CN110283937A - 用于检测器官移植术后感染的检测引物组、检测试剂及测序文库 - Google Patents

用于检测器官移植术后感染的检测引物组、检测试剂及测序文库 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测器官移植术后感染的检测引物组，包括CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒的多重PCR引物组以及通用引物组。上述的检测引物组能够在同一扩增条件下的同一反应体系中完成对5种病毒的检测，病毒检测的覆盖范围广，检测效率高、特异性强。同时，检测引物组能够使PCR扩增产物能够直接用于高通量测序，提高了检测通量和检测灵敏度。本发明公开了一种检测试剂，包括上述的检测引物组。本发明公开了用于检测器官移植术后感染的测序文库及其构建方法，测序文库的构建方法有效简化了传统文库的构建步骤，提高了构建效率。

Description

用于检测器官移植术后感染的检测引物组、检测试剂及测序 文库
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测器官移植术后感染的检测引物组、检测试剂、测序文库，以及测序文库的构建方法。
背景技术
器官移植是目前治疗多种终末期器官疾病的最佳治疗手段。同种异体移植受体存活率在过去的几十年内有显著提高，一方面是由于免疫抑制剂的作用降低了急性排斥反应发生率，另一方面是由于移植术后受体的感染性并发症能被有效预防和治疗。近年来，我国心脏死亡器官捐献(donation after cardiac death，DCD)供体器官移植发展迅速。DCD供体器官热缺血时间长、器官质量较差、术后功能恢复延迟的风险高，手术期多需要更强的免疫诱导和免疫抑制治疗。免疫抑制剂抑制了受体的非特异性免疫与特异性免疫功能，使受体发生术后感染的风险增加。此外，DCD供体在重症监护室(intensive care unit，ICU)内的监护治疗时间较久，并发病原体感染的可能性较大，部分受体移植术后容易发生供体来源的感染(donor derived infection，DDI)。目前，约50％以上的器官移植患者在病程中发生感染，成为导致器官移植患者死亡的重要危险因素。因此，器官移植术后感染的及时检测、诊断对术后感染的防治、提高患者生存率至关重要。
当器官移植受体术后发生感染时，临床上多采用影像学检测、血清学检测、以及免疫学检测等。然而，影像学检测无法准确判断病原体类型，对病原体检出的准确率低。血清学检测包括血清降钙素原(procalcitonin，PCT)、C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、抗体检测等。然而器官移植术后无论是否发生感染，PCT水平都会有所升高，而CRP水平并不能特异性鉴定细菌感染的发生；抗体检测易出现延迟或缺失，容易造成假阴性结果，影响阳性检出率。免疫标记技术可以特异性地识别病原体种类，该检测方法灵敏度及特异度均较高，然而不能排除假阳性，临床应用较为困难。
基于聚合酶链式反应(PCR)的器官移植术后病原体的检测具有较高的检测灵敏度，相对于传统的检测手段具有明显优势。检测病原体核酸具有较高的检测灵敏度，但由于PCR检测引物的高特异性，在一次扩增反应中一般仅能鉴定一种病原体的核酸，导致器官移植术后感染的病原体检测范围受限、检出效率低。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中器官移植术后感染的的病原体检测范围受限、检出效率低的缺陷。
为此，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于检测器官移植术后感染的检测引物组，包括CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒的多重PCR引物组，以及通用引物组；
所述多重PCR引物组的上游引物具有位于5’端的第一标签序列和位于3’端的上游识别序列，所述多重PCR引物组的下游引物具有位于5’端的第二标签序列和位于3’端的下游识别序列；所述通用引物组的上游引物具有位于5’端的上游通用序列和位于3’端的第三标签序列，所述通用引物组的下游引物具有位于5’端的下游通用序列和位于3’端的第四标签序列；所述第一标签序列和所述第三标签序列为互补序列，所述第二标签序列和所述第四标签序列为互补序列，所述上游通用序列和所述下游通用序列包括高通量测序的接头序列。
可选地，上述的检测引物组，所述第一标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第四标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述上游通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述下游通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
可选地，上述的检测引物组，所述上游识别序列包括SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.72所示的任一核苷酸序列，所述下游识别序列包括SEQ ID NO.73-SEQ ID NO.94所示的任一核苷酸序列。
可选地，上述的检测引物组，所述多重PCR引物组包括用于检测CMV病毒的第一引物组，用于检测EBV病毒的第二引物组，用于检测BK病毒的第三引物组，用于检测HBV病毒的第四引物组，和用于检测B19病毒的第五引物组；
所述第一引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.13所示，所述第一引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.35所示；
所述第二引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.19所示，所述第二引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.36-SEQ ID NO.41所示；
所述第三引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.20-SEQ ID NO.23所示，所述第三引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.42-SEQ ID NO.45所示；
所述第四引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.24-SEQ ID NO.26所示，所述第四引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.46-SEQ ID NO.48所示；
所述第五引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.28所示，所述第五引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.49-SEQ ID NO.50所示。
第二方面，本发明提供了一种器官移植术后感染的检测试剂，包括上述的检测引物组。
可选地，上述的检测试剂，所述检测试剂包括如下成分：
含有所述多重PCR引物组的混合液I，所述多重PCR引物组的上游引物和下游引物以1：1的摩尔比混合，使所述多重PCR引物组的上游引物与所述下游引物的浓度均为5μM；
含有所述的通用引物组的混合液II，所述通用引物组的上游引物和下游引物以1：1的摩尔比混合，使所述通用引物组的上游引物与所述下游引物的浓度均为5μM；
KAPA Hifi Enzyme Mix，所述KAPA Hifi Enzyme Mix中含有DNA聚合酶0.5U/25μL、MgCl2 2.5mM、dATP 0.3mM、dCTP 0.3mM、dGTP 0.3mM和dTTP 0.3mM。
可选地，上述的检测试剂，所述检测试剂用于器官移植术后感染的多重PCR扩增检测的反应体系包括：
含有上述多重PCR引物组的混合液I，5μM,1μl；
KAPA Hifi Enzyme Mix，15μl；
DNA扩增模板，9μl；
总体积为25μl。
可选地，上述的检测试剂，所述检测试剂用于器官移植术后感染的多重PCR扩增检测的反应程序为：
95℃预变性5min；
95℃变性15s，60℃退火3.5min，72℃延伸1.5min，共13个循环。
第三方面，本发明提供了一种用于检测器官移植术后感染的测序文库，所述测序文库基于上述的检测引物组，上述的检测试剂，或上述的试剂盒构建得到。
第四方面，本发明提供了一种测序文库的构建方法，包括以下步骤：
S1，提取待测样本的基因组DNA或血浆游离DNA；
S2，以所述基因组DNA或血浆游离DNA为DNA扩增模板，采用多重PCR引物组进行多重PCR扩增，得到第一PCR扩增产物；
S3，以S2得到的多重PCR扩增产物为模板，采用通用引物组进行PCR扩增，得到第二PCR扩增产物；
S4，纯化所述第二PCR扩增产物，得到所述测序文库。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的用于检测器官移植术后感染的检测引物组，包括CMV病毒(巨细胞病毒，cytomegalovirus)、EBV病毒(人疱疹病毒，Epstein-Barr virus)、BK病毒(人多瘤病毒，BKvirus)、HBV病毒(乙型肝炎病毒，hepatitis Bvirus)和B19病毒(人微小病毒，HumanparvovirusB19)的多重PCR引物组，多重PCR引物组能够在通过一次PCR扩增实现对CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒的同时检测，有效提高了器官移植术后感染的检测效率，有利于在器官移植术后早期实现对多种病原体的及时检测，使器官移植术后患者获得及时救治，提高患者的生存率和生存质量。本发明提供的多重PCR引物组检测的病毒范围广，有效减轻器官移植术后病毒检测的漏检、假阴性结果，改善由于病原体感染导致的器官功能丧失。利用通用引物组在多重PCR扩增产物的两端添加高通量结构序列，以同时实现对CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒的高通量、高灵敏检测。
在多重PCR扩增过程中，检测引物组的上游引物和下游引物在目标片段的5’端和3’端分别引入第一标签序列和第二标签序列。通用引物组的上游引物和下游引物通过第三标签序列和第四标签序列，实现与两端延伸后的目标片段的互补扩增，在目标片段的5’端和3’端进一步引入上游通用序列和下游通用序列，在两步PCR扩增过程中完成对目标片段的富集和高通量测序接头序列的添加，得到的PCR扩增的终产物能够直接用于高通量测序，有效提高了对器官移植术后感染的检测通量、检测速度和检测灵敏度。
2.本发明提供的检测引物组，第一标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第三标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第四标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；上游通用序列的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，下游通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
通过设计第一标签序列至第四标签序列的核苷酸序列，使检测引物组在为目标片段的两端引入标签序列和通用序列的同时，对上游识别序列和下游识别序列与CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒的目标区域的识别扩增不产生干扰，避免多重PCR扩增过程中的非特异性扩增，在提高多重PCR扩增效率的同时，使多重PCR扩增具有高的特异性。第二标签序列内的随机碱基能够实现对不同病毒的目标检测区域以及对同一病毒的不同目标检测区域的特异性标记，通过读取随机碱基序列，有利于排除在PCR过程和后续测序过程引入的错误，提高对器官移植术后病毒感染检测的准确性。
3.本发明提供的检测引物组，上游识别序列包括SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.72所示的任一核苷酸序列，下游识别序列包括SEQ ID NO.73-SEQ ID NO.94所示的任一核苷酸序列。上述的上游识别序列和下游识别序列能够特异性识别并扩增CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒的保守区域，且能够实现对同一病毒的多个目标区域的同时扩增，以保证对病毒的有效检出。
此外，上述不同序列识别扩增目标区域的扩增效率均衡，能到得到亮度均一、无明显拖尾的多重扩增条带。上游识别序列和下游识别序列能够识别扩增5种病毒的扩增条带清晰、扩增的特异性高、无非特异性条带产生，有利于实现对CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒的灵敏、特异性检测。
4.本发明提供的多重PCR引物组，包括用于检测CMV病毒的第一引物组，用于检测EBV病毒的第二引物组，用于检测BK病毒的第三引物组，用于检测HBV病毒的第四引物组，和用于检测B19病毒的第五引物组。利用上述的引物组，能够在同一PCR扩增体系内、在同一PCR扩增条件下，实现对CMV病毒的7个目标区域、EBV病毒的6个目标区域、BK病毒的4个目标区域、HBV病毒的3个目标区域和B19病毒的2个目标区域的同时扩增，且扩增效率均一、特异性强。得到的PCR扩增产物中，除包含目标区域序列，还包含在5’端和3’端引入的通用序列，由于通用序列中引入有高通量测序的接头序列和index序列，使得到的PCR扩增产物能够直接用于高通量测序，提高器官移植术后感染检测的检测通量、灵敏度和检测样本数。
5.本发明提供的用于检测器官移植术后感染的测序文库，基于上述的检测引物组、检测试剂或试剂盒构建得到，适于应用于高通量测序，为器官移植患者提供术后病毒检测信息，具有病毒检测范围广、检测效率高、灵敏度高以及准确度高等优势，有利于为器官移植术后感染的诊断、治疗提供有效的临床参考依据。
6.本发明提供的上述测序文库的构建方法，由于采用了上述的检测引物组，仅通过两次PCR扩增(多重PCR引物扩增与通用引物扩增)，即能够实现对目标区域富集扩增以及在扩增片段的两端添加高通量测序的接头序列，与传统的富集扩增、在富集产物两端添加高通量测序接头序列，然后以液相芯片捕获目标区域的高通量测序文库构的建过程相比，简化了测序文库的构建流程，提高了测序文库的构建效率，降低了构建成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例4提供的多重PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述实施例中使用的实验试剂均为常规实验试剂，可由市场直接获得；下述实施例中引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1
本实施例提供一种用于检测器官移植术后感染的检测引物组，包括CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒的多重PCR引物组，以及通用引物组。其中，多重PCR引物组包括用于检测CMV病毒的第一引物组，用于检测EBV病毒的第二引物组，用于检测BK病毒的第三引物组，用于检测HBV病毒的第四引物组，和用于检测B19病毒的第五引物组。
多重PCR引物组的上游引物具有位于5’端的第一标签序列和位于3’端的上游识别序列，多重PCR引物组的下游引物具有位于5’端的第二标签序列和位于3’端的下游识别序列。第一标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二标签序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，上游识别序列包括SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.72所示的任一核苷酸序列，下游识别序列包括SEQ ID NO.73-SEQ ID NO.94所示的任一核苷酸序列。具体地，检测引物组包括如下表1所示的引物：
表1
多重PCR引物组中由SEQ ID NO.7所示的CMV1-F至SEQ ID NO.28所示的B19V2-F的22条上游引物分别具有SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.72所示的上游标签序列，多重PCR引物组中由SEQ ID NO.29所示的CMV1-R至SEQ ID NO.50所示的B19V2-R的22条下游引物分别具有SEQ ID NO.73-SEQ ID NO.94所示的下游标签序列。第一引物组～第五引物组中的上游识别序列和下游识别序列分别特异性识别并扩增CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒基因组的保守区域(获取于https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，各病毒的保守区域覆盖病毒的外显子区域、内含子区域或外显子以及内含子区域。同时，在设计上游识别序列与下游识别序列时，需要考虑上游识别序列与第一标签序列组合后的上游引物、以及下游识别序列与第二标签序列组合后的下游引物的Tm值、引物二聚体、GC含量、重复序列等序列特征以及扩增动力学指标，使得到的22对引物能够在同一扩增体系和同一扩增条件下实现对不同病毒基因组以及同一病毒基因组不同区段的特异性扩增，避免体系内的非特异性扩增以及扩增效率不均衡现象。
通用引物组包括上游通用引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO.95所示)和下游通用引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO.96所示)。上游通用引物具有位于5’端的上游通用序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，和位于3’端的第三标签序列(其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示)；下游通用引物具有位于5’端的下游通用序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，和位于3’端的第四标签序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。上游通用序列中含有P5接头序列5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATC-3’，下游通用序列中含有P7接头序列5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’其中，上游通用引物的第三标签序列和检测引物组中的第一标签序列为互补序列，下游通用引物的第四标签序列和检测引物组中的第二标签序列为互补序列。在同一PCR扩增体系内，通过多重PCR引物组的上游引物和下游引物识别并扩增CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒基因组中的目标片段，上游通用引物和下游通用引物识别结合在CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒扩增片段的两端，通过PCR扩增进一步在目标片段的5’端和3’端引入上游通用序列和下游通用序列，得到最终的PCR扩增片段为：5’-上游通用序列-第一标签序列-目标片段序列-第二标签序列-下游通用序列-3’。
上述的检测引物组，利用多重PCR引物组能够同时实现对CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒共5种病毒的多目标检测区域的富集扩增，以及在PCR扩增片段的两端引入用于高通量测序的接头序列，有效提高了PCR检测效率。得到的PCR扩增片段适于直接应用于高通量测序，具有检通量高、检测速度快、检测灵敏度高等优势。多重PCR引物组同时实现对5种病毒的检测，对器官移植术后病原体检测的覆盖范围广、检出效率高，避免漏检等现象的发生。同时，多重PCR引物组对每种病毒的多区域进行识别扩增，避免检测的假阴性结果，提高检测的准确率。上述通过设计得到的多重PCR引物组中的22对引物和通用引物组中的一对通用引物能够实现对各目标检测区域的高特异性扩增，且扩增效率均衡，具有稳定性好、特异性高、均一性好等优势，能够通过多重PCR引物扩增和通用引物扩增得到亮度均一、无明显拖尾的目标扩增条带，且目标扩增产物的两端由于添加有高通量测序接头序列、文库标签序列，适于直接应用于高通量测序。第二标签序列中含有polyN的随机碱基序列，能够对不同病毒以及同一病毒不同目标检测片段进行特异性标记，获得测序数据后，通过读取特异性标签序列，有效去除了在测序过程和PCR过程引入的错误，提高检测的准确度。利用上述的检测引物组，能够在器官移植术后早期实现对多种病原体的及时检测，检测覆盖范围广、检测效率高，并具有高特异性和灵敏度，以及检测通量大、成本低等优势。
实施例2
本实施例提供一种器官移植术后感染的检测试剂，包括如下成分：
(1)引物混合液I，包含实施例1提供的多重PCR引物组，多重PCR引物组的上游引物和下游引物以1：1的摩尔比混合，使各上游引物和各下游引物的浓度均为5μM，引物混合液I的浓度为5μM；
(2)引物混合液II，包含实施例1提供的通用引物组，通用引物组的上游通用引物和下游通用引物以1：1的摩尔比混合，使上游通用引物和下游通用引物的浓度均为5μM，引物混合液II的浓度为5μM；
(3)KAPA Hifi Enzyme Mix，KAPA Hifi Enzyme Mix中含有DNA聚合酶0.5U/25μL、MgCl2 2.5mM、dATP 0.3mM、dCTP 0.3mM、dGTP 0.3mM和dTTP 0.3mM。
实施例3
本实施例提供一种用于检测器官移植术后感染的测序文库的构建方法，具体地，包括以下步骤：
S1，提取待测样本的基因组DNA或游离DNA
使用QIAGEN的DNA提取试剂盒(货号：51304/55114)提取待测样本的基因组DNA或游离DNA，待测样本为器官移植术患者的血液样本或尿液样本，器官移植术患者为CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒均为阳性感染的患者。使用荧光定量仪Qubit3.0对提取的DNA进行纯度和浓度测定，将提取的样本DNA浓度调整至1-5ng/μl。
S2，以步骤S1提取的基因组DNA或游离DNA作为DNA扩增模板，使用实施例1提供的检测引物组(22条上游引物+22条下游引物)进行多重PCR扩增，得到第一PCR扩增产物，多重PCR扩增的扩增体系如表2所示：
表2
引物混合液I(5μM) 1μl
KAPA Hifi Enzyme Mix 15μl
DNA扩增模板 9μl
多重PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；98℃变性15s，60℃退火3.5min，72℃延伸1.5min，共13个循环。
S3，纯化多重PCR扩增的第一PCR扩增产物，以第一PCR扩增产物为模板，使用实施例1提供的通用引物组(1条上游通用引物+1条下游通用引物)进行PCR扩增，得到得到第二PCR扩增产物，第二PCR扩增产物的扩增体系如表3所示：
表3
引物混合液II(5μM) 1μl
KAPA Hifi Enzyme Mix 15μl
DNA扩增模板 14μl
第二PCR扩增产物的扩增反应程序为：98℃预变性45s；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共11个循环，72℃延伸1min。
S4，纯化第二PCR扩增产物，得到测序文库
使用磁珠纯化步骤S2中得到多重PCR扩增的反应液，回收PCR扩增产物。取3μl PCR扩增产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增质量。图1显示多重PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳检测结果。由于第一引物组～第五引物组中各引物对的扩增片段的大小＜10bp，因此图1中针对CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒的各病毒仅显示一条扩增条带。由图1可知，本发明提供的多重PCR扩增引物组用于PCR扩增的条带完整、亮度均一、无明显拖尾现象，多重PCR扩增效率的均一性好、特异性高。
使用荧光定量仪Qubit3.0对多重PCR扩增产物进行纯度和浓度测定，选取OD260/OD280为1.8-2.0范围内的多重PCR扩增产物作为测序文库。
实验例1
1、实验目的：检测实施例4提供方法构建的测序文库用于器官移植术后感染检测的灵敏度和准确度。
2、实验方法：将实施例4提供的方法构建的测序文库，以及采用相同的基因组DNA或游离DNA为模板、以探针液相杂交捕获的方法得到的杂交捕获文库，分别使用IlluminaHiSeq X Ten进行高通量测序，比较两种文库获得的测序数据。
表4
3、由表4数据可知，在同等上机数据库量的情况下，以本发明提供的构建方法获得的测序文库经高通量测序所检测的reads数，远高于以杂交捕获方法得到的文库的reads数。由此可知，本发明提供的测序文库用于器官移植术后感染检测具有更高的灵敏度和准确度。同时，在测序文库的构建过程中，仅需一次PCR步骤即能实现文库的富集以及两端接头序列的添加，与传统两次扩增的文库构建过程相比，简化了测序文库的构建流程，提高了测序文库的构建效率，降低了构建成本。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 上海奥根诊断技术有限公司
<120> 用于检测器官移植术后感染的检测引物组、检测试剂及测序文库
<130> WXHA201800248
<160> 96
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 第一标签序列(Homo sapiens)
<400> 1
acacgacgct cttccgatct 20
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 第二标签序列(Homo sapiens)
<400> 2
ttccttggca cccgagaatt cca 23
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 第三标签序列(Homo sapiens)
<400> 3
tacactcttt ccctacacga cgctcttccg atct 34
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 第四标签序列(Homo sapiens)
<400> 4
gatnnnnnng tgactggagt tccttggcac ccgagaat 38
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 上游通用序列(Homo sapiens)
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatc 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 下游通用序列(Homo sapiens)
<400> 6
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV1-F)
<400> 7
acacgacgct cttccgatct gactatccct ctgtcctcag ta 42
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV2-F)
<400> 8
acacgacgct cttccgatct gggcagcgca gctactttta c 41
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV3-F)
<400> 9
acacgacgct cttccgatct tggccgacct gcttaagtg 39
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV4-F)
<400> 10
acacgacgct cttccgatct ccagtgaatt tctcttccgt ct 42
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV5-F)
<400> 11
acacgacgct cttccgatct accctgttct tcctcgctat 40
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV6-F)
<400> 12
acacgacgct cttccgatct gcttaccact ggcacgacac ct 42
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV7-F)
<400> 13
acacgacgct cttccgatct tcacatcatg cagctcctta 40
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV1-F)
<400> 14
acacgacgct cttccgatct cccatagact cccatgtaag c 41
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV2-F)
<400> 15
acacgacgct cttccgatct caccggccct tctctttccc 40
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV3-F)
<400> 16
acacgacgct cttccgatct cccaggcaca cactacacac a 41
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV4-F)
<400> 17
acacgacgct cttccgatct tgcagctttg acgatggagt ag 42
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV5-F)
<400> 18
acacgacgct cttccgatct cccaacactc caccacacc 39
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV6-F)
<400> 19
acacgacgct cttccgatct gaggagcaac aagtaagcc 39
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(BK1-F)
<400> 20
acacgacgct cttccgatct agaactgctc ctcaatggat g 41
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(BK2-F)
<400> 21
acacgacgct cttccgatct gatgaatcta ctgatgtggg aggc 44
<210> 22
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(BK3-F)
<400> 22
acacgacgct cttccgatct ggactccata ccatacatag gctg 44
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(BK4-F)
<400> 23
acacgacgct cttccgatct gctcctcaat ggatgttgc 39
<210> 24
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(HBV1-F)
<400> 24
acacgacgct cttccgatct accaccaaat gcccctat 38
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(HBV2-F)
<400> 25
acacgacgct cttccgatct ttcaagcctc caagctgtgc 40
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(HBV3-F)
<400> 26
acacgacgct cttccgatct ctgtattccc atcccatca 39
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(B19V1-F)
<400> 27
acacgacgct cttccgatct accagttcag gagaatcat 39
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(B19V2-F)
<400> 28
acacgacgct cttccgatct ccactatgaa aactgggcaa ta 42
<210> 29
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV1-R)
<400> 29
ttccttggca cccgagaatn nnntccaaga cactggctca gacttga 47
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV2-R)
<400> 30
ttccttggca cccgagaatn nnntccagcc cacrctggca atgac 45
<210> 31
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV3-R)
<400> 31
ttccttggca cccgagaatn nnntccaggg cgctttttta acgttacg 48
<210> 32
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV4-R)
<400> 32
ttccttggca cccgagaatn nnntccacat agagatagcg ataaatgagt c 51
<210> 33
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV5-R)
<400> 33
ttccttggca cccgagaatn nnntccagcc cgagcccgac ttta 44
<210> 34
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV6-R)
<400> 34
ttccttggca cccgagaatn nnntccatac tccccgtaca gctcgcaac 49
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV7-R)
<400> 35
ttccttggca cccgagaatn nnntccatgc agagcatgta tgagaactac 50
<210> 36
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV1-R)
<400> 36
ttccttggca cccgagaatn nnntccaccc tggacatctg gacaaag 47
<210> 37
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV2-R)
<400> 37
ttccttggca cccgagaatn nnntccaggc cagaagctgg ggtctag 47
<210> 38
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV3-R)
<400> 38
ttccttggca cccgagaatn nnntccatct taggagctgt ccgaggg 47
<210> 39
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV4-R)
<400> 39
ttccttggca cccgagaatn nnntccatca ctcctgccct tcctcac 47
<210> 40
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV5-R)
<400> 40
ttccttggca cccgagaatn nnntccatct taggagctgt ccgaggg 47
<210> 41
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV6-R)
<400> 41
ttccttggca cccgagaatn nnntccaccc actttatgta tggcact 47
<210> 42
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(BK1-R)
<400> 42
ttccttggca cccgagaatn nnntccaagc tgcccctgga cactct 46
<210> 43
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(BK2-R)
<400> 43
ttccttggca cccgagaatn nnntccagat ggaccctgca tgaaggttaa g 51
<210> 44
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(BK3-R)
<400> 44
ttccttggca cccgagaatn nnntccacag ctctggaaca caacagtgg 49
<210> 45
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(BK4-R)
<400> 45
ttccttggca cccgagaatn nnntccaagc tgcccctgga cactct 46
<210> 46
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(HBV1-R)
<400> 46
ttccttggca cccgagaatn nnntccattc tgcgacgcgg cga 43
<210> 47
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(HBV2-R)
<400> 47
ttccttggca cccgagaatn nnntccaaga gtaactccac agwagctcca a 51
<210> 48
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(HBV3-R)
<400> 48
ttccttggca cccgagaatn nnntccacaa gatgttgtac agacttg 47
<210> 49
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(B19V1-R)
<400> 49
ttccttggca cccgagaatn nnntccaccc acacataatc aaccc 45
<210> 50
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(B19V2-R)
<400> 50
ttccttggca cccgagaatn nnntccagct gctttcactg agttcttca 49
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 51
gactatccct ctgtcctcag ta 22
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 52
gggcagcgca gctactttta c 21
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 53
tggccgacct gcttaagtg 19
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 54
ccagtgaatt tctcttccgt ct 22
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 55
accctgttct tcctcgctat 20
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 56
gcttaccact ggcacgacac ct 22
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 57
tcacatcatg cagctcctta 20
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV)
<400> 58
cccatagact cccatgtaag c 21
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV)
<400> 59
caccggccct tctctttccc 20
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV)
<400> 60
cccaggcaca cactacacac a 21
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV)
<400> 61
tgcagctttg acgatggagt ag 22
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV)
<400> 62
cccaacactc caccacacc 19
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV)
<400> 63
gaggagcaac aagtaagcc 19
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(BK)
<400> 64
agaactgctc ctcaatggat g 21
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(BK)
<400> 65
gatgaatcta ctgatgtggg aggc 24
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(BK)
<400> 66
ggactccata ccatacatag gctg 24
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(BK)
<400> 67
gctcctcaat ggatgttgc 19
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(HBV)
<400> 68
accaccaaat gcccctat 18
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(HBV)
<400> 69
ttcaagcctc caagctgtgc 20
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(HBV)
<400> 70
ctgtattccc atcccatca 19
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(B19)
<400> 71
accagttcag gagaatcat 19
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(B19)
<400> 72
ccactatgaa aactgggcaa ta 22
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 73
agacactggc tcagacttga 20
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 74
gcccacrctg gcaatgac 18
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 75
gggcgctttt ttaacgttac g 21
<210> 76
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 76
catagagata gcgataaatg agtc 24
<210> 77
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 77
gcccgagccc gacttta 17
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 78
tactccccgt acagctcgca ac 22
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(CMV)
<400> 79
tgcagagcat gtatgagaac tac 23
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV)
<400> 80
ccctggacat ctggacaaag 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV)
<400> 81
ggccagaagc tggggtctag 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV)
<400> 82
tcttaggagc tgtccgaggg 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV)
<400> 83
tcactcctgc ccttcctcac 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV)
<400> 84
tcttaggagc tgtccgaggg 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(EBV)
<400> 85
cccactttat gtatggcact 20
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(BK)
<400> 86
agctgcccct ggacactct 19
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(BK)
<400> 87
gatggaccct gcatgaaggt taag 24
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(BK)
<400> 88
cagctctgga acacaacagt gg 22
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(BK)
<400> 89
agctgcccct ggacactct 19
<210> 90
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(HBV)
<400> 90
ttctgcgacg cggcga 16
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(HBV)
<400> 91
agagtaactc cacagwagct ccaa 24
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(HBV)
<400> 92
caagatgttg tacagacttg 20
<210> 93
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(B19)
<400> 93
cccacacata atcaaccc 18
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(B19)
<400> 94
gctgctttca ctgagttctt ca 22
<210> 95
<211> 58
<212> DNA
<213> 上游通用引物(Homo sapiens)
<400> 95
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 96
<211> 59
<212> DNA
<213> 下游通用引物(Homo sapiens)
<400> 96
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttccttggca cccgagaat 59

Claims (10)

1.一种用于检测器官移植术后感染的检测引物组，其特征在于，包括CMV病毒、EBV病毒、BK病毒、HBV病毒和B19病毒的多重PCR引物组，以及通用引物组；
所述多重PCR引物组的上游引物具有位于5’端的第一标签序列和位于3’端的上游识别序列，所述多重PCR引物组的下游引物具有位于5’端的第二标签序列和位于3’端的下游识别序列；所述通用引物组的上游引物具有位于5’端的上游通用序列和位于3’端的第三标签序列，所述通用引物组的下游引物具有位于5’端的下游通用序列和位于3’端的第四标签序列；所述第一标签序列和所述第三标签序列为互补序列，所述第二标签序列和所述第四标签序列为互补序列，所述上游通用序列和所述下游通用序列包括高通量测序的接头序列。
2.根据权利要求1所述的检测引物组，其特征在于，所述第一标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第四标签序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述上游通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述下游通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1或2所述的检测引物组，其特征在于，所述上游识别序列包括SEQ IDNO.51-SEQ ID NO.72所示的任一核苷酸序列，所述下游识别序列包括SEQ ID NO.73-SEQID NO.94所示的任一核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测引物组，其特征在于，所述多重PCR引物组包括用于检测CMV病毒的第一引物组，用于检测EBV病毒的第二引物组，用于检测BK病毒的第三引物组，用于检测HBV病毒的第四引物组，和用于检测B19病毒的第五引物组；
所述第一引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.13所示，所述第一引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.35所示；
所述第二引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.19所示，所述第二引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.36-SEQ ID NO.41所示；
所述第三引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.20-SEQ ID NO.23所示，所述第三引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.42-SEQ ID NO.45所示；
所述第四引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.24-SEQ ID NO.26所示，所述第四引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.46-SEQ ID NO.48所示；
所述第五引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.27-SEQ ID NO.28所示，所述第五引物组的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.49-SEQ ID NO.50所示。
5.一种器官移植术后感染的检测试剂，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的检测引物组。
6.根据权利要求5所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括如下成分：
含有所述多重PCR引物组的混合液I，所述多重PCR引物组的上游引物和下游引物以1：1的摩尔比混合，使所述多重PCR引物组的上游引物与所述下游引物的浓度均为5μM；
含有所述通用引物组的混合液II，所述通用引物组的上游引物和下游引物以1：1的摩尔比混合，使所述通用引物组的上游引物与所述下游引物的浓度均为5μM；
KAPA Hifi Enzyme Mix，所述KAPA Hifi Enzyme Mix中含有DNA聚合酶0.5U/25μL、MgCl2 2.5mM、dATP 0.3mM、dCTP 0.3mM、dGTP 0.3mM和dTTP 0.3mM。
7.根据权利要求5或6所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂用于器官移植术后感染的多重PCR扩增检测的反应体系包括：
含有所述多重PCR引物组的混合液I，5μM,1μl；
KAPA Hifi Enzyme Mix，15μl；
DNA扩增模板，9μl；
总体积为25μl。
8.根据权利要求5－7任一项所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂用于器官移植术后感染的多重PCR扩增检测的反应程序为：
95℃预变性5min；
95℃变性15s，60℃退火3.5min，72℃延伸1.5min，共13个循环。
9.一种用于检测器官移植术后感染的测序文库，其特征在于，所述测序文库基于权利要求1－4任一项所述的检测引物组，或权利要求5－8任一项所述的检测试剂。
10.一种权利要求9所述的测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，提取待测样本的基因组DNA或血浆游离DNA；
S2，以所述基因组DNA或血浆游离DNA为DNA扩增模板，采用多重PCR引物组进行多重PCR扩增，得到第一PCR扩增产物；
S3，以S2得到的多重PCR扩增产物为模板，采用通用引物组进行PCR扩增，得到第二PCR扩增产物；
S4，纯化所述第二PCR扩增产物，得到所述测序文库。
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