结果；(3)质控单元，对上述样本获取单元和ddcfDNA定量单元进行监测调控。
进一步的，所述检测肺部感染引起的移植肾损伤或预后的产品包括用于检测肺部感染引起的移植肾损伤或预后的SNP分子标记、探针、检测芯片、试剂盒或检测装置。
进一步的，所述的用途中，利用用于检测ddcfDNA的产品检测血浆中cfDNA的浓度和ddcfDNA％，所述ddcfDNA％为血浆中cfDNA在有效SNP位点处区别于基因型为纯合子的SNP信号即ddcfDNA的SNP信号占血浆中cfDNA有效SNP位点处总测序信号的比例，根据如下公式计算血浆中ddcfDNA基因组当量N，计算公式如下：
N＝(cfDNA浓度×洗脱体积)/提取体积×ddcfDNA％/6.6；
上述公式中的洗脱体积为血浆中cfDNA提取方法中提取步骤中使用的洗脱液体积；提取体积为血浆中cfDNA提取方法中待提取的血浆的体积；
分别检测非肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部未感染组和肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部感染组的血浆中ddcfDNA基因组当量，当计算的移植肾肺部感染组的血浆中ddcfDNA基因组当量高于移植肾肺部未感染组时，且P<0.01，为肺部感染引起的移植肾损伤；优选的，还包括检测肺部感染引起的移植肾损伤预后，分别检测非肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部未感染组和肺部感染引起的移植肾损伤预后的移植肾肺部感染治疗组的血浆中ddcfDNA基因组当量，当计算的移植肾肺部感染治疗组血浆中ddcfDNA基因组当量与移植肾肺部未感染组无显著差异时，且P≥0.05时，为肺部感染引起的移植肾损伤预后稳定。
第二方面，本发明提供了一种用于检测肺部感染引起的移植肾损伤或预后的产品包括所述的检测ddcfDNA的产品。
第三方面，本发明提供了一种检测肺部感染引起的移植肾损伤的方法，包括：
S1、检测待测血浆中cfDNA的浓度和ddcfDNA％；
S2、将上述获得的cfDNA的浓度和ddcfDNA％代入如下公式计算血浆中ddcfDNA基因组当量N，计算方公式下：
N＝(cfDNA浓度×洗脱体积)/提取体积×ddcfDNA％/6.6；
上述公式中的洗脱体积为血浆中cfDNA提取方法中提取步骤中使用的洗脱液体积；提取体积为血浆中cfDNA提取方法中待提取的血浆的体积；
S3、根据上述公式分别计算非肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部未感染组和肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部感染组的血浆中ddcfDNA基因组当量，当计算的移植肾肺部感染组的血浆中ddcfDNA基因组当量高于移植肾肺部未感染组相比时，且P<0.01，为肺部感染引起的移植肾损伤。
进一步的，所述ddcfDNA％的检测方法，包括如下步骤：
(1)捕获基因组DNA的目标区域，所述基因组DNA的目标区域包括所述的SNP分子标记；
(2)将步骤(1)所得的目标区域进行高通量测序，所得测序结果用于基因组DNA的SNP分型；
(3)筛选步骤(2)中SNP分型后基因型为纯合子的SNP位点，作为有效SNP位点；
(4)捕获cfDNA的目标区域，所述cfDNA的目标区域包括所述的SNP分子标记；
(5)将步骤(4)所得的目标区域进行高通量测序，保留与步骤(3)中所述的有效SNP位点相同坐标位置的SNP位点；
(6)检测cfDNA在有效SNP位点处区别于步骤(3)中基因型为纯合子的SNP信号，即ddcfDNA的SNP信号；
(7)计算步骤(6)中ddcfDNA的SNP信号占cfDNA在有效SNP位点处总测序信号的比例，即得到ddcfDNA的定量结果ddcfDNA％。
进一步的，所述捕获基因组DNA的目标区域包括如下步骤：
(1)提取血细胞中的基因组DNA；
(2)将步骤(1)中基因组DNA打断为DNA片段，所述DNA片段末端修复后连接所述的单分子标记接头，得到基因组DNA连接产物；
(3)PCR扩增步骤(2)中基因组DNA连接产物，得到基因组DNA文库；
(4)利用所述的检测芯片捕获得到步骤(3)中所述基因组DNA文库的目标区域。
进一步的，所述捕获cfDNA的目标区域包括如下步骤：
(1)提取血浆中的cfDNA；
(2)将步骤(1)中cfDNA末端修复后连接所述的单分子标记接头，得到cfDNA连接产物；
(3)PCR扩增步骤(2)中cfDNA连接产物，得到cfDNA文库；
(4)利用所述的检测芯片捕获得到步骤(3)中cfDNA文库的目标区域。
第四方面，本发明提供了一种检测肺部感染引起的移植肾损伤预后的方法，包括所述的检测肺部感染引起的移植肾损伤的方法，分别检测非肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部未感染组和肺部感染引起的移植肾损伤预后的移植肾肺部感染治疗组的血浆中ddcfDNA基因组当量，当计算的移植肾肺部感染治疗组血浆中ddcfDNA基因组当量与移植肾肺部未感染组无显著差异时，且P≥0.05时，为肺部感染引起的移植肾损伤预后稳定。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后的产品中的用途，所述的用于检测ddcfDNA的产品可以检测肾移植受者血浆中供体游离cfDNA(ddcfDNA)的水平，根据供体游离cfDNA(ddcfDNA)的水平计算血浆中ddcfDNA基因组当量，根据ddcfDNA基因组当量诊断肺部感染引起的移植肾功能损伤和预后，能够实现对器官移植受者术后的肺部感染引起的移植肾损伤和预后早期诊断，具有快速、准确、灵敏度高的优势，且检测方法无创，极大减少患者痛苦。
2.本发明提供的一种用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后产品中的用途，所述的用于检测ddcfDNA的产品包括检测ddcfDNA的SNP分子标记、检测SNP分子标记的探针、ddcfDNA的检测芯片、ddcfDNA的检测试剂盒或ddcfDNA的检测装置；所述检测ddcfDNA的SNP分子标记选自如表1中所示的SNP位点；上述的SNP位点通过检测供体来源cfDNA的特异性目标区域获得的，包括5764个SNP位点和56种病原菌特异性区域序列，覆盖范围广，检测通量高；通过SNP分型可以准确区分人群中不同个体，通过上述的检测ddcfDNA的SNP分子标记可以用于检测进行肾脏移植后的患者中供体游离cfDNA的水平，进而实现肺部感染引起的移植肾损伤或预后的早期诊断；
3.本发明提供的一种用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染对移植肾损伤和预后产品中的用途，利用用于检测ddcfDNA的产品检测血浆中cfDNA的浓度和ddcfDNA％，所述ddcfDNA％为血浆中cfDNA在有效SNP位点处区别于基因型为纯合子的SNP信号即ddcfDNA的SNP信号占血浆中cfDNA有效SNP位点处总测序信号的比例，根据公式计算血浆中ddcfDNA基因组当量，分别检测非肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部未感染组和肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部感染组的血浆中ddcfDNA基因组当量，当计算的移植肾肺部感染组的血浆中ddcfDNA基因组当量高于移植肾肺部未感染组时，且P<0.01，为肺部感染引起的移植肾损伤；还包括检测肺部感染引起的移植肾损伤预后，分别检测非肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部未感染组和肺部感染引起的移植肾损伤预后的移植肾肺部感染治疗组的血浆中ddcfDNA基因组当量，当计算的移植肾肺部感染治疗组血浆中ddcfDNA基因组当量与移植肾肺部未感染组无显著差异时，且P≥0.05时，为肺部感染引起的移植肾损伤预后稳定；本发明所述的血浆ddcfDNA基因组当量是通过不同类型肾移植术后发病样本检测结果统计分析计算得到的，结果可靠，稳定，科学。对比分析移植肾未感染组，移植肾肺部感染组和移植肾肺部感染治疗组的血浆ddcfDNA基因组当量结果，能够实现针对肺部感染引起的移植肾损伤和预后进行高灵敏度和高特异性的早期诊断，进而可以为移植肾损伤患者提供个体化用药指导。
4.本发明提供的一种检测肺部感染对移植肾损伤和预后的方法，包括cfDNA文库的构建方法，在cfDNA的两端添加单分子标记接头对cfDNA进行标记，测序分析时能够对样本cfDNA准确筛选，相对增加了有效数据量，实现对起始量低的cfDNA的检测。
5本发明提供一种用于检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后的产品，通过对样本cfDNA的捕获测序，鉴定出样本中不同基因型的ddcfDNA的定量结果；将其应用于肾移植术后肺部感染造成肾损伤的诊断，可实现针对肾移植的高灵敏度和高特异性的无创早期检测，并可对肾移植患者进行持续性的监测；由于血浆ddcfDNA含量在移植肾未感染组和移植肾肺部感染组中有显著差异，可以为分析和判断肺部感染造成移植肾损伤的临床诊断提供可靠的信息，从而为肾移植术后患者的早期诊断、治疗、个体精准化用药指导以及预后动态监测等提供了可靠的分析依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1所示的中国人群数据库与Hapmap数据库频率信息的比对结果；
图2是本发明实施例5所示的患者血浆中ddcfDNA的比例；
图3是本发明实施例6所示的患者血浆中ddcfDNA基因组当量。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述实施例中使用的实验试剂均为常规实验试剂，可由市场直接获得；
下述实施例中使用的探针设计和芯片、单分子标记接头分别按照中国专利文献CN107254514A(申请号为201710334862.1，发明名称为检测异源cfDNA的SNP分子标记及检测方法、用途)中说明书实施例2、3制备。
下述实施例2中的样本采集如下：样本来自中南大学附属湘雅二院，分为移植肾肺部未感染组，移植肾肺部感染组和移植肾肺部感染治疗组。移植肾肺部未感染组14例；移植肾肺部感染组14例；移植肾肺部感染治疗组15例。移植肾肺部未感染是指非肺部感染引起的移植肾损伤。移植肾肺部感染是指由肺部感染引起的移植肾损伤。移植肾肺部感染治疗组为由肺部感染引起的移植肾损伤，通过治疗肺部感染，移植肾损伤的病情得到控制，患者症状稳定(为医生根据肾穿结果诊断)。
实施例1 SNP位点筛选
选择dbSNP(data base SNP,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)数据库和中国人群数据库(保存于上海奥根诊断技术有限公司)，中国人群数据库是基于3000例中国人的全基因组样本信息构建的遗传多态性位点目录，如图1所示，中国人群数据库与Hapmap数据库(http://www.hapmap.org)存在部分差异性频率信息，代表了中国人群中的差异性遗传位点，使中国人群数据库能够更精准的呈现中国人群的遗传多态性位点信息。
从上述两种数据库中筛选次等位基因频率(MAF)接近于0.5的位点，得到表1所示的5754个目标SNP位点。
所述药物代谢基因的SNP位点，如CYP3A4、CYP3A5和CYP2D6基因，CYP3A4、CYP3A5和CYP2D6基因的SNP位点如表2所示，上述基因单核苷酸多态性影响肾移植急性排斥反应和多种免疫抑制剂(如他克莫司或环孢素)血药浓度/剂量比(C/D)；通过检测表2中所示的位点，可以针对性检测肾移植后的急性排斥反应，为肾移植的早期治疗、个体化精准用药指导以及预后动态监测等提供了关键的突变位点信息，辅助医生选择合适的药物和药物剂量，提高肾移植后的存活率和肾功能的恢复程度。
表1目标SNP位点
表2药物代谢基因SNP位点
rs55951658 rs55901263 rs4646438 rs28371759 rs4986913 rs776746
rs56411402 rs3892097 rs5030655 rs1065852
实施例2提取基因组DNA和血浆cfDNA
1、样本采集和血细胞、血浆分离
(1)样本采集：抽取供体的血液分成两份，各8ml左右，用streck保存管保存运输；
(2)血浆分离：将一份获得的新鲜全血样本，1900g，4℃离心10min，分离上清液至新的离心管，将上清液继续16000g，4℃离心10min，离心后的上清液转移至新的离心管，得到分离后的血浆，血浆可在-20℃下保存；
(3)血细胞分离：将另一份获得的新鲜全血样本离心后的下层沉淀即为血细胞。
2、使用(莱枫基因组DNA提取试剂盒，DK601-02)提取分离后的血细胞，得到基因组DNA；用(QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit，55114)抽提分离后血浆，得到血浆cfDNA，所述抽提的步骤包括：
(1)材料准备：ACB(300ml)加200ml异丙醇；ACW1(19ml)加25ml无水乙醇；ACW2(13ml)加30ml无水乙醇；Carrier RNA(310μg)溶于1550ul AVE，且分装成60ul每管(注：每管反复冻融不超3次)；打开水浴锅，温度调至60℃；
(2)加入1.44ml ACL至每个15ml离心管底部(提前分装)；加入5ul carrier RNA的AVE溶液至每个15ml离心管底部；吸取1.8ml上述分离后的血浆(即待提取的血浆的体积)至相应的标记好的15ml离心管；然后吸取180ul QIAGEN Proteinase K至相应的15ml离心管；
(3)将步骤(2)中最后获得的15ml离心管剧烈震荡10S，快速离心5s，60℃，孵育30min，每隔15min震荡一次(无需拿出水浴锅)；准备好相应数量的1.5ml离心管，并写上完整的提取编号；准备好相应数量的QIAamp Mini column，并写上编号；将适配接头装于VacConnector上，并将QIAamp Mini column装于适配接头；将带有编号的扩容管连接至QIAamp Mini Spin Columa吸附柱；
(4)将步骤(3)中孵育后的离心管擦干，每管加入3.24ml ACB，颠倒混匀10次，然后于-20℃冰箱放置5min；将上述离心管从冰箱取出一一对应转入扩容管中，打开真空泵，控制负压在50，直到全部滤过完成；卸下扩容管并丢弃，进一步核对；
(5)洗脱；在DNA吸附柱中加入600ul ACW1洗脱，注意不要湿润吸附柱边缘，直到全部滤过完成后，加入700ul ACW2洗脱，注意不要湿润吸附柱边缘，直到全部滤过完成后，加入700ul无水乙醇洗脱，注意不要湿润吸附柱边缘；
(6)提取：关闭真空泵，小心拔下QIAamp Mini column放入收集管中，14000rmp离心3min；将离心好的QIAamp Mini column放入准备好的1.5ml离心管中，打开盖子，室温干燥3min；分别加入60ul洗脱液AVE(使用的洗脱液体积)，室温放置3分钟；14000rmp离心1分钟洗脱DNA，得到提取液，即得到血浆cfDNA。
实施例3文库构建
1、分别取1μl实施例2中获得的血浆cfDNA进行QuantiFluorTM-ST(Promega)定量，另取1μl使用Agilent 2100检测质量。
2、以实施例2中获得血浆cfDNA和血细胞基因组DNA作为样本，使用VAHTSUniversal DNA Library Prep Kit for Illumina V3制备血浆cfDNA和基因组DNA文库，具体步骤如下所示：
(1)末端补平
a.向标记好的离心管中加入7.5μl末端补平混合液(End Repair mix)；
b.取25μl步骤2中定量后的样本，加入a所示的末端补平混合液，得到总体积为32.5μl的样本反应液，用移液器吹打混匀；
c.在PCR仪上运行如下程序：
20℃保持15min，
65℃保持15min，
4℃静置。
(2)加单分子标记接头
a.根据样本的数量，计算所需试剂用量，于标记好的离心管中加入如下表3所示的接头连接混合液和步骤3所得到末端修复样本(End repair DNA)，用移液器吹打混匀：
表3接头连接混合液
试剂名称 1个样本
单分子标记接头 2.5μl
Rapid Ligation Buffer 12.5μl
Rapid DNA Ligase 2.5μl
End repair DNA 32.5μl
总体积 50μl
c.连接：20℃保持1h。
(3)加接头后磁珠纯化
a.从4℃冰箱取出VAHTS DNA Clean Beads，室温平衡30min，涡旋振荡混匀；
b.吸取40μl VAHTS DNA Clean Beads加入50μl步骤(2)中获得的接头连接产物(Adapter Ligation)中，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
c.瞬时离心样品管2s，置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，吸弃上清。
d.保持样品管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec，吸弃上清。重复该步骤两次。
e.将样品管瞬时离心，放置于磁力架上去掉残存的乙醇，室温晾干至磁珠表面无明亮反光，加入50μl Nuclease-free water，用移液器吹打混匀。室温静置2min，再次放置于磁力架上，取20μl上清于新的离心管。
f.重复b-e步骤一次，最后用23μl Nuclease-free water洗脱。
e.取1μl样本使用QuantiFluorTM-ST(Promega)精确定量，得到样本文库，将样本文库保存至-20℃或进行下一步的杂交捕获。
(4)文库扩增
a.室温解冻2x KAPA HiFi Mix及每个样本对应的index primer；
b.取25μl的2x KAPA HiFi Mix以及2μl对应的index primer加入到步骤(3)中纯化的样本中，总体积50μl，用移液器轻轻混匀，瞬时离心2s，进行文库扩增；在PCR仪上运行如下程序：98℃变性45s，11个循环(98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸1min，4℃静置。
(5)文库鉴定
取2μl步骤(4)所得PCR产物于2％琼脂糖凝胶电泳，确定片段分布于250-500bp之间。
(6)文库纯化
a.吸取38.4μl VAHTS DNA Clean Beads加入步骤(4)中扩增后的文库样本中，充分吹打混匀，室温静置5min。
b.瞬时离心样品管2s，置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，吸弃上清。
c.保持样品管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，快速转动样品管以清洗磁珠，吸弃上清。
d.将样品管瞬时离心，放置于磁力架上去掉残存的乙醇，室温晾干至磁珠表面无明亮反光，加入40μl Nuclease-free water，用移液器吹打混匀。室温静置2min，再次放置于磁力架上，取40μl上清于新的离心管。
e.取1μl样本使用QuantiFluorTM-ST(Promega)精确定量，得到样本文库，将样本文库保存至-20℃或进行下一步的杂交捕获。
实施例4文库目标区域杂交捕获、测序
1、根据实施例3中纯化后的文库样本浓度吸取总量为1000ng的样本至新的1.5ml离心管，入浓缩仪浓缩至完全干燥，如不立即进行下一步实验，可室温(15-25℃)放置过夜；
2、杂交体系配制与文库的变性
(1)室温溶解Cot-1 DNA、xGen Universal Blocking Oligo P5、XGen UniversalBlocking Oligo-P7(6nt)，根据文库样本数量，配制表4所示的Block混合液(Hybr Mix)，用移液器吹打混匀备用；
表4 Hybr Mix
(2)室温溶解xGen 2X Hybridization Buffer，根据文库样本数量，配制表5所示的杂交混合液，用移液器吹打混匀备用；
表5杂交混合液
试剂名称 1个反应体积
xGen Hybridization Buffer 10.4μL
xGen Hybridization Buffer Enhancer 2.6μL
总体积 13μL
(3)4℃解冻RNA探针(RNA probe)，室温解冻Rnase inhibitor，根据文库样本数量，配制表6所示的RNA probe mix，用移液器吹打混匀备用；
表6 RNA probe mix
试剂名称 1个反应体积
RNA probe 0.8μL
Rnase inhibitor 1μL
Nuclease free water 3.2μl
总体积 5μL
(4)向每管步骤(1)中浓缩完成后的样本加入7μl表4所示的block混合液；
(5)用移液器吹打混匀样本并转移至low-bind 0.2ml PCR管，将样本放入PCR仪运行如下程序：
95℃保持10min，
65℃静置；
(6)当95℃运行结束时，保持样本在PCR仪上，将按13μl/样分装好的杂交混合液置于65℃孵育，2.5min后，再将RNA probe mix置于65℃孵育2.5min，然后立即将杂交混合液和RNA probe mix全部对应加入至步骤(5)中已加样本的low-bind 0.2ml PCR管中，用移液器吹打混匀，避免产生气泡，此时反应总体积为25μl。
(7)记录杂交开始时间，根据实验进度，选择4h或16h杂交时间。
3、配制Wash Buffer
(1)根据表7将xGen 2X Bead Wash Buffer、xGen 10X Wash Buffer I、xGen 10XWash Buffer II、xGen 10X Wash Buffer III、xGen 10X Stringent Wash Buffer配制成1X工作液，移液器吹打混匀；
表7工作液体系
(2)准备稀释好的Wash Buffer I和Stringent Wash Buffer，按表8条件存放，其它试剂于室温存放(保证65℃孵育时间不少于2h)；
表8存放条件
试剂名称 1X工作液体积 1X工作液储存温度
Wash Buffer I 100μL 65℃
Wash Buffer I 200μL 室温(15-25℃)
Stringent Wash Buffer 400μL 65℃
(3)准备M-280磁珠
从4℃冰箱中取出M-280磁珠，确认磁珠已放置于室温30min，涡旋混匀使磁珠重悬浮；
①在1.7ml low-bind管中为每个样本准备100μl磁珠；
②将low-bind管置于磁力架上，静置至管内液体澄清，吸弃上清；
③加入200μl 1X Bead Wash Buffer，涡旋混匀10sec，静置于磁力架上至管内液体澄清，吸弃上清；
④重复步骤③一次；
⑤加入100μl 1X Bead Wash Buffer，移液器吹打混匀。
⑥将100μl悬浮磁珠转移至新的0.2ml low-bind管，置于磁力架上，静置至管内液体澄清，吸弃上清；
4、捕获
(1)确认步骤2的杂交反应已满足4h或16h，保持样本和磁珠在PCR仪上，将样品转至准备好的磁珠管内，移液器吹打混匀，避免产生气泡；
(2)65℃孵育45min，期间每隔12min将磁珠混匀(保持样本在PCR仪上)，避免产生气泡。
5、洗涤
注意以下步骤需在65℃条件下快速操作：
(1)每个样本加入100μl 1X Wash Buffer I(65℃预热)，快速混匀；
(2)将样品转移至一新的1.7ml管中(65℃预热)，快速混匀；
(3)样品管置于磁力架上，静置至管内液体澄清，吸弃上清；
(4)加入200μl 1X Stringent Wash Buffer(65℃预热)，轻柔混匀，65℃水浴5min。样品管置于磁力架上，静置至管内液体澄清，吸弃上清；
(5)重复步骤(4)一次；
(6)加入200μl常温1X Wash BufferI，涡旋混匀2min。样品管置于磁力架上，静置至管内液体澄清，吸弃上清；
(7)加入100μl常温1X Wash BufferⅡ，涡旋混匀1min。样品管置于磁力架上，静置至管内液体澄清，吸弃上清；
(8)加入200μl常温1X Wash BufferⅢ，涡旋混匀30sec，样品管置于磁力架上，静置至管内液体澄清，吸弃上清；
(9)将样品管从磁力架上取下，加入20μl Nuclease-Free Water，移液器吹打混匀，确保所有磁珠处于悬浮状态并全部转至0.2ml PCR管。
6、PCR富集
(1)室温解冻KAPA HiFi Mix，配制表9所示的PCR扩增混合液(PCRmix)，快速混匀：
表9 PCR mix
试剂名称 基因组文库
KAPA HiFi Mix 25μL
10uM P5/P7primer 5μL
总体积 30μL
(2)向步骤5中杂交捕获的每个样本(20uL)加入30μL PCR mix，总体积50μL，用移液器轻轻混匀，瞬时离心2s，在PCR仪上运行如下程序：98℃变性45s，12个循环(98℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸1min，4℃冷却静置。
7、纯化
重悬浮VAHTS DNA Clean Beads，确认磁珠已放置室温30min，每个样本用38.4μlbeads纯化，最终用20μl Nuclease-Free Water洗脱。
8、文库定量
a.取1μl步骤7中纯化后的样品用Qubit Fluorometer 3.0定量；
b.取2μl PCR产物用于2％琼脂糖凝胶电泳，剩余样本于-20℃保存。
9、送测
样本数据量为10M Reads，插入片段选择178(测序平台为illumine X-Ten，或其他高通量测序平台)。
实施例5供体cfDNA(ddcfDNA)定量分析
1、对基因组DNA文库和血浆cfDNA文库高通量测序后数据call SNP(samtool)，提取5764个SNP位点信息；
2、对基因组DNA文库中的5764个SNP位点进行分析，进行基因分型；筛选受体患者基因组上为纯合型的SNP位点作为有效SNP位点，
3、根据步骤2中的有效SNP位点对血浆cfDNA文库进行分析，检测cfDNA测序结果的有效位点处区别于步骤2中基因型为纯合子的SNP信号(也可称为异源SNP信号)占cfDNA在有效SNP位点处总测序信号的比例，即得到ddcfDNA的定量结果ddcfDNA％。
4、计算方式如下所示：假设受体患者血细胞基因组DNA上有一个有效SNP位点，基因组DNA上纯合型的位点基因型为AA，检测到异源SNP信号为a，则可以得到供体在此位点的基因型为Aa或aa,基因分型如表10所示，根据异源SNP信号的两种基因型，统计异源cfDNA信号，计算出异源cfDNA信号比例即ddcfDNA％，如下：
表10基因分型
当供体基因型为aa，异源信号比例＝a型reads数/A型reads数；
当供体基因型为Aa，异源信号比例＝2×a型reads数/A型reads数。
根据上述计算的移植肾肺部未感染组，移植肾肺部感染组和移植肾肺部感染治疗组的血浆中ddcfDNA的比例结果如图2所示，在该图中，P<0.01表示差异性显著，P≥0.05表示无显著差异，图中Definitive infection代表移植肾肺部感染组，Resolving infection代表移植肾肺部感染治疗组，non-infection代表移植肾肺部未感染组。
实施例6计算单位体积血浆中ddcfDNA基因组当量
将实施例2中提取患者血浆cfDNA浓度、洗脱液体积(使用的洗脱液体积)、提取体积(待提取的血浆的体积)和实施例5获得患者血浆中ddcfDNA％代入下述公式，计算血浆中ddcfDNA基因组当量N，(公式中的“6.6”为固定值，其为单个细胞中基因组当量)，计算公式如下：
N＝(cfDNA浓度×洗脱体积)/提取体积×ddcfDNA％/6.6；
计算结果如图3所示，在该图中，P<0.01表示差异性显著，P≥0.05表示无显著差异，从图中可知，移植肾肺部感染组血浆ddcfDNA基因组当量显著高于移植肾肺部未感染组和移植肾肺部感染治疗组，有显著差异(P<0.01)，移植肾肺部未感染组和移植肾肺部感染治疗组之间无显著差异(P＝0.25)，因此可验证，当所述ddcfDNA基因组当量在移植肾肺部感染组中高于移植肾肺部未感染组，且p<0.01时，为肺部感染引起的移植肾损伤，当所述移植肾肺部感染治疗组血浆中ddcfDNA基因组当量与移植肾肺部未感染组无显著差异，且P≥0.05时，为肺部感染引起的移植肾损伤预后效果良好，可以检测肺部感染引起的移植肾的损伤和评估肺部感染预后的效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海奥根诊断技术有限公司
<120> 用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后中的用途
<130> WXHA201900034
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 3
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcacatcacg atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tca 33
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
nnnnnngtca gtact 15
<210> 6
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(64)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnngtcagt act 73
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(39)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnnng tcagtact 48
<210> 8
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(14)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
gtactgacnn nnnnagatcg gaagagcaca cgtctgaact ccagtcacat cacgatctcg 60
tatgccgtct tctgcttg 78
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(14)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 9
gtactgacnn nnnnagatcg gaagagcaca cgtctgaact ccagtca 47
<210> 10
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(14)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 10
gtactgacnn nnnn 14

Claims (14)

1.一种用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤的产品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的用途还包括制备评估肺部感染引起的移植肾损伤预后的产品中的用途。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的用于检测ddcfDNA的产品包括检测ddcfDNA的SNP分子标记、检测SNP分子标记的探针、ddcfDNA的检测芯片、ddcfDNA的检测试剂盒或ddcfDNA的检测装置。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述检测ddcfDNA的SNP分子标记选自如表1中所示的SNP位点；优选的，所述SNP位点包括药物代谢基因的SNP位点；优选的，所述药物代谢基因为CYP3A4、CYP3A5和CYP2D6；优选的，所述检测SNP分子标记的探针是基于所述SNP位点设计而成的；优选的，所述探针包括上游探针和下游探针，所述上游探针的序列是以所述SNP位点为坐标起点，向5’方向延伸80bp的碱基序列为序列信息设计的；所述下游探针的序列是以所述SNP位点为坐标起点，向3’方向延伸80bp碱基序列为序列信息设计的。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述ddcfDNA的检测芯片包括所述检测SNP分子标记的探针；优选的，还包括单分子标记接头，所述单分子标记接头是由正向序列和反向序列部分配对后的Y型接头；优选的，所述正向序列由5’端至3’端依次包括5’-接头和特异性分子标签A，所述反向序列由3’端至5’端依次包括3’-接头和特异性分子标签B；优选的，所述5’-接头的碱基序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述3’-接头的碱基序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，所述特异性分子标签A的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性分子标签B的碱基序列如SEQ ID NO.10所示，其中N代表随机碱基；优选的，所述正向序列的3’末端连接有碱基T，所述反向序列的5’末端连接有磷酸基团；优选的，所述正向序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示，所述反向序列如SEQ ID NO.8或SEQ IDNO.9所示；优选的，还包括试剂盒，所述试剂盒包括检测ddcfDNA的SNP分子标记、检测SNP分子标记的探针、ddcfDNA的检测芯片或单分子标记接头。
6.根据权利要求3或4或5所述的用途，其特征在于，还包括所述ddcfDNA的检测装置，所述检测装置包括：(1)样本获取单元，用以获取基因组DNA和血浆cfDNA；(2)ddcfDNA定量单元，检测ddcfDNA，以获取ddcfDNA定量结果；(3)质控单元，对上述样本获取单元和ddcfDNA定量单元进行监测调控。
7.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述检测肺部感染引起的移植肾损伤或预后的产品包括用于检测肺部感染引起的移植肾损伤或预后的SNP分子标记、探针、检测芯片、试剂盒或检测装置。
8.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于，利用用于检测ddcfDNA的产品检测血浆中cfDNA的浓度和ddcfDNA％，所述ddcfDNA％为血浆中cfDNA在有效SNP位点处区别于基因型为纯合子的SNP信号即ddcfDNA的SNP信号占血浆中cfDNA有效SNP位点处总测序信号的比例，根据如下公式计算血浆中ddcfDNA基因组当量N，计算公式如下：
N＝(cfDNA浓度×洗脱体积)/提取体积×ddcfDNA％/6.6；
上述公式中的洗脱体积为血浆中cfDNA提取方法中提取步骤中使用的洗脱液体积；提取体积为血浆中cfDNA提取方法中待提取的血浆的体积；
根据上述公式分别检测非肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部未感染组和肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部感染组的血浆中ddcfDNA基因组当量，当计算的移植肾肺部感染组的血浆中ddcfDNA基因组当量高于移植肾肺部未感染组时，且P<0.01，为肺部感染引起的移植肾损伤；优选的，还包括检测肺部感染引起的移植肾损伤预后，分别检测非肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部未感染组和肺部感染引起的移植肾损伤预后的移植肾肺部感染治疗组的血浆中ddcfDNA基因组当量，当计算的移植肾肺部感染治疗组血浆中ddcfDNA基因组当量与移植肾肺部未感染组无显著差异时，且P≥0.05时，为肺部感染引起的移植肾损伤预后稳定。
9.一种用于检测肺部感染引起的移植肾损伤或预后的产品，其特征在于，包括权利要求1-8任一项中所述的检测ddcfDNA的产品。
10.一种检测肺部感染引起的移植肾损伤的方法，其特征在于，包括：
S1、检测待测血浆中cfDNA的浓度和ddcfDNA％；
S2、将上述获得的cfDNA的浓度和ddcfDNA％代入如下公式计算血浆中ddcfDNA基因组当量N，计算公式如下：
N＝(cfDNA浓度×洗脱体积)/提取体积×ddcfDNA％/6.6；
上述公式中的洗脱体积为血浆中cfDNA提取方法中提取步骤中使用的洗脱液体积；提取体积为血浆中cfDNA提取方法中待提取的血浆的体积；
S3、根据上述公式分别计算非肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部未感染组和肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部感染组的血浆中ddcfDNA基因组当量，当计算的移植肾肺部感染组的血浆中ddcfDNA基因组当量高于移植肾肺部未感染组相比时，且P<0.01，为肺部感染引起的移植肾损伤。
11.根据要求10所述的方法，其特征在于，所述ddcfDNA％的检测方法，包括如下步骤：
(1)捕获基因组DNA的目标区域，所述基因组DNA的目标区域包括权利要求1-8任一项所述的SNP分子标记；
(2)将步骤(1)所得的目标区域进行高通量测序，所得测序结果用于基因组DNA的SNP分型；
(3)筛选步骤(2)中SNP分型后基因型为纯合子的SNP位点，作为有效SNP位点；
(4)捕获cfDNA的目标区域，所述cfDNA的目标区域包括权利要求1-8任一项所述的SNP分子标记；
(5)将步骤(4)所得的目标区域进行高通量测序，保留与步骤(3)中所述的有效SNP位点相同坐标位置的SNP位点；
(6)检测cfDNA在有效SNP位点处区别于步骤(3)中基因型为纯合子的SNP信号，即ddcfDNA的SNP信号；
(7)计算步骤(6)中ddcfDNA的SNP信号占cfDNA在有效SNP位点处总测序信号的比例，即得到ddcfDNA的定量结果ddcfDNA％。
12.根据要求10或11所述的方法，其特征在于，所述捕获cfDNA的目标区域包括如下步骤：
(1)提取血浆中的cfDNA；
(2)将步骤(1)中cfDNA末端修复后连接权利要求1-8任一项所述的单分子标记接头，得到cfDNA连接产物；
(3)PCR扩增步骤(2)中cfDNA连接产物，得到cfDNA文库；
(4)利用权利要求1-8任一项所述的检测芯片捕获得到步骤(3)中cfDNA文库的目标区域。
13.根据要求10或11所述的方法，其特征在于，所述捕获基因组DNA的目标区域包括如下步骤：
(1)提取血细胞中的基因组DNA；
(2)将步骤(1)中基因组DNA打断为DNA片段，所述DNA片段末端修复后连接权利要求1-8任一项所述的单分子标记接头，得到基因组DNA连接产物；
(3)PCR扩增步骤(2)中基因组DNA连接产物，得到基因组DNA文库；
(4)利用权利要求1-8任一项所述的检测芯片捕获得到步骤(3)中所述基因组DNA文库的目标区域。
14.一种检测肺部感染对移植肾损伤预后的方法，其特征在于，包括权利要求10-13所述的方法，分别检测非肺部感染引起的移植肾损伤的移植肾肺部未感染组和肺部感染引起的移植肾损伤预后的移植肾肺部感染治疗组的血浆中ddcfDNA基因组当量，当计算的移植肾肺部感染治疗组血浆中ddcfDNA基因组当量与移植肾肺部未感染组无显著差异时，且P≥0.05时，为肺部感染引起的移植肾损伤预后稳定。
CN201910587416.0A 2019-06-28 2019-06-28 用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后中的用途 Pending CN110452975A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910587416.0A CN110452975A (zh) 2019-06-28 2019-06-28 用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后中的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910587416.0A CN110452975A (zh) 2019-06-28 2019-06-28 用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后中的用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110452975A true CN110452975A (zh) 2019-11-15

Family

ID=68481881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910587416.0A Pending CN110452975A (zh) 2019-06-28 2019-06-28 用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后中的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110452975A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113061666A (zh) * 2020-12-30 2021-07-02 中南大学湘雅二医院 肝移植后巨细胞病毒的检测方法、应用及系统
WO2023116717A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 The First Affiliated Hospital Of Guangzhou Medical University Method for monitoring donar dna fraction

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160024581A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-28 Immucor Gti Diagnostics, Inc. Methods and compositions for assessing renal status using urine cell free dna
WO2017045654A1 (zh) * 2015-09-18 2017-03-23 广州华大基因医学检验所有限公司 确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA比例的方法
CN107254514A (zh) * 2017-05-12 2017-10-17 苏州人人基因科技有限公司 检测异源cfDNA的SNP分子标记及检测方法、用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160024581A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-28 Immucor Gti Diagnostics, Inc. Methods and compositions for assessing renal status using urine cell free dna
WO2017045654A1 (zh) * 2015-09-18 2017-03-23 广州华大基因医学检验所有限公司 确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA比例的方法
CN107254514A (zh) * 2017-05-12 2017-10-17 苏州人人基因科技有限公司 检测异源cfDNA的SNP分子标记及检测方法、用途

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SIMON ROBERT KNIGHT等: "Donor-specific Cell-free DNA as a Biomarker in Solid Organ Transplantation. A Systematic Review", 《TRANSPLANTATION》, vol. 103, no. 2 *
戚金: "肾移植病人肺部感染的护理及预防感染干预", 《内蒙古中医药》 *
戚金: "肾移植病人肺部感染的护理及预防感染干预", 《内蒙古中医药》, no. 01, 15 January 2017 (2017-01-15) *
翁敏佳: "肾移植后肺部感染及并发急性肾损伤的分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
翁敏佳: "肾移植后肺部感染及并发急性肾损伤的分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, no. 12, 15 December 2009 (2009-12-15) *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113061666A (zh) * 2020-12-30 2021-07-02 中南大学湘雅二医院 肝移植后巨细胞病毒的检测方法、应用及系统
WO2023116717A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 The First Affiliated Hospital Of Guangzhou Medical University Method for monitoring donar dna fraction

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107190329B (zh) 基于dna的融合基因定量测序建库、检测方法及其应用
CN107254514A (zh) 检测异源cfDNA的SNP分子标记及检测方法、用途
CN109609692B (zh) 用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法
CN111349721B (zh) 用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法
CN109637587B (zh) 检测基因融合突变的方法、装置、存储介质、处理器及转录组数据表达量标准化的方法
CN111235316A (zh) 鉴定新型冠状病毒的引物探针及在三重荧光rpa的应用
CN112662776B (zh) 检测环状rna和/或所述环状rna表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用
JP2013198483A (ja) テスト体液サンプルの分類方法
CN115786459B (zh) 一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法
CN107619867A (zh) 用于同时检测肺癌多种基因突变类型的序列组合和探针
CN109055555B (zh) 一种肺癌早期转移诊断标志物及其试剂盒和应用
CN110452975A (zh) 用于检测ddcfDNA的产品在制备检测肺部感染引起的移植肾损伤和预后中的用途
CN110283937A (zh) 用于检测器官移植术后感染的检测引物组、检测试剂及测序文库
CN108148908B (zh) 动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物的应用
KR102241455B1 (ko) 조기 간암 진단을 위한 엑소좀 유래 microRNA 바이오마커 및 그 용도
CN110396560A (zh) 用于检测ddcfDNA的产品在制备检测BKVAN产品中的用途及方法
CN105063052B (zh) 急性髓系白血病miRNA标记物
CN111718993B (zh) 一种人血清miR-146a双重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用
CN114410795A (zh) 基于miRNA特征标记的肝癌早期检测
CN112458162A (zh) 器官移植ddcfDNA检测试剂和方法
CN110257521A (zh) miRNA-30a及其靶基因在肺癌检测中的应用
CN115725727B (zh) 一种用于检测ar-v7及ar基因表达的锁式探针及试剂盒
CN117625788B (zh) 一种多重pcr结合分子标签测序文库的构建方法
CN114574497B (zh) 一种识别卵巢癌耐药病人细胞外囊泡的核酸适体及其应用
CN114958985B (zh) 一种检测pcm1-jak2融合基因的多重pcr方法、引物探针组合与试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191115

RJ01 Rejection of invention patent application after publication